JP7256069B2 - 生体の酸化ストレスの評価方法 - Google Patents
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特許法第３０条第２項適用 配布日 平成３０年 ８月１０日 刊行物名 第１４回 加齢皮膚医学研究会 プログラム抄録集 発行者名 加齢皮膚医学研究会 集会名 第１４回 加齢皮膚医学研究会 開催日 平成３０年 ８月２６日（開催期間 平成３０年 ８月２５日～２６日）
本発明は、皮膚角層中のＤＪ－１タンパク質を指標とする生体の酸化ストレスの評価方法に関する。
ＤＪ－１タンパク質は、公知の生理活性タンパク質で、神経細胞や皮膚細胞を含む広範なヒト細胞に存在しており、１８９のアミノ酸からなる。ＤＪ－１タンパク質はガン遺伝子産物であり、家族性パーキンソン病と関連があることが知られている（非特許文献１）。
さらに、ＤＪ－１タンパク質は酸化ストレスによる神経細胞死を抑制する効果を有することが知られている。すなわち、酸化ストレスを与える６－ヒドロキシドーパミンを注入されたパーキンソン病モデルラットに、６－ヒドロキシドーパミンの注入と同時又は注入後にＤＪ－１タンパク質を注入すると、ドーパミン神経細胞死が抑制され、行動異常が改善されることが知られている（特許文献１参照）。
特許文献１には、酸化ストレスによる神経細胞死を抑制する効果をＤＪ－１タンパク質が有することが記載されている。そしてＤＪ－１タンパク質に結合し、活性化する化合物を提案している。
さらに、ＤＪ－１タンパク質は酸化ストレスによる神経細胞死を抑制する効果を有することが知られている。すなわち、酸化ストレスを与える６－ヒドロキシドーパミンを注入されたパーキンソン病モデルラットに、６－ヒドロキシドーパミンの注入と同時又は注入後にＤＪ－１タンパク質を注入すると、ドーパミン神経細胞死が抑制され、行動異常が改善されることが知られている（特許文献１参照）。
特許文献１には、酸化ストレスによる神経細胞死を抑制する効果をＤＪ－１タンパク質が有することが記載されている。そしてＤＪ－１タンパク質に結合し、活性化する化合物を提案している。
またＤＪ－１タンパク質は、皮膚の抵抗性に関与していることが知られている。本発明者らは、皮膚角層中のＤＪ－１タンパク質量を測定することによって紫外線に曝露したときの発赤の発生に対する抵抗性の指標とすることができること（特許文献２）、紫外線曝露暦の評価とすることができること（特許文献３）、あるいは発毛状態の評価指標とできること（特許文献４）などを明らかにしている。
ＤＪ－１タンパク質は、酸化型と非酸化型の２タイプが存在し、従来のＤＪ－１タンパク質としては、酸化型と非酸化型の両方を区別せずに使用している場合がある。ＤＪ－１の酸化型は、酸化型を認識するモノクローナル抗体によって測定することが可能である（非特許文献３）。
ＤＪ－１タンパク質は、酸化型と非酸化型の２タイプが存在し、従来のＤＪ－１タンパク質としては、酸化型と非酸化型の両方を区別せずに使用している場合がある。ＤＪ－１の酸化型は、酸化型を認識するモノクローナル抗体によって測定することが可能である（非特許文献３）。
一方、近年酸化ストレスの評価が注目されている。
活性酸素種（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｅｓ：ＲＯＳ）は、生体内においてＤＮＡ、脂質、タンパク質、酵素などの生体高分子と反応し、その結果脂質過酸化、ＤＮＡ変異、タンパク質の変性、酵素の失活をもたらす。酸化ストレスの上昇はこうした分子レベルの生体酸化損傷を増加させ、様々な疾病や老化亢進につながると考えられている。近年、この活性酸素種が老化、がん、糖尿病、高血圧といった生活習慣病をはじめとして数多くの疾病に深く関わっているとともに、活性酸素種自体もシグナル伝達や免疫機構において重要な生理機能を担っていることが明らかにされてきた。生体内の酸化ストレスを正確に評価し、酸化ストレス低減のための対策を施すことは、病態把握、未病診断、病気予防、老化制御に役立つと期待されている。
活性酸素種（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｅｓ：ＲＯＳ）は、生体内においてＤＮＡ、脂質、タンパク質、酵素などの生体高分子と反応し、その結果脂質過酸化、ＤＮＡ変異、タンパク質の変性、酵素の失活をもたらす。酸化ストレスの上昇はこうした分子レベルの生体酸化損傷を増加させ、様々な疾病や老化亢進につながると考えられている。近年、この活性酸素種が老化、がん、糖尿病、高血圧といった生活習慣病をはじめとして数多くの疾病に深く関わっているとともに、活性酸素種自体もシグナル伝達や免疫機構において重要な生理機能を担っていることが明らかにされてきた。生体内の酸化ストレスを正確に評価し、酸化ストレス低減のための対策を施すことは、病態把握、未病診断、病気予防、老化制御に役立つと期待されている。
酸化ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ）の定義は、生体内において酸化力（ｐｒｏ－ｏｘｉｄａｎｔ）が抗酸化力（ａｎｔｉ－ｏｘｉｄａｎｔ）を上回った状態とされている。酸化ストレスを惹き起こす要因は、生体内において発生する活性酸素種に由来する酸化反応である。ＲＯＳは呼吸による酸素消費に伴って発生するほか、炎症反応、放射線や紫外線、喫煙やアスベスト等の化学物質への曝露、激しい運動等により発生する。
一方、生体内には活性酸素種を消去する抗酸化機構が備わっており、活性酸素種による酸化から生体を守っている。活性酸素種の消去機構は抗酸化酵素と、抗酸化物質より構成される。抗酸化酵素としては、例えばスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）やカタラーゼ（ＣＡＴ）等が知られており、それぞれスーパーオキサイド、過酸化水素を消去するほか、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＳＨ－Ｐｘ）のように過酸化脂質（ＬＯＯＨ）を還元する酵素も存在する。抗酸化物質としてはビタミンＣやビタミンＥ、βカロテンといった抗酸化ビタミンのほか、リコピンやアスタキサンチンといったカロテノイド類、カテキンやクルクミンといったポリフェノール類など数多くの種類が知られており、その多くは、食品として摂取される。こうした抗酸化物質は数々の疫学調査によって、健康維持、疾病予防に重要な役割を果たすことが示されている。生体内において上記の抗酸化機構を上回る過剰な活性酸素種が発生すると、酸化ストレスが発生、ＲＯＳによる酸化反応が亢進する。
一方、生体内には活性酸素種を消去する抗酸化機構が備わっており、活性酸素種による酸化から生体を守っている。活性酸素種の消去機構は抗酸化酵素と、抗酸化物質より構成される。抗酸化酵素としては、例えばスーパーオキサイドジスムターゼ（ＳＯＤ）やカタラーゼ（ＣＡＴ）等が知られており、それぞれスーパーオキサイド、過酸化水素を消去するほか、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＳＨ－Ｐｘ）のように過酸化脂質（ＬＯＯＨ）を還元する酵素も存在する。抗酸化物質としてはビタミンＣやビタミンＥ、βカロテンといった抗酸化ビタミンのほか、リコピンやアスタキサンチンといったカロテノイド類、カテキンやクルクミンといったポリフェノール類など数多くの種類が知られており、その多くは、食品として摂取される。こうした抗酸化物質は数々の疫学調査によって、健康維持、疾病予防に重要な役割を果たすことが示されている。生体内において上記の抗酸化機構を上回る過剰な活性酸素種が発生すると、酸化ストレスが発生、ＲＯＳによる酸化反応が亢進する。
８－ｈｙｄｒｏｘｙ－２’－ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ（８－ＯＨｄＧ／８－ｏｘｏ－ｄＧ：以下「８－ＯＨｄＧ」）はＤＮＡを構成する塩基の一つｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ（ｄＧ）の８位がヒドロキシル化された構造を持つＤＮＡ酸化損傷マーカーである。ｄＧはＤＮＡを構成する４種類の塩基のうち最も酸化還元電位が低いため、活性酸素による酸化を受けやすい。このためｄＧの主要な酸化生成物である８－ＯＨｄＧは活性酸素による生体への影響を鋭敏に反映する。現在最も広く用いられている酸化ストレスマーカーの一つであり、動物種を問わず尿を使って非侵襲的に生体内酸化ストレスを評価できる。８－ＯＨｄＧによる酸化ストレス評価によって、生物学的重要性、疾病との関係が明らかにされつつある。特に染色体ＤＮＡに発生した８－ＯＨｄＧは複製時にＧ⇒Ｔ変異を惹起することから、染色体における８－ＯＨｄＧの増加は発がんリスクの上昇に関連すると考えられている。
