JP2004518118A - 新規プロテオーム解析法及びそのための装置 - Google Patents
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Abstract
本発明は、プロテオームを、その本来の構造及び機能を保持しつつ、膜蛋白質と当該膜蛋白質と相互作用し得る化合物とにグループ分けし、当該膜蛋白質と当該化合物の両方を生物学的親和性に基づいて解析することを含むプロテオーム解析法、並びにそのための装置を提供する。
Description
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、膜蛋白質とそのリガンドの一括発見及び一括定量並びにその機能（相互作用）の解析を可能にする機能的蛋白質科学 （ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ） の方法論、技術及び装置に関する。本発明はまた、特定の疾患の発症、増悪、治癒に関わる膜蛋白質とそのリガンドを発見、単離、同定、定量し、それらの機能を解明し、それらの種類と定量値をデータベースとして構築することを含む、膜蛋白質とそのリガンドを指標とする新規な蛋白質薬理学 （ｐｈａｒｍａｃｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ） 的疾患解析方法、並びに当該データベースに関する。さらに本発明は、各生物の膜蛋白質ライブラリーの構築法に関し、また、蛋白質の構造と機能の保持を可能にし、且つ膜蛋白質の研究に必須である膜蛋白質の単離法、同定法、定量法、及び膜蛋白質の機能解明に必須のその他の基本的方法に関する。
【０００２】
発明の背景
分子生物学やゲノミクス（ゲノム科学）を含む創薬の基盤研究の進歩により、ここ数年間で創薬の様相が急速に変化し、ゲノム創薬に代表される新しい創薬方法が開発されつつある。
【０００３】
新規医薬品の発見は、特定の疾患において独自の生理活性を有する物質を見つけ出すことにある。このような生理活性を有する物質の多くは蛋白質であり、蛋白質の構造と機能の解明は医薬品開発において必須の課題である。
【０００４】
受精から発生・分化・増殖・代謝・死に至る生命活動にとって、膜包埋蛋白質は重要な機能を担っている。これら膜蛋白質は細胞外情報の細胞内伝達の膜受容体として、生理物質の細胞内外への特異的な膜運搬体として、並びに動的な膜構造を保持する膜の裏打ち蛋白質として機能している。精製、単離及び機能解析における困難性は、膜会合蛋白質の研究を遅延させてきた。
【０００５】
蛋白質の機能（生理作用）は、ゲノミクスにより決定された核酸配列からは予測できないため、遺伝情報を新薬に結び付ける方法の確立がポストゲノムに求められている。その一つとしてプロテオミクス（蛋白質科学）が注目を浴びている。１００，０００種を超えて存在する全蛋白質の単離、同定、機能の解明がプロテオミクスの目標である。状況が進むにつれ、ゲノム情報を蛋白質機能の理解にいかに結び付るかが、２１世紀創薬の戦略課題となっている。
【０００６】
生命活動全般に関わる蛋白質分子の構造と機能の高度な多様性はＤＮＡ分子の多様性の比ではない。この意味において、構造的に類似したヒトの２４本の染色体に対しＤＮＡ配列決定法のみを適用して成功を達成したゲノミクスの戦略を、多様性に富む対象を扱うプロテオミクスにそのまま適用することは非現実的である。また、ＤＮＡ配列のみでは生命活動の予測は不可能である。従って、蛋白質機能を解明し得るプロテオミクスが切望される。
【０００７】
分子構造と分子活性との関係は生物学の研究において基本的である。構造−活性関係は、任意の生体反応、例えば酵素の機能、細胞間連絡法、並びに細胞制御及びフィードバック系を理解するために重要である。
【０００８】
蛋白質は生命現象の源であり、他の分子（蛋白質分子、ＤＮＡ分子、合成化合物、光子などを含む）との相互作用においてその機能を発揮する。所定の蛋白質を理解するということは、当該分子の物理的又は化学的性質の単なる列記を超える。これは、互いに影響する分子を同定し、その相互作用の現象形態（生理作用）を解明することにより、どの分子とどのような相互作用が生じているかを見出すことを含む。
【０００９】
ある種の巨大分子が、非常に特異的な３次元的及び電子的分布を有する他の分子と相互作用し、そして結合することが知られている。この様な特異性を有する任意の巨大分子は、それが代謝中間体の加水分解を触媒する酵素であるか、イオンの膜輸送を仲介する細胞表面蛋白質であるか、近隣の細胞に対して特定の細胞を同定するのに役立つ糖蛋白質であるか、血漿中で循環しているＩｇＧ抗体であるか、核ＤＮＡのオリゴヌクレオチド配列であるか等に拘らず、受容体と考えることができる。受容体が選択的に結合する種々の分子はリガンドとして知られている。
【００１０】
既存の医薬品の約半数は細胞膜上の受容体を介して作用することが知られている。従って、新規膜蛋白質とその生理的リガンドの解明は、種々の疾患の新規治療薬開発に画期的なスクリーニング系を提供する。さらに、疾患に関わる新規・既知の膜蛋白質・リガンドのデータベースの構築は、ゲノム薬理学が到達できない疾患の分子動力学の解明を可能とし、新規診断法及び新規治療薬の開発に繋がることが期待される。
【００１１】
未知の受容体及びリガンドの発見には多くの方法が利用可能であるが、従来のアイデア、方法及び実験から得られうる受容体又はリガンドの数は、それらの特徴によりしばしば制限される。複数のペプチドからなる複合型の受容体の発見には、依然としてより困難な問題が伴う。新規受容体及びリガンドは、Ｘ線結晶回折又は遺伝子組換え技術等の新規技術の適用により見出される。しかし、このような新規方法は、偶然の一致に依拠し、長期間の生化学的研究を必要とするか、又は極めて限られた分子種にのみ適用可能であった。
【００１２】
以上の考察を踏まえると、その生理機能の一部の解明（＝生理的リガンドの同定）のために、プロテオミクスの標的として膜受容体や膜運搬体等の膜蛋白質を研究することは、大いに意義がある。
【００１３】
従来のプロテオーム研究は、蛋白質分離手段として、もっぱら二次元電気泳動法に依拠してきた。しかしながら、所定の細胞の全蛋白質を解析する場合、現行法は、以下の５つの問題を抱えている。
【００１４】
第１に、生体試料全体を一枚のゲル上で電気泳動すると、高分子量の蛋白質や不溶性膜蛋白質は泳動されずに原点付近に残るために解析自体が不能になる。従って、従来の二次元電気泳動法は、細胞に発現する全蛋白質の解析ができず、特定の蛋白質（主として、可溶性の低分子量蛋白質）の解析に用いられていた。２０世紀の生物学は分子生物学技術の開発によって劇的な発展を遂げたが、標的とされた蛋白質の多くは可溶性蛋白質であった。初期のプロテオーム研究は、血漿中に検出される蛋白質の総数が約２００個であるが、細胞破砕液に含まれる蛋白質の数が１４００〜４０００個であることを明らかにした。ヒト蛋白質をコードする約３００００個の遺伝子から発現する蛋白質の総数は１００，０００個を超えると予測される。このことは、最高感度のプロテオミクス技術によってさえも全蛋白質の数％しか検出できないことを意味する。
【００１５】
如何なる生命現象も蛋白質の機能として説明することができるが、同時に生命は自己と非自己を膜で区切ることで誕生した。すなわち、外界の非自己を認識し、自己をそれに応答させる仕事は、膜蛋白質により行われている。ところが、現在のプロテオミクス技術で検出不能の蛋白質の多くは、膜に会合して、又は膜に埋め込まれてその機能を示す、生命活動に重要な役割を担うこれら膜蛋白質である。
【００１６】
第２に、複数の蛋白質からなり、細胞中の特有の機能を発揮する蛋白質複合体は、界面活性剤を含む緩衝液中で泳動すると疎水性相互作用に基づく蛋白質間の結合が解離するために、実際に生体に存在する構造（蛋白質の四次構造）と機能を解析することができない。
【００１７】
第３に、生体試料中に含まれる全蛋白質をグループ分けする有効なアイデア、方法又は技術が提供されていない。合計約３０，０００個のヒト遺伝子から発現する全蛋白質数は１００，０００個を超える膨大な数にのぼる。それらは、同一遺伝子からの転写後にスプライシングに供され、それによりペプチド鎖が他よりも短い蛋白質が生成し、そして翻訳後には糖質、脂質、燐酸基等の種々の修飾に供される。その結果、プロテオミクスの標的である蛋白質は、ゲノミクスの標的であるＤＮＡポリマー分子に比べて、はるかに複雑な分子群からなる。これらの事実に基づくと、目的（核酸配列を決定すること）のみに基づく方法論（核酸の配列決定）しかプロテオームの多様な構造と機能を解明できないという仮説が提起される。従って、プロテオーム解析の前に、生体試料に含まれる蛋白質を、何らかのアイデアに基づいてグループ分けすることが非常に重要であり、そして前処理の幾つかの試みが、今日までになされている。例えば、Ｍｏｌｌｙら ［Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６７， ２８７１−２８８１ （２０００）］ 及び Ｓａｎｔｏｎｉら ［Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２１， １０５４−１０７０ （２０００）］は、強力な溶解剤を用いて試料を前処理したが、全ての蛋白質は可溶化しなかった。Ｈｅｒｂｅｒｔら ［Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２１， ３６３９−３６４８ （２０００）］ 及び Ｚｕｏら ［Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２８４， ２６６−２７８ （２０００）］ は、それらの等電点に基づき分離することにより試料を前処理したが、標的蛋白質に応じて適切な範囲の等電点を設定することが困難なため、等電点電気泳動をすることはできなかった。これらの試みは、電気泳動法の部分的な改善を目的としており、本発明によって実現される全蛋白質のグループ分けによる全プロテオーム解析を目的としていないことに留意されるべきである。しかしながら、グループ分けの効果的なアイデアは現在までに何ら提唱されていなかったため、試料調製からその後の解析に至るまで試料をグループ分けしない同様の方法が用いられている。これは、プロテオミクス研究を上記の２つの問題と直面させる。
【００１８】
第４に、プロテオミクスの従来の研究では、ゲルを小さな画分に区分し、特定の溶液を使用して各画分から蛋白質を抽出するという時間を浪費する多工程の複雑な操作が、ＭＳ解析前に必要とされる。この方法の複雑な操作は、装置の小型化、測定時間の短縮、複数の試料の処理、又は装置全体の自動化を妨げる。
【００１９】
第５の問題は、多くの種類の、いわゆる「量が少ない蛋白質 （ｌｏｗ−ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）」が存在することである。酵母では、たった１００個の遺伝子が、全蛋白質のうち５０重量パーセントをコードしており、このことは、残りの５０％の蛋白質が数千の遺伝子の産物であることを意味する。多くの最も重要な蛋白質（例えば、調節蛋白質、又は受容体を含むシグナル伝達関連蛋白質）が、「量が少ない蛋白質」に含まれ、電気泳動に基づく現在のプロテオーム解析法は、それらを解析することができない。
【００２０】
電気泳動のこのような限定された能力を解決し、かつ蛋白質間相互作用を解明するために、ＩＣＡＴ（同位体コード親和性タグ）法 ［Ｇｙｇｉら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １０， ９９４−９９９ （１９９９）］、酵母のツーハイブリッドシステム、ＢＩＡ−ＭＳ−ＭＳ、蛋白質アレイ法（溶液又はチップ） ［Ｚｈｏｕら、ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９， Ｓ３４−Ｓ３９］ 又はＬＣ−ＭＳ−ＭＳのペプチドミックスなどの多くの試みがなされている。しかしながら、これらの新規方法及び技術論は、プロテオミクスの究極目的である全プロテオームの発現解析、相互作用解析及びネットワーク解析を実現していない。固相蛋白質アレイ法（チップ法） ［Ｆｕｎｇら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １２， ６５−６９ （２００１）］ 及び液相蛋白質アレイ法 （例えば、蛍光コードビーズ ［Ｆｕｌｔｏｎら、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４３， １７４９−１７５６ （１９９７）］ ［Ｈａｎら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｐｔｅｃｈｎｏｌ． （ｉｎ ｐｒｅｓｓ）］ を含む上記方法のうち最も有望な蛋白質アレイ法でさえも、２つの最も重要な基本的技術論、即ち、全プロテオームの精製及び分離、並びに支持体上への全プロテオームの選択的固定化を実現できていない。
【００２１】
従って、本発明の目的は、プロテオーム研究が現在直面している全ての問題を解決し、それによって全蛋白質のうち、生体機能及び疾患の解明に重要であると認識され、且つその機能を保持しつつ精製及び単離するという最大の困難性によりその研究をはるかに遅れさせていた膜蛋白質のプロテオーム研究を初めて可能とするアイデア、方法及び技術を提供することである。より具体的には、本発明は、膜蛋白質のそれに対するプロテオーム研究に注目し、膜蛋白質の無傷での単離、膜蛋白質がそれら本来の構造と機能を保持する膜蛋白質ライブラリーの構築、そのリガンドとの相互作用の観点からの膜蛋白質の機能の説明（即ち、膜蛋白質本来のエフェクター分子、即ち、リガンドの発見及び同定）、並びにこの目標のための、任意の膜蛋白質の解析を許容する基本的なアイデア、方法、技術及びデバイスの提供を目的とする。さらに、本発明は、それらが関与する疾患の機序の解明における使用のために、このように得られた膜蛋白質及びそれらの生理リガンドの情報を集積してデータベースとすることを目的とし、さらにこのような疾患の新規診断法を確立し、新規治療薬の開発への扉を開くことを目的とする。
【００２２】
発明の簡単な要約
本発明は、膜蛋白質のプロテオーム研究のために、生体を構成する全蛋白質を膜蛋白質とそれ以外の可溶性蛋白質にグループ分けするという、本分野で現在まで誰も提起しなかった基本アイデアを提供する。本発明は、蛋白質がその機能を発揮している本来の局在部位に着目するというグループ分けのアイデアに基づく。
【００２３】
可溶性蛋白質のみを電気泳動し、膜蛋白質を新規方法により解析するというこのような洞察及び導入（即ち、膜蛋白質を、細胞膜脂質二重層モデルの人工リポソームに包埋し、膜蛋白質ライブラリーを構築する）は、電気泳動による膜蛋白質解析における困難性を解決し、そしてグループ分けした後に、可溶性蛋白質に対する生物学的親和性を利用する全蛋白質（膜蛋白質及び可溶性蛋白質）解析を通じて膜蛋白質の機能（可溶性蛋白質との相互作用）を解析するという基本原理を確立する。この本質的な技術論はまた、膜蛋白質間又は可溶性蛋白質間の相互作用のスクリーニング及び解析に適用可能であり、将来のプロテオミクスに対して革新的な理論を提供する。
【００２４】
