DE3115278A1 - Verfahren zum nachweis von nucleinsaeuren in biologischen proben - Google Patents

Verfahren zum nachweis von nucleinsaeuren in biologischen proben

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DE3115278A1 DE19813115278 DE3115278A DE3115278A1 DE 3115278 A1 DE3115278 A1 DE 3115278A1 DE 19813115278 DE19813115278 DE 19813115278 DE 3115278 A DE3115278 A DE 3115278A DE 3115278 A1 DE3115278 A1 DE 3115278A1
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Description

Die Erfindung bezieht sich allgemein auf das Gebiet der Fluoreszenzmikroskopie, die sich in letzter Zeit zu einem wertvollen Hilfsmittel für die biologische Forschung entwickelt hat. Die Fluoreszenzmikroskopie ist ein ausserordentlich empfindliches Verfahren zum Nachweis von geringen Substanzmengen, die mit Farbstoffen, die bei Anregung durch einfallendes Licht fluoreszieren, angefärbt werden können. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von einer Reihe von Organismen in-.biologischen Proben. Der Nachweis dieser Organismen wird durch erfindungsgemäss verwendete fluoreszierende Farbstoffe, die sich zur Färbung von Nucleinsäuren eignen, ermöglicht.
Zur selektiven Färbung von Nucleinsäuren sind bisher eine Reihe von Verbindungen verwendet worden. Von Bertalanffy und Bickis, "J. Hi-stochem. Cytochem., Bd.. 4 (1956), S. 481 bis 493, berichten, dass Acridinorange zum Nachweis von cytoplasmatischer Basophilie (RNA) durch Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden kann. Insbesondere stellten diese Autoren fest, dass Acridinorange die Identifizierung von basophilen cytoplasmatischen Einschlüssen im supravitalen Zustand ermöglicht und dass die rot fluoreszierenden cytoplasmatischen Einschlüsse den Einschlüssen entsprechen, die mit der Toluidinblau-Technik angefärbt werden können und von denen sich durch Ribonuclease zeigen lässt, dass sie vorwiegend aus RNA bestehen.
Rosseil et al., Nature, Bd. 253 (1975), S. 461, berichten, dass 41 ,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) wertvolle DNA-bindende Eigenschaften besitzt. Insbesondere stellten diese Autoren fest, dass DAPI als hochspezifisches Fluoreszenzanfärbemittel sowohl für nukleare als auch für mitochondrielle DNA in Hefe verwendet werden kann.
3763 - 6 -
Hilwig und Gropp, Experimental Cell Research, Bd. 75 (1972), S. 122 bis 126 diskutieren ein einfaches und direktes Fluoreszenz-Anfärbeverfahren, bei dem ein Benzimidazolderivat (bezeichnet als 33258 Hoechst) zur Sichtbarmachung von chromosomalen Segmenten von Heterochromatin und (in der Maus) Stellen von sich wiederholender DNA verwendet wird.
Obgleich gemäss dem Stand der Technik Farbstoffe in der Fluoreszenzmikroskopie, Histologie und Fluoreszenzmikrofluorimetrie in weitem Umfang verwendet werden, erweisen sich diese Farbstoffe in bezug auf Erregungs-ZEmissions-Spektren, Quantenausbeute und Hintergrundfluoreszenz als so unzureichend, dass die Suche nach anderen fluoreszierenden Nucleinsäurefarbstoffen weitergeführt wurde.
Aufgabe der Erfindung ist es, nucleinsäurespezifische Farbstoffe bereitzustellen, die bei sichtbaren Wellenlängen erregbar, in freiem Zustand im xiesentlichen nicht-fluoreszieren, aber bei Bindung an Nucleinsäuren stark fluoreszierend sind.