染色体ＤＮＡ上に形成された８－ＯＨｄＧは修復酵素の作用により染色体ＤＮＡより切り出され細胞外に放出、腎臓を経て尿中に排出される。８－ＯＨｄＧの由来としてはこのほかミトコンドリアＤＮＡ、細胞内ヌクレオチドプールが知られている。８－ＯＨｄＧは化学的に比較的安定な物質であること、２次代謝などを受けずに尿中に排出されることから、生体内における酸化ストレスを定量的に反映するバイオマーカーとして利用されている。
８－ＯＨｄＧの測定は従来ＨＰＬＣ－ＥＣＤ法によって測定されていたが、近年ではＥＬＩＳＡ法が普及している。
あるいは、血清中のインドキシル硫酸値を生体の酸化ストレス度の指標とする方法も普及してきている。
さらにまた、酸化ストレス評価の手段としては、その他に、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍ４（ＦＲＡＳ４，Ｈ＆Ｄ社製，輸入元ウイスマー社）によるｄ－ＲＯＭｓ（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ：酸化ストレス）テスト、ＢＡＰ（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ：抗酸化力）テスト、ＯＸＹ吸着（ｏｘｙ－ａｄｓｏｒｂｅｎｔ：抗酸化力）テストなどがある。
しかしＤＪ－１が生体内酸化ストレスの指標となることは知られていない。
８－ＯＨｄＧの測定は従来ＨＰＬＣ－ＥＣＤ法によって測定されていたが、近年ではＥＬＩＳＡ法が普及している。
あるいは、血清中のインドキシル硫酸値を生体の酸化ストレス度の指標とする方法も普及してきている。
さらにまた、酸化ストレス評価の手段としては、その他に、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍ４（ＦＲＡＳ４，Ｈ＆Ｄ社製，輸入元ウイスマー社）によるｄ－ＲＯＭｓ（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ：酸化ストレス）テスト、ＢＡＰ（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ：抗酸化力）テスト、ＯＸＹ吸着（ｏｘｙ－ａｄｓｏｒｂｅｎｔ：抗酸化力）テストなどがある。
しかしＤＪ－１が生体内酸化ストレスの指標となることは知られていない。
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ４７３（２０１６）８７－９１
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｌｏｌｏｇｙ．２００２，１７５；３０３－３１７
Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ． ３０７（１０）：９２５－９３５．２０１５
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．７３（７）：７１４－７２８．２０１４
本発明者らは、ヒト皮膚の角層に対する紫外線の影響を研究している。この研究過程において、ヒト表皮角化細胞に紫外線を照射したところ、前記のＤＪ－１が活性酸素消去に直接働くことを見出した。そして、ヒト皮膚の角層中ＤＪ－１値が高いヒトの方が紫外線を照射した皮膚の色素沈着の回復が早いという知見を得た。そしてさらに研究を進めたところ、皮膚角層のＤＪ－１を指標とする新たな、皮膚の酸化ストレスを測定し評価する方法を見出し、本発明をなした。
すなわち、本発明は皮膚角層を用いた、生体の酸化ストレスの評価方法を提供することを課題とする。
すなわち、本発明は皮膚角層を用いた、生体の酸化ストレスの評価方法を提供することを課題とする。
本発明は以下の構成である。
（１）角層試料中のＤＪ－１タンパク質を指標とする、生体の酸化ストレスの評価方法。
（２）生体の酸化ストレスの評価方法が、角層試料の酸化ＤＪ－１値を指標とするものである（１）に記載の評価方法。
（３）生体の酸化ストレスの評価方法が、角層試料の酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値によるものである（１）に記載の評価方法。
（４）角層試料がテープストリッピング法によって採取されたものである（１）～（３）のいずれかに記載の評価方法。
（５）酸化ＤＪ－１値の測定が、酸化ＤＪ－１特異性モノクローナル抗体を用いたイムノアッセイ法である（１）～（４）のいずれかに記載の評価方法。
（１）角層試料中のＤＪ－１タンパク質を指標とする、生体の酸化ストレスの評価方法。
（２）生体の酸化ストレスの評価方法が、角層試料の酸化ＤＪ－１値を指標とするものである（１）に記載の評価方法。
（３）生体の酸化ストレスの評価方法が、角層試料の酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値によるものである（１）に記載の評価方法。
（４）角層試料がテープストリッピング法によって採取されたものである（１）～（３）のいずれかに記載の評価方法。
（５）酸化ＤＪ－１値の測定が、酸化ＤＪ－１特異性モノクローナル抗体を用いたイムノアッセイ法である（１）～（４）のいずれかに記載の評価方法。
本発明により、新たな生体の酸化ストレスを評価する方法が提供される。本発明の方法は、皮膚角層を試験検体とするため、検体の採取や保管が簡単である。さらに、粘着テープを用いると、非侵襲的に採取できるため、被験者の負荷が軽減される。またＤＪ－１の測定はＥＬＩＳＡなどによって測定可能であり、フリーラジカル測定のような専用の測定装置を必要としない。したがって、酸化ストレス評価に必要な測定コストを安価に抑制することが可能となる。
以下、本発明について詳細に説明する。
生体において、ＤＪ－１遺伝子の発現によってＤＪ－１タンパク質（以下ＤＪ－１）が生成される。ＤＪ－１は、様々な原因によって酸化型ＤＪ－１となる。
本願明細書において、酸化ＤＪ－１値、総ＤＪ－１値とは次の通り定義される。
総ＤＪ－１値：公知の抗ＤＪ－１抗体であってＤＪ－１と酸化ＤＪ－１両方に結合性を有する抗体を用いたＥＬＩＳＡ法で測定された測定量（総ＤＪ－１量）を試料中のタンパク質量で除した値を、総ＤＪ－１値という。総ＤＪ－１値には酸化型と非酸化型の両方が包含される。
酸化ＤＪ－１値：ＤＪ－１が活性酸素等で酸化された酸化型ＤＪ－１とのみ反応する特異抗体を用いたＥＬＩＳＡ法またはウエスタンブロット法で測定された酸化ＤＪ－１の測定量（酸化型ＤＪ－１量）を試料中のタンパク質量で除した値をいう。
生体において、ＤＪ－１遺伝子の発現によってＤＪ－１タンパク質（以下ＤＪ－１）が生成される。ＤＪ－１は、様々な原因によって酸化型ＤＪ－１となる。
本願明細書において、酸化ＤＪ－１値、総ＤＪ－１値とは次の通り定義される。
総ＤＪ－１値：公知の抗ＤＪ－１抗体であってＤＪ－１と酸化ＤＪ－１両方に結合性を有する抗体を用いたＥＬＩＳＡ法で測定された測定量（総ＤＪ－１量）を試料中のタンパク質量で除した値を、総ＤＪ－１値という。総ＤＪ－１値には酸化型と非酸化型の両方が包含される。
酸化ＤＪ－１値：ＤＪ－１が活性酸素等で酸化された酸化型ＤＪ－１とのみ反応する特異抗体を用いたＥＬＩＳＡ法またはウエスタンブロット法で測定された酸化ＤＪ－１の測定量（酸化型ＤＪ－１量）を試料中のタンパク質量で除した値をいう。
また、本願明細書において「生体内酸化ストレス」状態とは次のいずれかの場合をいう。
（１）健康人の場合：血清中インドキシル硫酸値が正常値（１．８７μｇ／ｍＬ）を上回るとき。
（２）透析患者の場合：血清中インドキシル硫酸値が上記正常値を超えるか、近傍値を示すとき。
（１）健康人の場合：血清中インドキシル硫酸値が正常値（１．８７μｇ／ｍＬ）を上回るとき。
（２）透析患者の場合：血清中インドキシル硫酸値が上記正常値を超えるか、近傍値を示すとき。
ＤＪ－１を指標として生体の酸化ストレスを評価するために、次のような工程を行う。
（工程１）角層剥離手段を用いて、皮膚より角層試料を採取する。
（工程２）工程１で採取した角層試料からタンパク質を抽出する。