より詳細には、本発明は、生体中の全蛋白質を膜蛋白質と可溶性蛋白質とにグループ分けし、膜蛋白質とそのリガンドの生物学的親和性に基づいてそれらを一括して解析することを特徴とするプロテオーム解析方法及びそのための種々の装置を提供する。本方法は、以下の工程を含む：
（１） 生体試料から可溶性蛋白質画分を単離し、ゲル電気泳動により画分中の可溶性蛋白質を分離し、蛋白質をその生理的機能を保持して固定化し得る表面を有するリガンド支持体に泳動後のゲルを接触させて、ゲル中の可溶性蛋白質をリガンド支持体に移行させる；
（２） 細胞試料から膜画分を単離し、膜画分をリポソームと融合させて、全ての膜蛋白質がその脂質二重層に付着若しくは貫通した膜蛋白質ライブラリー（膜蛋白質包埋リポソームのセット）を調製する；
（３） リガンド支持体上に固定された可溶性蛋白質を膜蛋白質ライブラリーと接触させて、可溶性蛋白質に対して親和性を有する膜蛋白質をリガンド支持体上に捕捉する；および
（４） 親和性を有する膜蛋白質および可溶性蛋白質の両方もしくはいずれか一方を、これら蛋白質の物理的又は化学的性質の少なくとも１つを解析し得る手段により分析する。
【００２５】
好ましくは、蛋白質の物理的又は化学的性質の少なくとも１つを解析し得る手段は、質量分析による解析であり、従って、適切なリガンド支持体は、質量分析用プレートである。
【００２６】
本発明により、具体的には以下の課題が解決される。
膜蛋白質が、蛋白質変性剤、蛋白質可溶化剤、その他膜蛋白質が存在する生理条件を逸脱させるいかなる処理条件も使用せずに、その疎水性領域及び親水性領域の生体状態を維持して人工リポソーム膜に移行するので、膜蛋白質の２次、３次、４次構造及び生理機能の保持が可能となる。受容体については、ＧＰＩ型、ＧＰＣＲ型及びオリゴマー型受容体を含む任意の生体膜型受容体の任意の構造と機能の保持を可能とする。従って、全ての膜蛋白質が、構造と機能を保持したまま調製でき、それによって医学、農学を含む全ての生物学領域において膜蛋白質研究の困難さが払拭される。
【００２７】
リガンドを含む可溶性蛋白質のみが電気泳動法により分離されるので、任意の可溶性蛋白質が、不溶性蛋白質の混入によって種々の妨害を受けることなく解析され得る。
【００２８】
一次元及び二次元電気泳動法で分離した可溶性蛋白質を質量分析用プレート上に直接転写させることにより、操作時間が劇的に短縮し、質量分析用プレートに移行すべき蛋白質量の増加により発現量が低い蛋白質の検出が可能になり、装置が小型化及び自動化し、処理すべき試料数が増加する。
【００２９】
膜蛋白質が移行したリポソームを支持体上に固定された種々のリガンドと接触させ、両者の生物学的親和性を利用して精製することによって、高度に精製された、目的とする膜蛋白質・リガンド複合体が、単離され得る。
【００３０】
本発明では、膜蛋白質とリガンド（拮抗剤を含む）の分子間の純粋な相互作用は、両分子が高純度であるか、他の多数の物質と共存しているかにかかわらず、また、細胞内情報伝達物質若しくは転写調節物質による影響を受けることなく測定され得る。換言すれば、細胞の応答性に依拠した相互作用検出法では、リガンドの生理学的作用点が、膜蛋白質か、細胞内情報伝達物質か、転写調節物質か、あるいはその他の作用点かが不明なままである。それに反して、本発明は、膜蛋白質とリガンドのみの相互作用の検出を提供する。
【００３１】
膜蛋白質・リガンド複合体を質量分析用プレート上で精製することにより、これら両者をＭＡＳＳ分光計で一括して検出することが可能となる。
【００３２】
膜蛋白質・リガンド複合体の形成と検出により、膜蛋白質の機能（当該リガンドとの相互作用）が明らかとなる。
【００３３】
本発明はまた、所定の疾患に罹患した生物（ヒト、植物、動物及び全ての他の生物を含む）から採取した試料を用いて上記方法によりプロテオームを解析し、得られた解析データを健常な同種生物のそれと比較することを含む、該疾患特異的に量又は特性において変化を示す膜蛋白質及び／又はそのリガンドを同定する方法を提供する。この方法を複数の疾患に適用し、得られたデータを集積することにより、診断用データベースが構築され得る。このように、疾患特異的な膜蛋白質とそのリガンドを見出し、その定量値をデータベースに入力し、そのデータを健常な同種生物のデータと比較することにより、膜蛋白質とリガンドという２元の蛋白質薬理学データに基づいた疾患の診断が利用可能となる。
【００３４】
ゲノム薬理学は、患者の遺伝的素因解析、あるいは静的な病因分析により課される限界を有する。ゲノム薬理学の解析結果は、患者の疾患とはほとんど直接関連がなく、それ故、動的に変化し、疾患を引き起こす蛋白質の情報を提供することはできない。これに対して、蛋白質薬理学は、生体反応を司る蛋白質の動態を直接教示しており、蛋白質の変化を通じて患者の現在の疾患状態を動的に示す。
【００３５】
ゲノム薬理学情報の収集は患者の遺伝的素因に関わる個人情報に抵触し、個人、人種及び国家によっては、しばしば解決不能な倫理上の問題であり得る。しかしながら、蛋白質薬理学情報は、患者の疾患原因の理解に関するものであり、通常病院で実施される検査及び診断と同様に収集されるので、２１世紀の生物科学観と倫理観の葛藤に巻き込まれる心配はない。
【００３６】
膜蛋白質とリガンドの２元データを一括して解析できるため、疾患が膜蛋白質を介する情報伝達の欠陥により引き起こされる場合に、疾患が膜蛋白質の量及び特性の変化、リガンドの量及び特性の変化、又はその両方により引き起こされるのか否かにつき、疾患の原因が簡便に診断され得る。
【００３７】
本発明の以上の構成を全自動装置として組み立てれば、画期的な産業上の利用分野が開拓され得る。その一例は、全自動膜蛋白質・リガンドプロテオーム解析システムである。その構成要素の概略図を図１に示す。なお、膜蛋白質の研究目的に応じて、本発明に基づいて種々の他の装置を組み立てることが可能なことは言うまでもない。
【００３８】
本発明は、ゲノム配列から相同性検索によりＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を予測することを含むオーファンリガンドの研究はもちろんのこと、ゲノム配列及びコンピューターを用いる相同性に基づく予測技術では到底発見不可能なその他の全てのタイプの受容体（ＧＰＩ型、オリゴマー型）とそのリガンドの発見、同定、解析に利用可能である。
【００３９】
その上、本発明は、今なお困難を極める全てのタイプの膜蛋白質（受容体以外の膜蛋白質）の発見、同定及び解析に多大な貢献をすると考えられ、従って、全膜蛋白質とリガンドが関与する疾患の解析、診断薬・診断法の開発、治療薬の開発を目的とする、いわゆる「受容体関連創薬型」医薬品を含むいわゆる「膜蛋白質関連創薬型」医薬品の開発を可能にする。
【００４０】
本発明は、生物学研究史上困難を極めた膜蛋白質研究に画期的な方法論を導入し、医療への貢献のみならず、２１世紀初頭の全地球的課題である食料・環境を巡る重要な問題の解決を目的とする、生物の新機能の発見と利用及びそれを応用した新しい産業を生み出す駆動力となるであろう。
【００４１】
本発明のこれら及び他の目的及び利点、並びに本発明の他の特徴は、本発明の以下の説明から明らかとなるであろう。
【００４２】
発明の詳細な説明
１．用語及び本発明の一般的態様
以下の用語は、本明細書において使用される場合、下記の一般的意味を有する。また、本発明の一般的態様は以下の通りである。
【００４３】
（ｉ） 「相補的」とは、受容体とそのリガンドが相互作用する表面の形態的（ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ）適合性又は一致性をいう。換言すれば、受容体とそのリガンドは相補的であり、そしてそれ故、その接触表面特性は相互に相補的である。
【００４４】
（ｉｉ） 「リガンド」は、特定の受容体により認識される分子である。本発明におけるリガンドの例としては、生理学的リガンドに限定されず、細胞膜受容体に対するフルアゴニスト、パーシャルアゴニスト、アンタゴニスト及びインバースアゴニスト、毒素、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、鎮静剤、オピエート、ステロイド等）、ペプチド、酵素、酵素基質、補酵素、薬物、レクチン、糖、オリゴヌクレオチド、核酸、オリゴサッカライド、蛋白質、及びモノクローナル抗体が挙げられる。リガンドは天然分子でも人工分子でもよい。天然リガンドの局在は限定されない。それは、大気圏を含む地球表面上に存在する任意の物質、生物が分泌する物質、細胞内物質、細胞小器官内物質、核物質などであり得る。
【００４５】
（ｉｉｉ） 「受容体」とは、特定のリガンドに対する親和性を有する分子である。受容体は天然分子でも人工分子でもよい。これは、単独で又は他の分子種との複合体として機能する。受容体は、共有結合により又は非共有結合により、直接的に又は特定の結合物質を介して複合受容体（オリゴマー受容体）を形成する。本発明により使用され得る受容体としては、抗体、細胞膜受容体、特定の抗原決定基（例えばウイルス、細胞又は他の材料上にあるもの）と反応するモノクローナル抗体及び抗血清、薬物、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、補酵素、レクチン、糖、ポリサッカライド、細胞、細胞膜、及びオルガネラが挙げられるがこれらに限定されない。受容体はしばしば、当該分野において抗リガンドと称される。本明細書において「受容体」なる用語が使用される場合、意味の相違は意図されない。
【００４６】
さらに本発明においては、その構造・機能にかかわらず、任意の膜受容体、膜チャネル、膜ポンプ、膜運搬体、膜裏打ち蛋白質、及びそれら蛋白質に会合により結合する物質が、受容体もしくは膜蛋白質と広く記載される。なぜなら、本発明の方法によれば、それらを単離・同定し得ることが当業者に容易に認識されるからである。
【００４７】
２つの巨大分子が分子認識を介して結合して複合体を形成する場合、「リガンド・受容体複合体」が形成される。受容体の局在は、狭義の細胞膜（細胞外層を形成するいわゆる原形質膜）に限定されない。受容体とは、共通する構成物である脂質二重層を有する任意の膜に結合する分子をいう。例えば、核膜に結合するＤＮＡポリメラーゼ複合体は、ＤＮＡの複製及び修復に重要であり、ＲＮＡポリメラーゼは、転写に重要であり、小胞体膜に結合するリボソームは、蛋白質の翻訳に重要である。ミトコンドリア膜に結合する酸化還元酵素群は、ＡＴＰ産生に重要な役割を担っており、ペルオキシゾーム膜の代謝関連酵素群は、過酸化物の代謝や熱の発生に関わっており、ライソゾーム膜に含まれる分解酵素群は、蛋白質、核酸、糖質及び脂質の分解に関わっており、ゴルジ装置の膜蛋白質は、蛋白質合成後のグリコシル化、及び合成された蛋白質若しくは脂質の膜輸送において重要な機能を有する。さらに細胞内の情報伝達に深く関わるリン酸化酵素群、並びに脱リン酸化酵素群の作用する足場として種々の細胞内膜表面が関わっている可能性が示唆される。以上の例示は、受容体（膜蛋白質）の重要な機能をその例示範囲に限定するものではない。膜蛋白質が関わる生命現象の多様性が示されるにつれて、本発明により新たに同定される膜蛋白質及びそれらの機能は、全て本発明に包含される。
【００４８】
受容体と脂質二重層の位置関係は変動する。最も一般的なものは、蛋白質の疎水性領域と脂質二重層の疎水性領域との疎水性相互作用によって安定化され、且つ数回折り畳まれた膜貫通型のもの（Ｇ蛋白質共役型受容体）である。これには、脂質二重層の外側の脂質層に埋め込まれたＧＰＩアンカー型受容体（グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型受容体）も含まれる。例としては、細胞の外側の表層に固定された糖蛋白質、糖脂質、オリゴマー糖質、細胞の内側に固定されたＧＴＰ／ＧＤＰ共役蛋白質群を含む広義のオリゴマー受容体構成分子群、膜の形状の維持及び変化に重要な役割を果たす膜の裏打ち蛋白質群、それらと結合する機能性蛋白質群などが挙げられる。以上は、受容体（膜蛋白質）と脂質二重層の位置関係の例示である。例示は限定的ではない。本発明によりさらに多彩な位置関係が明らかにされるにつれ、本発明はこのような任意の関係を含むものである。
【００４９】
本発明において研究対象となり得る受容体は未知なものを含め多数存在する。以下の例示は、これらの一部である。
【００５０】
ａ） 癌特異的膜蛋白質
癌細胞膜に発現し機能する膜蛋白質を同定し、その機能を解析することにより、癌細胞に対する増殖抑制、アポトーシス誘導、転移抑制等の作用機序を持った医薬品の開発が期待される。当該膜蛋白質に特異的な抗体自体が、有効な医薬品として使用され得るとともに、毒素等を標的癌細胞に送達するターゲッティング療法にも適用可能である。
【００５１】
ｂ） 自己免疫疾患において自己抗体（リガンド）、又は臓器移植において自己組織障害性リンパ球が攻撃する組織の細胞膜に発現する膜蛋白質を同定することによって、自己抗体あるいは自己抗原特異的組織障害性リンパ球との結合をブロックするのに有用な関連診断薬又は医薬品を開発することができる。特に、自己免疫疾患の疾患多様性は、組織特異性に基づくと考えられており、アジソン貧血、糸球体腎炎（原発性、ＩｇＡ）、グレーブス甲状腺機能亢進症、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、悪性貧血、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、乾癬、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎、白斑、クローン病、特発性血小板減少性紫斑病及び他の疾患において自己抗体又は自己組織障害性リンパ球が攻撃する膜抗原を単離及び同定することができれば、副作用が軽減され、且つ個々の自己免疫疾患に特異的な医薬品を開発することができる。
【００５２】
ｃ） 人工リガンド（拮抗剤）は存在するが、内因性のリガンドが未知であるベンゾジアゼピン受容体、カンナビノール受容体、シグマ受容体１、シグマ受容体２の内因性リガンドを特定することによって、及びＮＭＤＡ受容体のフェンシクリジン結合サイトに結合する内因性リガンドを特定することによって、中枢神経疾患の画期的な治療薬を開発することができる。
【００５３】
ｄ） 微生物に発現する受容体
微生物の生存に必須な膜運搬体に結合するリガンドの決定は、新しい作用機序を有する抗生物質の開発に有用である。特に、日和見真菌、原生動物及び現在使用されている抗生物質に耐性を有する細菌に対する抗生物質が価値がある。
【００５４】
ｅ） リガンドとしての核酸に対する受容体
核酸配列を合成し、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列にハイブリダイズする膜蛋白質を単離、同定及び機能解析し、外因性核酸と細胞膜機能の全く新しい相互作用を解明し、有用な関連診断薬又は医薬品の開発を導くことができる。例えば、アンチセンス技術に基づく医薬品の細胞内への有効な輸送系、又はＤＮＡ，ＲＮＡウイルスの新しい感染防御機構を開発することができる。
【００５５】
ｆ） リガンドとしての脂質又は脂質代謝物に対する受容体
