CN105628466A - 玉米茎秆Micro-CT扫描样品及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及玉米茎秆Micro-CT扫描的样品制备方法，所述方法经过固定、脱水、干燥相关流程，既保证材料不发生形变，又实现样品脱水干燥，使样品密度差异增加，成功制备了玉米茎秆样本，Micro-CT扫描后获得茎秆维管束轮廓清晰、明亮，质量高的CT图像。本发明方法获得的CT扫描图像，可直接用于维管束三维重建获得维管束的几何信息和结构信息，对实现玉米维管束多尺度几何模型及水分运输动力学模型的构建具有重要意义。

Description

玉米茎秆Micro-CT扫描样品及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及玉米茎秆Micro-CT扫描样品及其制备方法。

背景技术

玉米是近年来中国主要粮食作物中面积和产量增加最快的作物，在中国农业生产中占有重要地位。据中国国家统计局发布的数据显示，2014年中国玉米产量为2.1567亿吨，比上年的2.18亿吨减少1％，原因由于部分玉米产区出现干旱。我国是一个水资源相对贫乏的国家，在玉米生产中，有2/3的玉米面积没有灌溉条件，同时受温室效应、自然灾害的影响，水资源短缺的矛盾越来越突出，玉米受旱成为制约玉米产量的重要因素，给我国的农业生产带来巨大威胁，对我国的作物产量稳定性造成巨大挑战。长期以来，玉米抗旱一直是作物研究的难点和重点。

贯穿禾本科作物整株的维管束系统是其关键的输导组织，维管束散生分布是禾本科作物的共同特点。维管束主要分为韧皮部和木质部，前者包括筛管和伴胞，主要负责溶解状态的同化物运输；后者以导管为主，负责运输水分和无机盐类。玉米是维管束系统发达、受维管束差异变化影响较大的作物。已有大量研究表明，源-流-库系统的差异是影响玉米品种生理特点、产量结构和抗性性能的重要因素之一，特别是近些年对“流”的研究日趋得到重视。茎秆维管束是玉米水分、养分运输的重要通道，同时也是植株的支持系统；维管束的表型性状与玉米的生理功能息息相关，决定了一个品种的地域适应性和生物适应性，对玉米的稳产、高产起着重要作用。目前，有关于玉米茎秆解剖结构的研究主要是借助显微与超显微技术获得茎秆某一部位的显微信息，通过人工测量，分析其形态结构与运输能力、抗旱节水之间的关系；所获得的图像均为二维图像，由于二维图像及玉米茎秆非均匀性的影响，利用现有的二维显微图像与计算机软件实现玉米组织结构的体素结构形态、密度、空间分布及维管束连接等分析存在较大困难。因此，研究高质量获取玉米茎秆的CT扫描图像，探究茎秆组织的几何信息和结构信息，建立玉米维管束多尺度几何模型及水分运输动力学模型，不仅对玉米水分利用效率评价、抗旱性品种筛选具有重要意义，还将为提高作物水分利用效率，实现节水农业提供重要的理论依据。

目前为止，未见在玉米茎秆Micro-CT扫描的相关报道。现有技术报道了Micro-CT与同步加速器相结合的方法，实现了蕨类植物、红杉木质部的三维重建与水分运输功能研究，按照现有技术获得玉米茎秆的CT图像需要较高的试验成本，另外玉米茎秆鲜样扫描过程中组织容易失水变形，扫描效果不稳定，无法高质量地获得茎秆组织结构的CT图像及三维信息，因而无法实现玉米维管束多尺度几何模型及水分运输动力学模型的构建。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备玉米茎秆Micro-CT扫描样品的方法。本发明提供的方法，分别对玉米茎秆材料的固定、脱水、干燥条件进行优化，通过优化材料样本体积、优化固定和脱水方案、引入CO₂临界点干燥，制备适用于Micro-CT扫描的茎秆样本，获得玉米茎秆Micro-CT扫描的高质量图像。

本发明所述Micro-CT(microcomputedtomography，微计算机断层扫描技术)，又称微型CT、显微CT。

具体而言，本发明提供了一种制备玉米茎秆Micro-CT扫描样品的方法，包括以下步骤：取新鲜玉米茎秆，切割成厚0.5～2.0cm的样本块，在FAA固定液中固定3天以上，梯度脱水，CO₂临界点干燥，即得。

本发明所述切割时可使用手术刀片，并保证样本材料的完整性，避免材料出现破裂现象。本发明经过反复试验研究发现，样本块厚度为0.5～1.0cm、优选为0.8～1.0cm，经过固定、脱水、干燥后，获得的Micro-CT扫描图像效果最佳，维管束轮廓清晰、明亮，图像质量高。若材料过薄或过厚均会影响后期的CT扫描结果，材料过薄，后期CT扫描图像分辨率较低、图像不清晰；若材料过厚，则难以彻底干燥，导致CT扫描图像中部维管束轮廓不清晰、图像噪点高等问题出现。