（工程３）工程２で抽出したタンパク質含有溶液のタンパク質量、酸化型ＤＪ－１量、総ＤＪ－１量を測定し、酸化型ＤＪ－１量及び総ＤＪ－１量をタンパク質含有量で補正し、酸化ＤＪ－１値、総ＤＪ－１値を得る。
（工程４）酸化ＤＪ－１値、または酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値比を酸化ストレス指標値とする。
（工程５）多数の被験者から採取した角層試料の工程４指標値と、酸化指標値に基づく相関式から回帰直線を求め、この回帰直線から工程４で得た酸化ＤＪ－１値または酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値比の指標に対応する酸化指標値を対比し、被験者の酸化ストレスを評価する。
（工程１）角層剥離手段を用いて、皮膚より角層試料を採取する。
（工程２）工程１で採取した角層試料からタンパク質を抽出する。
（工程３）工程２で抽出したタンパク質含有溶液のタンパク質量、酸化型ＤＪ－１量、総ＤＪ－１量を測定し、酸化型ＤＪ－１量及び総ＤＪ－１量をタンパク質含有量で補正し、酸化ＤＪ－１値、総ＤＪ－１値を得る。
（工程４）酸化ＤＪ－１値、または酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値比を酸化ストレス指標値とする。
（工程５）多数の被験者から採取した角層試料の工程４指標値と、酸化指標値に基づく相関式から回帰直線を求め、この回帰直線から工程４で得た酸化ＤＪ－１値または酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値比の指標に対応する酸化指標値を対比し、被験者の酸化ストレスを評価する。
各工程について説明を加える。
＜工程１＞
工程１の角層剥離手段は、バイオプシーや粘着テープを用いる方法のいずれであっても良い。被験者の負担を考慮すると粘着テープを用いる方法が好ましい。粘着テープを用いる方法は、テープストリッピング法と呼ばれる。
テープストリッピング法は、粘着性テープを皮膚に貼り付けた後、剥がして皮膚の表層を回収する方法である。
粘着剤としては、天然ゴム、ポリイソブチレン、ポリブタジエン、シリコーンゴム、ポリイソプレン、スチレン－イソプレン－スチレンブロック共重合体等の合成ゴム、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル酸エステル共重合体等の合成樹脂等が用いられている。テープストリッピング法に用いる粘着テープは市販されており、これを使用しても良い。
＜工程１＞
工程１の角層剥離手段は、バイオプシーや粘着テープを用いる方法のいずれであっても良い。被験者の負担を考慮すると粘着テープを用いる方法が好ましい。粘着テープを用いる方法は、テープストリッピング法と呼ばれる。
テープストリッピング法は、粘着性テープを皮膚に貼り付けた後、剥がして皮膚の表層を回収する方法である。
粘着剤としては、天然ゴム、ポリイソブチレン、ポリブタジエン、シリコーンゴム、ポリイソプレン、スチレン－イソプレン－スチレンブロック共重合体等の合成ゴム、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル酸エステル共重合体等の合成樹脂等が用いられている。テープストリッピング法に用いる粘着テープは市販されており、これを使用しても良い。
＜工程２＞
工程２のタンパク質を抽出する方法は、非イオン性の界面活性剤を含む、中性～弱アルカリ性のバッファー、例えば、以下の抽出バッファー［０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ(ｐＨ８．０), ０．１４Ｍ ＮａＣｌ, ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０］を用いることができるが、これに限定されるものではない。工程１で採取した皮膚角層が付着したテープをはさみ等で細切し遠心チューブなどの容器に移し、少量の上記バッファーに浸漬し、転倒攪拌や超音波処理を行うことにより、効率よく可溶性成分を抽出できる。またガラスビーズを加えて激しく振盪してテープや角層組織を破砕しても良い。抽出液は、遠心分離やフィルターろ過など適切な方法によって不溶解物を除去し、上清のみを回収する。
工程２のタンパク質を抽出する方法は、非イオン性の界面活性剤を含む、中性～弱アルカリ性のバッファー、例えば、以下の抽出バッファー［０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ(ｐＨ８．０), ０．１４Ｍ ＮａＣｌ, ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０］を用いることができるが、これに限定されるものではない。工程１で採取した皮膚角層が付着したテープをはさみ等で細切し遠心チューブなどの容器に移し、少量の上記バッファーに浸漬し、転倒攪拌や超音波処理を行うことにより、効率よく可溶性成分を抽出できる。またガラスビーズを加えて激しく振盪してテープや角層組織を破砕しても良い。抽出液は、遠心分離やフィルターろ過など適切な方法によって不溶解物を除去し、上清のみを回収する。
＜工程３＞
工程２において、採取し、回収した上清の、タンパク質量、酸化型ＤＪ－１量、総ＤＪ－１量を測定する。
工程２において、採取し、回収した上清の、タンパク質量、酸化型ＤＪ－１量、総ＤＪ－１量を測定する。
タンパク質量は、生化学分野で汎用されているあらゆる方法が利用でき、特に制限されるものではない。例えばローリー法、改良ローリー法、ブラッドフォード法、改良ブラッドフォード法、紫外線吸収法、ケルダール法などあらゆる方法が挙げられる。また、タンパク質の定量は市販のキットを使用して簡便に行うことが可能である。例えば、テルモフィッシャーサイエンティフィック製ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ、バイオラッド社のＤＣプロテインアッセイや、ＲＣ ＤＣプロテインアッセイなどが利用できる。
酸化ＤＪ－１量の測定は、非特許文献３に開示された方法に従って、酸化ＤＪ－１特異的モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法又はエンザイムイムノアッセイ方法によって測定することができる。酸化ＤＪ－１量のウエスタンブロットによる測定方法は、具体的には、抽出液中のタンパク質をクロロホルムメタノール法にて濃縮し、ドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ：Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）の後、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ：Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜に転写し、検出試薬（ＥＣＬ Ｓｅｌｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｇｅｎｔｓ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて検出して、画像をＩｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ＬＡＳ－４００／Ｆｕｊｉｆｉｌｍを用いて解析すればよい。酸化型ＤＪ－１モノクローナル抗体は、非特許文献４に従って作製されたものを用いることができる。
総ＤＪ－１量の測定は、従来から知られている方法で測定することができる。例えば、ＤＪ－１に対する抗体との反応に基づくエンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイを利用することができる。また市販されているＤＪ－１測定キットを利用することも可能である。具体的には、ＣｉｒｃｕＬｅｘ Ｈｕｍａｎ ＤＪ－１／ＰＡＲＫ７ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（ＭＢＬ）、Ｈｕｍａｎ ＰＡＲＫ７ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ （アブカム）、Ｈｕｍａｎ Ｐａｒｋ７／ＤＪ－１ ＤｕｏＳｅｔ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，）を例示することができる。