これらの低分子量化合物を合成し、交差反応する膜蛋白質を単離、同定、機能解析し、有用な関連診断薬又は医薬品を開発することができる。例えば、アラキドン酸カスケード中の多くの代謝物の平滑筋の収縮及び弛緩作用に関与する全く新しい受容体の発見、並びに細胞の形態、移動、増殖及び接着に関与するＥＤＧ（内皮分化遺伝子）受容体の新規サブタイプの発見によって、中枢神経疾患、循環器疾患、癌、消化器系疾患、免疫系疾患の領域において全く新しい作用機序を有する医薬品を開発することができる。
【００５６】
ｇ） 膜蛋白質プリオン
正常プリオンから病原性プリオンへの転化機構の解明のためには、その本来の構造であるＧＰＩ型プリオン膜蛋白質をリポソームに包埋させた再構成系を使用し、リポソーム膜からの遊離機構、遊離促進分子の単離、膜蛋白質型プリオンと遊離プリオンの病原性プリオンへの転化率の解析等を、本発明に基づき研究する。結果として、病原性プリオンの測定系、病原性プリオンの除去法、病原性プリオン感染防御法、ＣＪＤ発症の遅延法、ＣＪＤ発症患者の治療法等を開発することができる。
【００５７】
（ｉｖ） 「生体膜」とは、構成成分として脂質二重層を有する任意の膜をいい、細胞膜、並びに任意の生物の細胞内小器官を構成する膜（例えば、小胞体膜、ゴルジ体膜、核膜等）が挙げられる。
【００５８】
（ｖ） 「リポソーム」とは、脂質二重層により外界から仕切られた粒子を意味する。リポソームの脂質二重層は、物理的、化学的及び生物学的に生体膜に類似する。好ましくは、リポソームは、植物から抽出された脂質等の膜構成成分から構成される。
【００５９】
（ｖｉ） 「膜会合物質」とは、生体膜を貫通する、又は生体膜の内側若しくは外側に結合する任意の物質をいう。膜会合物質としては、細胞の外側から内側へと情報を伝達する膜受容体、細胞の外側及び内側の間で生理物質の輸送のために膜チャネルを構成する膜蛋白質、動的膜構造を保持する膜裏打ち蛋白質、蛋白質翻訳酵素、リボソーム及び共有結合又は非共有結合を介して生体膜に結合する任意の他の物質が挙げられる。
【００６０】
（ｖｉｉ） 「膜蛋白質包埋リポソーム」とは、膜蛋白質が共有結合又は非共有結合を介して結合するリポソームをいう。
【００６１】
（ｖｉｉｉ） 「膜蛋白質ライブラリー」とは、所定の細胞の生体膜、所定の細胞の全ての生体膜、所定の組織の全ての生体膜、所定の器官の全ての生体膜、所定の個体の全ての生体膜、又は任意の他の可能な生体膜試料に含まれる膜蛋白質から構成される膜蛋白質包埋リポソームのセットを意味する。
【００６２】
（ｉｘ） 「リガンド支持体」とは、一般にリガンドと称される可溶性分子を結合させるための基材をいう。この基材は、その形状と特性を維持するための基本構造、及びリガンドの結合形態と結合量を最適化するためのリガンド吸着素材（表面）からなる。
【００６３】
リガンド吸着素材は、リガンドの結合形態に応じて共有結合性であっても非共有結合性吸着素材であってもよい。後者の吸着形態としては、典型的には、順相、逆相、疎水性、陰イオン性、陽イオン性及び他の非共有結合性吸着素材が挙げられる。
【００６４】
吸着素材は、リガンドと基材の基本構造表面との間に、距離（１０Å〜１００００Å、好ましくは約１００Å）を置くスペーサー分子を含んでいてもよい。このスペーサー分子の素材は、網目状又は多孔性の生体ポリマーであっても合成ポリマーであってもよい。如何なる場合であっても、膜蛋白質とリガンドは、直径１０ｎｍ〜５０００ｎｍのリポソームに包埋された膜蛋白質をリガンドに非常に強い結合力で結合させるために、親和性よりもアビディティー （ａｖｉｄｉｔｙ） をもたらすように形成される。
【００６５】
多くの実施態様では、基材の形状は実質的に平面であるが、幾つかの実施態様では、それは、磁性粒子、非磁性粒子、ストランド、沈澱、ゲル、シート、チューブ、球状体、容器、毛細管、パッド、スライス、フィルム、プレート、スライド及び他の種々の表面構造の形態である。本質的には、任意の都合の良い形状を、本発明において使用することができる。
【００６６】
基材表面は、生物学的、非生物学的、有機若しくは無機物質又はこれらの組合せであってもよく、本明細書記載の反応が生じる硬質支持体表面上に形成される。
【００６７】
基材表面は、適切な蛋白質吸着特性を与えるように選択される。その例としては、官能基付加ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ２、ＳｉＮ４、改質シリコン、広範囲のゲル又はポリマー（例えば、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネート、又はこれらの組合せなど）が挙げられる。複数のモノマー又はポリマー配列を有する基材表面としては、例えば、核酸の直鎖状及び環状ポリマー、ポリサッカライド、脂質、α−、β−又はω−アミノ酸を有するペプチド、クロマトグラフィーで使用されるゲル表面の担体（陰イオン性／陽イオン性化合物、炭素鎖１〜１８からなる疎水性化合物、親水性化合物（例えば、シリカ、ニトロセルロース、セルロースアセテート、アガロース等）と架橋した担体など）、人工ホモポリマー（例えば、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、ポリアセテート等）、上記化合物のいずれかに既知の薬物又は天然化合物が結合（共有及び非共有結合）したヘテロポリマー、並びに本開示の概観後に適していることが明らかになるであろう他のポリマーが挙げられる。
【００６８】
（ｖｉｉ） 「質量分析用プレート」とは、一般にリガンドと称される可溶性分子を結合させるための基材（リガンド支持体）の中で、リガンドを一次元及び二次元電気泳動法や高速液体クロマトグラフ法等の高精度分析法で分離し、基材表面上に直接移行させた後に、その後の高感度質量分析計に自動的且つ瞬間的に適合させ得る基材を意味する。基材は、その形状と特性を維持するための基本構造、及びリガンドの結合形態と結合量を最適化するためのリガンド吸着素材（基材表面）からなる。
【００６９】
リガンド吸着素材は、リガンドの結合形態に応じて共有結合性であっても非共有結合性吸着素材であってもよい。後者の吸着形態としては、典型的には、順相、逆相、疎水性、陰イオン性、陽イオン性及び他の非共有結合性吸着素材が挙げられる。
【００７０】
吸着素材は、リガンドと基材の基本構造表面との間に、距離（１０Å〜１００００Å、好ましくは約１００Å）を置くスペーサー分子を含んでいてもよい。このスペーサー分子の素材は、網目状又は多孔性の生体ポリマーであっても合成ポリマーであってもよい。如何なる場合であっても、膜蛋白質とリガンドは、直径１０ｎｍ〜５０００ｎｍのリポソームに包埋された膜蛋白質をリガンドに非常に強い結合力で結合させるために、親和性よりもアビディティーをもたらすように形成される。
【００７１】
基材表面は、生物学的、非生物学的、有機若しくは無機物質又はこれらの任意の組合わせであってもよく、本明細書記載の反応が生じる硬質支持体表面上に形成される。
【００７２】
基材表面は、適切な蛋白質吸着特性を与えるように選択される。その例としては、官能基付加ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ２、ＳｉＮ４、改質シリコン、広範囲のゲル又はポリマー（例えば、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネート、又はこれらの組合せなど）が挙げられる。複数のモノマー又はポリマー配列を有する基材表面としては、例えば、核酸の直鎖状及び環状ポリマー、ポリサッカライド、脂質、α−、β−又はω−アミノ酸を有するペプチド、クロマトグラフィーで使用されるゲル表面の担体（陰イオン性／陽イオン性化合物、炭素鎖１〜１８からなる疎水性化合物、親水性化合物（例えば、シリカ、ニトロセルロース、セルロースアセテート、アガロース等）と架橋した担体など）、人工ホモポリマー（例えば、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、ポリアセテート等）、上記化合物のいずれかに既知の薬物又は天然化合物が結合（共有及び非共有結合）したヘテロポリマー、並びに本開示の概観後に適していることが明らかになるであろう他のポリマーが挙げられる。
【００７３】
（ｖｉｉｉ） 「質量分析計」とは、気体状の試料をイオン化した後、イオン化分子及びその分子断片を電磁場に投入し、その移動状況から質量数／電荷数によってそれらを分離し、物質のスペクトルを求めることにより、物質の分子量を測定、検出する装置を意味する。好ましく利用され得る数種のタイプが存在するが、他のタイプもまた使用され得る。
【００７４】
典型的な実施態様（図１）では、本発明のプロテオーム解析方法は、可溶性蛋白質のみをゲル電気泳動により分離し、分離した可溶性蛋白質をゲルから直接質量分析用プレート上に転写する工程（工程Ａ）、膜蛋白質を人工リポソーム膜に付着または貫通させる工程（工程Ｂ）、膜蛋白質包埋リポソームを可溶性蛋白質が転写された質量分析用プレートと接触させ、生物学的親和性（アビディティー）を利用してリガンド・受容体複合体を形成させる工程（工程Ｃ）、及び該複合体を質量分析により一括して検出し、得られたデータを集積し、データベース化する工程（工程Ｄ）を含む。
【００７５】
工程Ａ〜Ｄの具体的な実施態様及び当該工程を実施するための各装置、並びにこれら構成要素から派生する本発明の他の局面を以下に詳細に説明する。
【００７６】
２．迅速蛋白質転写装置（装置Ａ）
本装置は、電気泳動装置、蛋白質転写装置及び質量分析用プレートを主要な構成要素として構成される。電気泳動装置は、市販の入手可能なものであっても独自に考案された装置であってもよい。目的に応じて一次元ゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動のどちらも使用することができる。二次元ゲル電気泳動では、一次元の泳動は蛋白質の等電点による分離が基本であり、二次元の泳動は蛋白質の分子量による分離が基本である。電気泳動に使用されるゲルのサイズは特に制限されない。１０ｃｍｘ１０ｃｍが一般的であるが、必要ならば２０ｃｍｘ２０ｃｍあるいは他のサイズも使用できる。また、ゲルの素材もポリアクリルアミドが基本であるが、目的によってはアガロースゲル、セルロースアセテート膜等の異なる基材もまた使用できる。ゲル濃度は、均一であっても、勾配を有していてもよい。
【００７７】
電気泳動に供される可溶性蛋白質は、任意の公知の方法によって生物学的試料から調製することができる。試料の例としては、動植物や微生物等の任意の生物の細胞、組織又は細胞外液（例えば、血液、血漿、尿、骨髄液、腹水等）などが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、標的細胞を入手後、適切なバッファー溶液中で種々の蛋白質分解酵素阻害剤の存在下にてホモゲナイズするか、ポリトロン等の細胞ホモジナイザーで懸濁化するか、低浸透圧ショックにより細胞を破壊するか、超音波処理により細胞膜を破壊した後、遠心分離して上清を採取することにより可溶性画分を得ることができる。
【００７８】
第２の工程は、蛋白質を泳動後のゲルから質量分析用プレート上に移行させることを含む。本発明の好ましい態様においては、質量分析用プレートの形状は、その後に使用される質量分析計の試料導入口に完全に一致するように考案される。例えば、電気泳動後のゲルのサイズに合わせた集合型の質量分析用プレートに蛋白質を転写した後に、質量分析計の試料導入口にフィットするように、各スプリット型プレートへとクラスターを簡単に分離できるように予め切れ目を入れた「クラスター型質量分析用プレート」が挙げられる。図２に本発明の好ましい質量分析用プレートの一実施態様を示す。
【００７９】
従来の質量分析においては、試料を逐一測定するか、又は限られた試料のみが一度に測定される。これは、前述のスプリット型質量分析用プレートの如く、質量分析用プレートが一次元に移行していたからである。対照的に、本発明の完全自動化プロテオーム解析では、レーザー射出口又は質量分析用プレートを乗せた架台を二次元方向へ移動させ、連続全面スキャンすることにより、電気泳動により二次元に展開された蛋白質を全て解析することが可能となる（断続的なスキャン法では、レーザー光の照射されない蛋白質、即ち、未解析の蛋白質が残存する）。この方法と断続スキャン法を組合わせれば、９６穴プレートに分注された９６種の試料を一括して質量分析用プレートにマウントし（矩形チップに９６種類の試料が等間隔で整列する）、そのチップを質量分析に直接供することが可能である。
【００８０】
好ましい実施態様では、質量分析用プレートの素材は、基盤としてアルミプレート及び吸着素材としてシリカから構成される。アルミプレートは、電気力による転写のために使用され、異なる通電体（例えばステンレス鋼等）もまた使用可能である。拡散による転写については、絶縁体（セラミック、プラスチック等）を使用することができる。吸着素材としては、任意の蛋白質を移行させることができるシリカを使用するが、目的によっては先に挙げた他の素材も使用することができる。
【００８１】
泳動後ゲルに展開された蛋白質は、種々の方法（拡散、電気力など）によって質量分析用プレートに移行される。この工程は一般に転写（ｂｌｏｔｔｉｎｇ）と呼ばれる。転写の効率は、その後の質量分析による解析の測定限界との関連で重要な因子である。さらに、泳動時及び転写時の蛋白質の変性は極力避ける必要がある。なぜならば、可溶性蛋白質を膜蛋白質に結合させるときに、両者の一方が変性、即ち、本来の三次元構造を維持しない限り、結合が完成しないからである。また、本装置が広くプロテオミクス研究に応用可能であるためには、質量分析用プレートの表面を覆う分子の構成が重要である。転写の効率を上げるためには、蛋白質の吸着容量が大きいこと、（特定の蛋白質を吸着するのではなく）任意の蛋白質を吸着できること、任意の蛋白質においてその吸着率が一定であることが必要とされ、また、膜蛋白質との結合を実現するためには、質量分析用プレート上への転写及び吸着後に蛋白質の三次元構造が保持されることが、本質的に必要とされる。さらに、表面の素材によっては、膜蛋白質とリガンドを一括で、あるいは膜蛋白質のみもしくはリガンドのみをＭＡＳＳ分析で検出、同定及び定量してもよい。
【００８２】
本発明で膜蛋白質をＭＡＳＳ分析する場合には、リガンドと支持体との間に蛋白質又は他の生体ポリマー若しくは合成ポリマーからなるスペーサーを介在させ、膜蛋白質とリガンドとをその生物学的親和性（アビディティー）に基づいて効率的に結合させることが好ましい。なぜなら、膜蛋白質は、リポソーム上に固定され、リガンドもまた、支持体上に固定されるからである。「用語及び本発明の一般的態様」で述べたようにアビディティーを向上させる必要がある。実施例で使用される生体ポリマーは、プロテインＧ、抗体及びビオチンである。リガンドと基材の基本構造表面との間の距離は１０Å〜１００００Å、好ましくは約１００Åである。スペーサーの形状は、網目状であっても多孔性であってもよい。
【００８３】
支持体とスペーサーとの間、及びスペーサーとリガンドとの間の結合形態については、後に詳述するが、プロテオーム解析の目的に応じて共有結合又は非共有結合のいずれかを選択することができる。それにより、膜蛋白質と可溶性蛋白質の両者を一括して、又はそれぞれ別々に、質量分析によって高感度に測定することができる。
【００８４】
本発明の方法によれば、ゲル中を泳動した蛋白質が一工程の処理により質量分析用プレート上に転写される。従って、従来のプロテオーム分析で必要とされた、泳動後から質量分析開始までの煩雑な工程を全て省略でき、操作時間が大幅に短縮化される。結果として、プロテオーム解析に必要な膨大な量の試料処理が可能となる。
