KR100522352B1 - 자궁경부 액상세포 수기 검사방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 액상세포 슬라이드에서 발생하는 불량률을 극소화 하면서 판독에 중요한 요소인 핵염색질의 미세한 구조의 관찰미흡을 해소하여 검사결과의 품질을 높이고, 검사원가 절감에 기여할 수 있도록 한 자궁경부 액상세포 수기 검사방법에 관한 것으로서,
자체구입한 검체 재취용 브러쉬를 이용하여 자궁경부에서 검체를 채취하고, 검체가 채취된 브러쉬는 보존제에 수용하는 단계와; 검체가 수용된 보존제 용기를 흔들거나 테이블에 두드려서 세포를 보존제 내에 부유시키는 단계와; 멀티피펫을 사용하여 15㎖ 원심분리관에 20％ 설탕 4㎖를 분주하고, 혈청분리관을 사용하여 검체 8㎖를 20％ 설탕의 상측에 분주하는 단계와; 분주된 상태에서 1000rpm에서 2분간 원심분리하는 단계와; 흡입기를 이용하여 상층액 8㎖를 흡입하여 버리는 단계와; 나머지 4㎖를 2000rpm에서 10분간 원심분리하여 원심분리관 바닥에 침사물을 형성시키는 단계와; 상층액 모두를 버리는 단계와; 원심분리관 바닥에 형성된 침사물위에 6㎖의 완충액을 분주하여 세포부유액을 형성시킨 다음, 10분간 방치한 후 다시 2000rpm에 10분간 원심분리하여 바닥에 침사물을 형성시키는 단계와; 피펫을 사용하여 1000㎕의 완충액을 원심분리관에 분주한 뒤 반복적인 피펫동작으로 침사물을 원심분리관 바닥으로 부터 탈락시키는 단계와; 피펫을 사용하여 1.5㎝ 직경의 원형 검체분주틀에 부착된 슬라이드 위에 세포 부유액 400㎕를 적하하고, 완충액 600㎕를 추가로 적하하는 단계와; 적하된 상태로 15분간 방치한 후 완충액 2회와, 알코올에 3회 세척한 후 95％ 에틸 알코올에 슬라디드 고정하는 단계와; 상기 액상세포 슬라이드를 기존의 팝 스미어 슬라이드를 염색하는 데 사용하는 염색시약을 사용하여 팝 스테인한 후 검경하는 단계로 이루어지는 것이 특징이다.
Description
본 발명은 자궁경부 액상세포 수기 검사방법에 관한 것으로서 더욱 상세하게는 수기적 방법으로 액상세포 검사 슬라이드를 제작하여 검사의 질을 높이면서 검사원가를 절감할 수 있도록 한 수기 검사방법의 제공에 관한 것이다.
현재 일반적으로 사용되고 있는 액상세포 검사방법으로는 모노프렙(Mono Prep)과 신프렙(Thin Prep), 슈어패스(Sure Path)등이 있으며, 이러한 방법들의 경우에는 적혈구, 백혈구 등 관찰대상 이외의 불필요한 세포를 제거하고 관찰대상의 상피세포를 선택적으로 수거할 수 있도록 하는 데 목적이 있다.
이중 가장 현재 가장 많이 사용되는 방법이 슈어패스(Sure Path)검사방법이며, 슈어패스 세포분리시약(Sure Path Density reagent;다당류)를 사용하며, 상대적으로 비중이 높은 상피세포를 원심분리를 통하여 선택적으로 분리 수거하는 방법이다.
상기와 같은 슈어패스(Sure Path)검사방법을 살펴보면,
1단계, 산부인과에서 제공된 브러쉬를 사용하여 자궁경부에서 검체를 채취하고 자궁경부 세포가 부착되어 있는 브러쉬를 미리 제공된 10㎖의 보존제에 담근다.
