KR102332433B1 - 조직 염색용 조성물 및 이를 이용한 조직 염색 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조직 염색용 조성물 및 이를 이용한 조직 염색 방법에 관한 것으로, 기존의 헤마톡실린과 에오신 염색 시약으로 두 단계를 거쳐 시행하던 염색을 한 단계로 단축시키면서 시약 절감 효과와 함께 염색시간의 단축으로 빠른 진단을 제공할 수 있다.

Description

조직 염색용 조성물 및 이를 이용한 조직 염색 방법 {Tissue Dyeing Composition and Tissue Dyeing Method Using the Same}

본 발명은 조직 염색용 조성물 및 이를 이용한 조직 염색 방법에 관한 것으로, 기존의 헤마톡실린과 에오신 염색 시약으로 두 단계를 거쳐 시행하던 염색을 한 단계로 단축시키면서 시약 절감 효과와 함께 염색시간의 단축으로 빠른 진단을 제공할 수 있다.

헤마톡실린과 에오신 (Hemtoxylin & Eosin) 염색법은 조직 표본에서 병리의 시각화를 위해 가장 일반적으로 사용되는 조직학적 기술이다. 통상의 헤마톡실린과 에오신 염색은 알루미늄계 헤마톡실린, 에오신, 분화 용액 및 청색화제를 포함하는 용액으로 구성된다.

헤마톡실린은 알루미늄 이온과 착화될 때 데옥시리보 핵산에 결합하여 세포 핵의 자주색 착색을 생성하는, 양으로 하전된 분자를 생성하는 천연 염료이다. 분화 용액은 전형적으로 조직 및 슬라이드로부터 과도한 배경 염색을 제거함으로써 스테인드 슬라이드의 콘트라스트를 선명하게하는 약산성 용액이다. 염색제는 염색된 표본에 적용될 때 결합된 헤마톡실린의 구조를 변형시켜 생생한 청색/보라색 착색을 생성하는 염기성 pH의 용액이다. 에오신은 세포질 및 결합 조직 내에서 양으로 하전된 단백질에 결합하여 핵의 청색/보라색 색과 대비되는 분홍색/오렌지 색을 생성하는 음으로 하전된 염료이다.

이러한 종래의 헤마톡실린과 에오신을 이용한 염색법은 조직 절편 (예를 들어, 동결절편) 염색에 가장 흔히 사용되고 있는 염색법이며, 헤마톡실린은 DNA와 RNA와 결합하여 핵을 푸르게 보이게 하고, 에오신은 세포질을 구성하는 단백질들과 결합하여 붉은색으로 염색된다. 특히 헤마톡실린이 핵에 염색되어 푸르게 보이는 것은 핵에 직접 헤마톡실린 형태로 결합하는 것이 아니라, 산화된 형태의 헤마테인 (haematein)이 매염제인 알루미늄 (aluminium)염이나 철 (iron)염과 함께 복합체로 핵염색질에 결합되기 때문인 것으로 알려져 있다.

헤마톡실린과 에오신 염색은 가장 흔히 "배치 (batch)"형식으로 수행되는데, 두 단계를 거쳐 시행해야 하는 문제점이 있다. 특히 동결절편검사 시 염색 단계에서 헤마톡실린 단계는 2단계 이상을 거쳐 수행되어 시간적 지연이 발생하는 문제점이 있다. 아울러 헤마톡실린 에오신 염색시약은 고가의 소모 시약으로 재료 비용의 소모가 크다.

본 발명자들은 기존의 헤마톡실린과 에오신 염색 시약으로 두 단계를 거쳐 시행하던 염색을 한 단계로 단축시키면서 시약 절감 효과와 함께 염색시간의 단축으로 빠른 진단을 제공할 수 있는 조성물을 개발하였다.

이에, 본 발명의 목적은 조직 염색용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 조직 염색용 조성물을 이용한 조직 염색 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 조직 염색용 조성물 및 이를 이용한 조직 염색 방법에 관한 것으로, 기존의 헤마톡실린과 에오신 염색 시약으로 두 단계를 거쳐 시행하던 염색을 한 단계로 단축시키면서 시약 절감 효과와 함께 염색시간의 단축으로 빠른 진단을 제공할 수 있다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 예는 헤마톡실린 염색과 에오신 염색을 동시에 수행할 수 있는 조직 염색용 조성물에 관한 것이다.

헤마톡실린 (Hemtoxylin)은 중남미산의 콩과식물 (Haematoxylon compechianum L.)의 부재에서 얻어지는 무색 또는 담황색 결정으로, C₁₆H₄O₆의 분자식을 가지고 있다. 물, 알코올, 글리세린 등에 가용하며, 암모니아, 붕소 등의 알칼리성 용액에 녹아 진홍색이 되고, 산성 용액에서는 황색으로 변한다. 공기 속에 방치하면 적색색소 헤마테인 (hematein) C₁₆H₁₂O₆를 생성하며, 철 이온이 있으면 이 변화가 빠르다. 핵, 염색체, 미토콘드리아 등을 청자색으로 염색하므로 조직 염색법에 사용되며, 알칼로이드의 적정 지시약, 구리 및 철의 시약으로 사용된다.