【００８５】
さらに、本発明では、電気泳動後のゲルの小片への切断工程が不要である。結果として、切断点（線）上の蛋白質、並びにＭＡＳＳで測定されないロス画分が節約される。これにより、ゲル中の全ての蛋白質を質量分析用プレートに添加することが可能となる。さらに、ゲルから蛋白質を抽出する工程（抽出効率は１０％未満）の代わりに、電気力あるいは拡散力による直接的な転写を用いたことにより１００％の転写効率が可能となり、質量分析用プレート上に転写される蛋白質量は、従来抽出されていた蛋白質量の数倍から数十倍である。
【００８６】
本発明の典型的な実施態様では、膜蛋白質とリガンドは、以下に説明する膜蛋白質包埋リポソームとリガンドの複合体形成後に、一括して検出及び解析される。異なる実施態様では、本発明は、リガンド（可溶性蛋白質）が転写された質量分析用プレートを単独で質量分析に供することによる、リガンドの解析方法を提供する。
【００８７】
すなわち、質量分析用プレート上の蛋白質は、質量分析用プレートをそのまま質量分析計にかけることにより解析することができる。本発明による、質量分析用プレート上に固定されたリガンドの解析は、市販の任意のタイプの質量分析計を用いて行なわれ得るが、レーザー光を吸収するマトリックスと試料を混合し、乾燥させて結晶化し、次いで結晶化した試料を、マトリックスからのエネルギー移動及び強力なレーザー照射によりイオン化し、真空中に導入する、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）と、初期加速による試料分子イオンの飛行時間差で質量数を解析する飛行時間型質量分析（ＴＯＦＭＳ）とから構成されるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法；１蛋白質を１液滴にのせて液体から直接電気的にイオン化する方法；試料溶液を電気的に大気中にスプレーして、個々の蛋白質多価イオンを折り畳まれていない状態で気相に導くナノエレクトロスプレー質量分析（ｎａｎｏ−ＥＳＭＳ）法等を利用する質量分析計を使用することがより好ましい。
【００８８】
本発明のリガンド支持体は、プロテオーム解析の標的及び目的に最適な支持体と超高感度な検出系とを組み合わせることにより、種々の実施態様が利用可能である。詳しくは後述するが（例えば、表１および図３を参照）、質量分析用プレートの他、非磁性粒子及び磁性粒子が例示される。
【００８９】
本発明の検出系についても、プロテオーム解析の標的及び目的に最適なリガンド支持体との組み合わせにより、種々の実施態様が利用可能である。詳しくは後述するが、質量分析の他、蛍光測定、放射活性測定などが例示される。リガンド支持体が粒子の場合、膜蛋白質・リガンド複合体は、予め蛍光標識されたリポソームを使用することにより、高感度に検出、単離及び定量することができる。
【００９０】
本工程（工程Ａ）は、可溶性蛋白質のみならず、細胞を構成する脂質二重層（例えば、細胞膜、核膜、小胞体膜等）に付着も貫通もせず、細胞外液（例えば、血液、血漿、尿、骨髄液、腹水等の各種体液）若しくは細胞内液又は細胞小器官内液に存在するペプチド、糖質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等や、生体由来のその他の任意の可溶性分子、人工的に合成された任意の化合物、気体状物質（例えば酸素分子、酸化窒素など）等にも適用できる。すなわち、その特性を利用して各解析標的物質を高度に精製し、最適な支持体に移行させ、膜蛋白質等を包埋したリポソームとの相互作用解析に供する。
【００９１】
３．膜蛋白質包埋リポソーム製造装置（装置Ｂ）
本装置は、細胞からの膜画分分離、リポソーム作製、膜画分とリポソームの融合、融合リポソーム（膜蛋白質包埋リポソーム）の粒子サイズ調整、さらに必要ならば融合リポソームの保存のための装置を含んでなる。
【００９２】
細胞からの膜画分の抽出に際しては、従来の方法が使用できる。例えば、標的細胞を入手し、種々の蛋白質分解酵素阻害剤の存在下に適切な緩衝溶液中でホモゲナイズするか、ポリトロン等の細胞破壊装置で懸濁化するか、低浸透圧ショックにより破壊するか、又は超音波処理により細胞膜を破壊する方法が使用できる。その後、細胞膜画分、細胞小器官膜画分は、種々の媒体を用いた濃度勾配遠心法にて調製される。
【００９３】
リポソームの作製法としては、種々の既知の方法を用いることができる。選ばれた脂質の混合液を有機溶媒中に均一に溶解し、アルゴンガス中で溶媒を完全に気化し、緩衝溶液中で水和させてリポソームを作製することがその代表であるが、これに限定されない。リポソームの組成は重要である。一般に、細胞膜は、コレステロールを豊富に含むが、小胞体等の細胞内小器官を構成する脂質二重層は、コレステロールを殆ど又は全く含まない。従って、リポソームに移行させる細胞膜蛋白質の種類を決定する上で、膜蛋白質の受け皿となるリポソームの組成は非常に重要な因子となる。当業者は、膜蛋白質の由来に応じてリポソームを構成する脂質を適宜決定することができる。
【００９４】
膜画分とリポソームの融合法としては、種々の公知の方法を用いることができる。例えば、両者を適切な割合で混合した後に、凍結融解を繰り返すことを含む方法、選ばれた脂質の混合液から作製されたフィルム上に膜画分を含む水溶液を置いた後、水和法により膜蛋白質を脂質二重層に移行させることを含む方法又はその他の方法が本目的に使用できる。好ましくは、凍結融解法であり、本方法を用いることで、膜蛋白質のリポソームへの包埋率（移行率）を１００％にすることができる。
【００９５】
あるいは、リポソームを形成した後に膜蛋白質と融合する際には、リポソームと膜蛋白質画分との融合は、粒子径を１０ ｎｍ〜５０００ ｎｍ、好ましくは１０ ｎｍ〜５００ ｎｍに調整することにより促進することができる。
【００９６】
作製された膜蛋白質包埋人工リポソームは、超音波処理法、ホモジナイザー法又は他の方法によりサイジングすることができる。本発明では、膜蛋白質の変性を最小にし、且つ粒子経を１０ｎｍ〜５０００ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ〜５００ｎｍに調整するために濾過法（エクストルーダー法）を使用することが好ましい。
【００９７】
膜画分とリポソームの混合比率を注意深く調整することにより、リポソームに包埋される膜蛋白質の種類と数を所望の通りに制御することができる。この技術は、後述する装置Ｃによる、本発明の複合体を形成したリガンドと膜蛋白質の両者の分子量の測定及び決定に際して、ノイズ蛋白質（ノイズピーク）を減少させることにより解析を容易にするために決定的に重要である。
【００９８】
こうして得られる標的膜蛋白質が脂質二重層に付着もしくは貫通したリポソーム（膜蛋白質包埋リポソーム）を安定に保存する方法の開発は、プロテオーム研究をいつでもどこでも、また質量分析計などを保有しない研究機関で利用可能にするために、非常に重要である。単純リポソームの保存用に開発された幾つかの添加剤をこの目的のために用いることができる。
【００９９】
本発明の方法は膜蛋白質の種類を問わず適用可能である。従って、ゲノム配列から相同性検索により予測されるＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）のオーファンリガンドの探索はもちろんのこと、コンピューターによるゲノム配列相同性予測の方法からは到底発見不可能な、その他全てのタイプの受容体（ＧＰＩ型、オリゴマー型）とそのリガンドの発見、同定及び解析にも応用が可能であり、それにより、全てのタイプの受容体を標的とした受容体創薬型医薬品の開発が可能となる。また、本発明は、受容体以外の膜蛋白質の発見、同定及び解析に多大な貢献をする。従って、全ての膜蛋白質とリガンドが関与する疾患の解析、診断薬・診断法の開発、治療薬の開発を目的とする、膜蛋白質創薬型医薬品の開発が可能となる。
【０１００】
本発明の方法は、その構成成分の脂質部分により脂質二重層の内層に固定（貫通）されたタイプや、一般に生体膜の裏打ち蛋白質と呼ばれる脂質二重層の内側層に固定されたタイプのような、通常では細胞膜表層に現われない細胞内膜蛋白質の発見、同定及び解析にも適用可能である。
【０１０１】
さらに、本発明は、抗体を疾患の解析、診断及び治療に利用することを目的とする抗体創薬（抗体医薬を含む）研究に多大な貢献をする。疾患の解析、診断及び治療に有効な抗原は膜蛋白質として存在しており、対応する抗体の作製のためには、構造と機能を保持した膜抗原（膜蛋白質）の取得が必須条件である。本発明の方法、すなわち、膜抗原をその構造と機能を保持したままでリポソームに包埋する方法のみが抗体創薬に必須の上記条件を満たすことができる。抗体創薬の方法は、本発明がカバーする全ての膜蛋白質とリガンドが関与する疾患の解析、診断薬・診断法の開発、及び治療薬の開発を目指す包括的な方法の中で、リガンドを抗体に置き換えた一つの特殊な方法であることが明らかである。従って、本発明は、受容体創薬型医薬品の開発と同様に、抗体創薬型医薬品の開発を提供する。
【０１０２】
本発明は、膜蛋白質とそのリガンドのプロテオーム解析のために、膜蛋白質とそのリガンドの両方を一括発見、一括定量すること、及び両方の機能（相互作用）を解析すること、あるいはいずれか一方を発見、定量すること、及び両方の相互作用を解析することを可能にする。この場合、膜蛋白質とそのリガンドが既知であるか未知であるかは問われない。リガンドとしては、固有の内因性リガンド、拮抗剤（フルアゴニスト、パーシャルアゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニスト）、医薬品、試薬、抗体、及び膜蛋白質に結合するように人工的に修飾したあらゆる他の物質が挙げられる。
【０１０３】
本工程（工程Ｂ）で得られる膜蛋白質包埋人工リポソームは、正常な膜蛋白質を新剤型の膜蛋白質包埋人工リポソーム医薬として、膜蛋白質の欠損、変異及び他の変調が原因となる疾患を患う患者に直接投与することができる。脂質二重層の構成成分が動物以外の生物種から得られる場合、病原物質のヒトへの感染を避けることができる。
【０１０４】
本工程で得られる膜蛋白質包埋人工リポソームと内因性リガンドとの複合体、あるいは膜蛋白質包埋人工リポソームと拮抗剤（フルアゴニスト、パーシャルアゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニストを問わない）との複合体は、新規作用機序を有する、新剤型の膜蛋白質包埋人工リポソーム医薬として、膜蛋白質とリガンドの両方又はいずれか一方の変調が原因となる疾患を患う患者に直接投与することができる。
【０１０５】
本発明はまた、蛍光物質や他の標識物質を共有結合あるいは非共有結合により人工リポソームの脂質二重層に架橋する方法、疎水性相互作用により挿入する方法、及び人工リポソーム内の水相に可溶性の標識物質に封入する方法のいずれかを単独で又は組合わせて用いることで、新規且つ超高感度な膜蛋白・リガンド（拮抗剤を含む）相互作用検出の原理、方法及び装置を提供することができる。蛍光物質及び他の標識物質に代えて、第二シグナルを発生する物質（例えば、アルカリホスファターゼのような酵素）を、アビジン・ビオチンシステム又はニッケル・ヒスチジン又は他の架橋システムを利用して人工リポソームに架橋、挿入又は封入して、検出感度を増幅することもできる。
【０１０６】
下記実施例で示されるように、ＦＡＣＳで認識可能な蛍光分子及び他の標識分子を、遺伝子工学的手法や他の考えうる手法によりＤＮＡレベル、ＲＮＡレベルあるいは蛋白質レベルで導入した標識膜蛋白質を包埋した人工リポソームが、エクストルーダー法及び他の方法により１０ｎｍ〜５０００ｎｍ、好ましくは５００ｎｍ以下にサイジングされる場合、ＦＡＣＳ解析によれば、標識膜蛋白質包埋リポソームのポピュレーションが当該サイズ領域に明瞭に出現する。従って、例えば、膜蛋白質をコードするｃＤＮＡを遺伝子配列から作製し、当該ｃＤＮＡを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換して膜蛋白質（ＦＡＣＳで認識可能な蛍光分子及び他の標識分子を導入したもの）を発現させる場合に、発現宿主の細胞膜画分から調製された標識膜蛋白質包埋非標識リポソームを当該サイズに調整してＦＡＣＳで解析すれば、膜蛋白質の発現の有無、及び発現量を検出することができる。この場合、現在利用可能な他の方法と異なり、当該膜蛋白質のＤＮＡ配列以外の情報又は試薬（抗体、リガンド、拮抗剤、細胞の応答性又は他の膜蛋白質検出薬）がなくとも、検出が可能となる。抗体等の膜蛋白質検出薬が存在すれば、蛋白質レベルでの標識が可能となり、同様にＦＡＣＳによる発現解析が可能となる。もちろん同様の原理がリガンドの探索に応用可能である。
【０１０７】
本工程は、膜蛋白質だけでなく、細胞膜、核膜、小胞体膜等の細胞を構成する脂質二重層に付着もしくは貫通する糖質、ＤＮＡ、ＲＮＡを含む生体ポリマーを１個あるいは複数個、予め検討された脂質組成と形状を有する人工リポソームの脂質二重層に付着または貫通させるという応用が可能である。
【０１０８】
４．膜蛋白質・可溶性蛋白質結合装置（装置Ｃ）
本装置は、質量分析用プレート上に転写されたリガンドと膜蛋白質包埋リポソームとの結合反応装置、質量分析用プレート上に非特異的に結合したリポソームの洗浄・除去装置、及びリポソームを溶解除去して質量分析用プレート上にリガンドと膜蛋白質のみからなる複合体を形成させる装置を含んでなる。例えば、これらの装置は、質量分析用プレートを反応混液や洗浄液等に浸漬させるのに十分な底面積を有する反応槽であってもよく、必要に応じて振盪手段を有する。これら複数の工程を１つの装置で実行することが可能であり、また、目的に応じて所定の装置を省略することも考えられる。
【０１０９】
結合反応装置では、結合反応の前処理として、質量分析用プレート上における生理的なリガンド・膜蛋白質相互作用以外の非特異的な吸着反応を防止する目的で、質量分析用プレートの吸着表面を適切な物質で被覆する（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）工程を加えることができる。ブロッキング剤の要件としては、脂質二重層の親水ヘッドの非特異吸着を防止できること、リポソームに移行した標的膜蛋白質以外の膜蛋白質の非特異吸着を防止できること、その後の質量分析による解析を不能にする多成分系ではなく成分が既知であり且つ分子量が均一な系であること、イオン化エネルギーを吸収しない分子であること等である。
【０１１０】
反応方法としては、単純浸漬、振盪等を用いてもよい。質量分析用プレート近傍で膜蛋白質包埋リポソーム濃度を上昇させる方法としては、電気力によるリポソームの濃縮が推奨される。リポソームは全体として負に荷電しているため、質量分析用プレートの下部に陽極を、反応槽の上部に陰極を差し込めば、リポソームは質量分析用プレート表面に移行し、リガンド近傍の濃度が上昇する。
【０１１１】
質量分析用プレート上に非特異的に結合したリポソームの洗浄による除去は、洗浄緩衝液の塩濃度及び組成を適切に選択することにより可能となる。洗浄時の温度条件が重要であるが、当業者は好適な条件を適宜決定することができる。
【０１１２】
