KR20130140069A

KR20130140069A - 피부의 스트레스 축적도의 평가방법

Info

Publication number: KR20130140069A
Application number: KR1020137014928A
Authority: KR
Inventors: 시오지 이시와타리; 나오코 오이시; 치에 야스다
Original assignee: 가부시키가이샤환케루
Priority date: 2011-02-25
Filing date: 2012-02-14
Publication date: 2013-12-23
Also published as: TW201235662A; JP5658696B2; JP2012189581A; TWI580964B; WO2012114932A1; CN103380375A

Abstract

본 발명은 사용자에게 부담을 주지 않고 피부 스트레스의 축적도를 평가하고, 또한 민감 피부인지 여부를 간편하고 확실하게 평가할 수 있는 신규한 평가방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 평가방법은 피부 각질층을 테이프 스트리핑법 등에 의해, 비침습적으로 채취하여, 그 중에 함유되는 HSP27의 발현량을 측정함으로써 스트레스의 축적도를 평가하는 것을 특징으로 한다.

Description

피부의 스트레스 축적도의 평가방법{Method of evaluating degree of skin stress accumulation}

본 발명은 인간 피부의 스트레스 축적도의 평가방법 및 민감 피부의 평가방법에 관한 것이다.

인간의 피부는 항상 외계(外界)와 접촉하고 있어, 다양한 자극을 받고 있다. 그 자극의 대표적인 것은 자외선이다. 자외선은, 외견상으로는 커다란 변화를 피부에 주고 있지 않은 경우라도, 피부 세포의 DNA의 절단이나 콜라겐의 변성 등을 유발하여, 피부노화의 원인이 되고 있다. 자외선은 항상 피부에 스트레스를 계속해서 주고 있다. 또한 여성에게 있어서는, 세안이나 화장 등의 일상적인 행위도 피부에 자극을 주고 있어, 이들 자극이 피부에는 잠재적인 스트레스로서 축적된다. 그리고 이들 자극(스트레스)에 대한 저항성이 어떠한 원인으로 감소하면 민감 피부로서 인식되게 된다. 이러한 피부의 외적 자극의 축적도를 본 발명에서는 피부의 스트레스 축적도라고 한다. 한편 민감 피부란, 명확한 피부 병변은 없지만 불리, 유해한 반응이 일어나기 쉬운 피부로서 파악되고 있다. 그리고 이러한 민감 피부의 원인으로서 스트레스의 축적이 일정 레벨에 도달하면, 피부의 감수성이 높아진다고도 한다. 또한 민감 피부는, 건강한 정상 피부보다 외적 자극에 대한 저항성이 낮아, 용이하게 피부 트러블이 생기는 피부라고도 할 수 있다. 최근 들어, 민감 피부를 의식하는 여성이 증가하는 경향이 있어, 화장품 등에 대해서도 보다 자극이 적은 것이 요망되어지고 있다.

화장품의 판매 현장에서는 미용 전문가에 의한 문진을 행하고, 피부 스트레스의 축적 상황이나 민감 피부 여부를 평가하여 피부에 주는 스트레스(자극)가 적은 화장품을 선택해 왔다. 그러나 최근 들어 통신판매 등, 화장품 전문가 부재의 판매방법이 보급되어, 이 때문에, 피부의 스트레스 상태를 확인하고, 또한 민감 피부의 레벨을 전문가가 아니더라도 간편하게 평가하는 것이 요망되어 왔다. 이것이 가능해지면, 미용 전문가의 문진에 의하지 않고도, 사용자의 피부의 스트레스 상태나 민감 피부인지 여부를 평가하여, 적절한 화장품을 스스로 선택하는 것이 가능해진다. 또한 사용자의 피부에 따라 적합한 화장품이나 화학박피제(chemical peeling agent)를 간단하게 선택할 수 있어, 그것에 의해, 피부의 염증 등의 피부 트러블이나 부작용을 회피하여, 화장품에 의한 스킨 케어나 화학박피 시술 등의 유익성을 보다 높일 수 있다. 이 때문에, 문진에 의하지 않고도, 피부의 외적 자극 노출 이력(피부 스트레스의 축적도)을 평가하고, 또한 민감 피부인지 여부를 객관적으로 판별하는 방법이 요구되고 있다.

특허문헌 1에는, 피부에 화장료를 도포하고, 그 후 박리되어지는 피부 각질층을 회수해서 관찰하여, 피부의 민감성을 평가하는 방법이 개시되어 있다. 그러나 이 방법은, 화장품마다 모두 검사해야만 하며, 또한 사용자의 피부 스트레스의 축적도는 평가할 수 없다.

특허문헌 2에는, 캡시노이드와 같은 자극성 물질을 피부에 도포하여, 민감 피부인지 여부를 평가하기 위한 방법이 개시되어 있다. 그러나 캡시노이드와 같은 자극성이 강한 것을 사용하는 시험방법은, 피험자에게 있어서도 바람직하지 못하다.

특허문헌 3에는, 얼굴 각질층의 칼프로텍틴 존재량을 측정하여, 민감 피부 여부를 평가하는 방법이 개시되어 있다.

