CN104964865A

CN104964865A - 一种病叶的切片棉兰染色方法

Info

Publication number: CN104964865A
Application number: CN201510021839.8A
Authority: CN
Inventors: 周凌云; 曾振; 王沅江; 黄安平; 李维; 刘红艳; 包强
Original assignee: HUNAN TEA INSTITUTE (HUNAN TEA INSPECTION CENTER)
Current assignee: HUNAN TEA INSTITUTE (HUNAN TEA INSPECTION CENTER)
Priority date: 2015-01-16
Filing date: 2015-01-16
Publication date: 2015-10-07

Abstract

本发明属于农作物病害检测及防治技术的领域，具体涉及一种病叶的切片棉兰染色方法,其包括将叶片进行切片；采用脱色液对切片浸泡；将浸泡后的切片置于试管中，向试管中加入乙醇浸泡，然后对试管加热；将深层脱色的切片置于棉兰染色液中进行染色，然后清洗切片；将染色清洗后的切片制片。本发明采用徒手切片及98%无水乙醇进行加热脱色，该染色方法可被用于生产实践中叶片中真菌的显微观察，同时可用于田间病害的早期诊断和病叶的监测和鉴定；该染色方法即不引起细胞变形，又具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间，还能防止孢子飞散；加之染液的蓝色能增强反差，使物象更清楚。

Description

一种病叶的切片棉兰染色方法

技术领域

本发明属于农作物病害检测及防治技术的领域，具体涉及一种病叶的切片棉兰染色方法。

背景技术

目前，由植物病原真菌引起的病害约占植物病害的70～80％。一种作物上可发现几种甚至几十种真菌病害。往往很多真菌病害的症状表现相似，而且病原菌在不同阶段表现不同，许多真菌病害在环境条件不适宜时完全不表现病征，一般在寄主生育后期才产生病征，甚至在落叶上形成小黑点。

因此，要在寄主某一特定部位观察形成的定的菌核或孢子，需要建立一种快速、直接观察到叶片中各真菌的形态观察方法，但传统的切片观察往往由于切片要求高，难以得到超薄而且完整的切片，而且容易使真菌与叶片组织混淆。而采用棉兰染色法，菌丝细胞容易收缩变形，孢子容易飞扬，用乳酸石炭酸溶液作为介质，具有不使细胞变形，可杀菌防腐，不易干燥，能保持较长时间等优点。但是棉兰染色往往因为切片过厚或者是叶片过于粗老而使得效果不佳。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供病叶的切片棉兰染色方法，该方法通过深层脱色，使叶片脱色干净彻底，并调制好切片染色的时间，从而实现叶片中真菌观察背景纯净单一、菌结构清晰。

本发明解决上述技术问题采用的技术方案为：一种病叶的切片棉兰染色方法，其包括以下步骤：

（1）切片，将叶片进行切片；

（2）初级脱色，采用脱色液对切片浸泡；

（3）深层脱色，将浸泡后的切片置于试管中，向试管中加入乙醇浸泡，然后对试管加热；

（4）染色，将深层脱色的切片置于棉兰染色液中进行染色，然后清洗切片；

（5）制片，将染色清洗后的切片制片。

作为优选，所述切片过程是在一长条玻璃上固定两条短块玻璃，调节两短玻璃之间的缝隙，再用刀片在缝隙中进行切片。

作为优选，所述切片厚度为20-50μm。

作为优选，采用脱色液浸泡3-5h进行初级脱色。

作为优选，向试管中加入98%的无水乙醇，使切片的1/3-1/2浸泡在无水乙醇中。

作为优选，将装有切片的试管置于玻璃烧瓶中水浴加热, 其中无水乙醇占试管的1/3，在沸腾干燥后继续加酒精水浴2-4次，待切片透明为止。

作为优选，所述棉兰染色液由乳酸、苯酚、甘油、蒸馏水和苯胺蓝组成，乳酸（mL）∶苯酚（g）∶甘油（mL）∶蒸馏水（mL）∶甲基兰（mg） =10∶10∶20∶10∶25。