本发明所述FAA固定液的配方优选为无水乙醇：甲醛：冰醋酸＝95:5:5。样本在FAA固定液中固定的时间应不少于3d，优选为3～4天。虽然固定时间延长对材料后期CT扫描没有明显影响，但固定时间过短容易导致样品在后期的步骤中发生形变，样本一旦发生形变则难以获得完整的茎秆CT扫描图像。

本发明所述脱水优选为酒精梯度脱水；具体为：30％酒精脱水20min→30％酒精脱水10min→50％酒精脱水20min→50％酒精脱水10min→75％酒精脱水20min→75％酒精脱水10min→85％酒精脱水20min→85％酒精脱水10min→95％酒精脱水20min→95％酒精脱水10min→100％酒精脱水20min。

本发明所述干燥优选为二氧化碳临界点干燥。将100％酒精中的样品转移至二氧化碳临界点干燥仪的样品池中，转移过程中要保证样品始终处于100％酒精的环境中，避免接触空气。

作为本发明的优选方案，所述方法包括以下具体步骤：

(1)取位于第6节节间、穗位节节间或/和顶位节节间新鲜玉米茎秆，蒸馏水冲洗干净，用手术刀沿相同方向切割成厚度0.8～1.0cm的样本块；

(2)按照无水乙醇、甲醛、冰醋酸的体积比为95:5:5配置FAA固定液，将步骤(1)所得样本块放入所述FAA固定液中，固定3～4天；

(3)将样本块从固定液中取出，用蒸馏水冲洗干净，按照以下程序进行酒精梯度脱水：30％酒精，20min→30％酒精，10min→50％酒精，20min→50％酒精，10min→75％酒精，20min→75％酒精，10min→85％酒精，20min→85％酒精，10min→95％酒精，20min→95％酒精，10min→100％酒精，10min→100％酒精保存；

(4)将样本块从100％酒精中取出，在避免接触空气的条件下转移至二氧化碳临界点干燥仪，充分干燥，即可。

本发明所述临界点干燥程序优选为：CO₂进入速度为中速，设置双层滤片，CO₂充入后延迟120s进入循环，交换速率为6，总共进行12个循环，最后，中等速度加热，完成干燥。

本发明还保护所述方法制备得到的样品。

本发明进一步保护所述样品在获取玉米茎秆Micro-CT扫描信息中的应用。

具体而言，将本发明所述方法制备而成的样品，置于参数为2K模式、电压40kV,电流250μA的Micro-CT扫描仪(型号可选用Bruker1712Micro-CT)中进行扫描，即可获得清晰的玉米茎秆图像。

本发明通过探究玉米茎秆Micro-CT扫描的样品制备方法，经过固定、脱水、干燥相关流程，既保证材料不发生形变，又实现样品脱水干燥，使样品密度差异增加，成功制备了玉米茎秆样本，Micro-CT扫描后获得茎秆维管束轮廓清晰、明亮，质量高的CT图像。本发明方法获得的CT扫描图像，可直接用于维管束三维重建获得维管束的几何信息和结构信息，对实现玉米维管束多尺度几何模型及水分运输动力学模型的构建具有重要意义。

附图说明

图1为本发明方法制备的不同玉米茎秆节位样本Micro-CT扫描图像，A是玉米茎秆第6节节间CT扫描图，B是玉米茎秆穗位节节间CT扫描图，C是玉米茎秆顶位节节间CT扫描图。

图2为未经本发明方法处理，将玉米茎秆材料直接进行Micro-CT扫描所获得的图像，A是玉米茎秆第6节节间CT扫描图，B是玉米茎秆穗位节节间CT扫描图，C是玉米茎秆顶位节节间CT扫描图。由于样本含水量大，样本间的密度差异很小，Micro-CT扫描获得的图像噪点比较高、维管束轮廓模糊，图像质量低，无法进行维管束的三维提取。

图3为玉米茎秆材料经过自然干燥不同时间后，进行Micro-CT扫描所获得的图像，A玉米茎秆顶位节节间取样后自然干燥10h，B玉米茎秆顶位节节间取样后自然干燥24h，C玉米茎秆顶位节节间取样后自然干燥5d。茎秆经自然干燥后会发生明显变形，外周维管束形态受到严重影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

取农大178号玉米茎秆，按照以下步骤制备Micro-CT扫描样品：

(1)制备体积大小适中的茎秆样本：农大178茎秆新鲜材料获取后，蒸馏水冲洗干净，用手术刀切割成厚度1.0CM的样本块，切割时用力要均匀，尽量沿一个方向进行切割，保证样本材料的完整性，避免材料出现破裂现象；