2단계, 진동틀(Vortex)을 이용하여 검체를 브러쉬로 부터 탈락시키고 세포를 슈어패스키트(Sure Path Kit)보존재 내에 부유시킨다.
3단계, 멀티 피펫(Multi-Pipette)을 사용하여 15㎖ 원심분리관에 세포분리시약(Sure Path Density Reagent) 4㎖를 분주하고, 슈어패스(Sure Path)전용 장비를 사용하여 보존제 용기로부터 8㎖의 검체를 채취하여 슈어패스 세포분리시약(Sure Path Density Reagent)의 상층에 분주한다.
4단계, 1000rpm 에 2분간 원심분리를 수행하고, 이 때 비중이 높은 상피세포(Exocervical Squamous Cells; 자궁외경부 편평상피 세포, Endocervical Columner Cells; 자궁경관 원주상피세포)는 슈어패스 세포분리시약(Sure Path Density Reagent)층에 부유하거나 원심분리관 바닥에 침전한다.
반면에 상대적으로 비중이 낮은 적혈구, 백혈구, 점액 등은 검체와 슈어패스 세포분리시약(Sure Path Density Reagent)상부 경계층에 위치하게 된다.
5단계, 흡입기를 이용하여 상측액 8㎖를 흡입하여 버린다.
6단계, 나머지 4㎖를 다시 2000rpm에 10분간 원심분리시킨 후 원심분리관 바닥에 침사물(Cell Pellet)을 형성시킨다.
7단계, 상측액을 모두 버린다.
8단계, 진동틀(Vortex)을 이용하여 원심분리관 바닥에 형성된 침사물(Cell Pellet)을 원심분리관 바닥으로 부터 탈락시킨다.
9단계, 슈어패스(Sure Path)전용장비를 사용하여 침사물(Cell Pellet)에 1000㎖의 완충액을 넣어 세포를 부유시킨 후, 1.3㎝직경의 원형 검체분주틀이 부착된 슬라이드 위에 슈어패스(Sure Path)전용 장비를 사용하여 세포부유액 200㎕를 600㎕dml 완충액(Tris Buffer)과 함께 적하한다.
이때, 상대적으로 비중이 높은 상피세포가 제일먼저 슬라이드 표면에 부착하게 되고, 백혈구는 상피세로 사이의 슬라이드 표면에 부착되거나 상피세포 위에 얹혀있게 되고 적혈구는 대게 상층에 부유해 있게된다.
10단계, 이러한 상태로 10분이상 방치한 후 세포 부유액을 흡입하여 버린 후 슈어패스(Sure Path)염색키트로 염색한다.
상기와 같은 종래 방법인 슈어패스(Sure Path)방법의 경우에는 하기와 같은 문제점들이 발생하게 된다.
전용장비를 사용하여 자동화된 방법으로 제작된 액상세포 슬라이드는 상당한 불량률을 보이며, 이 경우에 슬라이드에 부착되는 상피세포의 수가 현격히 감소되는 현성을 보인다.
한편 전용장비를 사용한 자동화 방법에서는 세포가 부착된 슬라이드의 염색을 장비에서 실시하게 되는 데, 장비를 사용한 염색의 경우 세포의 핵염색은 충실하였으나 판독에 중요한 요소인 핵염색질의 미세한 구조의 관찰에 있어서는 미흡한단점을 가진다.
그리고, 전용장비가 검사회수에 비하여 상당한 고가이기 때문에 장비설치에 따르는 비용이 검사비용으로 부담되는 것은 물론, 신뢰도 측면에서도 높지않은 단점을 가진다.