リポソームの溶解除去法としては、適切な有機溶媒（グリセロール、アセトニトリル、アルコール、ジオキサン、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ等）を緩衝液等によって濃度を適宜調節して、質量分析用プレートと接触させる方法が例示される。穏やかな界面活性剤（例えば、オクチルグルコース等）の使用も効果的である。
【０１１３】
以上は、図１に示される全自動膜蛋白質・リガンドプロテオーム解析装置の仕様説明であり、検出系として質量分析による解析を想定している。しかしながら、本発明の多様な目的適合性を勘案すれば、可溶性蛋白質の支持体の形態は、図３及び表１に示すように多岐にわたることは自明であり、それは図３及び表１の例示範囲に留まらない。
【０１１４】
【表１】
【０１１５】
図３の例示では、電気泳動後の被転写支持体の基本構造に通電性の磁性金属を使用し、本発明によって開発されたアビディティーを向上させる目的のスペーサーを結合させた磁性粒子を支持体の表面素材として用いた。本磁性粒子を、二次元電気泳動により分離した可溶性蛋白質に共有又は非共有結合によって結合させた。カラムを使用する例では、６２５画分への分別後に、各々６２５本のミクロファイバー内腔に磁力で保持させた。膜蛋白質包埋リポソームを通過させ、通過、洗浄及び溶出画分をそれぞれ連続的にＬＣ−ＭＳ−ＭＳで測定した。プレートを使用する別の適応では、６２５画分への分別後に、磁性粒子を各々６２５本のチャンバーに磁力で保持させた。膜蛋白質包埋リポソーム及び拮抗剤候補の添加、反応、洗浄及び検出をＨＴＳ様式で達成した。チップの適応は、先に例示した質量分析用プレートの作製に転用できる例示である。表１には、支持体の種類による本発明の応用範囲の一例を示し、最後の例示は、非磁性粒子（ポリサッカライドゲル、合成ポリマーゲル等）に本発明のスペーサー分子を介して可溶性蛋白質を共有結合させた後に、可溶性蛋白質を膜蛋白質包埋リポソームに結合させた例を示したものである。検出系としては、質量分析システム以外の蛍光、放射活性、二次シグナル増幅系などが、プロテオーム分析の目的に応じて柔軟に用いることができ、未知のリガンド、特にオーファンリガンド等の探索に最適のシステムが提供される。
【０１１６】
５．質量分析装置
本発明で使用される生理活性物質の検出は質量分析計に限定されない。しかしながら、物質固有の物理量の一つである分子量が直接測定できること、検出限界がピコグラムに迫ること、さらにＭＳ−ＭＳ法によりアミノ酸の配列解析が可能であるという理由のため、質量分析計は、本発明においても重要な検出装置であると考えられる。上記の装置Ｃにより本発明の質量分析用プレート上に固定されたリガンド・膜蛋白質複合体の解析は、市販される任意のタイプの質量分析計に適合が可能である。例えば、上記の装置Ａにより質量分析用プレート上に固定されたリガンドのみの解析に好ましく使用される質量分析計が、同様に使用可能である。
【０１１７】
本発明では、質量分析用プレート上に膜蛋白質と可溶性蛋白質が共存する場合、試料に添加する溶媒の選択に応じて、両方を同時に、又はいずれか一方のみを質量解析により高感度で測定することができる。
【０１１８】
６．データベースの構築・解析装置（装置Ｄ）
上記の本発明装置Ａ、Ｂ及びＣから得られる上記膜蛋白質・リガンド複合体の測定結果を、あらかじめ設定された「リガンド・受容体（膜蛋白質）マトリックス表」（図４）に入力し、随時新しいデータを追加して診断確定用データベースとして構築する。
【０１１９】
先に例示的に紹介した質量分析用プレートの全域をカバーするように行番号（１〜２５）と列記号（Ａ〜Ｙ）を振り、合計６２５（２５ｘ２５）画分の各画分（４ｍｍｘ４ｍｍ）に１対１に対応する番地（Ａ１〜Ｙ２５）を振り当てる（図２）。その結果、泳動後に質量分析用プレート上に移行した全リガンドは、リガンド・受容体（膜蛋白質）マトリックス番地により分類することが可能となる。もちろん、その後に受容体包埋リポソームと反応させて得られる対応受容体も同じ番地により分類され、ある番地に収束する物質群は、相互にそして生理的に結合することが推定される。
【０１２０】
一つの特定の実施態様では、最初に、健常人の血清等の標的体液（可溶性リガンドを含むと考えられるもの）及び特定の疾患を有する患者の同じ標的体液を、別々に二次元ゲル電気泳動し、質量分析用プレートに転写後、質量分析等により測定する。この時点で、疾患によるリガンドの増減が判明し、データベースに登録が可能となる。
【０１２１】
次に、健常人の血清等の標的体液を電気泳動し、二枚のゲルに移行させ、健常人のリガンドが転写された二枚の質量分析用プレートを調製する。他方、健常人及び患者から同種細胞を採取し、上述の本装置Ｂ（膜蛋白質分離・リポソーム移行装置）を用いてそれぞれの膜蛋白質をリポソームに移行させ、膜蛋白質包埋リポソームを調製する。次いで、本装置Ｃ（可溶性蛋白質・膜蛋白質結合装置）を用いて、健常人のリガンドを移行した各質量分析用プレートに、健常人と患者由来の膜蛋白質包埋リポソームを別々に反応させ、リガンドと受容体の結合反応を行い、その後の洗浄操作等により、質量分析用プレート上に高度に精製されたリガンド・受容体複合体を得る。質量分析での解析により、疾患による受容体の増減が判明し、データベースに登録が可能となる。
【０１２２】
データベースの項目は、疾患名、リガンド採取体液名、膜蛋白質採取細胞名、と共にリガンド・受容体（膜蛋白質）マトリックス番地、質量分析結果の分子量・定量値（もしくはピーク高、ピーク面積等の分析機器から出力される信号強度）等である。
【０１２３】
質量分析による解析結果は、自動化プログラムのデータベースに入力され、その結果は、デイファレンシャルデイスプレイとして、例えば、図４の「リガンド・受容体（膜蛋白質）マトリックス表」の右半分の三角形にリガンドが増加した場合は赤色で、減少した場合は青色で、無変化の場合は黄色で表示され、同様に左半分の三角形に受容体が増加した場合は赤色で、減少した場合は青色で、無変化の場合は黄色で表示される。図４では、パターンで表示している。
【０１２４】
以上のおおよその操作時間は、４枚同時の電気泳動で終夜（約１２時間）、膜画分２種類同時の調製で約６時間、試料２種類同時のリポソーム移行に約２時間、２種類同時のリガンド・受容体結合反応で約１時間（上記工程の合計時間、約２１時間）、市販のＴＯＦ型質量分析計による解析に６２５画分で約５２時間である。質量分析計一台の場合は全工程２１＋５２ｘ４＝２２９時間を要し、質量分析計四台の場合は２１＋５２ｘ１＝７３時間を要する。律速工程は電気泳動、膜画分の調製、質量分析による解析である。これらが改良され自動化されれば、操作時間の大幅な短縮化が可能となる。例えば、電気泳動装置により一度に１００試料を５時間で処理可能にし、膜画分の調製、リポソーム移行、リガンド・受容体結合反応を全て自動化し、一台の装置により同時に２０試料を３時間で処理可能とする。また、質量分析計による解析時間を１／５に短縮することができる。
【０１２５】
かかる短縮化の後の、疾患確定のための本データベースの構築に要するおおよその時間を推定すると、１００疾患について、各群１００例に対して、血清と疾患の標的細胞一種類を試料に、本装置１０台、質量分析計１００台で上記の分析を実施すると、電気泳動に１００ｘ１００ｘ３ｘ５／９９／１０（１５２）時間、質量分析用質量分析用プレートの調製に１００ｘ１００ｘ２／１９／１０（１０５）時間、質量分析に１００ｘ１００ｘ１０．４ｘ３／１００（３１２０）時間を要すると見積もられ、質量分析には３１２０時間（１３０日）を要すると規定される。従って、所定の１００疾患についての確定用データベースは半年以内に構築され、その後は１００疾患の一括同日診断が可能となる。以上のことから、本装置と本データベースの医療分野に与えるインパクトは計り知れないであろう。
【０１２６】
本目的のために用いられるリガンド試料は、血液、血清、尿、脳骨髄液、精液、唾液、汗、涙液等の体液、全ての細胞内液、全ての細胞内小器官内液等である。膜蛋白質試料としては、身体を構成する任意の細胞、及びそれらの細胞内に含まれる全ての小器官が意図される。ＩＣＤ−１０の疾患分類表では、約１０，０００の疾患が示されている。全ての生物を標的とすると、本装置を使用して構築されるデータベースの記録数は天文学的な数字になることが予想されるが、コンピューターのハードウェア及びソフトウェアを含めた情報工学分野における急速な進歩は、かかる網羅的なデータベースの構築を可能にするだろう。
【０１２７】
本発明はまた、リガンド・膜会合蛋白質が関与する疾患の治療薬の開発に有用なツールを提供する。リガンド・膜会合蛋白質の機能解析は、２１世紀生物学（医学、農学を含む）の重要な分野を占め、分子生物学による生命機能解明の大半が何らかの膜会合蛋白質との関連で明らかにされるであろう。上記の診断用データベースから、特定疾患に関わるリガンドの増減、受容体の増減が明らかにされるが（ここまでのデータは診断確定に利用される）、本発明のさらなる利点は、特定のリガンドが特定の膜蛋白質と生理的に結合する、いわゆるリガンド・膜蛋白質双方のカウンター分子を同時に決定できることにある。本領域の新規物質は、偶然に又は他の目的で一方（例えばリガンド）が発見された後に、標識リガンドを用いて対応する受容体を発見することによって、又はその逆の道筋によるリガンド・受容体一対の発見により発見されてきた。ここまでは、偶然と長い忍耐が必要とされてきた。機能が不明なリガンド及び膜蛋白質、並びに人工物質（医薬品）と結合するが、その生理リガンドが同定されていない受容体が数多く存在する。本方法による測定結果を入力して得られるリガンド・受容体（膜蛋白質）マトリックス番地のどこかに複数の分子種（少なくとも一つのリガンドと一つの対応する受容体の二分子種）が認められ、かつ疾患特異的に存在量が増減していれば、その番地に帰属された全ての分子を、疾患関連リガンド・膜蛋白質として、及び創薬研究の成功確度の高い候補として提供できる。この目的には、タンデム型質量分析計を使用する。それによって、特定番地に帰属される全分子種のアミノ酸配列の推定が可能となる。
【０１２８】
本発明の方法によれば、ある細胞膜の任意の膜蛋白質を解析できるため、疾患に関連した個別の膜蛋白質を偶然性に依拠しながら一つ一つ発見していくのではなく、関連する疾患と標的細胞膜蛋白質を体系的に一つのサイクルによって解析することが可能となる。
【０１２９】
表２に示すように、細胞小器官、例えば、ミトコンドリア膜の膜蛋白質に照準を設定すれば、ＡＴＰ産生能の変化に基づく、疾患の分類、疾患間の関連性の解明、群特異的な治療薬の開発といった、現在までに誰もが考え及ばなかった創薬戦略を打ち出すことも可能となる。
【０１３０】
【表２】
【０１３１】
７．他の好ましい実施態様
本発明はまた、水溶液中で不溶性の分子と他の可溶性あるいは不溶性分子との相互作用を、水溶液中で観察、解析が可能な測定原理と方法を提供する。従って、本発明の範囲は、生体に由来する膜蛋白質・リガンド複合体の発見、定量及び解析にとどまるものではなく、膜蛋白質と相互作用する人工的に創出した物質の発見、定量及び解析、互いに相互作用可能な２以上の膜蛋白質の発見、定量及び相互作用解析、膜蛋白質以外の生体由来不溶性物質と不溶性あるいは可溶性物質との相互作用の解析、並びに、生体に由来しない物質（物体）の発見、定量及び解析にまで及ぶ。
【０１３２】
構成成分として糖鎖及び脂質を含む蛋白質のＭＳ解析において、事前に蛋白質分解酵素又はフォスホリパーゼ、エステラーゼ等の処理が必要とされる従来法に比べ、本発明では、質量分析用プレート上で試料に添加する溶媒の組成を変化させるだけで、全て（条件によっては一部）の糖鎖及び脂質が除去された単純蛋白質のスペクトルを得ることができる。詳細は下記実施例８で説明する。
【０１３３】
本発明はまた、病原性プリオン蛋白質等の変性した不溶性蛋白質の超高感度な検出法を提供する。詳細は下記実施例９で説明する。
【０１３４】
本発明の意義と目標は、全自動膜蛋白質・リガンド用プロテオミクス解析装置の完成に限られず、生命現象の基幹部分を担いながら方法・技術の壁から研究が大きく遅れてきた膜蛋白質科学の興隆に技術的貢献を行うことにある。本発明は、上述のように、プロテオームを膜蛋白質と可溶性蛋白質にグループ分けを行い、膜蛋白質をリポソームに包埋することで、膜蛋白質を可溶性蛋白質と同様に取り扱うことを可能にする原理、方法及び結果を提供する。
【０１３５】
本原理と方法は、ゲノム創薬の方法論が切り開いた創薬の新しい流れに合流し、受容体創薬、抗体創薬、ＨＴＳ創薬、蛋白質立体構造解析、遺伝子発現解析、他のプロテオーム解析等の技術とも絡み合う膜蛋白質創薬として近い将来必ず認められるであろう。
【０１３６】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【０１３７】
実施例
本発明の方法及び装置が、膜蛋白質とそのリガンドの同時スクリーニング及び両者の相互作用の解析に有効であり、プロテオーム解析のための新規な方法及び装置であることを示すために、以下に具体的な態様と結果を示す。
【０１３８】
受容体は、その構造からＧＰＩアンカー型、ＧＰＣＲ型及びオリゴマー型の３種類に分類される。本発明が膜蛋白質のプロテオーム解析に有用である証明を得るためには、これら全てのタイプの受容体を標的として各特異リガンドとの相互作用の解析を検討する必要がある。Ｕ９３７細胞はヒト単球由来の株化細胞であり、その膜表面上に多数の受容体が発現している。その中から、ＧＰＩアンカー型としてはウロキナーゼ受容体を選定し、ＧＰＣＲ型としては血清補体成分Ｃ５ａ受容体を選定し、オリゴマー型としてはインターフェロンγ受容体を選定した。
【０１３９】
参考例１：３種類の受容体の発現確認
Ｂｔ２ｃＡＭＰ刺激前後で、Ｕ９３７細胞を、予めＦＩＴＣで標識した３種類のリガンドとそれぞれ反応させ、ＦＡＣＳで分析し、受容体発現の存在を観察した。その結果、図５に示すように３種類全ての受容体の発現が確認された。
【０１４０】
実施例１：ウロキナーゼ受容体包埋リポソームの調製
（１）膜画分の調製
Ｕ９３７はヒト単球由来の株化細胞であり、ホルボールエステル（ＰＭＡ）刺激によりウロキナーゼ受容体を高濃度に発現することから、膜画分分離用の試料として用いた。洗浄後、氷冷下、ポリトロンで２−５秒×３回：１分間の間隔で細胞を破砕し、４０％蔗糖密度勾配遠心分離（９５，０００ ｇ ｘ ６０ ｍｉｎ）により、界面に膜画分を集積させた（図６）。
【０１４１】
（２）膜蛋白質包埋リポソームの調製
精製卵黄レシチン （１．２５ ｇ） 及びコレステロール （０．１２５ ｇ） を ２５ ｍＬ の生理食塩水中に懸濁させ、氷冷下でプローブ型超音波発生装置により１５分間処理した。得られたリポソームの平均粒子径は ８０ ｎｍ であった。先に調製したＵ９３７膜画分をこのリポソーム溶液に加え、−８０℃及び室温下で凍結融解を３回繰り返したところ、混合液は白濁した。リポソームのみを含有する溶液で同様の処理を行なったところ、リポソーム溶液は白濁した。一方、Ｕ９３７膜画分は、凍結融解を繰り返しても、半透明のままであった。これらの試料に塩化セシウムを添加し、終濃度を４０％に調製した溶液の上に、塩化セシウム濃度が３０％及び１５％の溶液、並びに生理食塩水の順で重層し、密度勾配遠心分離（９５，０００ ｇ ｘ １ｈ）を行なった。その結果、Ｕ９３７膜画分は塩化セシウム濃度３０％と１５％の界面にバンドを形成し、白濁したリポソームは塩化セシウム濃度１５％と生理食塩水の界面にバンドを形成した。リポソームとＵ９３７膜画分の混合液では、白濁したリポソームと同様の位置にバンドが認められ、Ｕ９３７膜画分の位置にはバンドが認められなかった。この結果より、Ｕ９３７膜画分はリポソームと融合し、膜蛋白質包埋リポソームを形成したと推察された（図７）。