Die zur Lösung dieser Aufgabe verwendeten Verbindungen sind aus der US-PS 3 833 863 und aus der Defensive Publication T88 9016 allgemein als Farbstoffe bekannt. Keine dieser Druckschriften befasst sich jedoch mit der Färbung von Nucleinsäuren.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren, dass dadurch gekennzeichnet ist, dass man die Nucleinsäuren mit einem fluoreszierenden Farbstoff der Formel anfärbt
R-Ifc*(=CH-CH)n=C- (CH=CH) X~
3763 - 7 -
in der
η eine ganze Zahl mit einem Wert von 0 oder 1 ist, m eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 oder 2 ist, R Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls durch Dialkylamino mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen in den Alkylresten substituiert ist, bedeutet,
R1 und Rp jeweils Wasserstoff, nieder-Alkyl oder halogensubstituiertes nieder-Alkyl bedeuten,
R_ Wasserstoff, nieder-Alkoxy, nieder-Alkyl oder Amino bedeutet, Z die nicht-metallischen Atome bedeutet, die zur Vervollständigung eines heterocyclischen Kerns aus der Gruppe Benzothiazol, Indolenin, Naphthothiazol, Benzoselenazol, Benzoxazol, Chinolin und Pyridin, die gegebenenfalls durch nieder-Alkyl, Halogen, Nitro oder Dialkylamino substituiert sind, bedeutet und ~X ein_ Anion bedeutet.
Die genannten Farbstoffe sind in wässrigen Lösungen im wesentlichen nicht-fluoreszierend, zeigen aber bei Bindung an doppelstrangige DNA ausgeprägte Intensivierungen. Einige dieser Farbstoffe zeigen diese Intesivierung bei Bindung an einstrangige RNA nicht, jedoch tritt ein signifikanter Anstieg der Fluoreszenz bei einem Grossteil der Farbstoffe bei Bindung an RNA auf. Aufgrund der Abwesenheit einer Fluoreszenz im freien Zustand können grosse Farbstoffmengen verwendet'werden, ohne dass man überschüssiges Reagens abtrennen oder entfernen muss. Diese Eigenschaft ist für einige Anwendungszwecke, bei denen eine geringe Absorption des Farbstoffs auftritt, wichtig. Aufgrund der hohen Fluoreszenz-Quantenausbeute von einigen der Farbstoffe können gegebenenfalls geringe Farbstoffmengen verwendet werden.
Die nachstehend aufgeführten Farbstoffe wurden hergestellt und auf ihre Eignung für das beanspruchte Verfahren untersucht.
3763 - 8 -
Farbstoff Chemische Bezeichnung
3-/'-Diniethylaminopropyl-2-p-dimethylaminostyryl· benzothiazoliumjodid
3-/"-Dimethylaminopropyl-2-p-dimethylaminostyrylbenzoxazoliumjodid
1 -/■-Dimethylaminopropyl-2-p-dimethylaminostyryl-3,3-dimethyl-3H-indoliumjodid
' S-Methyl-ö-dimethylamino^-p-dimethylamino-
styrylbenzothiazoliumjodid
3-ß-Dimethylaminoäthyl-2-p-dimethylaminostyrylbenzothiazoliumjodid
3-/'-Diniethylaminopropyl-2-p-diäthylaminostyrylbenzothiazoliumjodid
7 S-^
aminostyrylbenzothiazoliumjodid
3-/"-Dimethylaminopropyl-2-p-dimethylaminostyryl-oc-naphthothiazoliumjodid
· 3-/'-DimethylaminopΓopyl-2-p-dimethylamino-
styrylbenzoselenazoliumjodid
3-/'-Diinethylaminopropyl-5-methyl-2-p-dimethylaminostyrylbenzothiazoliumjodid
3-ß-Diäthylaminoäthyl-2-p-dimethylaminostyrylbenzothiazoliumjodid
3-Jr-Dimethylaminopropyl-2-p-(N-2-chloräthyl-N-äthyl)-aminostyrylbenzothiazoliumjodid