이에 본 발명에서는 상기와 같은 문제점들을 해결하기 위하여 발명한 것으로서 자체 제작한 보존제[24％ 에틸 알코올(Ethyl Alcohol-보존제 1ℓ당 900㎖), 100％ 메틸 알코올(Methyl Alcohol-보존제1ℓ당 50㎖), 이이소프로필 알코올(Isopropyl Alcohol-보존제1ℓ당 50㎖), 소듐 아자이드(Sodium Azide-보존제1ℓ당 2㎎)의 혼합물]와 20％ 설탕(Sucrose) 피펫, 멀티피펫, 원심분리관, 혈청분리관, 원심분리기, 직경 1.5㎝의 원형 검체분주틀, 원형 검주분체틀 고정판을 사용하여 수기적 방법으로 액상세포 검사 슬라이드를 제작하도록 함으로서 검사의 품질저하 없이 검사효율성을 배가시킬 수 있도록 하는 데 목적이 있다.
이하 상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 바람직한 검사방법에 대하여 설명하면 다음과 같다.
1단계, 자체구입한 검체 재취용 브러쉬를 이용하여 자궁경부에서 검체를 채취하고, 검체가 채취된 브러쉬는 자체 제작된 보존제[24％ 에틸 알코올(Ethyl Alcohol-보존제 1ℓ당 900㎖), 100％ 메틸 알코올(Methyl Alcohol-보존제1ℓ당 50㎖), 이이소프로필 알코올(Isopropyl Alcohol-보존제1ℓ당 50㎖), 소듐 아자이드(Sodium Azide-보존제1ℓ당 2㎎)의 혼합물]에 수용한다.
2단계, 검체가 수용된 보존제 용기를 흔들거나 테이블에 두드려서 세포를 보존제 내에 부유시킨다.
3단계, 멀티 피펫(Muilt-Pipette)을 사용하여 15㎖ 원심분리관에 20％ 설탕(Sucrose)4㎖를 분주하고, 혈청분리관을 사용하여 검체 8㎖를 20％ 설탕(Sucrose)의 상층에 분주한다.
4단계, 분주된 상태에서 1000rpm에서 2분간 원심분리한다.
5단계, 흡입기를 이용하여 상층액 8㎖를 흡입하여 버린다.
6단계, 나머지 4㎖를 다시 2000rpm에서 10분간 원심분리하여 원심분리관 바닥에 침사물을 형성시킨다.
7단계, 상층액 모두를 버린다.
8단계, 원심분리관 바닥에 형성된 침사물위에 6㎖의 완충액(Tris-Buffer)을 분주하여 세포 부유액을 형성시킨 다음, 10분간 방치 후 다시 2000rpm에 10분간 원심하여 원심분리관 바닥에 침사물을 형성시킨다.
9단계, 피펫을 사용하여 1000㎕의 완충액을 원심분리관에 분주한 뒤 반복적인 피펫동작으로 침사물을 원심분리관 바닥으로 부터 탈락시킨다.
10단계, 피펫을 사용하여 1.5㎝ 직경의 원형 검체분추틀이 부착된 슬라이드 위에 세포 부유액 400㎕를 적하하고, 완충액 1000㎕를 추가로 적하한다.
11단계, 이러한 상태에서 15분간 방치한 후 완충액 2회, 알코올[95％에틸 알코올(Ethyl Alcohol), 100％ 메틸 알코올(Methyl Alcohol), 80％ 이이소프로필 알코올(Isopropyl Alcohol)]혼합물에 3회 세척한 후 95％ 에틸 알코올(Ethyl Alcohol)에 슬라이드 고정한다.
12단계, 상기 액상세포 슬라이드를 염색하는 데 사용하는 통상의 염색시약을 사용하여 팝 스테인(Pap Stain)한 후 검경하여 검사하게 된다.
세포 혹은 세포성분의 크기에 따른 분리를 위한 분리시약으로 포도당, 설탕(Sucrose), 피콜(Ficol), 퍼콜(Perocol), 니코덴즈(Nycodenz)등을 사용할 수 있으며, 그 중에서도 설탕과 글리세롤(Glycerol)이 크기에 따른 세포분리에 흔히 사용되고 있으며, 적합한 세포 분리시약의 요건은 세포손상의 최소화, 등장액, 낮은 점도 등을 들 수 있다.