【０１４２】
（３）膜蛋白質包埋リポソームの確認
膜画分を分離・調製後、膜蛋白質を蛍光（ＦＩＴＣ）標識した。この膜画分を上記（２）の方法によりリポソームと反応させ、膜蛋白質包埋リポソームを形成させた。膜画分、膜蛋白質包埋リポソーム及び単純リポソームの各試料を、ＦＡＣＳによりそれぞれ解析した。その結果、図８に見られるように、１個の粒子あたりの蛍光強度（ｙ軸）は、膜画分が最も高く、単純リポソーム（蛋白質は存在せず、ＦＩＴＣの蛍光ではなく弱い散乱光が検出される）が最も低く、膜蛋白質包埋リポソームはその中間に位置した。膜蛋白質包埋リポソーム試料は、単純リポソームで検出される弱い散乱光を発する粒子をほとんど含まなかったことから、膜画分と単純リポソーム画分は、ほぼ１００％融合したと推察される。すなわち、膜画分と単純リポソームが融合して多重層リポソームが形成され、多重層リポソームのリポソーム内表面にも膜蛋白質が移行した結果、外膜表面上の膜蛋白質数が減少したために、膜蛋白質包埋リポソームでは蛍光強度が低減した。以上のことから、本調製法により、細胞及びそれから調製した細胞膜画分に結合した膜蛋白質が、リポソームの脂質二重層に移行することが示された。
【０１４３】
（４）ウロキナーゼ受容体の同定（Ｕ９３７細胞）
ＰＭＡの存在・非存在下で培養したＵ９３７細胞を可溶化し、ヤギ抗ヒトウロキナーゼ受容体抗体で免疫沈降し、電気泳動後ウエスタンブロッティングを行いＵ９３７細胞膜上でのウロキナーゼ受容体の存在を確認した。ウエスタンブロッティングの１次反応は、ビオチン化ヤギ抗ヒトウロキナーゼ受容体抗体を２５０倍希釈で２時間反応させ、２次反応は、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを１００倍希釈で１時間反応させた。反応後、ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴで検出した。その結果、図９で示すように、抗ヒトウロキナーゼ受容体抗体で染色される分子量 ５０ ｋＤａ の幅広いバンドが認められた。このことから、糖鎖構造の異なるウロキナーゼ受容体の存在が、Ｕ９３７細胞表面上に確認された。
【０１４４】
（５）ウロキナーゼ受容体包埋リポソームの確認
上記（３）の方法で得られた膜蛋白質包埋リポソームに、ヤギ抗ヒトウロキナーゼ受容体抗体を１次抗体として４℃で１時間反応させた後、ＦＩＴＣ標識ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体を２次抗体として４℃で１時間反応させた。１次抗体および２次抗体を１０倍希釈で反応させ、反応後、０．１％ ＢＳＡ−ＰＢＳ（プロテアーゼ阻害剤含む）で４回洗浄した。その後、共焦点レーザー顕微鏡 （ＬＳＭ４１０，カールツァイス株式会社）を使用し３２０倍で観察した（図１０）。抗ウロキナーゼ受容体特異抗体を添加した融合リポソームでは蛍光が観察されたが（図１０Ａ）、抗ウロキナーゼ受容体特異抗体を添加しない融合リポソームでは蛍光は観察されなかった（図１０Ｂ）。以上のことから、ウロキナーゼ受容体がリポソームの脂質二重層に移行することが示された。同様に、得られた膜蛋白質包埋リポソームを可溶化し、ヤギ抗ヒトウロキナーゼ受容体抗体で免疫沈降し、ウエスタンブロッティングに供した。ウエスタンブロッティングの一次反応は、ビオチン化ヤギ抗ヒトウロキナーゼ受容体抗体を２５０倍希釈で２時間反応させ、二次反応は、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを１００倍希釈で１時間反応させた。反応後、試料をＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴで検出した。その結果、図１１で示すように抗ヒトウロキナーゼ受容体抗体で染色される分子量 ５０ ｋＤａ の幅広いバンドが認められた。この結果は、Ｕ９３７細胞で先に確認された分子量分布と同じ分子量分布を示した。以上より、膜蛋白質包埋リポソームの脂質二重層に移行したウロキナーゼ受容体が、本来の細胞に存在する糖鎖構造等を保持したまま移行することが示された。
【０１４５】
（６）ウロキナーゼ受容体のリガンド結合能
Ｕ９３７細胞から調製した膜画分はその脂質二重層にウロキナーゼ受容体を保持していることが示されたので、ウロキナーゼ受容体のウロキナーゼ（リガンド）結合能を検討した。ウロキナーゼをＦＩＴＣで蛍光標識し、膜画分と反応させ、受容体とリガンドの結合を検討した。コントロールとしてＦＩＴＣで蛍光標識したヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を使用した。結果を図１２に示す。図から明らかなように、本方法で調製した膜画分は、その内因性リガンドであるウロキナーゼと結合したが（図１２Ａ）、ＨＳＡとは結合しなかった（図１２Ｂ）。このことは、本膜蛋白質調製法で得られた膜画分に保持されたウロキナーゼ受容体が、その三次元構造及び生理機能（リガンド結合能）を保持したことを意味する。次に、膜蛋白質包埋リポソームのウロキナーゼ結合能を調べた。ウロキナーゼをＦＩＴＣで蛍光標識し、先の方法で得られた膜蛋白質包埋リポソーム（ウロキナーゼ受容体包埋リポソームを含む）と反応させ、受容体とリガンドの結合を検討した。コントロールとしてＦＩＴＣで蛍光標識したヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を使用した。結果を図１３に示す。図から明らかなように、本方法で調製したウロキナーゼ受容体包埋リポソームは、その内因性リガンドであるウロキナーゼとは結合したが（図１３Ａ）、ＨＳＡとは結合しなかった（図１３Ｂ）。ウロキナーゼ受容体包埋リポソーム及びウロキナーゼの結合特異性を確認するために、ＲＩ標識したウロキナーゼ及び非標識ウロキナーゼの混合液を１：１〜１：１００００の種々のモル比で調製し、Ｕ９３７細胞及びウロキナーゼ受容体包埋リポソームとそれぞれ反応させ、細胞及びウロキナーゼ受容体包埋リポソームに結合した放射活性を測定した。図１４に示すように、両者とも、非標識リガンドの増加に伴ない、受容体に結合した放射活性は減少したことから、リポソーム包埋ウロキナーゼ受容体及びウロキナーゼの結合は特異的であると推察された。
【０１４６】
更に、ＰＭＡ刺激によるウロキナーゼ受容体の発現量変化を、膜蛋白質包埋リポソームへのウロキナーゼ結合量により検討した。図１５に示した通り、ＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞から調製した膜蛋白質包埋リポソームでは、未処理の細胞から調製したものに比較して、明らかに、蛍光標識ウロキナーゼと結合したリポソーム粒子数は増加した。
【０１４７】
以上の結果は、リポソームに包埋された膜蛋白質の構造及び機能が、生細胞膜上に発現する膜蛋白質のそれと同じであることを示す。従って、本発明による方法は、疾患における受容体及びリガンドの量及び特性の変化を、生細胞の代わりに評価し得ることが示された。
【０１４８】
実施例２：粒子径の縮小後における受容体包埋リポソームの出現
膜蛋白質包埋リポソームの粒子サイズをエクストルーダー法で変化させ、蛍光 （ＦＩＴＣ） 標識ウロキナーゼでウロキナーゼ受容体包埋リポソームの出現を検討した。その結果、図１６に示すように、ろ過孔サイズが ０．６ μｍ 以下のフィルターで整粒されたリポソーム溶液では、目的の受容体を包埋したリポソームの数が明らかに増加した。これは、融合直後の多重層リポソームでは目的受容体の多くがラージリポソームの内側に封入され蛍光検出されなかったこと、並びにさらに重要なことであるが、リポソームサイズを小さくすることにより、一個のリポソームに包埋される受容体の数が減少し、目的受容体を包埋するリポソームと目的受容体を含まないリポソームとが峻別され、包埋するリポソームの数が増加したという事実により引き起こされたと推察される。リポソームをエクストルーダー法又は他の方法で １０ ｎｍ − ５０００ ｎｍ、好ましくは５００ ｎｍ 以下の粒子経にサイジングすると、ＦＡＣＳ解析によれば、標識膜蛋白質包埋リポソームの集団が当該サイズ領域に明瞭に出現する。
【０１４９】
従って、例えば、膜蛋白質の遺伝子配列からｃＤＮＡを調製し、当該ｃＤＮＡを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、膜蛋白質（ＦＡＣＳで認識可能な蛍光分子及び他の標識分子を導入したもの）を発現させる場合、また、本発明の方法により、発現宿主の細胞膜画分から調製された標識膜蛋白質を包埋する非標識リポソームを当該サイズに調製しＦＡＣＳで解析する場合に、当該膜蛋白質の発現の有無、並びに発現量が検出されるのは自明である。この場合、現在使用し得る方法と異なり、膜蛋白質のＤＮＡ配列以外一切の情報及び試薬（抗体、リガンド、拮抗剤、細胞の応答性及び膜蛋白質の他の検出試薬）が存在しない条件下で、膜蛋白質の検出が可能となる。さらに、抗体等の膜蛋白質検出試薬が存在すれば、蛋白質レベルでの標識が可能となり、同様にＦＡＣＳでの発現の解析が可能となる。もちろん、本方法は、同様の原理によりリガンドの探索にも応用が可能である。
【０１５０】
実施例３：ウロキナーゼの質量分析用プレート上への転写
ウロキナーゼ（１０， １３， １６， ２０， ３３ μｇ）を、一定時間間隔をおきながらポリアクリルアミドゲルの同一ウェルにローディングして電気泳動を行った。泳動終了後、ゲルをガラスプレートから剥がし、転写緩衝液（５％アセトニトリル／１２５ ｍＭ ＮａＣｌ／ＰＢＳ）で５分間ゲル内溶液を置換した後、炭素数１６の疎水性基剤で表面加工されたアルミプレートに熱転写（拡散転写）を行った。５％アセトニトリルと１２５ ｍＭ ＮａＣｌ とを含有するリン酸緩衝液を転写緩衝液として用いて、３５℃で４時間転写を行った。図１７は、転写後の質量分析用プレート、及びクマシーブリリアントブルーで染色した転写前後のゲルを示す写真である。目視では質量分析用プレート上にウロキナーゼのバンドを確認することはできないが、転写後では、ゲル上のウロキナーゼのバンドが薄くなっていることから、ある程度のウロキナーゼが質量分析用プレート上に移行していることが示唆された。
【０１５１】
実施例４：質量分析での解析による、質量分析用プレート上のウロキナーゼの同定
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、熱転写（拡散転写）により質量分析用プレートに移行したウロキナーゼを質量分析計で直接測定した。その結果を図１８に示す。質量分析の条件は、エネルギー吸収物質としてシナピン酸 （５０％アセトニトリル／０．５％トリフルオロ酢酸に溶解した飽和溶液）を用い、これを０．５ μｌ／ｓｐｏｔ添加・風乾したのち、再度同量を添加・風乾した。測定はＣｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＳＥＬＤＩ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＲ Ｓｙｓｔｅｍにより行った。質量校正はβ−ラクトグロブリンＡ （ウシ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びコンアルブミン （ニワトリ） を用いる外部校正であった。ＳＥＬＤＩ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＲ Ｓｙｓｔｅｍの測定パラメータはＤｅｔｅｃｔｏｒ ｖｏｌｔａｇｅ ２２００Ｖ， Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ １０， Ｌａｓｅｒ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ２８５であった。その結果、分子量４９４６１．２の位置に１本のピークが観察された。検討に用いたウロキナーゼは前駆体であり、かつアミノ酸配列から予測される理論分子量は、４８，５２５であることから、糖鎖分子が付加していることが示唆される。
【０１５２】
実施例５：質量分析用プレート上へのウロキナーゼの移行率
質量分析での解析により、質量分析用プレート上へ移行したウロキナーゼの定量を行った。まず標準ウロキナーゼ ２５， １２．５， ６．２５ ｎｇ を用いて、質量分析により得られたピーク高と濃度の標準曲線を求めた。その後、ウロキナーゼ （２５００ ｎｇ） をポリアクリルアミドゲルにローディングして電気泳動を行った。熱転写（拡散転写）により質量分析用プレートに移行したウロキナーゼを質量分析計で直接測定した。その結果、図１９に示すように、２５ ｎｇ に相当するピーク高が検出された。この結果から、熱転写法によるゲルから質量分析用プレートへの移行率は約１％と見積もられた。
【０１５３】
実施例６：質量分析用プレート上のバクテリオロドプシン包埋リポソームの質量分析による解析
質量分析計を用いてバクテリオロドプシン（Ｓｉｇｍａ、Ｂ３６３６）を測定して得られた結果を図２０に示す。試料をチップ上に載せ、風乾し、２，５−ジヒドロ安息香酸 （エタノール中１７０ ｍｇ／ｍＬ） を０．５ μＬ／ｓｐｏｔ 添加、風乾した後、ＳＥＬＤＩ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＲ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ） に測定した。質量校正は、β−ラクトグロブリンＡ （ウシ）、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびコンアルブミン（ニワトリ）を用いる外部校正であった。ＳＥＬＤＩ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＲ Ｓｙｓｔｅｍの測定パラメータはＤｅｔｅｃｔｏｒ ｖｏｌｔａｇｅ ２１００Ｖ， Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ １０， Ｌａｓｅｒ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ２８５であった。その結果、いずれの場合にも２７０２７．３及び２８１２０．２の２本のピークが観測された。バクテリオロドプシンの理論分子量は２７０６８．０であることから、前者はバクテリオロドプシンであり、後者は、有機溶媒での処理の際にレチナールの脱離が見られたことから、バクテリオロドプシン様蛋白質であると示唆された。
【０１５４】
図２０Ａは、バクテリオロドプシン単独測定時の蛋白質濃度とピーク強度との相関を示し、比例関係より、検出限界は ２０ ｆｍｏｌ であった。図２０Ｂは、バクテリオロドプシン単独、単純リポソームとの共存条件下のバクテリオロドプシン及びリポソーム包埋バクテリオロドプシンの測定結果を示す。同一の溶媒条件下では、これら３つの様式では、同一濃度でのバクテリオロドプシンのＭＳシグナル強度は異なっていた。このことにより、単純リポソーム及びリポソーム包埋バクテリオロドプシンとの共存条件下でさえも、バクテリオロドプシンを質量分析により解析できることが示された。