에오신 (eosin)은 사브로민화 플루오레세인의 나트륨염 C₂₀H₆O₅Na₂Br₄이며, 그 진한 수용액은 적갈색을 띠는데 엷으면 황적색이 되어 녹색 형광을 발한다. 레이크 안료로 사용되는데 견뢰도는 낮다. 일반적으로 붉은색 잉크의 원료, 크레용, 타자기리본, 인쇄 잉크로 사용되고, 또한, 특수연료의 착색제나 분석용 시약으로도 사용된다.

본 발명에 있어서 조직 염색용 조성물은 헤마톡실린 및 에오신을 동시에 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 조직 염색용 조성물에 포함된 헤마톡실린 및 에오신의 부피는 1 내지 5 : 1, 2 내지 5 : 1, 3 내지 5 : 1인 것일 수 있으며, 예를 들어, 5 : 1, 4 : 1, 3 : 1인 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 조직 염색용 조성물은 암모니아 수를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서 암모니아 수의 농도는 0.1 내지 1.0 %(v/v), 0.1 내지 0.9 %(v/v), 0.1 내지 0.8 %(v/v), 0.1 내지 0.7 %(v/v), 0.1 내지 0.6 %(v/v), 0.1 내지 0.5 %(v/v), 0.1 내지 0.4 %(v/v), 0.2 내지 1.0 %(v/v), 0.2 내지 0.9 %(v/v), 0.2 내지 0.8 %(v/v), 0.2 내지 0.7 %(v/v), 0.2 내지 0.6 %(v/v), 0.2 내지 0.5 %(v/v), 0.2 내지 0.4 %(v/v), 0.3 내지 1.0 %(v/v), 0.3 내지 0.9 %(v/v), 0.3 내지 0.8 %(v/v), 0.3 내지 0.7 %(v/v), 0.3 내지 0.6 %(v/v), 0.3 내지 0.5 %(v/v), 0.3 내지 0.4 %(v/v), 예를 들어, 0.3 %(v/v)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 조직 염색용 조성물에 포함된 암모니아 수의 함량은 암모니아수를 제외한 염색 조성물 40.0 mL 당, 0.01 내지 0.05 mL, 0.02 내지 0.05 mL, 0.03 내지 0.05 mL, 예를 들어, 0.04 mL 포함된 것일 수 있다. 본 발명의 다른 일 예는 하기의 단계를 포함하는 헤마톡실린 염색과 에오신 염색을 동시에 수행할 수 있는 조직 염색 방법에 관한 것이다:

시료를 알코올로 고정시키는 조직 고정 단계;

물로 세척하는 제1 세척 단계;

염색용 조성물로 염색하는 이중 염색 단계;

물로 세척하는 제2 세척 단계;

알코올로 탈수하는 탈수 단계;

자일렌으로 투명하는 투명 단계; 및

염색이 완료된 시료를 봉입하는 봉입 단계.

헤마톡실린-에오진 염색은 조직절편에 대한 가장 일반적인 중염색법으로, 병리형태학적 관찰에서 빼놓을 수 없는 기본적인 염색으로서 사용되고 있다. 염색표본에서는 세포핵과 세포질의 구별염색이 좋고 핵은 자청색, 세포질은 담홍색으로 염색되며, 섬유나 세포간질도 담홍색으로 염색된다. 다른 염색법에 비해서 퇴색하지 않고 영구 보존할 수 있어, 모든 병리 조직 표본은 우선 이 염색을 실시해서 조직병변을 파악하고 필요에 따라서 그 특수염색을 병용한다.

기존의 헤마톡실린과 에오신 염색은 배치 (batch)형식으로 수행되는데, 두 단계를 거쳐 시행해야 하는 문제점이 있다. 특히, 동결절편검사 시 염색 단계에서 헤마톡실린 단계는 2단계 이상을 거쳐 수행되어 시간적 지연이 발생하는 문제점이 있다.

반면, 본 발명은 조직 염색용 조성물을 이용한 조직 염색 방법은 기존의 헤마톡실린과 에오신 염색 시약으로 두 단계를 거쳐 시행하던 염색을 한 단계로 단축시키면서 시약 절감 효과와 함께 염색시간의 단축으로 빠른 진단을 제공할 수 있다.

본 발명에 있어서 조직 염색 방법에 사용된 염색용 조성물에 대한 기재는 기 기술한 바와 동일하다.