상기와 같은 본 발명의 검사방법으로 검사함에 있어서,
1) 세포 분리시약의 비중차이를 이용한 세포 분리력과 슬라이드에 부착되는 상피세포 수를 표 1을 통하여 비교하여 보면,
| Gradient Media | 상피세포 수 | 염증세포 수 | 원주상피 세포 | |
| 포도당(Dextrose) | 10％ | +++ | +++ | + |
| 20％ | ++ | ++ | + | |
| 50％ | + | + | + | |
| 혈장대용품(Dextran) | 25％ | ++ | ++ | + |
| 50％ | + | + | + | |
| 설탕(Sucrose) | 5％ | ++++ | ++++ | + |
| 10％ | ++++ | ++++ | + | |
| 20％ | +++ | ++ | + | |
| 30％ | ++ | ++ | + | |
| 40％ | + | + | + | |
| Sure Path Gradient Media | +++ | +++ | + | |
(비고)
+; 상피세포 수 10,000/slide 이하, 염증세포 수 100/slide 이하
++; 상피세포 수 10,000-13,000/slide, 염증세포 수 100-1,000/slide
+++; 상피세포 수 13,000-16,000/slide, 염증세포 수 1,000-5,000/slide
++++; 상피세포 수 16,000/slide 이상, 염증세포 수 5,000/slide 이상.
표 1에서와 같이,
첫째, 포도당 10％ 가 슈어패스 세포분리시약(Sure Path Density Reagent)와 동일한 세포 분리력을 보였으며, 슬라이드에 부착된 상피세포 수와 염증세포 수가 슈어패스 세포분리시약을 사용하여 제작된 슬라이드와 동일하였다.
또한 20％와 50％의 포도당을 사용하여 제작된 슬라이드에서는 상피세포 수와 염증세포 수가 감소하였다.
두번째, 25％ 덱스트란(Dextran)과 50％ 덱스트란을 사용하여 제작된 슬라이드에서는 슈어패스 세포분리시약을 사용하여 제작된 슬라이드와 비교하여볼 때 상피세포 수와 염증세포 수가 모두 감소하였다.
세번째, 20％ 설탕을 사용하여 제작된 슬라이드에서 슈어패스 세포분리시약을 사용하여 제작된 슬라이드와 비교하여볼 때 염증세포 수가 감소하였으며, 상피세포 수는 양쪽 모두 동일하였다.
5％, 10％ 설탕을 사용하여 제작된 슬라이드에서는 슈어패스 세포분리시약(Sure Path Density Reagent)을 사용하여 제작된 슬라이드보다 상피세포 수와 염증세포 수가 다소 증가하였다.
30％와 40％ 설탕(Sucrose)을 사용하여 제작된 슬라이드에서는 슈어패스 세포분리시약(Sure Path Density Reagent)을 사용하여 제작된 슬라이드보다 상피세포 수와 염증세포 수가 모두 감소 하였다.
네번째, 자궁경관 원주상피세포의 유무는 서로 다른 세포 분리시약의 모든 슬라이드에서 차이는 없었다.
다섯번째, 각각의 세포 분리시약을 사용하여 제작된 전체 슬라이드 상에 적혈구는 없었다.
여섯번째, 수기적 슬라이드 제작방법에서 세포수축 등의 부적절한 상피세포 변화는 관찰할 수 없었다.
액상세포검사의 관찰 대상인 상피세포를 염증세포, 적혈구 등 관찰대상 세포가 아닌 다른 세포와 분리하기 위하여 세포 분리시약으로 20％설탕을 사용하였을 때 가장 좋은 세포 분리력을 보였다.
