CN103528871A - 芒属植物快速切片染色的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物切片的技术领域，涉及一种植物切片染色的方法，取新鲜的芒属植物茎段3-10cm，经酒精浸泡、适度软化处理、切片、对切下的薄片进行染色、固定、脱色后再次染色后制片用于显微镜观察。本发明方法的软化程度更易把握，不会出现过硬或过软等问题，易于切片的完整性，更利于后期的染色和制片。
Description
技术领域
本发明属于生物切片的技术领域，涉及一种植物切片染色的方法，更具体地说是涉及一种芒属植物快速切片染色并用于镜检的方法。
背景技术
生物质是继煤炭、石油之后，世界第三大能源（Liang，2000），生物质资源储量非常丰富，每年生物质能源为全世界提供了14％的能源，并成为世界上约15亿人口赖以生存的主要能源（KOUFOPANOS，1989）。如今，利用多年生草本植物发展生物质能源产业是可再生能源发展的一个新方向。关于木质纤维素能源植物的研究近年来受到普遍关注，纤维素类原料是地球上最丰富的可再生资源，植物干重的35%～50%是纤维素，20%～35%是半纤维素，还有5%～30%是木质素。全球光合作用产生的植物生物量每年高达1.1×1012t，纤维素原料占全球生物量的60%～80%（袁振宏，2005）。近些年来，全世界正努力利用可生物降解及对环境友好的天然纤维用于非传统用途，这引起了人们对这些纤维新的研究兴趣（Bassam，1998；Venendaal，1997）。例如用油菜、大豆、玉米、甘蔗、甜高粱等作物来生产生物柴油或纤维乙醇，用这样的可再生清洁能源来替代化石燃料（杜风光，2007）。因此通过测定不同植物的木质纤维素含量，可以发掘更多能源植物（孙智谋，2007；永安东，2003）。芒属植物因其高生物产量、强适应性等特点，作为纤维素类能源资源，具有极大的开发潜力。
纤维素是一种直链多糖，水解可得到葡萄糖，再经酵母发酵可得乙醇。半纤维素是戊糖（含木糖、阿拉伯糖）、己糖（含甘露糖、葡萄糖、半乳糖）和糖酸所组成的不均一聚糖，为异质多糖，结构和纤维素不同，水解后产生混合糖。木质素是一种高分子芳香族化合物，不能水解成糖，但可用作燃料。纤维素和半纤维素的降解利用主要受到分子间大量氢键的制约，同时也受到其与木质素间的化学键的影响（谢新明，2008）。目前，国内外很多学者认为，降低木质素含量，提高纤维素含量，这对木质纤维素的降解和转化乙醇非常有利。但木质素含量过低，对植物的生长发育又有影响。而植物中纤维素、半纤维素和木质素形成过程都与维管束的生长与消失过程有明显关联，对维管束的生长情况只有通过制片后经显微镜观察得到。
目前，植物制片前需要进行前处理，将植物材料进行切成便于观察的薄片才行，有两种方法进行：一种为徒手切片法、另一种为石蜡切片法。徒手切片是用手持双面刀片或剃刀，将新鲜材料或预先固定好的材料（切前水洗）切成薄片，不经染色或经简单染色后，用水封片作临时装片观察。徒手切片法的优点是不需要复杂的设备，方法简便，制片迅速，而且能观察到植物组织的自然色泽和活体结构，常用于研究植物解剖结构、细胞组织化学成分，植物资源鉴定等。同时，它具有利于临时观察、能够较快的得到结果的优点。缺点是对于体积过小、太软、太硬的材料则难于切片，而且不能制成连续切片。
而石蜡切片法是最常用的一种制片法。其制作过程是：取材→固定→冲洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→烤片→脱蜡→复水→染色→脱水→透明→封藏。石蜡制片是一个连续的操作过程，往往要连续几天才能完成，容易与其它工作发生冲突，也会因前后顺序颠倒或超过了规定的时间，给科研工作带来不小的损失。制片的各个步骤都是互相关联的，如脱水不彻底就会影响到透明的程度，以至影响蜡块的质量。
本试验运用快速切片法，通过显微镜观察在田间可以观察到不同时期的芒属茎段生长情况，了解芒属植物资源在纤维素、半纤维素和木质素形成过程中维管束的生长与消失过程，可为今后该类植物的遗传育种工作中选择亲本材料提供参考依据，并为大面积推广种植芒属植物，推动其工业化利用奠定一定的基础。
发明内容
本发明的目的就是要提供一种方法简单、成本低、便于快速化镜检，准确率高的快速切片方法，可用于显微镜观察。
本发明采用的技术方案包括：取新鲜的芒属植物茎段3-10cm，经酒精浸泡、适度软化处理、切片、对切下的薄片进行染色、固定、脱色后再次染色后制片用于显微镜观察。
因此，本发明提供芒属植物快速切片染色的方法，其具体步骤包括：
(1)取新鲜的芒属植物茎段3-10cm用70%的乙醇浸泡30秒，加入50-60%丙二酸水溶液进行软化处理30-60min；
(2)将材料取出，用氢氧化钠溶液浸泡5-10min，用蒸馏水冲洗三次，再用带柄手术刀快速切片，得到大量的芒属植物茎段薄片；
(3)对切下的薄片进行用蒸馏水冲洗两次，加入1%番红染色1h；
(4)番红染色后去掉染色液用蒸馏水冲洗一次，依次用30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇分别浸泡10-30秒；
(5)再次用0.5%固绿染色20-60秒，用95%乙醇浸泡30秒，再用100%乙醇浸泡5min；
(6)用乙醇二甲苯溶液浸泡3min，再用100%二甲苯浸泡5min，重复一次，取出薄片用树胶封片，在普通光学显微镜下进行观察维管束的生长情况。