본 발명에 있어서 조직 고정 단계의 알코올은 에탄올인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 제1 세척 단계는 20 내지 25 ℃에서 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 제1 세척 단계는 10 내지 15 초 간 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 이중 염색 단계는 20 내지 25 ℃에서 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 이중 염색 단계는 15 내지 20 초 간 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 이중 염색 단계는 모든 동결절편용 염색기를 이용하여 수행하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 반-자동 염색기를 이용해 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 제2 세척 단계는 20 내지 25 ℃에서 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 제2 세척 단계는 10초 간 수행하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 탈수 단계의 알코올은 에탄올인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 조직 염색용 조성물 및 이를 이용한 조직 염색 방법에 관한 것으로, 기존의 헤마톡실린과 에오신 염색 시약으로 두 단계를 거쳐 시행하던 염색을 한 단계로 단축시키면서 시약 절감 효과와 함께 염색시간의 단축으로 빠른 진단을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 헤마톡실린과 에오신의 비율이 1:1이고 10초간 염색을 실시한 신장 (kidney) 조직의 관찰 결과를 보여주는 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 헤마톡실린과 에오신의 비율이 2:1이고 10초간 염색을 실시한 위 (stomach) 조직의 관찰 결과를 보여주는 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 헤마톡실린과 에오신의 비율이 1:1이고 20초간 염색을 실시한 위 (stomach) 조직의 관찰 결과를 보여주는 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 헤마톡실린과 에오신의 비율이 3:1이고 10초간 염색을 실시한 위 (stomach) 조직의 관찰 결과를 보여주는 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 헤마톡실린과 에오신의 비율이 3:1.5이고 10초간 염색을 실시한 위 (stomach) 조직의 관찰 결과를 보여주는 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 헤마톡실린과 에오신의 비율이 4:1.5이고 10초간 염색을 실시한 위 (stomach) 조직의 관찰 결과를 보여주는 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 헤마톡실린과 에오신의 비율이 4:1.5이고 20초간 염색을 실시한 위 (stomach) 조직의 관찰 결과를 보여주는 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 헤마톡실린과 에오신의 비율이 5:1이고 10초간 염색을 실시한 위 (stomach) 조직의 관찰 결과를 보여주는 사진이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 헤마톡실린과 에오신의 비율이 5:1이고 20초간 염색을 실시한 위 (stomach) 조직의 관찰 결과를 보여주는 사진이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 헤마톡실린과 에오신의 비율이 4:1이고 10초간 염색을 실시한 폐 림프선 (lung lymph node) 조직의 관찰 결과를 보여주는 사진이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 헤마톡실린과 에오신의 비율이 4:1이고 20초간 염색을 실시한 유방 림프선 (breast lymph node) 조직의 관찰 결과를 보여주는 사진이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 헤마톡실린과 에오신의 비율이 4:1이고 20초간 염색을 실시한 유방 림프선 (breast lymph node) 조직의 관찰 결과를 보여주는 사진이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 헤마톡실린과 에오신의 비율이 4:1이고 20초간 염색을 실시한 유방 림프선 (breast lymph node) 조직의 관찰 결과를 보여주는 사진이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 헤마톡실린과 에오신의 비율이 4:1이고 20초간 염색을 실시한 위 (stomach) 조직의 관찰 결과를 보여주는 사진이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라 헤마톡실린과 에오신의 비율이 4:1이고 20초간 염색을 실시한 유방 (breast) 조직의 관찰 결과를 보여주는 사진이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따라 헤마톡실린과 에오신의 비율이 4:1이고 20초간 염색을 실시한 유방 (breast) 조직의 관찰 결과를 보여주는 사진이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

제조예 1. 염색 조성물의 제조

염색 조성물의 각 시료는 시그마(Sigma)사에서 시판되는 것을 구입하여 사용하였다. 하기 표 1에 기재된 바와 같이, 헤마톡실린과 에오신을 혼합하여 염색 조성물을 제조하였다.

	헤마톡실린	에오신	합계	비율
실시예 1	25 mL	25 mL	50 mL	1:1
실시예 2	40 mL	20 mL	60 mL	2:1
실시예 3	30 mL	10 mL	40 mL	3:1
실시예 4	28 mL	14 mL	42 mL	3:1.5
실시예 5	32 mL	8 mL	40 mL	4:1
실시예 6	32 mL	12 mL	42 mL	4:1.5
실시예 7	35 mL	7 mL	42 mL	5:1

제조예 2. 암모니아수가 첨가된 염색 조성물의 제조

제조예 1에서 제조된 각각의 염색 조성물 40.0 mL 당 0.3 %(v/v) 암모니아수를 0.02 mL 또는 0.04 mL 첨가하여 암모니아수가 첨가된 염색 조성물을 제조하였다.

