CN104458387B - 番红‑固绿对染过程中分色蓝化透明的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种番红‑固绿对染过程中分色蓝化透明的方法，其过程为：(1)将经番红染色后的材料置于含2mL浓HCl的100mL50％乙醇溶液中5s；(2)置于含2mL氨水的100mL 95％乙醇溶液中1s；(3)置于100mL无水乙醇溶液中3s；(4)将2mL固绿染色液滴在材料的上方1s；(5)置于50mL二甲苯+50mL无水乙醇+6mL丁香油的混合液中1s；(6)置于50mL二甲苯+50mL无水乙醇的混合液中30s；(7)置于100mL二甲苯溶液30s；(8)置于100mL二甲苯溶液30s。本方法确定了披碱草属植物石蜡切片法番红‑固绿对染过程中分色、蓝化、固绿复染、清洁、透明的具体时间。

Description

番红-固绿对染过程中分色蓝化透明的方法

技术领域

本发明涉及观察披碱草属植物胚胎发育过程中番红-固绿对染法，特别指适用于披碱草属植物胚胎发育的番红-固绿对染过程中分色蓝化透明的方法。

背景技术

披碱草属(Elymus L.)是小麦族(Triticeae)内种类最多、分布最广的一个属，是分布于北半球寒温带比较古老的野生草种。老芒麦(Elymus sibiricus)是披碱草属模式种，是牛、马、羊均喜食的优等饲用禾草，也是我国北方地区优良的多年生栽培牧草，被广泛用于人工草地建植和天然草地改良，同时作为麦类作物的近缘属，是麦类作物遗传改良的重要优异基因来源。

种子是生产建设优质、高产人工草地和饲草料的遗传物质，也是发展草地畜牧业、治理国土和保护生态环境的物质基础。研究发现，披碱草属植物结实率低的原因是其交配系统为兼性自交，种群开花期较长且不集中，使异花授粉的花粉不充分；柱头不伸出稃片外，稃片张开时间较短而引起花粉落在柱头上的几率变小。通过胚胎发育过程的研究可有效了解种子形成的过程，对提高种子产量的研究具有重要意义。但关于披碱草属植物胚胎发育过程研究的报道较少，石蜡切片法是胚胎学研究中常用的方法，尽管该方法制作过程繁琐、不易操作，但石蜡切片具有连续性，对了解生物器官和细胞的位置或排列具有重要意义。一张染色切片的质量好坏不仅取决于染液的质量、染色时间、染色温度，在很大程度上还取决于染色过程中分色液、蓝化液的性质和类型的选择及分色、蓝化的时间。关于披碱草属植物石蜡切片的过程可参考相关报道，但是针对其分色蓝化透明的具体处理未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种番红-固绿对染过程中分色蓝化透明的方法，这种方法在常规石蜡切片法的基础上，进一步完善番红-固绿对染法在披碱草属植物中的应用，提出了进行番红-固绿对染时分色蓝化透明的具体处理时间，帮助研究人员在显微镜下清晰观察到披碱草属植物胚胎发育的过程。