在一个具体实施方案中，步骤(2)所述氢氧化钠溶液是指10-6.5-10-5.5mol/L氢氧化钠水溶液。
在一个具体实施方案中，步骤(6)所述乙醇二甲苯溶液为100%乙醇与100%二甲苯等体积混合制成的。
技术效果：
1、本发明方法中充分考虑到芒属植物在生长过程中存在不同硬度的情况，将不同硬度的材料进行处理，使其硬度完全一致便于快速切片，由于所用设备只需要显微镜，大大地降低了对切片条件要求，便于田间规模化进行镜检不同芒属样品；
2、本切片制片方法操作简单、快速，大大缩短了检测时间，在较短的时间内就可以检测出结果。
3、与常规石蜡切片方法相比，无需要长时间进行制片且也具有很高的准确率和灵敏度，植物细胞不会发生变形，而与徒手切片方法相比，具有更高的准确率和灵敏度，制片时间不长，也很适合野外实验需要。
4、本发明在检测过程中采用丙二酸进行软化，相比其它方法，软化程度更易把握，不会出现过硬或过软等问题，易于切片的完整性，更利于后期的染色和制片。
附图说明
图1：10×10倍显微镜观察图片；
图2：10×10倍显微镜观察图片；
图3：10×10倍显微镜观察图片；
图4：10×10倍显微镜观察图片；
图5：10×10倍显微镜观察图片；
图6：10×10倍显微镜观察图片；
图7：10×4倍显微镜观察图片；
图8：10×10倍显微镜观察图片；
图9：10×10倍显微镜观察图片；
图10：10×10倍显微镜观察图片；
图11：10×10倍显微镜观察图片；
图12：10×10倍显微镜观察图片；
图13：10×10倍显微镜观察图片。
具体实施方式
下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。
实施例1
取新鲜的芒属植物茎段3-10cm用70%的乙醇浸泡30秒，加入55%丙二酸水溶液进行软化处理40min；将材料取出，用10-6mol/L氢氧化钠溶液浸泡8min，用蒸馏水冲洗三次，再用带柄手术刀快速切片，得到大量的芒属植物茎段薄片；对切下的薄片进行用蒸馏水冲洗两次，加入1%番红染色1h；番红染色后去掉染色液用蒸馏水冲洗一次，依次用30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇分别浸泡30秒；再次用0.5%固绿染色60秒，用95%乙醇浸泡30秒，再用100%乙醇浸泡10min；用乙醇二甲苯溶液浸泡3min，再用100%二甲苯浸泡5min，重复一次，取出薄片用树胶封片，在普通光学显微镜下进行观察维管束的生长情况。结果见图1-5。
对照实施例1
取新鲜的芒属植物茎段3-10cm放入1:1过氧化氢和乙酸各半的混合液（或2:1）中，每隔20或30分钟至1小时用镊子取出样品，流水冲洗约10分钟后，用刀片试切，若手感柔软，即可投入水中冲洗一天后切片。也可保存在甘油-乙醇各半的混合液中待用；对切下的薄片进行用蒸馏水冲洗两次，加入1%番红染色1h；番红染色后去掉染色液用蒸馏水冲洗一次，依次用30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇分别浸泡30秒；再次用0.5%固绿染色60秒，用95%乙醇浸泡30秒，再用100%乙醇浸泡10min；用乙醇二甲苯溶液浸泡3min，再用100%二甲苯浸泡5min，重复一次，取出薄片用树胶封片，在普通光学显微镜下进行观察维管束的生长情况，结果见图6-9。
对照实施例2
取新鲜的芒属植物茎段3-10cm用70%、乙醇50%乙醇各浸泡1小时，加入15%氢氟酸水溶液进行软化处理10～15天；将材料取出，用蒸馏水冲洗三次，再用带柄手术刀快速切片，得到大量的芒属植物茎段薄片；对切下的薄片进行用蒸馏水冲洗两次，加入1%番红染色1h；番红染色后去掉染色液用蒸馏水冲洗一次，依次用30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇分别浸泡30秒；再次用0.5%固绿染色60秒，用95%乙醇浸泡30秒，再用100%乙醇浸泡10min；用乙醇二甲苯溶液浸泡3min，再用100%二甲苯浸泡5min，重复一次，取出薄片用树胶封片，在普通光学显微镜下进行观察维管束的生长情况，见图10-13。
Claims (3)
1.本发明提供芒属植物快速切片染色的方法，其具体步骤包括：
(1)取新鲜的芒属植物茎段3-10cm用70%的乙醇浸泡30秒，加入50-60%丙二酸水溶液进行软化处理30-60min；
(2)将材料取出，用氢氧化钠溶液浸泡5-10min，用蒸馏水冲洗三次，再用带柄手术刀快速切片，得到大量的芒属植物茎段薄片；
(3)对切下的薄片进行用蒸馏水冲洗两次，加入1%番红染色1h；
(4)番红染色后去掉染色液用蒸馏水冲洗一次，依次用30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇分别浸泡30秒；
(5)再次用0.5%固绿染色60秒，用95%乙醇浸泡30秒，再用100%乙醇浸泡10min；
(6)用乙醇二甲苯溶液浸泡3min，再用100%二甲苯浸泡5min，重复一次，取出薄片用树胶封片，在普通光学显微镜下进行观察维管束的生长情况。
2.根据权利要求1的方法，步骤(2)所述氢氧化钠溶液是指10-6.5-10-5.5mol/L氢氧化钠水溶液。
3.根据权利要求1的方法，步骤(6)所述乙醇二甲苯溶液为100%乙醇与100%二甲苯等体积混合制成的。
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