角層からタンパク質を抽出するとき、抽出操作によって、抽出率に差が生じるため、上記の測定による酸化ＤＪ－１量及び総ＤＪ－１量をタンパク質量で除して、標準化し、この標準化後の値を本発明でいう「酸化ＤＪ－１値」、及び「総ＤＪ－１値」とする。
＜工程４＞
工程３により得た酸化ＤＪ－１値および総ＤＪ－１値に基づき、酸化ＤＪ－１値、あるいは酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値の比を求め、酸化ストレスの指標値とする。
工程３により得た酸化ＤＪ－１値および総ＤＪ－１値に基づき、酸化ＤＪ－１値、あるいは酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値の比を求め、酸化ストレスの指標値とする。
以下にヒトを対象とした試験例を示し、本発明の評価方法の有用性について具体的に説明する。
＜ヒト試験１．ヒトの酸化ストレス指標である血清インドキシル硫酸値の測定と総ＤＪ－１値の測定＞
生体内の酸化ストレスが高まっていることが明らかになっている透析患者と健常者を被験者として、本方法による酸化ストレス評価の有用性を確認した。
（１）試験方法
１）被験者
慢性糸球体腎炎および糖尿病性腎症などの治療のために人工透析を行っている患者１３４名、３４歳－５３歳の健常者５名（男性３名 女性２名 平均年齢４１歳）を対照群の被験者とした。
生体内の酸化ストレスが高まっていることが明らかになっている透析患者と健常者を被験者として、本方法による酸化ストレス評価の有用性を確認した。
（１）試験方法
１）被験者
慢性糸球体腎炎および糖尿病性腎症などの治療のために人工透析を行っている患者１３４名、３４歳－５３歳の健常者５名（男性３名 女性２名 平均年齢４１歳）を対照群の被験者とした。
２）酸化ストレス指標の測定
体内の酸化ストレス指標として慢性腎症の重症度依存的に増加する尿毒素として知られる血清インドキシル硫酸をＨＰＬＣ法で測定した。
体内の酸化ストレス指標として慢性腎症の重症度依存的に増加する尿毒素として知られる血清インドキシル硫酸をＨＰＬＣ法で測定した。
３）角層の採取とタンパク質量、総ＤＪ－１値の測定
２．５×２．５ｃｍの角層チェッカー（アサヒバイオメッド）を用いてテープストリッピングにより頬部分の角層を採取し、Ｔ－ＰＥＲ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）およびガラスビーズを用いてビーズ破砕法により採取した角層のタンパク質を抽出した。抽出溶液中の総ＤＪ－１はＥｌｉｓａ ｋｉｔ（Ｈｕｍａｎ Ｐａｒｋ７／ＤＪ－１ ＤｕｏＳｅｔ； Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて測定し、酸化ＤＪ－１はＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法（ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｍ１０６Ｃｌｏｎｅ）６）を用いて測定した。総タンパク質量はＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を用いて測定し、単位タンパク質量あたりの角層中の総ＤＪ－１値を算出した。
２．５×２．５ｃｍの角層チェッカー（アサヒバイオメッド）を用いてテープストリッピングにより頬部分の角層を採取し、Ｔ－ＰＥＲ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）およびガラスビーズを用いてビーズ破砕法により採取した角層のタンパク質を抽出した。抽出溶液中の総ＤＪ－１はＥｌｉｓａ ｋｉｔ（Ｈｕｍａｎ Ｐａｒｋ７／ＤＪ－１ ＤｕｏＳｅｔ； Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて測定し、酸化ＤＪ－１はＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法（ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｍ１０６Ｃｌｏｎｅ）６）を用いて測定した。総タンパク質量はＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を用いて測定し、単位タンパク質量あたりの角層中の総ＤＪ－１値を算出した。
４）統計処理
相関の検定は Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ ｒａｎｋ ｔｅｓｔを用いた。二群の検定にはｔ－検定を、不等分散の場合には、Ｗｅｌｃｈのｔ－検定を実施した。
相関の検定は Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ ｒａｎｋ ｔｅｓｔを用いた。二群の検定にはｔ－検定を、不等分散の場合には、Ｗｅｌｃｈのｔ－検定を実施した。
（２）試験結果
１）血清インドキシル硫酸値
解析対象者１３４名の血清インドキシル硫酸の値は、正常値（正常値１．８７ μｇ／ｍＬ以下）を示した健常者に比べて有意に高く、酸化ストレスが高い集団であることが確認された（図１）。
重症度が高いほど酸化ストレスが高い状態であるかを確認するために、透析歴との相関関係をみたところ、軽度に相関した（図２）。しかし、皮膚症状のある６３名と症状のない７０名の２群間において、また、痒みの症状を有する（ＶＡＳスコア５０以上）２６名と有していない１０８名の２群間においても、乾燥症状を有する（ＶＡＳスコア５０以上）４７名と有していない８７名の２群間においても、血清インドキシル硫酸値の違いが認められなかった。
１）血清インドキシル硫酸値
解析対象者１３４名の血清インドキシル硫酸の値は、正常値（正常値１．８７ μｇ／ｍＬ以下）を示した健常者に比べて有意に高く、酸化ストレスが高い集団であることが確認された（図１）。
重症度が高いほど酸化ストレスが高い状態であるかを確認するために、透析歴との相関関係をみたところ、軽度に相関した（図２）。しかし、皮膚症状のある６３名と症状のない７０名の２群間において、また、痒みの症状を有する（ＶＡＳスコア５０以上）２６名と有していない１０８名の２群間においても、乾燥症状を有する（ＶＡＳスコア５０以上）４７名と有していない８７名の２群間においても、血清インドキシル硫酸値の違いが認められなかった。
２）角層中の総ＤＪ－１値
解析対象者１１７名（１３４名のうち測定欠損値を除く）の角層中の総ＤＪ－１値は、平均６．８９ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（０．８１－２２．７３ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）であった。これまでに株式会社ファンケルで取得した健常者５５４６名の総ＤＪ－１値に比べると、透析患者の測定結果はほぼ同程度であったものの平均値が高いことがわかった（図３）。
しかし、酸化ストレスの指標とされる血清インドキシル硫酸値と角層中の総ＤＪ－１値には、強い相関関係は認められなかった（図４）。
解析対象者１１７名（１３４名のうち測定欠損値を除く）の角層中の総ＤＪ－１値は、平均６．８９ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（０．８１－２２．７３ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）であった。これまでに株式会社ファンケルで取得した健常者５５４６名の総ＤＪ－１値に比べると、透析患者の測定結果はほぼ同程度であったものの平均値が高いことがわかった（図３）。
しかし、酸化ストレスの指標とされる血清インドキシル硫酸値と角層中の総ＤＪ－１値には、強い相関関係は認められなかった（図４）。
＜ヒト試験２．酸化ＤＪ－１値とヒトの酸化ストレス評価指標の比較＞
前記のヒト試験１と同様に、従来の酸化ストレス評価の測定方法である血清インドキシル硫酸値及びＯＸＹ値と、酸化ＤＪ－１値の対比試験を行った。
（１）試験方法
１）被験者