本发明要解决的技术问题由如下方案来实现：番红-固绿对染过程中分色蓝化透明的方法，其步骤特征在于：

(1)将经番红染色后的材料置于含2mL浓HCl的100mL 50％乙醇溶液中5s；

(2)将经步骤(1)处理的材料置于含2mL氨水的100mL 95％乙醇溶液中1s；

(3)将经步骤(2)处理的材料置于100mL无水乙醇溶液中3s；

(4)将2mL固绿染色液滴在步骤(3)处理的材料的上方1s；

(5)将经步骤(4)处理的材料置于50mL二甲苯+50mL无水乙醇+6mL丁香油的混合液中1s；

(6)将经步骤(5)处理的材料置于50mL二甲苯+50mL无水乙醇的混合液中30s；

(7)将经步骤(6)处理的材料置于100mL二甲苯溶液中30s；

(8)将经步骤(7)处理的材料置于100mL二甲苯溶液中30s。

本发明番红-固绿对染过程中分色蓝化透明的方法至少包括如下优点：

1、确定了披碱草属植物石蜡切片法番红-固绿对染过程中分色的时间；

2、确定了披碱草属植物石蜡切片法番红-固绿对染过程中蓝化的时间；

3、确定了披碱草属植物石蜡切片法番红-固绿对染过程中固绿复染的时间；

4、确定了披碱草属植物石蜡切片法番红-固绿对染过程中清洁与透明时间。

附图说明

图1是本发明老芒麦胚发育过程观察。

图2是本发明老芒麦胚乳发育过程观察。

图1包括六张图片，即A.椭圆形原胚；B.棒状胚；C.分化胚I；D.分化胚II；E.分化胚III；F.成熟胚。

在图片F.成熟胚中，包含有a.盾片；b.胚芽；c.胚芽鞘；d.胚轴；e.胚根；f.胚根鞘；g.外胚叶。

图2包括六张图片，即A.椭圆形原胚时期的胚乳；B.棒状胚时期的胚乳；C.分化胚I时期的胚乳；D.分化胚II时期的胚乳；E.分化胚III时期的胚乳；F.成熟胚时期的胚乳。

在图片B.棒状胚时期的胚乳中，包含有h.角质层；i.种皮；j.糊粉层。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的描述。

如图1至2所示，老芒麦在开花后6d，形成32-细胞椭圆形原胚(如图1-A)。原胚细胞进一步分化，花后7d形成棒状胚，此时胚发育已进入分化胚阶段。棒状胚具有明显的胚柄(如图1-B)。花后8d时，形成一个凹陷，这凹陷为生长点，在生长点的上部开始分化出胚芽鞘的上半部分及盾片，并盾片和胚芽鞘部分开始分离，此阶段称为分化胚I(如图1-C)。花后9d左右，在生长点下部出现一个凹陷，此时盾片和胚芽鞘分离，胚芽鞘将生长点包围，而生长点进一步分化形成第一叶原基，为分化胚II(如图1-D)。花后10d时，第一叶原基下方的凹陷分化为胚根和胚根鞘，此时期为分化胚III(如图1-E)。花后11d已完成胚器官的发育，此时的胚具有盾片、胚芽鞘、胚芽、胚轴、胚根、胚根鞘以及外胚叶(如图1-F)，为成熟胚，此时胚柄完全退化。

虽然胚乳与胚之间没有维管连接，但是胚乳对于胚起着供给营养的作用。在胚生长之前胚乳已经生长，它是消化内部珠心组织生长的。发育的胚又消化胚乳而生长。在老芒麦椭圆形原胚时期(即开花后6d)，其胚乳游离核之间形成细胞壁，基本完成胚乳细胞化。胚乳细胞较大，细胞间有较大的间隙，接近种皮的1～2层细胞比胚乳细胞小(图2-A)。在棒状胚时期(开花后7d)，胚乳细胞变大，种皮外有较厚的角质层，并胚乳最外的1层细胞开始分化为糊粉层，糊粉层细胞体积较小，细胞核较大，细胞排列规则而紧密(图2-B)。从分化胚至成熟胚(开花后8d至11d)，胚乳细胞形状不规则，体积比糊粉层细胞的大，有较大的细胞间隙(图2-C，D，E，F)。

1.市售石蜡清洁法

将用于包埋的56-58℃熔点的石蜡放入干净的烧杯中加热至冒白烟，除去水分和挥发杂质，稍冷却后用4层纱布过滤至另一烧杯中备用。

2.制片步骤

(1)取材：以老芒麦为研究对象，在盛花期，标记同时开花的穗，并从开花第一天开始每天取一个穗，刨开颖，取出雌蕊，切下柱头，放入F.A.A固定液(50％乙醇配制)中保存。

(2)脱水：完全除去材料中的水分，便于透明剂透入材料。最常用的脱水剂为乙醇。由于F.A.A固定液用50％乙醇配制的，应从50％乙醇开始脱水。

固定液处理至少1.5h后→50％乙醇(1.5h)→50％乙醇(1h)→70％乙醇(1h)→85％乙醇(1.5h)→95％乙醇(挑入少量番红染色，以便包埋时辨认，1h)→100％乙醇(1h)→100％乙醇1h。