3-/"-DiIiIe thylaminopropyl-2-p-N, N-bis- (2-chloräthyl)-amino-o-methyIstyrylbenzothiazoliumjodid
3-/'-Dimethylaminopropyl-2-p-N, N-bis- (2-chloräthyI)-aminostyrylbenzothiazoliumjodid
3-(ß-Pyrrolidinoäthyl)-2-p-dimethylamino-• styrylbenzothiazoliumjodid
3-(ß-Morphölinoäthyl)-2-p-dimethylaminostyrylbenzothiazoliumjodid
3-^-Dimethylaminopropyl-2-(ii-p-dimethylaminophenyl-1,3-butadienyl)-benzothiazoliumjodid
- 9 -
Farbstoff Chemische Bezeichnung
18 3-/-Dimethylaminopropyl-2-(4-p-dimethylaminophenyl-1,3-butadienyl)-benzoxazoliumjodid
19 3-/'-Dimethylaminopropyl-2-(4-p-dimethylaminophenyl-1,3-butadienyl)-5-methylbenzothiazoliumjodid
20 S-Z-Dimethylaminopropyl-^-(4-p-dimethylaminophenyl-1,3-butadienyl)-ct-naphthothiazoliumjodid
21 3-/'"'-Dime thy laminopropy 1-2-(4-p-dimethylamine-phenyl-1,S-butadienyl-S-chlor-benzothiazoliumjodid
22 3-/"-Dimethylaminopropyl-2- (4-p-dimethylaminophenyl-1,3-butadienyl)-6-nitrobenzothiazoliumjodid
23 3-/^-Dimethylaminopropyl-2-(4-p-dimethylaminophenyl-1,3-butadienyl)-benzoselenazoliumjodid
24 - 3-/'-Diäthylamincpropyl-2-(1l-p-dimethylamino-
phenyl-1,3-butadienyl)-benzothiazoliumjodid
25 1 - jA-Dimethylaminopropyl-4-p-dimethylaminostyrylchinoliniumjodid
26 1 -/'-Dimethyiaminopropyl-2-p-dime thylaminostyrylchinoliniumjodid
27 1-^-Dimethylaminopropyl-4-(4-p-dimethylaminophenyl-1,3-butadienyl)-chinoliniumjodid
28 1- ^-Dimethylaminopropyl-4-p-dimethylaminostyrylpyridiniumjodid
29 S-Propyl^-p-dimethylaminostyrylbenzothiazoliumjodid
30 1-Äthyl-4-p-diäthylaminostyrylchinoliniumjodid
31 Anhydro-3-/'-sulfopropyl-2-p-dimethylaminostyrylbenzothiazoliumhydroxid
32 3-ß-Carboxyäthyl-2-p-dimethylaminostyrylbenzothiazoliumjodid
3763 - 10 -
Farbstoff Chemische Bezeichnung
33 1-Methyl-2-dimethylamino-U-p-dimethylamino-
styry!pyridiniumjodid
3^ 1-Methyl-2-dimethylamino-4-p-diäthylamino-
styrylpyridiniumjodid
35 1 -Äthyl^-diäthylamino-^-p-diäthylaminostyrylpyridiniumjodid
36 1-Methyl-2-dimethylamino-4-p-N,N-bis-(2-chloräthyl)-aminostyrylpyridiniumjodid
37 1 -Methyl-^-dimethylamino-U-p-N, N-bis- (2-chloräthyl)-amino-o-methyl-styrylpyridinium- jodid
38 1 -Äthyl-2-diäthylamino-il-p-dimethylaminostyrylpyridiniumjodid
Die vorgenannten Farbstoffe wurden zur Bestimmung der Anregungswellenlängen und der entstehenden Fluoreszenzemission bestrahlt* Sodann wurden Proben von DNA und RNA mit den einzelnen Farbstoffen angefärbt. Die Proben wurden bei der entsprechenden Wellenlänge bestrahlt. Die Fluoreszenzverstärkung wurde festgestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.
- 10 -
Tabelle T
Farb λ Anregung XEmission Verstärkung der Fluoreszenz Relative Fluoreszenz
stoff (run) (nra) Färbst.+DNA/Färbst. Färbst.+RNA/Färbst. des Farbstoffs in DNA-Lösung
1 550 595. 121 15 1
2 530 568 22 9 0,15
3 560 598 3 1 0,08
4 560 • 600 . 28 17 0,21
5 545 598 57 19 Q,43
6 560 596 71 8 0,67
7 560 600 124 14 0,96
8 570 620 159 100 0,88
9 560 602 126 20 0,83
10 550 • 597 142 20 1,14
11 545 600 36 7 0,13
12 546 595 41 5 0,75
13 545 593 26 3 0,32
14 528 583 21 2 0,65
15 556 605 20 9 0,03
16 544 598 11 3 0,08
17 620 685 57 3 0,11
18 560 660 5 2 0,02
19 620 693 83 4 0,13
20 622 715 33 7 0,09
Tabelle I (Fo.rts.