비특허문헌 1, 2는, 열충격단백질(HSP)27이 계면활성제인 소듐 라우릴 설페이트(SDS)에 의한 피부 자극에 반응하여 피부에서 증가하는 것이 기재되어 있다.

일본국 특허공개 평10-295648호 공보 일본국 특허공개 제2005-296007호 공보 일본국 특허 제4469762호 공보

Ingeborg L.A.Boxman, et al., Experimental Dermatology, 2002, 11, 509-517. Ingeborg L.A.Boxman, et al., British Journal of Dermatology, 2002, 146, 777-785.

전술한 바와 같이, 피부 스트레스의 축적도를 평가하고, 민감 피부인지 여부를 객관적으로 평가하는 방법이 요망되고 있다. 그 평가방법은, 외과적으로 피부를 적출하는, 피부에 자극을 주는 등의 사용자에게 부담을 주는 방법이 아닌 것이 바람직하다. 본 발명은 사용자에게 부담을 주지 않고 피부 스트레스의 축적도를 평가하고, 또한 민감 피부인지 여부를 간편하고 확실하게 평가할 수 있는 생화학적 지표를 사용한 신규한 평가방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명의 구성은 아래와 같다.

(1) 피부 각질층의 열충격단백질(HSP)27의 발현량을 사전에 또는 동시에 측정한 정상의 인간 피부의 HSP27의 발현량과 대비하는 것을 특징으로 하는, 인간 피부의 스트레스 축적도의 평가방법.

(2) 피부 각질층의 HSP27의 발현량을 사전에 또는 동시에 측정한 정상의 인간 피부의 HSP27의 발현량과 대비하는 것을 특징으로 하는 민감 피부의 평가방법.

(3) 피부 각질층을 채취하는 채취 공정과, 상기 채취 공정에서 채취된 각질층 세포에 있어서의 HSP27의 발현량을 측정하는 측정 공정과, 상기 측정 공정에서 측정된 HSP27의 발현량을 건강한 정상 피부의 피부 각질층에 있어서의 HSP27의 발현량과 비교하는 비교 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 (1) 또는 (2)에 기재된 평가방법.

(4) 피험자의 평가 대상 부위의 각질층을 채취하는 채취 공정과, 상기 채취 공정에서 채취된 각질층에 있어서의 HSP27의 발현량을 측정하는 측정 공정과, 상기 측정 공정에서 측정된 HSP27의 발현량을 건강한 정상 피부를 가진 사람의 상기 평가 대상 부위의 각질층의 HSP27의 발현량과 비교하는 비교 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 (1) 또는 (2)에 기재된 평가방법.

(5) 피부 각질층의 HSP27의 발현량을 사전에 또는 동시에 측정한 표본 집단의 피부의 HSP27의 발현량 분포와 상대 비교하는 것을 특징으로 하는, 인간 피부의 스트레스 축적도의 평가방법.

(6) 피부 각질층의 HSP27의 발현량을 사전에 또는 동시에 측정한 표본 집단의 피부의 HSP27의 발현량 분포와 상대 비교하는 것을 특징으로 하는 민감 피부의 평가방법.

(7) 피험자의 평가 대상 부위의 각질층을 채취하는 채취 공정과, 상기 채취 공정에서 채취된 각질층에 있어서의 HSP27의 발현량을 측정하는 측정 공정과, 상기 측정 공정에서 측정된 HSP27의 발현량을 표본 집단의 상기 평가 대상 부위의 각질층의 HSP27의 발현량 분포와 비교하는 비교 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 (5) 또는 (6)에 기재된 평가방법.

(8) 피부의 각질층을 채취하는 공정이 테이프 스트리핑법에 의한 것인 (3), (4) 또는 (7) 중 어느 하나에 기재된 평가방법.

본 발명의 평가방법에 의하면, 피부 스트레스의 축적도를 각질층에 있어서의 HSP27의 발현량을 측정함으로써 평가할 수 있다. 또한 이 HSP27 존재량을 지표로 하여, 간편하게 피부가 민감 피부인지 여부를 평가할 수 있다. 또한, 본 발명의 평가방법은, 테이프 스트리핑법 등 간편한 조작방법으로 평가 시료를 채취하기 때문에, 피험자의 부담이 적어, 누구든지 간단하게 평가하는 것이 가능해진다. 또한 생화학적인 시험방법으로, 누가 측정해도 동일한 결과가 얻어지기 때문에, 종래와 같은 전문가의 면담방식에 의한 카운셀링이 불필요해진다.

도 1은 자외선 조사에 의한 스트레스 부하의 축적이 각질층에 있어서의 HSP27의 발현량의 증가에 반영되는 것을 나타낸 도면이다.
도 2는 SDS에 의한 저자극의 스트레스 부하가 인간 각질층에 있어서의 HSP27의 발현량의 증가에 반영되는 것을 나타낸 도면이다.
도 3은 민감 피부인 아토피성 환자의 정상 피부와 염증 피부의 각질층의 HSP27의 존재량을 측정한 도면이다. 아토피성 환자의 경우는, 정상 피부에도 스트레스가 축적되어 있는 것을 확인한 도면이다.
도 4는 건강한 정상인의 각종 부위의 피부 중의 HSP27을 ELISA법에 의해 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 스트레스에 일상적으로 노출되어 있는 부위일수록 HSP27의 측정값이 높다.
도 5는 표본 집단의 HSP27 발현량을 나타내는 히스토그램이다.
도 6은 피부의 민감성 앙케이트 결과와 HSP27량의 관계를 나타내는 도면이다.
도 7은 옥외 활동 경험의 앙케이트 결과와 HSP27량의 관계를 나타내는 도면이다.