慢性糸球体腎炎および糖尿病性腎症などの治療のために人工透析を行っている患者２４名（総ＤＪ－１量が多い１０名、少ない８名、中央値付近の６名（男性１４名 女性１０名 平均年齢６３．９歳））を、透析患者を対象に先行して測定した結果から選択した。すなわち、測定欠損値を除く１１８名の角層中のＤＪ－１値（最小値 ０．８１ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ 最大値 ２２．７３ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ 中央値 ６．４４ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）と１３４名の血清中のＤＪ－１値（最小値 ９７．５ ｐｇ／ｍＬ 最大値 ４９１.２ ｎｇ／ｍＬ 中央値２２０４．８ ｐｇ／ｍＬ）を指標として、角層中および血清中各々について、最小値から順に高い８名（角層：男性２名 女性３名 血清：男性２名 女性１名）、最大値から順に低い１０名（角層：男性３名 女性２名 血清：男性３名 女性２名）、中央値を中心とした３名（角層：男性２名 女性１名 血清：男性２名 女性１名）を抽出し、赤血球中の総ＤＪ－１量および酸化ＤＪ－１値を測定した。また、３４歳－５３歳の健常者５名（男性３名 女性２名 平均年齢４１歳）を対照群の被験者とした。
前記のヒト試験１と同様に、従来の酸化ストレス評価の測定方法である血清インドキシル硫酸値及びＯＸＹ値と、酸化ＤＪ－１値の対比試験を行った。
（１）試験方法
１）被験者
慢性糸球体腎炎および糖尿病性腎症などの治療のために人工透析を行っている患者２４名（総ＤＪ－１量が多い１０名、少ない８名、中央値付近の６名（男性１４名 女性１０名 平均年齢６３．９歳））を、透析患者を対象に先行して測定した結果から選択した。すなわち、測定欠損値を除く１１８名の角層中のＤＪ－１値（最小値 ０．８１ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ 最大値 ２２．７３ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ 中央値 ６．４４ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）と１３４名の血清中のＤＪ－１値（最小値 ９７．５ ｐｇ／ｍＬ 最大値 ４９１.２ ｎｇ／ｍＬ 中央値２２０４．８ ｐｇ／ｍＬ）を指標として、角層中および血清中各々について、最小値から順に高い８名（角層：男性２名 女性３名 血清：男性２名 女性１名）、最大値から順に低い１０名（角層：男性３名 女性２名 血清：男性３名 女性２名）、中央値を中心とした３名（角層：男性２名 女性１名 血清：男性２名 女性１名）を抽出し、赤血球中の総ＤＪ－１量および酸化ＤＪ－１値を測定した。また、３４歳－５３歳の健常者５名（男性３名 女性２名 平均年齢４１歳）を対照群の被験者とした。
２）酸化ストレス評価指標の測定
上記の人工透析を行っている患者２４名、健常者５名の体内の酸化ストレス評価指標として血清インドキシル硫酸の測定及び血清のＯＸＹ吸着（ｏｘｙ－ａｄｓｏｒｂｅｎｔ以下「ＯＸＹ」）テストを行った。ＯＸＹテストは、血清検体を規定の酸化能をもつＨＣｌＯ溶液に加えて反応させた後、残存するＨＣｌＯをアルキル置換芳香族アミンと反応させて呈色させ、吸光度を測定して、試薬ブランク（ＨＣｌＯのみ）との比較差から検体のＯＸＹ吸着能を定量化した。
上記の人工透析を行っている患者２４名、健常者５名の体内の酸化ストレス評価指標として血清インドキシル硫酸の測定及び血清のＯＸＹ吸着（ｏｘｙ－ａｄｓｏｒｂｅｎｔ以下「ＯＸＹ」）テストを行った。ＯＸＹテストは、血清検体を規定の酸化能をもつＨＣｌＯ溶液に加えて反応させた後、残存するＨＣｌＯをアルキル置換芳香族アミンと反応させて呈色させ、吸光度を測定して、試薬ブランク（ＨＣｌＯのみ）との比較差から検体のＯＸＹ吸着能を定量化した。
３）角層の採取とタンパク質、酸化ＤＪ－１値の測定
ヒト試験１と同様に、２．５×２．５ｃｍの角層チェッカー（アサヒバイオメッド）を用いてテープストリッピングにより頬部分の角層を採取し、Ｔ－ＰＥＲ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）およびガラスビーズを用いてビーズ破砕法により採取した角層のタンパク質を抽出した。酸化型ＤＪ－１量はＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法（ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ， Ｍ１０６Ｃｌｏｎｅ）６）を用いて測定した。総タンパク質量はＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を用いて測定し、単位タンパク質量あたりの酸化ＤＪ－１値を算出した。
ヒト試験１と同様に、２．５×２．５ｃｍの角層チェッカー（アサヒバイオメッド）を用いてテープストリッピングにより頬部分の角層を採取し、Ｔ－ＰＥＲ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）およびガラスビーズを用いてビーズ破砕法により採取した角層のタンパク質を抽出した。酸化型ＤＪ－１量はＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法（ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ， Ｍ１０６Ｃｌｏｎｅ）６）を用いて測定した。総タンパク質量はＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を用いて測定し、単位タンパク質量あたりの酸化ＤＪ－１値を算出した。
４）統計処理
相関の検定は Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ ｒａｎｋ ｔｅｓｔを用いた。二群の検定にはｔ－検定を、不等分散の場合には、Ｗｅｌｃｈのｔ－検定を実施した。
相関の検定は Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ ｒａｎｋ ｔｅｓｔを用いた。二群の検定にはｔ－検定を、不等分散の場合には、Ｗｅｌｃｈのｔ－検定を実施した。
（２）試験結果と評価
１）血清インドキシル硫酸値と角層の酸化ＤＪ－１値の相関
人工透析患者のうち２４名、健常者群５名の血清インドキシル硫酸値と角層の酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値比の相関を確認するため、測定結果の散布図を作成した。
図５に示すとおり、総ＤＪ－１値と血清インドキシル硫酸測定値に比較して、酸化ＤＪ－１値と血清インドキシル硫酸値には強い負の相関（相関係数０．２６）があることが確認された。
すなわち、角層中の酸化ＤＪ－１値は、酸化ストレス指標の血清インドキシル硫酸値に代わる酸化ストレス指標になりうる新しい指標である。
１）血清インドキシル硫酸値と角層の酸化ＤＪ－１値の相関
人工透析患者のうち２４名、健常者群５名の血清インドキシル硫酸値と角層の酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値比の相関を確認するため、測定結果の散布図を作成した。
図５に示すとおり、総ＤＪ－１値と血清インドキシル硫酸測定値に比較して、酸化ＤＪ－１値と血清インドキシル硫酸値には強い負の相関（相関係数０．２６）があることが確認された。
すなわち、角層中の酸化ＤＪ－１値は、酸化ストレス指標の血清インドキシル硫酸値に代わる酸化ストレス指標になりうる新しい指標である。
２）血清のＯＸＹ値と角層の酸化ＤＪ－１値の相関
人工透析患者２４名のうち測定欠損値を除く１９名と、健常者群５名の血清ＯＸＹ値と角層の酸化ＤＪ－１値の相関を確認するため測定結果の散布図を作成した。
図６に示すとおり、両者には強い正の相関（相関係数０．３４）があることが確認できた。すなわち、角層中の酸化ＤＪ－１値は、血清ＯＸＹ値に代わる酸化ストレス評価指標（抗酸化力）になりうる新しい指標である。
人工透析患者２４名のうち測定欠損値を除く１９名と、健常者群５名の血清ＯＸＹ値と角層の酸化ＤＪ－１値の相関を確認するため測定結果の散布図を作成した。
図６に示すとおり、両者には強い正の相関（相関係数０．３４）があることが確認できた。すなわち、角層中の酸化ＤＪ－１値は、血清ＯＸＹ値に代わる酸化ストレス評価指標（抗酸化力）になりうる新しい指標である。
以上のとおり、角層中の酸化ＤＪ－１値は、生体内の酸化ストレス評価指標である血清インドキシル硫酸値及びＯＸＹ値と強い相関を示すことから、生体内の酸化ストレス指標として有用であることが判明した。