Farb \ Anregung λ Emission Verstärkung der Fluoreszenz Relative Fluoreszenz
stoff (nm) (nm) Färbst.+DNA/Farbst. Färbst.+RNA/Färbst. des Farbstoffs in DNA-Lösung
21 620 ' 695 65 3 0,15
22 610 700 5 2 <0,01
23 621 698 35 3 0,05
24 620 690 67 3 0,13
25 586 690 19 12 <0,01
26 565 630 12 14 <0,01
27 6*23 775 14 4 <0,01
28 515 620 11 6 0,03
29 540 595 28 7 0,24
30 585 680 36 7 0,02
31 525% 595 2 2 <0,01
32 520 694 1 ,1 <0,01
.■ 33 420 570 4 2 0,07
34 430 574. 4 1 0,09
35 455 568 5 1 0,12
36 375 535 2 1 '0,19
37 390 535 4 1 0,09
38 425 565 5 2 0,10
3763 - 13 -
Alle vorgenannten Werte wurden unter Verwendung eines Perkin-Elmer MPF 43-A Fluoreszenz-Spektrophotometers bei einer Farbstoff konzentration von 0,1 mikromolar in 3 ml 10 millimolarem, mit Kochsalz gepuffertem Phosphatpuffer (PBS) vom pH-Wert 7,3 ermittelt. Die die Fluoreszenzverstärkung wiedergebenden Werte wurden erhalten, indem man das Verhältnis der Fluoreszenzintensität einer Farbstofflösung mit einem Gehalt an 100 ug pro ml Kälberthymus-Typ I-DNA und Hefe-Typ III-RNA zur Fluoreszenzintensität der Lösung des freien Farbstoffs bestimmte.
Die relative Fluoreszenz wird in einfacher Weise aus dem Verhältnis der Fluoreszenzintensität einer Farbstofflösung mit einem Gehalt an 100 ^g pro 1 ml Kälberthymus-Typ I-DNA zu der Fluoreszenzintensität des Farbstoffs 1 erhalten. Die Werte sind nicht in bezug auf das Ansprechverhalten des Geräts bei · verschiedenen Wellenlängen korrigiert.
Beispiel 1
5 ,ul einer Lösung des Farbstoffs 1 (2 mg/ml in 0,9-prozentiger Kochsalzlösung) werden zu 100 μΐ frischem Vollblut (EDTA) gegeben. Das Gemisch wird geschüttelt, und ein feuchter Objektträger wird sofort zur Untersuchung unter dem Fluoreszenzmikroskop (540 nm Breitba.nd-Anregungsfilter, 590 nm Langpass-Emissionsfilter, 400-fache Vergrösserung) hergestellt. Die Kerne der peripheren Blutleukozyten (PBL) werden beobachtet. Es ergibt sich eine intensive orangefarbene Anfärbung gegen einen schwarzen Hintergrund. Ferner werden massig gefärbte Blutplättchen beobachtet. In den Erythrozyten oder im Cytoplasma der PBL lässt sich keine Färbung feststellen.
Beispiel 2
20 ;j1 einer Lösung des Farbstoffs 1 (2 mg/ml in 0,9-prozentiger Kochsalzlösung) werden zu 2 ml einer Suspension von E. coli
8 9
(10 bis 10 Zellen/ml) gegeben. Das Gemisch wird stark durch-
- 13 -
3763 - 14 -
gewirbelt. Gemäss Beispiel 1 wird ein feuchter Objektträger hergestellt und untersucht. Die Bakterien lassen sich als leuchtend orangefarbene Stäbchen gegen einen schwarzen Untergrund erkennen.
Beispiel 3
η 2 ml einer Suspension von E. coli (-'«ΊΟ Zellen pro ml) werden mit 20 μΐ einer Lösung von 2 mg/ml des Farbstoffs 25 versetzt. Das Gemisch wird geschüttelt. Gemäss Beispiel 1 wird ein feuchter Objektträger hergestellt und beobachtet. Die Bakterien lassen sich als leuchtend rote Stäbchen auf einem schwarzen Hintergrund erkennen.
Beispiel 4
'100 ^l von Phagensuspensioneii (PICM, 5 χ 109 pfu/ml; T6,
gp
4 χ 10 pfu/ml; 2 χ 10 pfu/ml) werden mit 10 ^i 1 einer Lösung des Farbstoffs 1 (1,6 mg/ml in 0,9-prozentiger Kochsalzlösung, steril filtriert durch ein 0,3 ,nm-Filter) gegeben. Das Gemisch wird geschüttelt und zur Herstellung eines feuchten Objektträgers verwendet. Der Objektträger wird gemäss Beispiel 1 unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. PICM und T6 werden als kleine orangefarbene Nadelspitzen gegen einen schwarzen Hintergrund sichtbar.