실험예 1. 혼합 비율 및 염색 시간에 따른 염색 정도 확인

환자에게서 추출한 동결절편 시료를 알코올로 고정 후, 상기 제조예 1의 염색 조성물을 첨가하여, 20 내지 25 ℃에서 반-자동 염색기를 통해 반응시켰다. 그 다음, 20 내지 25 ℃에서 물로 10초 시료를 세척하였다. 그 다음, 100 %(v/v) 에탄올로 탈수를 완전히 시킨 후, 자일렌 (xylene)으로 투명 시킨 다음 봉입하여 세포를 광학현미경에서 관찰하여, 그 결과를 도 1 내지 도 10 및 표 2에 나타내었다.

판독 불가: 염색정도가 매우 좋지 않아 결과 판독이 불가함

좋지 않음: 염색정도가 좋지 않고 결과 판독에도 문제가 있음

보통: 염색정도는 우수하지 않으나 결과 판독 가능

판독 가능: 염색정도가 우수하고 결과판독 가능

좋음: 염색정도가 매우 우수하여 결과판독에 용이함

	10초 1회	20초 1회	10초 2회
실시예 1	판독 불가	-	-
실시예 2	판독 불가	판독 불가	-
실시예 3	좋지 않음	좋지 않음	좋지 않음
실시예 4	좋지 않음	좋지 않음	좋지 않음
실시예 5	보통	판독 가능	판독 가능
실시예 6	좋지 않음	보통	보통
실시예 7	좋지 않음	보통	보통

도 1 내지 도 10 및 표 2에서 확인할 수 있듯이, 4:1 비율에서 혼합한 염색 조성물에서 최적의 염색력을 보였으며 기존 염색의 퀄리티와 비슷한 양상으로 결과를 확인 할 수 있었다.

실험예 2. 암모니아수 첨가에 따른 염색 정도 확인

환자에게서 추출한 동결절편 시료를 알코올로 고정 후, 상기 제조예 2의 염색 조성물을 첨가하여, 20 내지 25 ℃에서 반-자동 염색기를 통해 반응시켰다. 그 다음, 20 내지 25 ℃에서 물로 10초 시료를 세척하였다. 그 다음, 100 %(v/v) 에탄올로 탈수를 완전히 시킨 후, 자일렌 (xylene)으로 투명 시킨 다음 봉입하여 세포를 광학현미경에서 관찰하여, 그 결과를 도 11 내지 도 15 및 표 3에 나타내었다.

	1 드롭 (0.02 ml)	2 드롭 (0.04 ml)
실시예 4	좋지 않음	-
실시예 5	판독 가능	좋음
실시예 6	보통	보통

도 11 내지 도 15 및 표 3에서 확인할 수 있듯이, 0.3 %(v/v) 암모니아수 2 드롭 첨가한 최종 염색 조성물에서 기존 4:1 비율의 조성물보다 염색력의 우수함을 보였으며, 문제가 되었던 시간경과에 따른 침전물 생성을 일부 차단하는 효과가 있음을 확인하였다.

Claims (10)

1. 암모니아 수, 헤마톡실린 및 에오신을 포함하고,
   상기 암모니아 수의 농도는 0.1 내지 1.0 %(v/v)이며,
   상기 암모니아 수의 함량은 암모니아수를 제외한 염색용 조성물 40.0 mL 당 0.03 내지 0.05 mL인 것인, 헤마톡실린 염색과 에오신 염색을 동시에 수행할 수 있는 염색용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 염색용 조성물에 포함된 헤마톡실린과 에오신의 부피비는 3 내지 5 : 1인 것인, 염색용 조성물.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 다음의 단계를 포함하는 헤마톡실린 염색 및 에오신 염색 동시 조직 염색 방법:
   시료를 알코올로 고정시키는 조직 고정 단계;
   물로 세척하는 제1 세척 단계;
   암모니아 수, 헤마톡실린 및 에오신을 포함하고, 상기 암모니아 수의 농도는 0.1 내지 1.0 %(v/v)이며, 상기 암모니아 수의 함량은 암모니아수를 제외한 염색용 조성물 40.0 mL 당 0.03 내지 0.05 mL인 것인, 헤마톡실린 염색과 에오신 염색을 동시에 수행할 수 있는 염색용 조성물로 염색하는 이중 염색 단계;
   물로 세척하는 제2 세척 단계;
   알코올로 탈수하는 탈수 단계;
   자일렌으로 투명하는 투명 단계; 및
   염색이 완료된 시료를 봉입하는 봉입 단계.
7. 제6항에 있어서, 상기 조성물에 포함된 헤마톡실린과 에오신의 부피비는 3 내지 5 : 1인 것인, 헤마톡실린 염색 및 에오신 염색 동시 조직 염색 방법.
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제

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