＜ヒト試験３．酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値の比とヒトの酸化ストレス評価指標の比較＞
前記のヒト試験１、ヒト試験２に基づいてより信頼性の高い酸化ストレス指標を設定することを試みた。
（１）試験方法
１）被験者
慢性糸球体腎炎および糖尿病性腎症などの治療のために人工透析を行っている患者２４名（総ＤＪ－１量が多い１０名、少ない８名、中央値付近の６名（男性１４名 女性１０名 平均年齢６３．９歳））を、透析患者を対象に先行して測定した結果から選択した。すなわち、測定欠損値を除く１１８名の角層中の総ＤＪ－１値（最小値 ０．８１ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ 最大値 ２２．７３ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ 中央値 ６．４４ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）と１３４名の血清中総ＤＪ－１濃度（最小値 ９７．５ ｐｇ／ｍＬ 最大値 ４９１.２ ｎｇ／ｍＬ 中央値２２０４．８ ｐｇ／ｍＬ）を指標として、角層中および血清中各々について、最小値から順に高い８名（角層：男性２名 女性３名 血清：男性２名 女性１名）、最大値から順に低い１０名（角層：男性３名 女性２名 血清：男性３名 女性２名）、中央値を中心とした３名（角層：男性２名 女性１名 血清：男性２名 女性１名）を抽出し、赤血球中の総ＤＪ－１値および酸化ＤＪ－１値を測定した。また、３４歳－５３歳の健常者５名（男性３名 女性２名 平均年齢４１歳）を対照群の被験者とした。
前記のヒト試験１、ヒト試験２に基づいてより信頼性の高い酸化ストレス指標を設定することを試みた。
（１）試験方法
１）被験者
慢性糸球体腎炎および糖尿病性腎症などの治療のために人工透析を行っている患者２４名（総ＤＪ－１量が多い１０名、少ない８名、中央値付近の６名（男性１４名 女性１０名 平均年齢６３．９歳））を、透析患者を対象に先行して測定した結果から選択した。すなわち、測定欠損値を除く１１８名の角層中の総ＤＪ－１値（最小値 ０．８１ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ 最大値 ２２．７３ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ 中央値 ６．４４ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）と１３４名の血清中総ＤＪ－１濃度（最小値 ９７．５ ｐｇ／ｍＬ 最大値 ４９１.２ ｎｇ／ｍＬ 中央値２２０４．８ ｐｇ／ｍＬ）を指標として、角層中および血清中各々について、最小値から順に高い８名（角層：男性２名 女性３名 血清：男性２名 女性１名）、最大値から順に低い１０名（角層：男性３名 女性２名 血清：男性３名 女性２名）、中央値を中心とした３名（角層：男性２名 女性１名 血清：男性２名 女性１名）を抽出し、赤血球中の総ＤＪ－１値および酸化ＤＪ－１値を測定した。また、３４歳－５３歳の健常者５名（男性３名 女性２名 平均年齢４１歳）を対照群の被験者とした。
２）酸化ストレス指標の測定
上記の人工透析を行っている患者２４名、健常者５名について、体内の酸化ストレス指標として血清インドキシル硫酸の測定及び血清のＯＸＹテストを行った。ＯＸＹテストは、血清検体を規定の酸化能をもつＨＣｌＯ溶液に加えて反応させた後、残存するＨＣｌＯをアルキル置換芳香族アミンと反応させて呈色させて吸光度を測定して、試薬ブランク（ＨＣｌＯのみ）との比較差から検体のＯＸＹ吸着能を定量化した。
上記の人工透析を行っている患者２４名、健常者５名について、体内の酸化ストレス指標として血清インドキシル硫酸の測定及び血清のＯＸＹテストを行った。ＯＸＹテストは、血清検体を規定の酸化能をもつＨＣｌＯ溶液に加えて反応させた後、残存するＨＣｌＯをアルキル置換芳香族アミンと反応させて呈色させて吸光度を測定して、試薬ブランク（ＨＣｌＯのみ）との比較差から検体のＯＸＹ吸着能を定量化した。
３）角層の採取とタンパク質、酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値の測定
ヒト試験１と同様に、２．５×２．５ｃｍの角層チェッカー（アサヒバイオメッド）を用いてテープストリッピングにより頬部分の角層を採取し、Ｔ－ＰＥＲ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）およびガラスビーズを用いてビーズ破砕法により採取した角層のタンパク質を抽出した。抽出溶液中の総ＤＪ－１はＥｌｉｓａ ｋｉｔ（Ｈｕｍａｎ Ｐａｒｋ７／ＤＪ－１ ＤｕｏＳｅｔ； Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて測定し、酸化ＤＪ－１量はＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法（ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ， Ｍ１０６Ｃｌｏｎｅ）６）を用いて測定した。総タンパク質量はＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を用いて測定した。
ヒト試験１と同様に、２．５×２．５ｃｍの角層チェッカー（アサヒバイオメッド）を用いてテープストリッピングにより頬部分の角層を採取し、Ｔ－ＰＥＲ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）およびガラスビーズを用いてビーズ破砕法により採取した角層のタンパク質を抽出した。抽出溶液中の総ＤＪ－１はＥｌｉｓａ ｋｉｔ（Ｈｕｍａｎ Ｐａｒｋ７／ＤＪ－１ ＤｕｏＳｅｔ； Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を用いて測定し、酸化ＤＪ－１量はＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ法（ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ， Ｍ１０６Ｃｌｏｎｅ）６）を用いて測定した。総タンパク質量はＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）を用いて測定した。
酸化型ＤＪ－１量は、酸化型ＤＪ－１特異的マウスモノクローナル抗体を非特許文献４に基づいて作製し、これを用いて総ＤＪ－１と同様に測定した。
酸化型ＤＪ－１量、総ＤＪ－１量を前記のタンパク質量で除して（標準化して）、酸化ＤＪ－１値、総ＤＪ－１値を得た。
なお、生体内の酸化ＤＪ－１値及び総ＤＪ－１値を測定するため、赤血球についても測定を行った。被験者の血液は、生理食塩液を加えて遠心することにより洗浄し、赤血球画分に蒸留水を加えて溶血した。溶血後に１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を添加して遠心し、上清を回収して被験検体とした。
酸化型ＤＪ－１量、総ＤＪ－１量を前記のタンパク質量で除して（標準化して）、酸化ＤＪ－１値、総ＤＪ－１値を得た。
なお、生体内の酸化ＤＪ－１値及び総ＤＪ－１値を測定するため、赤血球についても測定を行った。被験者の血液は、生理食塩液を加えて遠心することにより洗浄し、赤血球画分に蒸留水を加えて溶血した。溶血後に１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を添加して遠心し、上清を回収して被験検体とした。
４）酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値比の計算
総ＤＪ－１値と酸化ＤＪ－１値から酸化ストレス指標の酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値の比を得た。
総ＤＪ－１値と酸化ＤＪ－１値から酸化ストレス指標の酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値の比を得た。
５）統計処理
相関の検定は Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ ｒａｎｋ ｔｅｓｔを用いた。二群の検定にはｔ－検定 を、不等分散の場合には、Ｗｅｌｃｈのｔ－検定を実施した。