Beispiel 5
Vorratslösungen von DNA und Fabrstoff 1 in 50 nanomolarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,8 werden so vermischt, dass sich Endkonzentrationen von 1 bis 100 nanomolar DNA-Basenpaare und 1 inikromolar Farbstoff in einem Endvolumen von 2 ml ergeben. Die Fluoreszenz der Lösungen wird mit einem Perkin-Elmer MPF 43A-Fluoreszenzspektrophotometer gemessen. Die Anregung liegt bei 555 nm (4 nm Bandpass) und die Emission bei 605 nm (4 nm Bandpass), über diesen Bereich wird eine lineare Kurve von Fluoreszenz gegen DNA-Konzentration erhalten.
- 14 -
3763 - ' - 15 -
Beispiel 6
0,5 ml einer Lösung des Farbstoffs 28 (50 jag/ml in 0,9-prozentiger Kochsalzlösung; steril filtriert durch ein 0,3 Jim-Filter) werden mit 5 ul frischem Vollblut (EDTA) versetzt. Das Gemisch wird geschüttelt, und es wird ein feuchter Objektträger zur Untersuchung unter dem Fluoreszenzmikroskop (450 bis 490 nm Breitbandanregung, 530 nm Langpass-Emissionsfilter; 400-fache Vergrösserung) hergestellt. Die Kerne der peripheren Blutleukozyten lassen eine hell-orangefarbene Färbung erkennen. Das endoplasmatische Retikulum wird gelb gefärbt. Cytoplasma und Membran werden grün gefärbt. Blutplättchen färben sich orangefarben. Erythrozyten und Retikulozyten lassen sich leicht aufgrund des intensiv gefärbten gelb-orangefarbenen Retikulums der Retikulozyten und der schwach gefärbten grünlichen Membran der Erythrozyten, unterscheiden.-
Beispiel 7
Das Verfahren von Beispiel 6 wird unter Verwendung einer Lösung des Farbstoffs 33 wiederholt. Kerne und endoplasmatisches Retikulum der peripheren Blutleukozyten werden intensiv gelb gefärbt. Cytoplasma und Membran nehmen eine intensive grün-gelbe Färbung an. Erythrozyten und Retikulozyten lassen sich ebenfalls leicht durch das intensiv gefärbte gelbliche Retikulum der Retikulozyten und die klare grün-gelbe Färbung der Erythrozytenmembran unterscheiden.
Aus den vorstehenden Beispielen wird erkennbar, dass sich die erfindungsgemäss verwendeten Farbstoffe zum Nachweis einer praktisch unbegrenzten Anzahl von mikroskopischen Organismen in bioologischen Flüssigkeiten eignen. Zusätzlich zur Anwendung bei der Mikrofluoreszenz-Zytologie lassen sich die Farbstoffe in Strömungszytofluorimetrieinstrumenten zum Nachweis von erhöhten Bakterienkonzentratiunen in Urin- und Wasserproben verwenden. Vollblut kann zur Ermittlung eines Profils der Bestandteile analysiert werden, da die Farbstoffe eine fluoreszierende Färbung von Plasmiden, Retikulozyten, Leukozyten und
Blutplättchen bewirken.
- 15 -
Ende der Beschreibung

Claims (11)

  1. DR.-ING. WALTER ABITZ DR. DIETER F. MORF DIPL.-PHYS. M. GRITSCHNEDER Patentanwälte
    München, 15. April 1981 Postanschrift / Postal Address Postfach 86Ο1ΟΘ. 8OOO München 86
    Pienzenauerstraße 28 Telefon 98 32 22
    Telegramme: Chemindus München Telex: (O) 5 239Θ2
    3763
    ABBOTT LABORATORIES North Chicago, Illinois 60064
    Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren in biologischen
    Proben
    Patentansprüche
    'Li Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren in biologischen Proben, dadurch gekennzeichnet, dass man die Nucleinsäuren mit einem fluoreszierenden Farbstoff der Formel anfärbt
    Z,
    =C- (CH=CH)
    3763 - 2 -
    in der
    η eine ganze Zahl mit einem VJert von 0 oder 1 ist, m eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 oder 2 ist, R Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls durch Dialkylamino mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen in den Alkylresten substituiert ist, bedeutet, R1 und R„ jeweils Wasserstoff, nieder-Alkyl oder halogensubstituiertes nieder-Alkyl bedeuten, R^ Viasserstoff, nieder-Alkyl, nieder-Alkoxy oder Amino bedeutet,
    Z die nicht-metallisehen Atome bedeutet, die zur Vervollständigung eines heterocyclischen Kerns aus der Gruppe Benzothiazol, Indolenin, Naphthothiazol, Benzoselenazol, Benzoxazol, Chinolin und Pyridin, die gegebenenfalls durch nieder-Alkyl, Halogen, Nitro oder Dialkylamino substituiert sind, erforderlich sind, und .