이하, 본 발명에 대해서 상세하게 설명한다.

본 발명의 평가방법은, 피부 각질층에 있어서의 HSP27의 존재량을 지표로 하는 것을 특징으로 하고 있다.

HSP27이란 일련의 열충격단백질 패밀리의 하나로서 알려져 있는 분자량 27 KD의 단백질로서, 분자 샤프론으로서의 기능을 가지고 있다. 면역 스트레스에 수반하여 피부에서의 유전자 발현이 증가하는 것이 알려져 있다.

본 발명에 있어서의 민감 피부란, 명확한 피부 병변은 없지만 불리, 유해한 반응이 일어나기 쉬운 피부를 말한다. 또한, 건강한 정상 피부보다 외계 자극에 대한 저항성이 낮아, 용이하게 피부 트러블을 발생시키는 피부라고도 할 수 있다. 한편, 건강한 정상 피부란, 상기와 같은 민감 피부의 성질을 나타내지 않는 건강하고 정상적인 피부이다. 민감 피부에 있어서는, 경피 수분 증산량(TEWL)이 높아지고, 고주파 전도도(각질층 수분량)가 낮아지는 등의 경향이 있는 것이 알려져 있다. 또한, 민감 피부의 경우는, 접촉성 피부염이나 피부 거칠어짐이 일어나는 경우가 있다.

각질층은 피부의 가장 위에 있는 조직으로, 체외로부터의 이물질이나 자극으로부터 피부를 지키는 작용을 가지고 있다.

본 발명에 있어서의 평가 대상 부위는, 각질층을 입수할 수 있는 부분이라면 어떠한 부위도 포함할 수 있지만, 주된 부위로서는 안면, 경부(頸部), 상완부(上腕部)를 들 수 있다. 종래의 방법에 따라, 이들 부위의 피부 유래의 각질층을 얻을 수 있다. 그러나, 전술한 바와 같이, 외과적으로 피부를 적출하는 등의 방법은 사용자에게 부담을 주기 때문에, 테이프 스트리핑, 찰과(擦過) 등의 간편하게 각질층을 얻을 수 있는 방법이 바람직하다.

이렇게 해서 준비한 각 시료에 있어서의 HSP27의 발현량은, 종래부터 알려져 있는 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들면, HSP27에 대한 항체와의 반응에 기초하는 효소면역분석법(enzyme immunoassay), 방사면역분석법(radio immunoassay), 웨스턴 블로팅(Western blotting) 등의 방법을 사용할 수 있다.

각 시료로부터 HSP27을 그것 자체 기지의 생화학적 방법, 예를 들면 동결 융해법, 초음파 파쇄법, 호모제네이트법(homogenate method) 등을 매개로 가용성 분획을 조제한다. 추출 후, 신속하게 측정한다.

스트레스가 축적된 피부나 민감 피부는, 건강한 정상 피부에 비해 각질층에 있어서의 HSP27의 발현량이 유의하게 높기 때문에, 각질층에 있어서의 HSP27의 발현량의 많고 적음을 지표로 하여, 간편하게 스트레스의 축적도 또는 피부가 민감 피부인지 여부를 평가할 수 있다. 본 발명에 사용하는 각질층은, 테이프 스트리핑 등의 각질층의 표층 부분만을 각질 테이프로 채취하는 간단한 방법으로 채취할 수 있다. 또한, 본 발명은 피부에 자외선이나 화학물질 등의 자극을 주지 않고 HSP27의 발현량을 측정할 수 있다. 이 때문에, 사용자에게 부담을 주지 않고 사용자의 피부가 민감 피부인지 여부를 평가할 수 있다. 특히, 사용자의 피부에 따라 적합한 화장품이나 화학박피제를 간단하게 선택할 수 있어, 그것에 의해, 피부의 염증 등의 피부 트러블이나 부작용을 회피하여, 화장품에 의한 스킨 케어나 유익성을 보다 발휘시킬 수 있다.

본 발명의 평가방법은, 각질층을 채취하는 채취 공정과, 상기 채취 공정에서 채취된 각질층에 있어서의 HSP27의 발현량을 측정하는 측정 공정과, 상기 측정 공정에서 측정된 HSP27의 발현량을 건강한 정상 피부의 각질층에 있어서의 HSP27의 발현량과 비교하는 비교 공정으로 구성된다. 또는, 본 발명의 평가방법은, 각질층을 채취하는 채취 공정과, 상기 채취 공정에서 채취된 각질층에 있어서의 HSP27의 발현량을 측정하는 측정 공정과, 상기 측정 공정에서 측정된 HSP27의 발현량을 표본 집단의 각질층에 있어서의 HSP27의 발현량의 분포와 비교하는 비교 공정으로 구성된다. 이하에 이 평가방법에 대해서 설명한다.