(2)FAA样本固定：以无水乙醇：甲醛：冰醋酸＝95:5:5的比例配置FAA固定液，将切割的新鲜样本块用纱布包好，系好标签，放入FAA固定液中固定，固定时间3d；

(3)样本脱水：样本固定完成后，从固定液中取出，用蒸馏水冲洗干净，经一系列梯度浓度的酒精梯度脱水，具体流程为：30％酒精，20min→30％酒精，10min→50％酒精，20min→50％酒精，10min→75％酒精，20min→75％酒精，10min→85％酒精，20min→85％酒精，10min→95％酒精，20min→95％酒精，10min→100％酒精，10min→100％酒精保存；

(4)CO₂临界点干燥：梯度脱水完成后，将100％酒精中的样品转移至临界点干燥仪(LeicaEMCPD300)的样品池中，转移过程中要保证样品始终处于100％酒精的环境中，避免接触空气；

设定临界点干燥仪程序为：CO₂进入速度为中速，设置双层滤片，CO₂充入后延迟120s进入循环，交换速率为6，总共进行12个循环，中等速度加热，完成干燥，即可；所得样本放入超净离心管中密封保存。

将本实施例所得样本经Bruker1712Micro-CT，在2K模式、电压40kV,电流250uA下进行扫描，通过数据重构获得CT扫描图像，结果如图1所示。

由图1可知，实施例1获得的玉米茎秆样本，Micro-CT扫描后获得质量高的CT图像，茎秆形状完整，外周表皮轮廓清晰，未发生形变，中间维管束轮廓清晰、明亮，维管束与基本组织区别十分明显。

本实施例同时设立了对比例1，具体制备方法为：取农大178茎秆相同节位鲜样材料切割成厚度1.0CM的样本块，未经固定、脱水、干燥步骤，经Bruker1712Micro-CT，在2K模式、电压40kV,电流250uA下进行扫描。

结果见图2，由于样本含水量大，样本间的密度差异很小，Micro-CT扫描获得的图像噪点比较高、维管束轮廓与基本组织之间的界限模糊，图像质量低，无法进行维管束的三维提取。

本实施例同时设立了对比例2，具体制备方法为：农大178茎秆相同节位鲜样材料切割成厚度1.0-2.0CM的样本块，平行制备三组样本，在室温下自然干燥，各组样本分别干燥10h、24h、5d，经Bruker1712Micro-CT，在2K模式、电压40kV,电流250uA下进行扫描。

结果见图3，茎秆经自然干燥后会发生明显变形，自然干燥时间越长，形变程度越严重；由于茎秆组织失水，外周表皮发生明显的皱褶，同时导致外周维管束形态受到严重影响。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种制备玉米茎秆Micro-CT扫描样品的方法，其特征在于，包括以下步骤：取新鲜玉米茎秆，切割成厚0.5～2.0cm的样本块，在FAA固定液中固定3天以上，梯度脱水，CO₂临界点干燥，即得。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述玉米茎秆的位置为第6节节间、穗位节节间或/和顶位节节间。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述样本块的厚度为0.8～1.0cm。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的方法，其特征在于，所述FAA固定液的配方为无水乙醇：甲醛：冰醋酸＝95:5:5。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述固定时间为3～4天。

6.根据权利要求1～5任意一项所述的方法，其特征在于，所述脱水为酒精梯度脱水。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述脱水具体为：30％酒精脱水20min→30％酒精脱水10min→50％酒精脱水20min→50％酒精脱水10min→75％酒精脱水20min→75％酒精脱水10min→85％酒精脱水20min→85％酒精脱水10min→95％酒精脱水20min→95％酒精脱水10min→100％酒精脱水20min。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)取位于第6节节间、穗位节节间或/和顶位节节间新鲜玉米茎秆，蒸馏水冲洗干净，用手术刀沿相同方向切割成厚度0.8～1.0cm的样本块；

(2)按照无水乙醇、甲醛、冰醋酸的体积比为95:5:5配置FAA固定液，将步骤(1)所得样本块放入所述FAA固定液中，固定3～4天；

(3)将样本块从固定液中取出，用蒸馏水冲洗干净，按照以下程序进行酒精梯度脱水：30％酒精，20min→30％酒精，10min→50％酒精，20min→50％酒精，10min→75％酒精，20min→75％酒精，10min→85％酒精，20min→85％酒精，10min→95％酒精，20min→95％酒精，10min→100％酒精，10min→100％酒精保存；

(4)将样本块从100％酒精中取出，在避免接触空气的条件下转移至二氧化碳临界点干燥仪，充分干燥，即可。

9.权利要求1～8任意一项所述的方法制备得到的样品。

10.权利要求9所述样品在获取玉米茎秆Micro-CT扫描信息中的应用。