【０１５５】
実施例７：質量分析用プレート上のウロキナーゼ受容体の質量分析による解析
質量分析用プレートにプロテインＧを共有結合で架橋し、抗ウロキナーゼ受容体抗体を非共有結合で結合させて、質量分析用プレートを作製した。図２１に示したウロキナーゼ受容体の精製品（図２１Ａ）をこのプレートに塗布後、常法により質量分析で解析した（図２１Ｂ）。その結果、分子量４９９７８．１の位置にウロキナーゼ受容体のピークが見出され（図２１Ｃ，上段）、ウロキナーゼ受容体のリガンドと考えられる抗ウロキナーゼ受容体ＩｇＧ抗体もまた理論分子量域に認められた。コントロールとして非特異的ＩｇＧを使用した場合には、ウロキナーゼ受容体の質量ピークは観察されなかった（図２１Ｃ，下段）。次に、Ｕ９３７細胞膜画分を質量分析に供した。その結果、同様の位置にウロキナーゼ受容体ピークが認められた。このことにより、Ｕ９３７細胞膜画分由来のウロキナーゼ受容体もまた、抗ウロキナーゼ受容体ＩｇＧに特異的に結合し得るというアイデアが支持される。さらに、質量分析用プレートにプロテインＧを共有結合させ、抗ウロキナーゼ受容体ＩｇＧ（ヤギ）を結合させ、プレート上にスペーサーとしてプロテインＧ／抗体の複合体を提供した。ウロキナーゼ精製品をこのプレートに塗布後、Ｕ９３７細胞から常法で調製したプロテオリポソーム溶液をプレート上４℃で一晩反応させた。オクチルグルコシドを含む緩衝液を用いてリポソームを除去した後、質量分析による解析を行なった。その結果、おおよそ ５０，０００ Ｄａ の位置にウロキナーゼ受容体とウロキナーゼの両者から構成されるピークを認めた（図２５，上段）。プロテオリポソームの代わりに蛋白質を含まない単純リポソームを使用した場合には、この領域にピークが見出されはしたものの（図２５Ｃ，中段）、ピーク強度は明らかに低減していた。即ち、２つのピーク間の差異は、ウロキナーゼ受容体が存在するか否かに起因している。このことは、プロテオリポソームに包埋されているウロキナーゼ受容体が、プレート上に結合したウロキナーゼに結合できるという事実を示す。ウロキナーゼ受容体及びウロキナーゼの両者のピークは、抗ウロキナーゼＩｇＧの代わりに、ウロキナーゼに結合し得ないウシＩｇＧを使用した場合には観察されなかった（図２５Ｃ、下段）。
【０１５６】
ここで特に言及されるべきことは、脂質二重層に包埋されたウロキナーゼ受容体が、質量分析により、そのリガンド（ウロキナーゼ）と共に一括して検出、同定されたという事実である。このことにより、本発明の基本原理が証明された。
【０１５７】
実施例８：質量分析用プレート上での糖成分の除去
糖鎖を有する膜蛋白質（ウロキナーゼ受容体、ウシロドプシン）および可溶性蛋白質（ウロキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、並びに糖鎖を有しない膜蛋白質（バクテリオロドプシン）および可溶性蛋白質（β−ラクトグロブリン、チトクロームｃ）を質量分析用プレート上に捕捉し、風乾し、５０％アセトニトリル・０．５％トリフルオロ酢酸で溶解した飽和シナピン酸（ＳＰＡ）、飽和２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）およびインドールアクリル酸（ＩＡＡ）を０．５ μｌ／ｓｐｏｔ 添加し、風乾した。測定はＳＥＬＤＩ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＲ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ）により行った。質量校正はユビキチン（ウシ）、ミオグロビン（ウマ）、血清アルブミン（ウシ）を用いる外部校正であった。その結果を表３および図２２に示す。
【０１５８】
【表３】
【０１５９】
膜蛋白質・可溶性蛋白質にかかわらず、ＳＰＡ又はＩＡＡを用いて得られた分子量は、そのアミノ酸配列から予測される理論値と同様であるものの、ＤＨＢを用いて得られた分子量は、蛋白質の糖鎖の存在に依存していた。例えば、糖鎖を含まない蛋白質であるチトクロームＣは、両方の場合においてほぼ同じ分子量を示したものの（ＳＰＡによれば１２，２５１、ＤＨＢによれば１２，２９７）、糖鎖を有する蛋白質であるウロキナーゼ受容体は、ＤＨＢ及びＳＰＡを用いた場合の間において約 ３，０００ Ｄａ の差異を示した（ＳＰＡによれば４７，４６６、ＤＨＡによれば５０，４６５）。ＤＨＢを用いて得られた糖鎖を有する他の蛋白質の分子量もまた、ＳＰＡ又はＩＡＡを用いて得られた分子量よりも １０００〜３０００ Ｄａ 大きいものであった。
【０１６０】
糖鎖又は脂質を構成成分として含む蛋白質の質量分析による解析において、蛋白質分解酵素あるいはフォスホリパーゼ、エステラーゼ等の前処理が必要とされる従来法と著しい対照を示し、本発明の方法では、質量分析用プレート上の試料に添加する溶媒の組成を単に変化させることにより、全て（条件によっては一部）の糖鎖及び脂質が除去された単純蛋白質スペクトルを得ることができる。
【０１６１】
本発明は、膜蛋白質・可溶性蛋白質に関わらず如何なる蛋白質にも適用が可能であり、溶媒は、蛋白質を組成とする触媒、いわゆる酵素と定義される物質以外の如何なる物質を含んでいてもよく、それらの濃度、添加順序等及び質量分析計の測定原理、種類等は限定されない。
【０１６２】
実施例９：質量分析による変性蛋白質の検出
質量分析による解析において、シナピン酸（ＳＰＡ）を溶媒としてチトクロームｃ、β−ラクトグロブリン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ウロキナーゼ等の可溶性蛋白質を測定すると正常なＭＡＳＳシグナル強度が出現するが、溶媒として２，５−ジヒドロキシ安息香酸 （ＤＨＢ） を使用するとＭＡＳＳピークは極端に減弱化した（図２３右）。膜蛋白質（バクテリオロドプシン、ウロキナーゼ受容体）では、この溶媒効果は逆であった（図２３左）。これにより、膜蛋白質群のみを高感度に検出すること、又は可溶性蛋白質群のみを高感度に検出することが可能となる。本発明の重要な局面は、本来の生理的状態では可溶性である蛋白質が何らかの原因（自身のペプチド断片の遊離、遺伝子の変異、同一配列を有するヘテロ構造分子間での熱力学的により安定な構造への相互変換等）で変性し、非可溶性蛋白質となったときに、可溶性蛋白質と非可溶性蛋白質の選別検出を可能とする測定法を提供することである。これは、既存の如何なる技術によっても想到し得ない。
【０１６３】
従って、本発明によれば、病原性プリオン蛋白質（ヒト、ヒツジ、ウシ、酵母等の生物種を問わない）の超高感度な検出及び定量が提供される。またこの測定原理は、アミロイドβ蛋白質（Ａβ）の変性（不溶化）に伴ない発症するアルツハイマー病、トランスサイレチン蛋白質 （ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ） の変性（不溶化）に伴ない発症する家族性アミロイドーシスポリニューロパシー （Ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｌｏｙｔｉｃ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ） 等の他の神経変性疾患に応用が可能であるのみならず、変性（不溶性）蛋白質が関与する任意の疾患の検出、動物の検疫、食肉検査等に応用が可能である。本発明は、試験管内での蛋白質の再構成度の測定等、可溶性分子の変性状態（不溶性）と生理状態（可溶性）とを選別する測定法に対し広範な応用が可能である。
【０１６４】
実施例１０：支持体に結合したリガンドと膜蛋白質包埋リポソームとの結合
膜蛋白質の支持体としてリポソーム、生体膜（膜画分）又は生体膜（細胞）を、リガンド支持体として質量分析用プレート、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂゲル又は磁性鉄粒子を、スペーサーとしてプロテインＧ又はビオチンを、表４に示される通りに組み合わせて用いることにより、膜蛋白質・リガンド複合体を形成させた。
【０１６５】
【表４】
【０１６６】
その結果、支持体とリガンドの間にスペーサー分子が存在することが好ましいことが判明した。リガンドの種類によって異なるが、スペーサーが存在しない場合は、膜蛋白質包埋リポソームは全く結合しないか、又は結合力が弱かった。これは、両分子が異なる固体表面に固定されるため、一点での結合による親和性効果の相互作用よりも、複数の点での結合によるアビディティー効果の相互作用が必要とされるからである。複数の点での結合を可能にするために、両分子会合時の立体障害を減弱化し衝突回数を増加させるような適切なスペーサー分子を介在させることが必要である。スペーサー分子は、リガンドと支持体の間に存在し、生体ポリマー（タンパク質など）、合成ポリマー又は金属等からなり、解析の目的に応じて共有結合・非共有結合による結合が可能であり、三次元的な空間を有する微小な網目状、多孔性等の形状であり得る。
【０１６７】
実施例１１：Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂゲルに固定化されたリガンドと受容体包埋リポソームとの結合
ビオチン化したリガンド３種（ウロキナーゼ、インターフェロン−γ、補体Ｃ５ａ）を、アビジン化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂゲルに結合させた。この場合のリガンド支持体はＳｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂゲルで、スペーサーはアビジン（蛋白質）である。膜蛋白質包埋リポソームを、上記実施例１（２）の方法によりＦＩＴＣ標識蛍光リポソームとＵ９３７膜画分から調製し、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂゲルに固定した３種類のリガンドと反応させ、ＰＢＳで３回洗浄した後、可視光及び蛍光で観察した。その結果、図２４に示すように、可視光 （Ｂ） では全てのゲルで白色が観察された。暗視野における蛍光 （Ａ） では、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂゲルのみでは発色は観察されなかったが、組み合わせて結合させた３種類のリガンドを用いた他のゲルでは、蛍光を発した。この結果は、本発明の原理が、前述の質量分析用プレート／質量分析に加えて、任意のリガンド支持体／任意の検出系の組み合わせ（例えば、粒子／蛍光、粒子／放射活性、粒子／二次シグナル発生試薬等）に応用が可能であることを示す。
【０１６８】
上記実施例では、受容体の任意のタイプについて本発明が応用可能であることを示すために、ウロキナーゼ受容体（ＧＰＩアンカー型）、活性化補体Ｃ５ａ受容体（ＧＰＣＲ型）及びインターフェロン−γ受容体（オリゴマー型）と、それらのリガンド（ウロキナーゼ、Ｃ５ａ、ＩＦＮγ）とを用いて相互作用（機能）の検出結果を示している。これらの結果により、分子の構造・機能にかかわらず任意の膜関連受容体、膜関連チャネル、膜関連ポンプ、膜関連トランスポーター並びにそれら蛋白質に付随的に結合する物質が本発明の原理及び方法に従ってリガンドと共に単離・同定され得ることが、当業者には容易に理解されるであろう。
【０１６９】
また、測定法として質量分析を想定した、膜蛋白質・リガンド用全自動プロテオーム解析装置の各構成部分の基本仕様及び検討結果を示したが、蛍光分析を想定した蛍光標識リポソーム及びリガンド・粒子結合体を用いる実施例が示すように、本発明は多岐にわたり応用可能であることが当業者には容易に理解されるだろう。
【０１７０】
このように、本発明を好ましい実施態様を強調して説明してきたが、好ましい実施態様が変更され得ること、並びに本発明が本明細書に具体的に記載された以外によっても実施され得ることは、当業者には自明であろう。従って、本発明は上記の特許請求の範囲によって定義される発明の精神と範囲に包含される全ての改変を含むものである。
【０１７１】
本出願は、２００１年１月９日付で出願された米国仮特許出願第６０／２６０，４３３号及び２００１年３月２日付で出願された同第６０／２７２，９８１号を基礎とするものであり、それらの内容はすべて本明細書中に包含されるものである。
本明細書で引用した、特許、特許出願及び刊行物を含むすべての参考文献は、ここで言及することによりそのすべてが組み込まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明のプロテオーム解析システム及びその構成要素の代表的な実施態様を模式的に示す。
【図２】
図２は、本発明で用いられる質量分析用プレートの１つの実施態様を示す。
【図３】
図３は、本発明で用いられる可溶性蛋白質（リガンド）支持体の種々の実施態様を示す。
【図４】
図４は、本発明で用いられるリガンド・受容体（膜蛋白質）マトリクス表の１つの実施態様を示す。
【図５】
図５は、Ｂｔ２ｃＡＭＰ刺激前（図５Ｂ）及び後（図５Ａ）でのＵ９３７細胞膜に対するウロキナーゼ受容体（リガンド：ＦＩＴＣ−ＵＫ）、Ｃ５ａ受容体（リガンド：ＦＩＴＣ−Ｃ５ａ）、及びインターフェロン−γ受容体（リガンド：ＦＩＴＣ−ＩＦＮγ）の発現を示す。
【図６】
図６は、Ｕ９３７細胞からの膜画分の分離を示す写真である。この写真では、左は、４０％スクロース密度勾配遠心分離前を示し、右は、４０％スクロース密度勾配遠心分離後を示す。
【図７】
図７は、Ｕ９３７膜蛋白質包埋リポソームの単離を示す写真である。Ａ：リポソーム（２００μｌ）＋膜画分；Ｂ：リポソーム（５０μｌ）＋膜画分；Ｃ：膜画分；Ｄ：リポソーム（２００μｌ）。
【図８】
図８は、ＦＩＴＣ標識膜画分（図８Ａ）、ＦＩＴＣ標識膜蛋白質包埋リポソーム（図８Ｂ）、単純なリポソーム（図８Ｃ）のＦＡＣＳ解析の結果を示す。
【図９】
図９は、Ｕ９３７細胞膜上でのウロキナーゼ受容体の発現を示すウエスタンブロット解析の結果である。
【図１０】
図１０は、抗ウロキナーゼ受容体抗体の存在下（図１０Ａ）及び非存在下（図１０Ｂ）におけるウロキナーゼ受容体包埋リポソームの共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図１１】
図１１は、可溶化膜蛋白質包埋リポソームのウエスタンブロット解析の結果である。
【図１２】
図１２は、膜画分中のウロキナーゼ受容体のリガンド（ＦＩＴＣ標識ウロキナーゼ）結合能を示す（図１２Ａ）。ＦＩＴＣ標識ＨＳＡをコントロールとして用いた（図１２Ｂ）。
【図１３】
図１３は、リポソーム包埋ウロキナーゼ受容体のリガンド（ＦＩＴＣ標識ウロキナーゼ）結合能を示す（図１３Ａ）。ＦＩＴＣ標識ＨＳＡをコントロールとして用いた（図１３Ｂ）。
【図１４】
図１４は、Ｕ９３７細胞（図１４Ａ）及びウロキナーゼ受容体包埋リポソーム（図１４Ｂ）との標識リガンドの結合のモル比依存性を示す。
【図１５】
図１５は、ＰＭＡ刺激（図１５Ｂ）及び非刺激（図１５Ａ）のＵ９３７細胞から調製された膜蛋白質包埋リポソームのリガンド（ＦＩＴＣ標識ウロキナーゼ）結合能を示す。
【図１６】
図１６は、リポソーム粒子サイズの縮小化によるウロキナーゼ受容体包埋リポソームの出現を示す。
【図１７】
図１７は、ウロキナーゼが転写された質量分析用プレート及び該プレート上への転写前後のポリアクリルアミドゲルのクマシーブリリアントブルー染色の写真である。