相関の検定は Ｓｐｅａｒｍａｎ’ｓ ｒａｎｋ ｔｅｓｔを用いた。二群の検定にはｔ－検定 を、不等分散の場合には、Ｗｅｌｃｈのｔ－検定を実施した。
（２）試験結果と評価
１）赤血球中の総ＤＪ－１値と酸化ＤＪ－１値の評価
角層総ＤＪ－１値が酸化ストレスの亢進した状態を反映するか否かについては、上記の試験１では明らかにならなかった。
そこで、人工透析患者のうち２４名を選択し、健常者群５名と赤血球中および角層中の総ＤＪ－１値および酸化ＤＪ－１値を測定して比較した。健常者５名の赤血球中ＤＪ－１値は平均５．２２ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（４．２７－５．９２ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）であったが、透析患者２４名の赤血球中ＤＪ－１値は、平均９．４３ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （４．４２－１６．９７ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）と高値を示す被験者が多く、両群間に違いを認めた。また、酸化ＤＪ－１値は、健常者では平均７５．１９ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（６９．８２－８０．９３ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）に対し、透析患者では、平均７８．９２ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（４３．０３－１３４．２６ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）と、各群の平均値に大きな差は認められなかったものの、両群間に分布の違いを認めた（図７ａ）。なお、総ＤＪ－１値の測定と酸化ＤＪ－１値の測定の方法に違いがあり、両方の数値を絶対量として比較することができないため、総ＤＪ－１値に対する酸化ＤＪ－１値の比（酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値比）で比較したところ、健常者に比べて人工透析患者では有意に低かった（図７ｂ）。
１）赤血球中の総ＤＪ－１値と酸化ＤＪ－１値の評価
角層総ＤＪ－１値が酸化ストレスの亢進した状態を反映するか否かについては、上記の試験１では明らかにならなかった。
そこで、人工透析患者のうち２４名を選択し、健常者群５名と赤血球中および角層中の総ＤＪ－１値および酸化ＤＪ－１値を測定して比較した。健常者５名の赤血球中ＤＪ－１値は平均５．２２ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（４．２７－５．９２ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）であったが、透析患者２４名の赤血球中ＤＪ－１値は、平均９．４３ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （４．４２－１６．９７ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）と高値を示す被験者が多く、両群間に違いを認めた。また、酸化ＤＪ－１値は、健常者では平均７５．１９ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（６９．８２－８０．９３ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）に対し、透析患者では、平均７８．９２ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（４３．０３－１３４．２６ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）と、各群の平均値に大きな差は認められなかったものの、両群間に分布の違いを認めた（図７ａ）。なお、総ＤＪ－１値の測定と酸化ＤＪ－１値の測定の方法に違いがあり、両方の数値を絶対量として比較することができないため、総ＤＪ－１値に対する酸化ＤＪ－１値の比（酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値比）で比較したところ、健常者に比べて人工透析患者では有意に低かった（図７ｂ）。
２）角層総ＤＪ－１値と酸化ＤＪ－１値の評価
健常者の角層中ＤＪ－１値は平均２．０７ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （０．７８－３．５３ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）であったが、透析患者２４名の角層中総ＤＪ－１量は、平均３．２３ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （１．１１－８．６５ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）と高値を示す被験者が多く、有意ではないものの両群間に違いを認めた。一方、酸化ＤＪ－１値においては、健常者では平均３．９１ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（２．３６－７．４７ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）に対し、透析患者１９名（２４名のうち測定欠損値を除く）では、平均２．５６ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（１．１４－５．３６ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）と両群間に大きな測定値の違いは認められなかった（図８ａ）。
酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値の比について、両群を比較したところ、赤血球と同様に、健常者に比べて人工透析患者では有意に低かった（図８ｂ）。
健常者の角層中ＤＪ－１値は平均２．０７ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （０．７８－３．５３ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）であったが、透析患者２４名の角層中総ＤＪ－１量は、平均３．２３ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ （１．１１－８．６５ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）と高値を示す被験者が多く、有意ではないものの両群間に違いを認めた。一方、酸化ＤＪ－１値においては、健常者では平均３．９１ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（２．３６－７．４７ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）に対し、透析患者１９名（２４名のうち測定欠損値を除く）では、平均２．５６ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（１．１４－５．３６ ｐｇ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）と両群間に大きな測定値の違いは認められなかった（図８ａ）。
酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値の比について、両群を比較したところ、赤血球と同様に、健常者に比べて人工透析患者では有意に低かった（図８ｂ）。
３）角層および赤血球の角層の酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値比の相関