2) 염색상태의 비교
슈어패스키트(Sure Path Kit) 염색시약과 자동화 장비를 사용한 염색약 슬라이드와 수기적 방법으로 팝 스테인(Pap Stain)한 슬라이드를 비교한 결과,
자동화 장비를 사용하여 염색한 경우에는 핵 염색은 충실하였으나, 미세한 핵염색질(Chromatin Pattern)의 소견은 수기적 방법으로 팝 스테인(Pap Stain)한 슬라이드 보다 미흡하였다.
세포질 염색은 검체에 따라 다양하였으나 자동화 장비를 사용하여 염색한 슬라이드에서 대부분의 상피세포(90％)가 라이트 그린(Wright Green) 색조를 나타내어 세포관찰에 있어 색조대비가 미흡하였다.
3) 슈어패스 키트(Sure Path Kit)보존제와 본 발명의 보존제의 비교
본 발명의 보존제를 사용하였을 때 슈어패스 키트 보존제를 사용한 경우와 비교하여 자궁경부 검체의 고정상태, 슬라이드 표면에 부착된 상피세포의 수, 상피세포의 염색상태는 차이가 없었다.
4) 슈어패스(Sure Path)의 분주장비를 이용한 분부방법과 피펫을 이용한 수기적 분주방법의 비교,
세포 부유액을 슬라이드 위 원형 검체분주틀에 적하하는 단계에서 1000㎕의 완충액(Tris-Buffer)으로 세포 부유액을 형성시키고, 그 세포 부유액 200㎖를 600㎖의 완충액과 함께 적하하면 분주장비를 이용하지 않고 피펫완충액을 이용한 수기적 분주방법을 사용하면서 슬라이드에 적하하는 세포 부유액의 양을 늘리거나 완충액의 희석배수를 줄일 때 슬라이드 위에 부착된 상피세포 수의 증가를 관찰할 수 있었다.
1000rpm으로 2분 원심분리 하였을 경우 염증세포와 적혈구는 검체와 세포 분리시약의 경계부위 혹은 그 상측에 주로 위치한다고 생각되어 염증세포의 수를 감소시키는 방법으로 5㎖의 세포 분리시약과 8㎖의 검체를 1000rpm으로 2분간 원심분리한 후 9㎖의 상층액을 흡입하여 버리는 방법을 시도한 결과 염증세포 수 감소와 아울러 상피세포 수의 미미한 감소가 있었다.
다당류 성분과 유사하다고 생각되어 시중에 판매되는 "요리당"을 희석하여 세포 분리시약으로 사용하여 본 결과, 포도당(Dextrose) 10％와 슈어패스 세포분리시약(Sure Path Density Reagent)를 사용하여 제작된 슬라이드의 경우와 비교하여 세포분리력과 슬라이드에 부착되는 상피세포 수의 차이는 없었다.
자체 제작한 보존제[24％ 에틸 알코올(Ethyl Alcohol-보존제 1ℓ당 900㎖), 100％ 메틸 알코올(Methyl Alcohol-보존제1ℓ당 50㎖), 이이소프로필 알코올(Isopropyl Alcohol-보존제1ℓ당 50㎖), 소듐 아자이드(Sodium Azide-보존제1ℓ당 2㎎)의 혼합물]를 사용하고, 항박테리아(Bacteriostatic)시약인 소듐 아자이드(Sodium Azide)는 보존제 용액에 미생물이 번식하는 것을 방지하기 위하여 사용하였고, 메틸 알코올(Methyl Alcohol)과 이이소프로필 알코올(Isopropyl Alcohol)은 상피세포의 슬라이드 부착력과 세포고정을 증가시키기 위하여 첨가하였다.
락토바실라이(Lactobacill), 코코바실라이(Coccobacilli), 칸디다(Candida), 트리코모나스(Trichomonas)등으로 인하여 상피세포 변성이 심하여 대부분의 상피세포가 슬라이드 표면에서 탈락되는 현상을 보이는 경우에는 잔여 세포 부유액을 6㎖의 완충액(Tris-Buffer)으로 세척한 후 다시 2000rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 버리고 세포 부유액을 슬라이드 위에 적하함으로서 수세 단계에서 상피세포가 슬라이드 표면에서 탈락되는 현상을 방지하였다.