(3)透明：目的是取代脱水剂，便于包埋剂石蜡浸入；增加材料折光度，便于镜检。二甲苯为应用最广的一种透明剂。步骤如下：

①10mL无水乙醇+20mL二甲苯，30min

②10mL无水乙醇+10mL二甲苯，30min

③20mL无水乙醇+10mL二甲苯，1h

④30mL二甲苯，1h

⑤30mL二甲苯，1h

(4)浸蜡：目的为了逐渐以石蜡代替透明剂；切片时避免因挤压而破坏材料。

本实验采用碎蜡法，具体步骤如下：

①将恒温箱温度调至36℃，另一恒温箱调至58℃左右。

②将盛有材料的指管中的二甲苯倒出约一半，用一条硫酸纸将材料隔开，防止石蜡与材料接触，否则会使材料收缩。在硫酸纸的另一面加入50-52℃熔点的碎蜡，放入36℃恒温箱中(从脱水到这一步必须一天内完成)。

③碎蜡在二甲苯作用下融化，不断加蜡，指管内液体要溢出时倒掉一部分，逐步提高石蜡溶解量，使之达饱和。当指管内的液体处于半溶半凝状态时已达到饱和态。这时打开指管塞，放入58℃左右恒温箱中，使二甲苯充分挥发，至少5h以上。

④待二甲苯充分挥发后，将材料移至盛有50-52℃熔点石蜡的小烧杯(即纯蜡I)中放6h；再放入含干净石蜡的纯蜡II中放置6h；最后倒入纯蜡III中6h后开始包埋。

(5)包埋：目的使为石蜡所渗透的材料包埋于能与材料完全溶合的溶剂中(即同熔点的石蜡)，以备切片。

①褶纸船：用硬而不透水的硬纸，根据研究目的决定纸船的大小和材料排队次序。

②迅速倾倒干净而56-58℃熔点的石蜡于纸船内，倒入石蜡后在隔热的玻璃板上轻轻来回挥动，使其底部形成乳白一层，这时要戴口罩，不能对其吹气。

③用在酒精灯上微热的镊子取材料横放于蜡内排队，动作要快，但又不伤及材料。(做纵切时将材料横放于纸船内)

④冷却：对着纸船吹气使纸船上结蜡被，轻轻将纸船移入冷水中，防尘土落入，1小时后取出晾干即可贴切片。

(6)切片

①切片前磨刀。

②对蜡块进行分割、修整，修整好的样品装入已编号的纸袋备用。

③将蜡块固着在小金属盘上，进一步修整呈梯形。

④固定切片刀，调节刀的角度到15°，调节切片厚度，一般为8-12μm，调节刀片与蜡块的距离、蜡块的位置后开始切片。

(7)贴片

梅氏粘片剂的配制：新鲜鸡蛋白25mL，甘油25mL，水杨酸钠少量，配制时取新鲜鸡蛋一个，两端各打破一个小孔，在100mL量筒上待蛋清完全流出后加入甘油和防腐剂，用力摇荡；上浮泡沫，下沉杂质，用4层纱布过滤即可。

①在载玻片上涂粘片剂于其偏右侧，然后用小手指涂抹均匀，不可涂抹太多，多余的应拭去，滴数滴蒸馏水于载玻片上。

②将蜡带置于有水的载玻片上，并在酒精灯上通过2～3次，以不烫手为宜。

③以吸水纸吸取多余的水分，晾干即可进行下一步。

(8)染色

番红染剂配制：取5g番红，溶于500mL 50％乙醇中，完全溶解后用4层纱布过滤。

固绿染色液配制：取0.5g固绿溶于25mL无水乙醇中，在过滤中加25mL丁香油轻轻摇匀即可。

将经贴片后的载玻片入100mL二甲苯5min；再入100mL二甲苯1min；入50mL二甲苯+50mL无水乙醇混合溶液中1min；入100mL 95％乙醇溶液中1min；入100mL 70％乙醇1min；入100mL番红染剂24h