먼저, 상기와 같이 하여 측정된 HSP27의 발현량을 건강한 정상 피부의 각질층에 있어서의 HSP27의 발현량과 비교한다. 또한, 피험자의 어떤 평가 대상 부위의 각질층에 있어서의 HSP27의 발현량을 측정하여, 측정된 HSP27의 발현량을, 건강한 정상 피부를 가진 사람의 동일 평가 대상 부위의 각질층에 있어서의 HSP27의 발현량과 비교해도 된다. 건강한 정상 피부를 가진 사람의 각질층의 HSP27의 발현량은, 복수 명의 건강한 정상 피부를 가진 사람으로부터의 데이터의 평균값을 사용함으로써, 보다 객관적인 평가가 가능하다.

또는, 피험자의 어떤 평가 대상 부위의 각질층에 있어서의 HSP27의 발현량을 측정하여, 측정된 HSP27의 발현량을, 표본 집단의 동일 평가 대상 부위의 각질층에 있어서의 HSP27의 발현량의 분포와 비교해도 된다. 표본 집단의 HSP27의 발현량의 분포를 사용함으로써, 보다 객관적인 평가가 가능하다.

이와 같이 비교한 결과, 측정된 HSP27의 발현량이 건강한 정상 피부의 HSP27의 발현량보다 유의하게 큰 경우, 또는, 표본 집단의 HSP27의 발현량 분포와 비교하여, HSP27의 발현량이 크다고 판단되는 경우에는, 스트레스의 축적이 크다고 평가하고, 또한 민감 피부일 가능성이 높다고 평가할 수 있다. 이 건강한 정상 피부의 시료는, HSP27을 측정하는 사람으로부터 채취해도 되고, HSP27을 측정하는 사람과 상이한 사람으로부터 채취해도 된다. 또한, 이 표본 집단은 통계적으로 유효한 규모에서 무작위로 추출하는 것이 바람직하지만, 목적에 따라서, 예를 들면, 성별, 연령별로 표본 집단을 추출하는 것도 바람직하다.

또한, 피험자의 어떤 평가 대상 부위의 각질층에 있어서의 HSP27의 발현량이, 건강한 정상 피부를 가진 사람의 동일 평가 대상 부위의 각질층에 있어서의 HSP27의 발현량보다 유의하게 큰 경우, 또는, 표본 집단의 동일 평가 대상 부위의 각질층에 있어서의 HSP27의 발현량 분포와 비교하여, HSP27의 발현량이 크다고 판단되는 경우에도, 스트레스의 축적이 크다고 평가한다. 또한 이 수치가 현저히 높은 경우에 민감 피부를 갖는다고 평가한다.

즉 스트레스 축적이 높다고 평가하는 경우, 측정되는 HSP27의 발현량 정도에 따라, 스트레스의 축적도의 정도를 평가할 수 있다. 측정되는 HSP27의 발현량이 건강한 정상 피부의 발현량, 또는, 표본 집단의 발현량 분포와 비교하여 현저하게 많다고 판단되는 경우는, 그 피부는 민감 피부의 성질을 강하게 나타내, 건강한 정상 피부 또는 표본 집단의 평균보다 외계 자극에 대한 저항성이 현저하게 낮아, 매우 용이하게 피부 트러블을 발생시킬 가능성이 높다. 또한, 측정되는 HSP27의 발현량이 건강한 정상 피부의 발현량과 비교하여 소량만큼만 증가하고 있는 경우, 또는, 측정되는 HSP27의 발현량이 표본 집단의 그 발현량 분포와 비교하여, 평균값보다 조금 크다고 판단되는 경우는, 그 피부는 스트레스의 축적이 표본 집단의 평균값보다 많지만, 외계 자극에 대한 저항성이 낮아 피부 트러블을 발생시킨다고 하는 민감 피부에 도달하지 않았다고 평가할 수 있다.

이하, 구체적인 실시예에 대해서 설명하지만, 본 발명은 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

(실험 1) 자외선 조사에 의한 피부 스트레스 축적도의 시험

(1) 자외선에 의한 스트레스 부하

건강한 남자 10명을 피험자로 하여 시험을 실시하였다.

자외선 조사장치로서, Multiple Solar Ultraviolet Simulator Model 601(솔라라이트사 제조)을 사용하고, 광원으로 150 W 크세논 램프를 사용하였다. 피험자의 배부(背部) 피부에, 색소침착을 유도하는 홍반이 생기도록 조사 강도를 조정하고, 170초간 자외선(UVB)을 조사하였다. 또한, 자외선 조사 부위와 비조사 부위를 비교함으로써, 자외선에 의한 스트레스 축적을 확인하였다. 인공 자외선 조사 전 및 조사로부터 5, 11, 17일째에 테이프 스트리핑법(각질층 체커: 아사히 바이오메드 제조)에 의해 피부 각질층 샘플을 채취하였다.