作为优选，将深层脱色的叶片放置于所述棉兰染色液中20-30s后用无菌水进行清洗。

作为优选，采用50%的甘油进行制片。

本发明采用徒手切片及98%无水乙醇进行加热脱色，该染色方法可被用于生产实践中叶片中真菌的显微观察，同时可用于田间病害的早期诊断和病叶的监测和鉴定；该染色方法即不引起细胞变形，又具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间，还能防止孢子飞散；加之染液的蓝色能增强反差，使物象更清楚，为叶片病害的防治及病害玻片标本的制作提供可靠的技术和理论依据。

附图说明

图1是茶白星病菌切片染色观察病菌的子囊繁殖体（10×40）图。

图2是茶白星病菌切片染色观察病菌的分生孢子（10×40）图。

图3是茶白星病菌切片染色观察病菌的子囊孢子（10×40）图。

图4是茶白星病病症图。

图5是茶白星病菌回接显症棉兰染色病症显微成像（10×20）图。

图6是茶白星病菌回接显症棉兰染色病症显微成像（10×40）图。

图7是茶炭疽病分生孢子图。

图8是茶炭疽病菌回接显症棉兰染色病症显微成像（10×20）图。

图9是茶炭疽病菌回接显症棉兰染色病症显微成像（10×40）图。

具体实施方式

下面结合实施例详细介绍本发明的切片染色的方法，其包括以下步骤：

切片，切片过程是在一长条玻璃上固定两条短块玻璃，调节两短玻璃之间的缝隙，再用刀片在缝隙中进行切片，相对徒手切片，叶片更为固定，切片的厚度可以较薄，而且匀称，同时其预留缝隙可控，也有利于样品在玻片之间的转移；所述切片厚度为20-50μm，不仅可以实现切片呈单层细胞或少数几层细胞，观察到叶片中较为完整的真菌形态特征，而且所做的切片更加完整。

初级脱色，采用脱色液浸泡3-5h进行初级脱色, 是为了降低茶叶的绿色,获得浅绿色的切片；脱色液由乳酸、苯酚、甘油和蒸馏水组成，乳酸（mL）∶苯酚（g）∶甘油（mL）∶蒸馏水（mL）=15∶15∶15∶15。

深层脱色，将浸泡后的切片置于试管中，向试管中加入98%的无水乙醇，使切片的1/3-1/2浸泡在无水乙醇中；将装有切片的试管置于玻璃烧瓶中水浴加热, 其中无水乙醇占试管的1/3，在沸腾干燥后继续加酒精水浴2-4次，待切片透明为止。酒精是一种良好的有机溶剂，根据相似相融的原理，可以将物质上的有机分子溶解除去，在高温下实现快速脱色。

染色，将深层脱色的叶片放置于所述棉兰染色液中20-30s后用无菌水进行清洗，其中棉兰染色液由乳酸、苯酚、甘油、蒸馏水和甲基兰组成，乳酸（mL）∶苯酚（g）∶甘油（mL）∶蒸馏水（mL）∶甲基兰（mg） =20∶20∶40∶20∶50。其中苯酚可以起到杀菌的作用，乳酸甘油是用来保水的，棉兰可以使得真菌得以染成蓝色。从而在显微镜中观察到真菌菌丝、孢子或产孢器染色后为深蓝色,，寄主组织脱色彻底,而且几乎不着色,菌体与背景反差大,便于区分其周围相似的植物组织，轻松进行叶片中原本病菌或回接后菌体的观察。

