JP2009112255A - 皮膚のシミ形成を予測する皮膚検査方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、皮膚のシミ形成を予測するための皮膚検査方法を提供する。この方法は、皮膚中のMIF(macrophage migration inhibitory factor)の発現量が正常な皮膚中の発現量と比べて亢進している場合、シミの形成が起こり易い皮膚であると判断することを特徴とする。好ましい一態様では、被験対象部位から非侵襲的に採取された角質細胞を皮膚試料とし、前記皮膚試料から抽出したRNA又はタンパク質を試料として用いる。
【選択図】なし
Description
Watanabe H,J Biol Chem,279:1676−1683,2004.
[1]皮膚のシミ形成を予測する皮膚検査方法であって、皮膚中のMIFの発現量が正常な皮膚中の発現量と比べて亢進している場合、シミの形成が起こり易い皮膚であると判断することを特徴とする皮膚検査方法。
[2]前記MIFの発現量の亢進が、角質細胞中のMIF量を測定することにより決定される、[1]に記載の皮膚検査方法。
[3]前記MIFの発現量の測定が、前記皮膚試料から抽出したRNAを試料とし、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR法)によって行われる、[2]に記載の皮膚検査方法。
[4]前記MIFの発現量の測定が、前記皮膚試料から抽出したタンパク質を試料とし、免疫染色法、ウエスタンブロット法又は免疫測定法によって行われる、[2]に記載の皮膚検査方法。
[5]シミの形成抑制因子及び/又はシミ除去因子をスクリーニングする方法であって、候補化合物をMIFの発現及び/又は活性を阻害する能力について評価し、当該阻害能力を有するMIF抑制因子をシミの形成抑制因子及び/又はシミ除去因子として選定することを特徴とする皮膚検査方法。
(1)被験対象部位の皮膚試料を用意するステップ
(2)前記皮膚試料中のMIFの量を測定するステップ
(3)前記発現量からシミの形成し易さを評価するステップ
被験者皮膚の老人性色素班部位と非老人性色素班部位にそれぞれ半径1cmの円状のテープ(3M、Blenderm)を一枚貼り付け、十分に接着していることを確認した後、テープを剥がし取り、角質を含むテープを得た。得られた角質に含まれるRNAをRNA抽出キット(Ambion社製、RNAqueous−4PCR Kit)を用いて抽出した。すなわち、角質の付着したテープをテープごと350μLのLysis/Binding Solutionに入れ、proteinase K(Invitrogen社製)を添加し、56℃で1時間インキュベートした。その後、超音波破砕機を用いて分散させた後、350μLの64%エタノールを加えて攪拌し、テープを取り除き、角質抽出液を得た。付属のFilter CartrigeにRNAを吸着させた後に、100μLの抽出液でRNAを溶出した。得られた溶出液にDNaseIを加え、残存しているDNAを完全に除去した後、エタノールを用いてRNAを沈殿させてRNAを濃縮した。得られたRNAのペレットを必要量の水に溶解して、角質に含まれる残存RNAを得た。各RNAをRT−PCRキット(Invitrogen社製、SuperScript III Platinum SYBR Green Two−step qRT−PCR kit)を用いた定量PCR反応に供し、MIF遺伝子の発現量を定量した。MIF遺伝子の発現量はβ−アクチン遺伝子の発現量で規格化(ノーマライズ)した。なお、各遺伝子の発現量の測定に使用したプライマーは次の通りである。
AGAACCGCTCCTACAGCAAG(配列番号1)
CTTAGGCGAAGGTGGAGTTG(配列番号2)
β−アクチン用のプライマーセット
CACTCTTCCAGCCTTCCTTCC(配列番号3)
GTGTTGGCGTACAGGTCTTTG(配列番号4)
女性被験者の顔部皮膚の肝班部位と非肝班部位にそれぞれ半径1cmの円状のテープ(3M、Blenderm)を一枚貼り付け、十分に接着していることを確認した後、テープを剥がし取り、角質を含むテープを得た。以下、実験例1の方法によりMIFmRNAの発現量を測定した。
直径60mm dish(FALCON社製)でセミコンフルエントになるまで培養した正常ヒトメラノサイト(クラボウ社製)にrecombinant human MIF(R&D Systems社製)を添加し、48時間後にタンパク抽出試薬(ニッポンジーン社製、ISOGEN)を用いてタンパクを抽出した。チロシナーゼタンパク量の測定はウエスタンブロット法により行った。すなわち、正常ヒトメラノサイトから抽出したタンパクをタンパク濃度0.1mg/mLに統一し、同量のサンプルバッファーを加えて100℃で5分間処理した。そのうちの10μLをSDS電気泳動に供し、電気泳動後のゲルをトランスファー用メンブレン(Millipore社製、IPVH09120)にブロッティングした。次に、1%スキムミルク溶液(ブロッキング溶液)でメンブレンを1時間ブロッキングした後、ブロッキング溶液で200倍希釈したanti−tyrosinase抗体(LAB VISION社製、MS−800−P1)と室温で1時間反応させた。さらに、ブロッキング溶液で10,000倍希釈したPeroxidase−conjugated anti−mouse IgG(Jackson Immunoresearch社製、115−036−003)と室温で1時間反応させた後、ウエスタンブロッティング検出試薬(Amarsham社製、RPN2209)と室温で1分間反応させ、ライトキャプチャー(ATTO社製)にて発光パターンを撮影した。撮影後、75kDa付近に現れたチロシナーゼタンパクによるバンドを解析ソフト(ATTO社製)にて定量化した。
Claims (5)
- 皮膚のシミ形成を予測する皮膚検査方法であって、皮膚中のMIF(macrophage migration inhibitory factor)の発現量が正常な皮膚中の発現量と比べて亢進している場合、シミの形成が起こり易い皮膚であると判断することを特徴とする皮膚検査方法。
- 前記MIFの発現量の亢進が、角質細胞中のMIF量を測定することにより決定される、請求項1に記載の皮膚検査方法。
- 前記MIFの発現量の測定が、前記皮膚試料から抽出したRNAを試料とし、ポリメラーゼ連鎖反応法(PCR法)によって行われる、請求項2に記載の皮膚検査方法。
- 前記MIFの発現量の測定が、前記皮膚試料から抽出したタンパク質を試料とし、免疫染色法、ウエスタンブロット法又は免疫測定法によって行われる、請求項2に記載の皮膚検査方法。
- シミの形成抑制因子及び/又はシミ除去因子をスクリーニングする方法であって、候補化合物をMIFの発現及び/又は活性を阻害する能力について評価し、当該阻害能力を有するMIF抑制因子をシミの形成抑制因子及び/又はシミ除去因子として選定することを特徴とする皮膚検査方法。
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