(2) 피부 각질층 중 단백 추출방법

균질화용 튜브(homogenizing tube)에 0.1% SDS/PBS(-) 200 ㎕를 채취하고, 이것에 상기 테이프 스트리핑한 각질층 체커를 넣어, 균질화용 막자(homogenization pestle)를 사용하여 점착면을 문지름으로써 테이프 상의 각질층으로부터 단백을 추출하였다.

(3) 피부 각질층 단백의 정량

각질층 추출액 중에 포함되는 단백량은 DC Protein Assay Kit(Bio-Rad 제조)로 정량하였다.

(4) 웨스턴 블롯법에 의한 HSP27의 정량

1.5 ㎍의 각질층 단백을 XP PANTERA Gel(5-20% 구배 젤(gradient gel): DRC사 제조)을 사용하여 SDS-PAGE에 의해 분리 후, 단백질을 PVDF막에 전사하고, StartingBlock Blocking Buffer(Thermo Scientific사 제조)로 블로킹을 행하였다. 1차 항체(HSP27 Polyclonal Antibody: Stressgen사 제조)를 1000배 희석, 2차 항체(Goat anti-mouse IgG: invitrogen사 제조)를 10000배 희석으로 반응시킨 후, ECLplus(BD Bioscience사 제조)를 사용하여, LAS-4000mini(후지필름사 제조)로 검출을 행하였다. 얻어진 밴드의 발광 강도는 Science Lab 2004 Multi Gauge(후지필름사 제조)로 수치화를 행하였다. 사전에 유전자 재조합 HSP27 단백질을 표준품으로 하여 작성한 검량선에 의해, 발광 시그널의 강도를 HSP27의 단백질량으로서 판독하여 평가를 행하였다.

(5) 결과

자외선에 의한 자극(스트레스)을 준 피험자의 각질층의 HSP27량의 측정 결과를 표 1, 도 1에 나타낸다. 자외선이 장기간에 걸쳐 피부에 스트레스를 축적시키는 것을 확인하였다.

자외선 조사에 의해 피부에 홍반이 발생하고, HSP27은 날짜 경과에 따라 증가하였다. 이것은 자극이 지속되어, 그 결과 스트레스가 축적되어 간 것으로 평가하였다.

실시예 2

(실험 2) 소듐 도데실 설페이트(SDS)에 의한 저자극의 스트레스 축적시험

피부의 HSP27을 증가시키는 것이 알려져 있는 계면활성제 SDS의 자극이 스트레스로서 축적되는 것을 확인하기 위해 건강한 정상 피부의 남녀 8명을 대상으로 하여 이하의 시험을 행하였다.

(1) 스트레스의 부하

1일 4회 1시간 간격으로 2일간, 좌전완(左前腕) 내측부를 10% SDS 수용액으로 세정하여 피부 거칠어짐(스트레스 상태)을 작성하였다. 또한 동일인의 우전완을 물로만 세정하여, 대조로 하였다. 또한, 좌전완이, 수분 증산량이 처리 전과 비교하여 상승해 있는 것을 확인 후에 이하의 측정을 개시하였다.

(2) 시료의 채취와 수분 증산량의 측정

피부 거칠어짐 처리 후(0일째), 다음날, 3일째, 5일째, 7일째, 14일째에 수분 증산량을 측정하는 동시에 테이프 스트리핑법에 의해 각질층 샘플을 채취하였다. 또한, 14일째에 있어서도 수분 증산량의 측정값이, 피부 거칠어짐 처리 전의 측정값까지 되돌아가지 않은 경우는 21일째, 28일째까지 측정을 연장하였다.

또한, 수분 증산량의 측정은, Courage＆Khazaka사 제조 테바미터로 측정하였다. 각질층은 각질층 체커(아사히 바이오메드 제조)에 의해 채취하였다.

(3) 피부 각질층 중 단백 추출방법

실험 1과 동일하게, 균질화용 튜브에 0.1% SDS/PBS(-) 200 ㎕를 채취하고, 이것에 상기 테이프 스트리핑한 각질층 체커를 넣어, 균질화용 막자를 사용하여 점착면을 문지름으로써 테이프 상의 각질층으로부터 단백을 추출하였다.

(4) 피부 각질층 단백의 정량

(5) 웨스턴 블롯법에 의한 HSP27의 정량

1.5 ㎍의 각질층 단백을 XP PANTERA Gel(5-20% 구배 젤: DRC사 제조)을 사용하여 SDS-PAGE에 의해 분리 후, 단백질을 PVDF막에 전사하고, StartingBlock Blocking Buffer(Thermo Scientific사 제조)로 블로킹을 행하였다. 1차 항체(HSP27 Polyclonal Antibody: Stressgen사 제조)를 1000배 희석, 2차 항체(Goat anti-mouse IgG: invitrogen사 제조)를 10000배 희석으로 반응시킨 후, ECLplus(BD Bioscience사 제조)를 사용하여, LAS-4000mini(후지필름사 제조)로 검출을 행하였다. 얻어진 밴드의 발광 강도는 Science Lab 2004 Multi Gauge(후지필름사 제조)로 수치화를 행하였다. 사전에 유전자 재조합 HSP27 단백질을 표준품으로 하여 작성한 검량선에 의해, 발광 시그널의 강도를 HSP27의 단백질량으로서 판독하여 평가를 행하였다.