角層および赤血球の総ＤＪ－１値および酸化ＤＪ－１値の測定方法が異なることから、両者を比較するために、酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値比を用いて赤血球と角層を比較した。その結果、赤血球と角層の酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値の比は、相関を示した（図９、相関係数０．３８）。また、その値は、健常者では高く、透析患者では低かった。
すなわち角層の酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値比は、赤血球の測定結果に良く一致しており、体内の状態を反映しているものと考えられた。
角層および赤血球の総ＤＪ－１値および酸化ＤＪ－１値の測定方法が異なることから、両者を比較するために、酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値比を用いて赤血球と角層を比較した。その結果、赤血球と角層の酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値の比は、相関を示した（図９、相関係数０．３８）。また、その値は、健常者では高く、透析患者では低かった。
すなわち角層の酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値比は、赤血球の測定結果に良く一致しており、体内の状態を反映しているものと考えられた。
４）血清インドキシル硫酸値と角層の酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値の比の相関
人工透析患者のうち２４名、健常者群５名の血清インドキシル硫酸値と角層の酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値比の相関を確認するため散布図を作成した。
図１０に示すとおり、両者には、高い負の相関（相関係数－０．２８）があることが確認された。すなわち酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値の比は、血清インドキシル硫酸値に代わりうる酸化ストレス指標であることが確認できた。
人工透析患者のうち２４名、健常者群５名の血清インドキシル硫酸値と角層の酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値比の相関を確認するため散布図を作成した。
図１０に示すとおり、両者には、高い負の相関（相関係数－０．２８）があることが確認された。すなわち酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値の比は、血清インドキシル硫酸値に代わりうる酸化ストレス指標であることが確認できた。
５）血清のＯＸＹ値と角層の酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値比の相関
人工透析患者２４名のうち測定欠損値を除く１９名と、健常者群５名の血清ＯＸＹ値と角層の酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値の比の相関を確認するため散布図を作成した。
図１１に示すとおり、両者には高い正の相関（相関係数０．６０）があることが確認された。すなわち、酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値比は、血清ＯＸＹ値に代わりうる酸化ストレス指標（抗酸化力）であることが確認された。
人工透析患者２４名のうち測定欠損値を除く１９名と、健常者群５名の血清ＯＸＹ値と角層の酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値の比の相関を確認するため散布図を作成した。
図１１に示すとおり、両者には高い正の相関（相関係数０．６０）があることが確認された。すなわち、酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値比は、血清ＯＸＹ値に代わりうる酸化ストレス指標（抗酸化力）であることが確認された。
以上のとおり、角層中の酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値比は、生体内の酸化ストレスと強い相関を示すことから生体内の酸化ストレス指標として有用であることが判明した。
また試験２の酸化ＤＪ－１値の測定値のみを指標とするよりも、生体内の酸化ストレスを精密に評価することが可能であった。
また試験２の酸化ＤＪ－１値の測定値のみを指標とするよりも、生体内の酸化ストレスを精密に評価することが可能であった。
Claims (3)
- 生体の酸化ストレスの評価のために、皮膚から採取した角層試料中の酸化ＤＪ－１値／総ＤＪ－１値を指標とする方法。
- 角層試料がテープストリッピング法によって採取されたものである請求項１に記載の方法。
- 酸化ＤＪ－１値の測定が、酸化型ＤＪ－１特異性モノクローナル抗体を用いたイムノアッセイ法である請求項１又は２に記載の方法。
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|---|---|---|---|
| JP2019089435A JP7256069B2 (ja) | 2019-05-10 | 2019-05-10 | 生体の酸化ストレスの評価方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|
| JP2020186920A JP2020186920A (ja) | 2020-11-19 |
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| JP2019089435A Active JP7256069B2 (ja) | 2019-05-10 | 2019-05-10 | 生体の酸化ストレスの評価方法 |
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| JP (1) | JP7256069B2 (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120309040A1 (en) | 2009-12-11 | 2012-12-06 | Purdue Research Foundation | Detection of oxidized polypeptides |
| JP2014163749A (ja) | 2013-02-22 | 2014-09-08 | Fancl Corp | 皮膚のストレス蓄積度の評価方法 |
-
2019
- 2019-05-10 JP JP2019089435A patent/JP7256069B2/ja active Active
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Shioji Ishiwatari, et al.，The protective role of DJ-1 in ultraviolet-induced damage of human skin: DJ-1 levels in the stratum corneum as an indicator of antioxidative defense，Arch Dermatol Res，2015年，307(10)，第925-935頁 |
| Yuri Ishii, et al.，Effect of supplement containing Silybum marianum extract, soy extract, collagen peptide, bifidobacteria and apple extract on skin: A randomized placebo-controlled, double-blind, parallel group comparative clinical study，Glycative Stress Research，2016年09月30日，3(3)，第156-171頁 |
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| JP2020186920A (ja) | 2020-11-19 |
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