制片，将染色清洗后的切片采用50%的甘油进行制片，并采用保鲜膜进行载玻片及盖玻片的清洗。

实施例1 1、样品采集 2014年3月22日，湖南省石门采集茶白星病叶，去离子水冲洗叶片，-80℃保存备用。

2、切片观察

将叶片进行切片，切片厚度约20μm，再采用15mL乳酸、15g苯酚、15mL甘油和15mL蒸馏水组成的脱色液对切片浸泡；然后将浸泡后的切片置于试管中，向试管中加入98%的无水乙醇，无水乙醇占试管的1/3，使切片的1/3-1/2浸泡在无水乙醇中；再将试管置于玻璃烧瓶中水浴加热, 在沸腾干燥后继续加酒精水浴2次，待切片透明为止；接着将切片置于由20 mL乳酸、20g苯酚、40 mL甘油、20 mL蒸馏水和50mg甲基兰组成的棉兰染色液中进行染色，20s后用无菌水进行清洗，再切片；最后将染色清洗后的切片制片，通过观察发现了病原菌的产孢器及其中的孢子。见图1、图2、图3。

实施例2 1、样品采集 2014年6月10日。将茶白星病菌回接叶片发病显症，取病症部位的叶片。

2、切片观察

将叶片进行切片，切片厚度约30μm，再采用15mL乳酸、15g苯酚、15mL甘油和15mL蒸馏水组成的脱色液对切片浸泡；然后将浸泡后的切片置于试管中，向试管中加入98%的无水乙醇，无水乙醇占试管的1/3，使切片的1/3-1/2浸泡在无水乙醇中；再将试管置于玻璃烧瓶中水浴加热, 在沸腾干燥后继续加酒精水浴3次，待切片透明为止；接着将切片置于由20 mL乳酸、20g苯酚、40 mL甘油、20 mL蒸馏水和50mg甲基兰组成的棉兰染色液中进行染色，25s后用无菌水进行清洗，再切片；最后将染色清洗后的切片制片，通过观察发现了叶片中蓝色的炭疽病菌丝及孢子。见图4、图5、图6。

实施例3 1、样品采集 2014年6月22日，将茶炭疽病菌回接叶片发病显症，取病症部位的叶片。

2、切片观察

将叶片进行切片，切片厚度约50μm，再采用15mL乳酸、15g苯酚、15mL甘油和15mL蒸馏水组成的脱色液对切片浸泡；然后将浸泡后的切片置于试管中，向试管中加入98%的无水乙醇，无水乙醇占试管的1/3，使切片的1/3-1/2浸泡在无水乙醇中；再将试管置于玻璃烧瓶中水浴加热, 在沸腾干燥后继续加酒精水浴4次，待切片透明为止；接着将切片置于由20 mL乳酸、20g苯酚、40 mL甘油、20 mL蒸馏水和50mg甲基兰组成的棉兰染色液中进行染色，30s后用无菌水进行清洗，再切片；最后将染色清洗后的切片制片，在显微镜观察可以看到回接菌落的叶片中出现了茶炭疽病菌的孢子。见图7、图8、图9。

上述实施方式仅供说明本发明之用，而并非是对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明精神和范围的情况下，还可以作出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也应属于本发明的范畴。

Claims

1.一种病叶的切片棉兰染色方法，其包括以下步骤：

（1）切片，将叶片进行切片；

（2）初级脱色，采用脱色液对切片浸泡；

（5）制片，将染色清洗后的切片制片。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述切片过程是在一长条玻璃上固定两条短块玻璃，调节两短玻璃之间的缝隙，再用刀片在缝隙中进行切片。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于：所述切片厚度为20-50μm。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：采用脱色液浸泡3-5h进行初级脱色。

5. 根据权利要求1所述方法，其特征在于：向试管中加入98%的无水乙醇，使切片的1/3-1/2浸泡在无水乙醇中。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于：将装有切片的试管置于玻璃烧瓶中水浴加热, 其中无水乙醇占试管的1/3，在沸腾干燥后继续加酒精水浴2-4次，待切片透明为止。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述棉兰染色液由乳酸、苯酚、甘油、蒸馏水和甲基兰组成，乳酸（mL）∶苯酚（g）∶甘油（mL）∶蒸馏水（mL）∶甲基兰（mg） =10∶10∶20∶10∶25。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：将深层脱色的叶片放置于所述棉兰染色液中20-30s后用无菌水进行清洗。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：采用50%的甘油进行制片。