(6) 결과

SDS 세정에 의한 자극(스트레스)을 준 피험자의 각질층, 및 대조의 HSP27량의 측정 결과를 표 2, 도 2에 나타낸다. 또한 수분 증산량의 변화를 함께 나타낸다.

SDS 세정에 의한 피부 수분의 증산은, 1일째에 피크에 도달하고 서서히 회복되어 가지만, HSP27은 14일째까지 증가한다. 이것은 피부의 스트레스가 축적되어 간 것으로 평가하였다.

(실험 3) 아토피성 피부염 환자의 스트레스 축적도의 평가

아토피성 피부염 환자는, 피부가 항상 외계로부터의 자극을 계속해서 받고 있어, 피부는 항상 스트레스 상태에 있다. 이러한 상태에 있는 환자의 피부 스트레스의 축적도를 측정하였다.

(1) 피부 각질층 채취방법

아토피성 피부염이라고 진단된 여성 환자 4명의 피부염을 나타내고 있는 경부 피부로부터 각질 체커(2.5 ㎝×2.5 ㎝: 아사히 바이오메드 제조)를 사용해서, 테이프 스트리핑을 행하여, 각질층을 채취하였다. 또한 피부염 증상을 나타내지 않는 상완부 피부로부터도 동일하게 하여 샘플링을 행하였다.

동일하게 하여, 건강한 정상 여성 3명의 경부 피부, 상완부 피부로부터도 샘플링을 행하여 대조로 하였다.

(2) 피부 각질층 중 단백 추출방법

균질화용 튜브에 1% SDS/PBS(-) 200 ㎕를 채취하고, 이것에 상기 테이프 스트리핑한 각질층 체커를 넣어, 균질화용 막자로 점착면을 문지름으로써 테이프 상의 각질층으로부터 단백을 추출하였다.

(3) 피부 각질층 단백의 정량

(4) 웨스턴 블롯법에 의한 HSP27의 정량

1.5 ㎍의 각질층 단백을 XP PANTERA Gel(5-20% 구배 젤: DRC사 제조)을 사용하여 SDS-PAGE에 의해 분리 후, 단백질을 PVDF막에 전사하고, StartingBlock Blocking Buffer(Thermo Scientific사 제조)로 블로킹을 행하였다. 1차 항체(Hsp27 Polyclonal Antibody: Stressgen사 제조)를 1000배 희석, 2차 항체(Goat anti-mouse IgG: invitrogen사 제조)를 10000배 희석으로 반응시킨 후, ECLplus(BD Bioscience사 제조)를 사용하여, LAS-4000mini(후지필름사 제조)로 검출을 행하였다. 얻어진 밴드의 발광 강도는 Science Lab 2004 Multi Gauge(후지필름사 제조)로 수치화를 행하였다. 발광 시그널의 강도를 HSP27의 상대량으로 하여 평가를 행하였다.

(5) 결과

아토피성 피부염 환자 및 건강한 정상인의 피부 각질층의 HSP27량의 측정 결과를 표 3, 도 3에 나타낸다.

표 3, 도 3으로부터 명확한 바와 같이, 건강한 정상인의 HSP27은 각질층 중에는 거의 존재하지 않지만, 아토피성 피부염 환자의 환부 피부로부터는 고농도로 HSP27이 검출되었다. 또한 아토피성 피부염 환자의 정상 피부로부터는, 피부염을 나타내고 있는 부위정도는 아니지만, 건강한 정상인에 비해서 고농도로 HSP27이 검출되었다. 이상의 결과로부터, 늘 스트레스를 받고 있는 아토피성 피부염 환자의 피부는 스트레스가 축적되어 있는 것을 알 수 있다. 또한 아토피성 피부염의 환부가 아닌 피부도 상대적으로는 HSP27이 높은 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로부터, 민감 피부의 지표로서도 HSP27을 측정하는 것이 유용하다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3

(실험 3-2) 외계의 스트레스를 항상 받고 있는 안면과 비교적 스트레스를 받지 않는 전완부나 둔부(臀部) 피부의 HSP27을 측정하여, 피부에 축적되어 있는 스트레스의 정도를 평가하였다.

시험방법

(1) 시료의 채취

건강한 정상 여성 8명으로부터, 뺨, 턱밑, 전완, 둔부로부터 테이프 스트리핑법에 의해 각질층 샘플을 채취하였다. 1부위로부터 4매 채취하였다.

(2) 피부 각질층 중 단백 추출방법

균질화용 튜브에 0.5% chaps 버퍼 400 ㎕를 넣고, 이것에 상기 테이프 스트리핑한 각질층 체커를 넣어, 균질화에 의해 테이프 상의 각질층으로부터 단백을 추출하였다. 1부위로부터 채취한 4매를 모아 1개의 튜브로 추출하여, 1샘플로 하였다.

(3) 피부 각질층 단백의 정량

(4) ELISA법에 의한 HSP27의 정량

각질층 추출액 중에 포함되는 HSP27량은 Total human HSP27 DuoSet ELISA kit(R&D systems 제조)로 측정하였다. 결과를 단위 단백량당 HSP27량으로 하여 표 4, 도 4에 나타내었다.