分色、蓝化透明时间设计梯度，以选择最佳时间。

①将5个经番红染色后的材料置于含2mL浓HCl的100mL 50％乙醇溶液中，分别处理3s、5s、10s、15s和20s，优选地是5s。

②将4个经步骤①优选时间处理的材料置于含2mL氨水的100mL95％乙醇溶液中，分别处理1s、2s、3s和4s，优选地是1s。

③将4个经步骤②优选时间处理的材料置于100mL无水乙醇溶液中清洗，分别处理5s、10s、15s和20s，结果表明，5s效果较好，于是，又将4个经步骤②优选时间处理的材料置于100mL无水乙醇溶液中清洗，分别处理1s、2s、3s和4s，优选地是3s。

④将2mL固绿染色液滴在4个经步骤③优选时间处理的材料的上方，分别处理为1s、2s、3s和4s，优选地是1s。

⑤将4个经步骤④优选时间处理的材料置于50mL二甲苯+50mL无水乙醇+6mL丁香油的混合液中，分别处理1s、2s、3s和4s，优选地是1s。

⑥将5个经步骤⑤优选时间处理的材料置于50mL二甲苯+50mL无水乙醇的混合液中，分别处理15s、30s、45s、60s和75s，优选地是30s。

⑦将5个经步骤⑥优选时间处理的材料置于100mL二甲苯溶液中处理1次，分别处理15s、30s、45s、60s和75s，优选地是30s。

⑧将5个经步骤⑦优选时间处理的材料置于100mL二甲苯溶液中处理1次，分别处理15s、30s、45s、60s和75s，优选地是30s。

整体染色步骤如下：

贴片后的载玻片入100mL二甲苯

↓(5min)

100mL二甲苯

↓(1min)

50mL二甲苯+50mL乙醇

↓(1min)

100mL 95％乙醇

↓(1min)

100mL 70％乙醇

↓(1min)

100mL番红染剂

↓(24h)

2mL浓HCl的100mL50％乙醇溶液

↓(5s)

2mL氨水的100mL 95％乙醇溶液

↓(1s)

100mL无水乙醇

↓(3s)

2mL固绿染色液

↓(1s)

50mL二甲苯+50mL无水乙醇+6mL丁香油的混合液

↓(1s)

50mL二甲苯+50mL无水乙醇

↓(30s)

100mL二甲苯

↓(30s)

100mL二甲苯

↓(30s)

封片

(9)封片

加拿大树胶用二甲苯配制：10mL二甲苯+20mL树胶，搅匀、置凉、暗处。

①在桌上放一张白纸，将载玻片由二甲苯中取出后，以清洁布块迅速擦去材料以外的二甲苯，平置纸上，当材料上二甲苯尚未挥发时加1滴树胶于材料上。

②用右手执镊子夹住盖玻片右侧，将它放在树胶的左边，左手以食指抵住盖玻片的左边，右手将镊子逐渐下降，待盖玻片接触树胶后再慢慢抽出镊子，这时树胶就均匀布满盖玻片，材料同时被覆盖。如果胶量过少，盖片速度太快，就会在盖玻片下留有气泡，影响效果，可将封片后的载玻片置于酒精灯火焰上来回摆动2-3次，以除去气泡。将封片后的载玻片放在实验室实验台上晾干。

(10)镜检

使用4倍显微镜找到所述材料的观察目标范围，然后使用10-40倍显微镜寻找胚胎不同发育时期，拍摄图片。

以上所述的实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细的说明，以上仅为本发明的实施例而已，并不用于限定本发明，凡是在本发明原则之内，所作出的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.番红-固绿对染过程中分色蓝化透明的方法，其步骤特征在于：

(1)将经番红染色后的材料置于含2mL浓HCl的100mL 50％乙醇溶液中5s；

(2)将经步骤(1)处理的材料置于含2mL氨水的100mL 95％乙醇溶液中1s；

(3)将经步骤(2)处理的材料置于100mL无水乙醇溶液中3s；

(4)将2mL固绿染色液滴在步骤(3)处理的材料的上方1s；

(5)将经步骤(4)处理的材料置于50mL二甲苯+50mL无水乙醇+6mL丁香油的混合液中1s；

(6)将经步骤(5)处理的材料置于50mL二甲苯+50mL无水乙醇的混合液中30s；

(7)将经步骤(6)处理的材料置于100mL二甲苯溶液中30s；

(8)将经步骤(7)处理的材料置于100mL二甲苯溶液中30s。