    X ein Anion bedeutet.
  2. 2. Verfahren zum Nachweis X1On Nucleinsäuren in biologischen Preise"- dadurch gekennzeichnet; dass man die Nucleinsäuren mit einem fluoreszierenden Farbstoff der Formel anfärbt
    R-^C=CH-CH) =C-CH=CH-
    in der
    η eine ganze Zahl mit eineai VJert von 0 oder 1 ist, R Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls durch Dialkylamino mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen in den Alkylresten substituiert ist, bedeutet,
    R. und R2 jeweils Wasserstoff, nieder-Alkyl oder halogensubstituiertes nieder-Alkyl bedeuten,
    3763 - 3 -
    R_ Wasserstoff, nieder-Alkyl, nieder-Alkoxy oder Amino bedeuten,
    Z die nicht-metallischen Atome bedeutet, die zur Vervollständigung eines heterocyclischen Kerns aus der Gruppe Benzothiazol, Indolenin, Naphthothiazol, Benzoselenazol, Benzoxazol, Chinolin oder Pyridin, die gegebenenfalls durch nieder-Alkyl, Halogen, Nitro oder Dialkylamino substituiert sind, erforderlich sind, und
    X ein Anion bedeutet.
  3. 3. Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuren in biologischen Proben, dadurch gekennzeichnet, dass man die Nucleinsäuren mit einem fluoreszierenden Farbstoff der Formel anfärbt
    R-N=C-CH=CH-
    in der
    R Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls durch Dialkylamino mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen in den Alkylresten substituiert ist, bedeutet,
    R. und R„ jeweils Wasserstoff, nieder-Alkyl oder halogensubstituiertes nieder-Alkyl bedeuten, Z die nicht-metallischen Atome bedeutet, die zur Vervollständigung eines heterocyclischen Kerns aus der Gruppe Benzothiazol, Indolenin, Naphthothiazol, Benzoselenazol, Benzoxazol, Chinolin und Pyridin, die gegebenenfalls durch nieder-Alkyl, Halogen, Nitro oder Dialkylamino substituiert sind, erforderlich sind, und
    X ein Anion bedeutet.
    3763 - 4 -
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als fluoreszierenden Farbstoff i-^-Dimethylaminopropyl-4-p-dimethylaminostyrylchinoliniumjodid verwendet.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als fluoreszierenden Farbstoff S-Z^Dimethylaminopropyl-2-p-dimethylaminostyrylbenzothiazoliumjodid verwendet.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als fluoreszierenden Farbstoff 3-/'-Dimethylaminopropyl-5-chlor-2-dimethylaminostyrylbenzothiazoliumjodid verwendet.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als fluoreszierenden Farbstoff 3-/^-Dimethylaminopropyl-2-p-dimethylaminostyryl-oc-naphthothiazoliumjodid verwendet.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als fluoreszierenden Farbstoff 3-/^Dimethylaminopropyl-2-p-dimethylaminostyrylbenzoselenazoliumjodid verwendet.
  9. 9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als fluoreszierenden Farbstoff 3-J^-Dimethylaminopropyl-5-methyl-2-p-dimethylarainostyrylbenzothiazoliumjodid verwendet.
  10. 10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als fluoreszierenden Farbstoff I-Z^-Dimethylaminopropyl-4-p-dimethylaminostyrylpyridiniumjodid verwendet.
  11. 11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als fluoreszierenden Farbstoff i-Methyl-2-dimethylamino-4-p-dimethylaminostyrylpyridiniumjodid verwendet.
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