또한 표기는 평균값 ±S.E.로 나타내었다.

표 4, 도 4의 결과로부터 명확한 바와 같이, HSP27의 측정 결과는 일상적인 스트레스가 높은 안면(뺨)에서 특히 높고, 노출이 적은 둔부에서는 현저하게 낮았다. 이상의 결과로부터 HSP27은 피부의 일상적인 스트레스를 평가하는 지표로 할 수 있는 것이 명확해졌다.

실시예 4

(실험 4) 표본 집단의 각질층의 HSP27을 측정하여, 히스토그램을 작성하였다.

시험방법

(1) 시험 시료의 채취

무작위로 선발한 여성 445명을 대상으로 하여, 뺨으로부터 테이프 스트리핑법에 의해 각질층 샘플을 채취하였다. 샘플은 1부위로부터 1매 채취하였다.

(2) 피부 각질층 중 단백 추출방법

균질화용 튜브에 RIPA 버퍼 500 ㎕를 넣고, 이것에 상기 테이프 스트리핑한 각질층 체커를 넣어, 균질화에 의해 테이프 상의 각질층으로부터 단백을 추출하였다(추출액 A). 또한, 추출 후의 각질층 체커를, 별도의 균질화용 튜브에 옮겨, 1% SDS 함유 50 mM 트리스염산 버퍼 500 ㎕를 넣고, 균질화에 의해 테이프에 남은 각질층으로부터 단백을 추출하였다(추출액 B). 추출액 A는 HSP27의 정량 및 각질층 단백의 정량에 사용하고, 추출액 B는 각질층 단백의 정량에 사용하였다.

(3) 피부 각질층 단백의 정량

각질층 추출액 중에 포함되는 단백량은 BCA protein assay(Pierce 제조)로 정량하였다.

추출액 A와 추출액 B의 단백량의 합계를 total protein량으로 하였다.

(4) ELISA법에 의한 HSP27의 정량

각질층 추출액 중에 포함되는 HSP27량은 Total human HSP27 DuoSet ELISA kit(R&D systems 제조)로 측정하였다. 결과는 단위 단백량당 HSP27량으로 해석하였다. 표본 집단의 HSP27 발현량의 도수 분포표를 표 5에, 히스토그램을 도 5에 나타내었다.

표 5, 도 5에 나타낸 바와 같이, HSP27의 발현량은, 0.4 pg/㎍ total protein으로부터 50 pg/㎍ total protein을 초과하는 값까지의 넓은 범위에서 분포하고 있다. 평균값은 15.0 pg/㎍ total protein이었다. 이 도수 분포와 비교하여, HSP27의 발현량이 크다고 판단하는 기준은, 자유롭게 설정하는 것이 가능하지만, 예를 들면, 평균값 15.0 pg/㎍ total protein 이상의 값을 HSP27의 발현량이 크다고 판단해도 되고, 10.0 pg/㎍ total protein의 누적 도수가 약 50%이기 때문에, 10.0 pg/㎍ total protein을 초과하는 값을, HSP27의 발현량이 크다고 판단해도 좋을 것으로 생각한다. 어느 경우에도, HSP27의 발현량이 클수록, 인간 피부의 스트레스 축적도는 크다고 판단할 수 있다.

또한, 실험 4의 HSP27의 발현량은, 실험 3의 뺨 부위의 HSP27의 발현량의 1/10인데, 이것은 실험 4의 단백 추출방법에서는, HSP27을 포함하는 단백질을 추출한 후에, 1% SDS 함유 50 mM 트리스염산 버퍼를 사용하여 각질층의 단백질을 추출하고 있어, 실험 3과 비교해서 실험 4의 전체 단백질의 검출량이 증가한 것이 원인이다. 실험 3, 실험 4 모두 HSP27을 추출하는 공정에는 차이가 없고, HSP27은 용해성이 높기 때문에, 당해 공정에서 충분히 추출된다. 한편, 실험 4에서 추가한, SDS에 의한 추출방법에 의해 단백질의 거의 전량을 추출할 수 있지만, 당해 추출액 중의 HSP27을 측정하는 것은 불가능하다. 실험 3과 실험 4의 추출 공정이 상이하기 때문에, 실험 3과 실험 4의 데이터를 비교하는 것은 불가능하지만, 실험 3의 데이터 간의 비교, 실험 4의 데이터 간의 비교는 가능하다.

실시예 5

(실험 5) 인간 피부의 스트레스 축적도에 관한 앙케이트 결과와, HSP27량의 대비

실험 4의 표본 집단으로부터 무작위로 189명을 추출하고, 인간 피부의 스트레스 축적도에 관한 앙케이트를 실시하여, 그 결과와 HSP27의 발현량을 대비하였다.

(1) 피부의 민감성 앙케이트

피험자에게 피험자의 피부가 「비민감」, 「약간 민감」, 「민감」의 3종류 중 어느 것인지 선택하게 하였다.

하기 민감성의 10 요인을 피험자에게 제시하여, 비민감(민감하지 않다), 약간 민감(약간 민감하다), 민감(민감하다) 중 어느 것에 해당하는지 피험자에게 자기 판단케 하였다.