완충액(Tris-Buffer)에 의한 적정 산도(pH)와 적정 삼투압이 회복되면서 상피세포가 슬라이드 표면에서 탈락되는 현상을 막을 수 있었다.
이상과 같은 본 발명은,
1) 완충용액에 세포 침사물을 일정시간 방치하여 상피세포가 적정 산도와 적정 삼투압을 회복하도록 하여 전용장비를 사용하여 자동화된 방법으로 제작된 액상세포 슬라이드에서와 같이 발생하는 불량률을 극소화 할 수 있다.
2) 슬라이드를 팝 스테인(Pap Stain)함으로서 전용장비를 사용함으로서 판독에 중요한 요소인 핵염색질의 미세한 구조의 관찰미흡을 해소하면서 검사결과의 품질을 높일 수 있게된다.
3) 일일 평균 소수의 자궁경부 액상세포 검사를 실시하는 검사실에서 고가의 장비 또는 소모성 기구를 구입하지 않고 간편하게 수기적 방법으로 액상세포 슬라이드를 제작함으로서 검사원가를 대폭 절감할 수 있는 장점을 가진다.
Claims (1)
- 자궁경부 액상세포를 검사함에 있어서;자궁경부에서 채취된 검체를 보존제[24％ 에틸 알코올(Ethyl Alcohol-보존제 1ℓ당 900㎖), 100％ 메틸 알코올(Methyl Alcohol-보존제1ℓ당 50㎖), 이이소프로필 알코올(Isopropyl Alcohol-보존제1ℓ당 50㎖), 소듐 아자이드(Sodium Azide-보존제1ℓ당 2㎎)의 혼합물]에 수용하는 단계와;검체가 수용된 보존제 용기를 흔들거나 테이블에 두드려서 세포를 보존제 내에 부유시키는 단계와;멀티피펫을 사용하여 15㎖ 원심분리관에 20％ 설탕 4㎖를 분주하고, 혈청분리관을 사용하여 검체 8㎖를 20％ 설탕(Sucrose)의 상측에 분주하는 단계와;분주된 상태에서 1000rpm에서 2분간 원심분리하는 단계와;흡입기를 이용하여 상층액 8㎖를 흡입하여 버리는 단계와;나머지 4㎖를 2000rpm에서 10분간 원심분리하여 원심분리관 바닥에 침사물을 형성시키는 단계와;상층액 모두를 버리는 단계와;원심분리관 바닥에 형성된 침사물위에 6㎖의 완충액을 분주하여 세포부유액을 형성시킨 다음, 10분간 방치한 후 다시 2000rpm에 10분간 원심분리하여 바닥에 침사물을 형성시키는 단계와;피펫을 사용하여 1000㎕의 완충액(Tris-Buffer)을 원심분리관에 분주한 뒤 반복적인 피펫동작으로 침사물을 원심분리관 바닥으로 부터 탈락시키는 단계와;피펫을 사용하여 1.5㎝ 직경의 원형 검체분주틀에 부착된 슬라이드 위에 세포 부유액 400㎕를 적하하고, 완충액 600㎕를 추가로 적하하는 단계와;적하된 상태로 15분간 방치한 후 완충액 2회와, 알코올[95％ 에틸 알코올(Ethyl Alcohol), 100％ 메틸 알코올(Methyl Alcohol), 80％ 이이소프로필 알코올(Isopropyl Alcohol)]혼합물에 3회 세척한 후 95％ 에틸 알코올(Ethyl Alcohol)에 슬라이드 고정하는 단계와;상기 액상세포 슬라이드를 염색하는 데 사용하는 통상의 염색시약을 사용하여 팝 스테인(Pap Stain)한 후 검경하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 자궁경부 액상세포 수기 검사방법.
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