1 화장품을 사용하여 붉은 기나 가려움을 느끼는 경우가 있다

2　 청량감이 강한(시원한) 화장품이 피부에 맞지 않는 경우가 있다

3 에탄올이 들어간 화장품이 피부에 맞지 않는 경우가 있다

4 향수나 향료가 들어간 화장품이 피부에 맞지 않는 경우가 있다

5 피부가 약하기 때문에 화장품을 신중하게 고르고 있다

6 마사지 등 물리적인 자극에 의해 피부의 상태가 나빠지는 경우가 있다

7 평소의 생활에서도 자외선을 쐬거나 하면 피부가 붉어지거나, 따끔거리기 쉽다

8 땀을 흘린 뒤에 가려움이 생기는 경우가 있다

9 화장품이나 세제가 맞지 않아 붉은 기나 가려움이 생긴다

10 화장품의 피부 트러블에 의해 병원에 치료를 받으러 다닌 경험이 있다

「민감」을 선택하는 사람은, 인간 피부의 스트레스 축적도가 높고, 「비민감」을 선택하는 사람은 인간 피부의 스트레스 축적도가 낮을 것으로 예상하였다.

(2) 피부의 민감성 앙케이트 결과와 HSP27량의 관계

피부의 민감성 앙케이트 결과와 HSP27량의 관계를 표 6, 도 6에 나타낸다.

HSP27량 10.0 pg/㎍ total protein을 기준으로 하여, 기준값보다 낮은 사람은 인간 피부의 스트레스 축적도가 낮고, 기준값보다 높은 사람은 인간 피부의 스트레스 축적도가 높다고 판정하면, 피험자의 자각과 대응하는 경향이 있다.

(3) 옥외 활동 경험의 앙케이트

피험자에게 옥외 활동 경험에 대해서, 「있음」, 「없음」 중 어느 하나를 선택하게 하였다.

옥외 활동으로서, 스포츠나 정원 가꾸기(gardening)를 예시하였다.

옥외 활동 경험 「있음」이라고 회답하는 사람은 인간 피부의 스트레스 축적도가 높고, 「없음」이라고 회답하는 사람은 인간 피부의 스트레스 축적도가 낮을 것으로 예상하였다.

(4) 옥외 활동 경험의 앙케이트 결과와 HSP27량의 관계

옥외 활동 경험의 앙케이트 결과와 HSP27량의 관계를 표 7, 도 7에 나타낸다.

HSP27량 10~15 pg/㎍ total protein당을 기준으로 하여, 기준값보다 낮은 사람은 인간 피부의 스트레스 축적도가 낮고, 기준값보다 높은 사람은 인간 피부의 스트레스 축적도가 높다고 판정하면, 피험자의 옥외 자외선에 의한 스트레스 축적도와 대응하는 경향이 있다.

Claims

피부 각질층의 열충격단백질(HSP)27의 발현량을 사전에 측정한 정상의 인간 피부의 HSP27의 발현량과 대비하는 것을 특징으로 하는, 인간 피부의 스트레스 축적도의 평가방법.
피부 각질층의 HSP27의 발현량을 사전에 측정한 정상의 인간 피부의 HSP27의 발현량과 대비하는 것을 특징으로 하는 민감 피부의 평가방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
피부 각질층을 채취하는 채취 공정과, 상기 채취 공정에서 채취된 각질층 세포에 있어서의 HSP27의 발현량을 측정하는 측정 공정과, 상기 측정 공정에서 측정된 HSP27의 발현량을 건강한 정상 피부의 피부 각질층에 있어서의 HSP27의 발현량과 비교하는 비교 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 평가방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
피험자의 평가 대상 부위의 각질층을 채취하는 채취 공정과, 상기 채취 공정에서 채취된 각질층에 있어서의 HSP27의 발현량을 측정하는 측정 공정과, 상기 측정 공정에서 측정된 HSP27의 발현량을 건강한 정상 피부를 가진 사람의 상기 평가 대상 부위의 각질층의 HSP27의 발현량과 비교하는 비교 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 평가방법.
피부 각질층의 HSP27의 발현량을 사전에 또는 동시에 측정한 표본 집단의 피부의 HSP27의 발현량 분포와 상대 비교하는 것을 특징으로 하는, 인간 피부의 스트레스 축적도의 평가방법.
피부 각질층의 HSP27의 발현량을 사전에 또는 동시에 측정한 표본 집단의 피부의 HSP27의 발현량 분포와 상대 비교하는 것을 특징으로 하는 민감 피부의 평가방법.
제5항 또는 제6항에 있어서,
피험자의 평가 대상 부위의 각질층을 채취하는 채취 공정과, 상기 채취 공정에서 채취된 각질층에 있어서의 HSP27의 발현량을 측정하는 측정 공정과, 상기 측정 공정에서 측정된 HSP27의 발현량을 표본 집단의 상기 평가 대상 부위의 각질층의 HSP27의 발현량 분포와 비교하는 비교 공정을 구비한 것을 특징으로 하는 평가방법.
제3항, 제4항 또는 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
피부의 각질층을 채취하는 공정이 테이프 스트리핑법에 의한 것인 평가방법.