【図１８】
図１８は、質量分析用プレート上に転写されたウロキナーゼの質量分析による解析の結果を示す。
【図１９】
図１９は、質量分析用プレート上に転写されたウロキナーゼの定量の結果を示す。
【図２０】
図２０は、バクテリオロドプシンの質量分析による解析の結果を示す。図２０Ａは、種々の濃度のバクテリオロドプシンでの結果を示し、図２０Ｂは、バクテリオロドプシン単独、単純リポソーム共存下のバクテリオロドプシンおよびリポソーム包埋バクテリオロドプシンの結果を示す。
【図２１】
図２１は、質量分析用プレート上のウロキナーゼ受容体の質量分析による解析の結果を示す。図２１Ａは、電気泳動した精製ウロキナーゼ受容体の写真であり、図２１Ｂは、質量分析用プレート上に形成された複合体の模式図であり、図２１Ｃは、抗ウロキナーゼ受容体ＩｇＧ（上）及びコントロールＩｇＧ（下）をリガンドとして使用した場合における、質量分析による解析の結果を示す。
【図２２】
図２２は、ＩＡＡ又はＤＨＢの添加による、ウシロドプシンの質量分析による解析の結果を示す。
条件：
ウシロドプシン：２．５６ｐｍｏｌ膜懸濁液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、１００μＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）
マトリクス：０．１７ｍｇ／μＬ ＤＨＢ（エタノール０．５μＬ中）又はＩＡＡ飽和溶液（エタノール１．０μＬ中）。
【図２３】
図２３は、変性蛋白質モデルとしてのウロキナーゼ受容体（図２３Ａ）及び生理学的蛋白質モデルとしてのウロキナーゼ（図２３Ｂ）の質量分析による選択的測定を示す。
【図２４】
図２４は、種々の受容体を包埋するリポソームとＳｅｐｈａｒｏｓｅ−４Ｂゲル上に固定されたそれらのリガンドとの結合を示す。
【図２５】
図２５は、リガンドとしてのウロキナーゼ及び受容体としてのウロキナーゼ受容体の質量分析による一括解析を示す。
発明の技術分野
本発明は、膜蛋白質とそのリガンドの一括発見及び一括定量並びにその機能（相互作用）の解析を可能にする機能的蛋白質科学 （ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ） の方法論、技術及び装置に関する。本発明はまた、特定の疾患の発症、増悪、治癒に関わる膜蛋白質とそのリガンドを発見、単離、同定、定量し、それらの機能を解明し、それらの種類と定量値をデータベースとして構築することを含む、膜蛋白質とそのリガンドを指標とする新規な蛋白質薬理学 （ｐｈａｒｍａｃｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ） 的疾患解析方法、並びに当該データベースに関する。さらに本発明は、各生物の膜蛋白質ライブラリーの構築法に関し、また、蛋白質の構造と機能の保持を可能にし、且つ膜蛋白質の研究に必須である膜蛋白質の単離法、同定法、定量法、及び膜蛋白質の機能解明に必須のその他の基本的方法に関する。
【０００２】
発明の背景
分子生物学やゲノミクス（ゲノム科学）を含む創薬の基盤研究の進歩により、ここ数年間で創薬の様相が急速に変化し、ゲノム創薬に代表される新しい創薬方法が開発されつつある。
【０００３】
新規医薬品の発見は、特定の疾患において独自の生理活性を有する物質を見つけ出すことにある。このような生理活性を有する物質の多くは蛋白質であり、蛋白質の構造と機能の解明は医薬品開発において必須の課題である。
【０００４】
受精から発生・分化・増殖・代謝・死に至る生命活動にとって、膜包埋蛋白質は重要な機能を担っている。これら膜蛋白質は細胞外情報の細胞内伝達の膜受容体として、生理物質の細胞内外への特異的な膜運搬体として、並びに動的な膜構造を保持する膜の裏打ち蛋白質として機能している。精製、単離及び機能解析における困難性は、膜会合蛋白質の研究を遅延させてきた。
【０００５】
蛋白質の機能（生理作用）は、ゲノミクスにより決定された核酸配列からは予測できないため、遺伝情報を新薬に結び付ける方法の確立がポストゲノムに求められている。その一つとしてプロテオミクス（蛋白質科学）が注目を浴びている。１００，０００種を超えて存在する全蛋白質の単離、同定、機能の解明がプロテオミクスの目標である。状況が進むにつれ、ゲノム情報を蛋白質機能の理解にいかに結び付るかが、２１世紀創薬の戦略課題となっている。
【０００６】
生命活動全般に関わる蛋白質分子の構造と機能の高度な多様性はＤＮＡ分子の多様性の比ではない。この意味において、構造的に類似したヒトの２４本の染色体に対しＤＮＡ配列決定法のみを適用して成功を達成したゲノミクスの戦略を、多様性に富む対象を扱うプロテオミクスにそのまま適用することは非現実的である。また、ＤＮＡ配列のみでは生命活動の予測は不可能である。従って、蛋白質機能を解明し得るプロテオミクスが切望される。
【０００７】
分子構造と分子活性との関係は生物学の研究において基本的である。構造−活性関係は、任意の生体反応、例えば酵素の機能、細胞間連絡法、並びに細胞制御及びフィードバック系を理解するために重要である。
【０００８】
蛋白質は生命現象の源であり、他の分子（蛋白質分子、ＤＮＡ分子、合成化合物、光子などを含む）との相互作用においてその機能を発揮する。所定の蛋白質を理解するということは、当該分子の物理的又は化学的性質の単なる列記を超える。これは、互いに影響する分子を同定し、その相互作用の現象形態（生理作用）を解明することにより、どの分子とどのような相互作用が生じているかを見出すことを含む。
【０００９】
ある種の巨大分子が、非常に特異的な３次元的及び電子的分布を有する他の分子と相互作用し、そして結合することが知られている。この様な特異性を有する任意の巨大分子は、それが代謝中間体の加水分解を触媒する酵素であるか、イオンの膜輸送を仲介する細胞表面蛋白質であるか、近隣の細胞に対して特定の細胞を同定するのに役立つ糖蛋白質であるか、血漿中で循環しているＩｇＧ抗体であるか、核ＤＮＡのオリゴヌクレオチド配列であるか等に拘らず、受容体と考えることができる。受容体が選択的に結合する種々の分子はリガンドとして知られている。
【００１０】
既存の医薬品の約半数は細胞膜上の受容体を介して作用することが知られている。従って、新規膜蛋白質とその生理的リガンドの解明は、種々の疾患の新規治療薬開発に画期的なスクリーニング系を提供する。さらに、疾患に関わる新規・既知の膜蛋白質・リガンドのデータベースの構築は、ゲノム薬理学が到達できない疾患の分子動力学の解明を可能とし、新規診断法及び新規治療薬の開発に繋がることが期待される。
【００１１】
未知の受容体及びリガンドの発見には多くの方法が利用可能であるが、従来のアイデア、方法及び実験から得られうる受容体又はリガンドの数は、それらの特徴によりしばしば制限される。複数のペプチドからなる複合型の受容体の発見には、依然としてより困難な問題が伴う。新規受容体及びリガンドは、Ｘ線結晶回折又は遺伝子組換え技術等の新規技術の適用により見出される。しかし、このような新規方法は、偶然の一致に依拠し、長期間の生化学的研究を必要とするか、又は極めて限られた分子種にのみ適用可能であった。
【００１２】
以上の考察を踏まえると、その生理機能の一部の解明（＝生理的リガンドの同定）のために、プロテオミクスの標的として膜受容体や膜運搬体等の膜蛋白質を研究することは、大いに意義がある。
【００１３】
従来のプロテオーム研究は、蛋白質分離手段として、もっぱら二次元電気泳動法に依拠してきた。しかしながら、所定の細胞の全蛋白質を解析する場合、現行法は、以下の５つの問題を抱えている。
【００１４】
第１に、生体試料全体を一枚のゲル上で電気泳動すると、高分子量の蛋白質や不溶性膜蛋白質は泳動されずに原点付近に残るために解析自体が不能になる。従って、従来の二次元電気泳動法は、細胞に発現する全蛋白質の解析ができず、特定の蛋白質（主として、可溶性の低分子量蛋白質）の解析に用いられていた。２０世紀の生物学は分子生物学技術の開発によって劇的な発展を遂げたが、標的とされた蛋白質の多くは可溶性蛋白質であった。初期のプロテオーム研究は、血漿中に検出される蛋白質の総数が約２００個であるが、細胞破砕液に含まれる蛋白質の数が１４００〜４０００個であることを明らかにした。ヒト蛋白質をコードする約３００００個の遺伝子から発現する蛋白質の総数は１００，０００個を超えると予測される。このことは、最高感度のプロテオミクス技術によってさえも全蛋白質の数％しか検出できないことを意味する。
【００１５】
如何なる生命現象も蛋白質の機能として説明することができるが、同時に生命は自己と非自己を膜で区切ることで誕生した。すなわち、外界の非自己を認識し、自己をそれに応答させる仕事は、膜蛋白質により行われている。ところが、現在のプロテオミクス技術で検出不能の蛋白質の多くは、膜に会合して、又は膜に埋め込まれてその機能を示す、生命活動に重要な役割を担うこれら膜蛋白質である。
【００１６】
第２に、複数の蛋白質からなり、細胞中の特有の機能を発揮する蛋白質複合体は、界面活性剤を含む緩衝液中で泳動すると疎水性相互作用に基づく蛋白質間の結合が解離するために、実際に生体に存在する構造（蛋白質の四次構造）と機能を解析することができない。
【００１７】
第３に、生体試料中に含まれる全蛋白質をグループ分けする有効なアイデア、方法又は技術が提供されていない。合計約３０，０００個のヒト遺伝子から発現する全蛋白質数は１００，０００個を超える膨大な数にのぼる。それらは、同一遺伝子からの転写後にスプライシングに供され、それによりペプチド鎖が他よりも短い蛋白質が生成し、そして翻訳後には糖質、脂質、燐酸基等の種々の修飾に供される。その結果、プロテオミクスの標的である蛋白質は、ゲノミクスの標的であるＤＮＡポリマー分子に比べて、はるかに複雑な分子群からなる。これらの事実に基づくと、目的（核酸配列を決定すること）のみに基づく方法論（核酸の配列決定）しかプロテオームの多様な構造と機能を解明できないという仮説が提起される。従って、プロテオーム解析の前に、生体試料に含まれる蛋白質を、何らかのアイデアに基づいてグループ分けすることが非常に重要であり、そして前処理の幾つかの試みが、今日までになされている。例えば、Ｍｏｌｌｙら ［Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６７， ２８７１−２８８１ （２０００）］ 及び Ｓａｎｔｏｎｉら ［Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２１， １０５４−１０７０ （２０００）］は、強力な溶解剤を用いて試料を前処理したが、全ての蛋白質は可溶化しなかった。Ｈｅｒｂｅｒｔら ［Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２１， ３６３９−３６４８ （２０００）］ 及び Ｚｕｏら ［Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２８４， ２６６−２７８ （２０００）］ は、それらの等電点に基づき分離することにより試料を前処理したが、標的蛋白質に応じて適切な範囲の等電点を設定することが困難なため、等電点電気泳動をすることはできなかった。これらの試みは、電気泳動法の部分的な改善を目的としており、本発明によって実現される全蛋白質のグループ分けによる全プロテオーム解析を目的としていないことに留意されるべきである。しかしながら、グループ分けの効果的なアイデアは現在までに何ら提唱されていなかったため、試料調製からその後の解析に至るまで試料をグループ分けしない同様の方法が用いられている。これは、プロテオミクス研究を上記の２つの問題と直面させる。
【００１８】
第４に、プロテオミクスの従来の研究では、ゲルを小さな画分に区分し、特定の溶液を使用して各画分から蛋白質を抽出するという時間を浪費する多工程の複雑な操作が、ＭＳ解析前に必要とされる。この方法の複雑な操作は、装置の小型化、測定時間の短縮、複数の試料の処理、又は装置全体の自動化を妨げる。
【００１９】
第５の問題は、多くの種類の、いわゆる「量が少ない蛋白質 （ｌｏｗ−ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）」が存在することである。酵母では、たった１００個の遺伝子が、全蛋白質のうち５０重量パーセントをコードしており、このことは、残りの５０％の蛋白質が数千の遺伝子の産物であることを意味する。多くの最も重要な蛋白質（例えば、調節蛋白質、又は受容体を含むシグナル伝達関連蛋白質）が、「量が少ない蛋白質」に含まれ、電気泳動に基づく現在のプロテオーム解析法は、それらを解析することができない。
【００２０】
電気泳動のこのような限定された能力を解決し、かつ蛋白質間相互作用を解明するために、ＩＣＡＴ（同位体コード親和性タグ）法 ［Ｇｙｇｉら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １０， ９９４−９９９ （１９９９）］、酵母のツーハイブリッドシステム、ＢＩＡ−ＭＳ−ＭＳ、蛋白質アレイ法（溶液又はチップ） ［Ｚｈｏｕら、ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９， Ｓ３４−Ｓ３９］ 又はＬＣ−ＭＳ−ＭＳのペプチドミックスなどの多くの試みがなされている。しかしながら、これらの新規方法及び技術論は、プロテオミクスの究極目的である全プロテオームの発現解析、相互作用解析及びネットワーク解析を実現していない。固相蛋白質アレイ法（チップ法） ［Ｆｕｎｇら、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １２， ６５−６９ （２００１）］ 及び液相蛋白質アレイ法 （例えば、蛍光コードビーズ ［Ｆｕｌｔｏｎら、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ４３， １７４９−１７５６ （１９９７）］ ［Ｈａｎら、Ｎａｔ． Ｂｉｏｐｔｅｃｈｎｏｌ． （ｉｎ ｐｒｅｓｓ）］ を含む上記方法のうち最も有望な蛋白質アレイ法でさえも、２つの最も重要な基本的技術論、即ち、全プロテオームの精製及び分離、並びに支持体上への全プロテオームの選択的固定化を実現できていない。
【００２１】
従って、本発明の目的は、プロテオーム研究が現在直面している全ての問題を解決し、それによって全蛋白質のうち、生体機能及び疾患の解明に重要であると認識され、且つその機能を保持しつつ精製及び単離するという最大の困難性によりその研究をはるかに遅れさせていた膜蛋白質のプロテオーム研究を初めて可能とするアイデア、方法及び技術を提供することである。より具体的には、本発明は、膜蛋白質のそれに対するプロテオーム研究に注目し、膜蛋白質の無傷での単離、膜蛋白質がそれら本来の構造と機能を保持する膜蛋白質ライブラリーの構築、そのリガンドとの相互作用の観点からの膜蛋白質の機能の説明（即ち、膜蛋白質本来のエフェクター分子、即ち、リガンドの発見及び同定）、並びにこの目標のための、任意の膜蛋白質の解析を許容する基本的なアイデア、方法、技術及びデバイスの提供を目的とする。さらに、本発明は、それらが関与する疾患の機序の解明における使用のために、このように得られた膜蛋白質及びそれらの生理リガンドの情報を集積してデータベースとすることを目的とし、さらにこのような疾患の新規診断法を確立し、新規治療薬の開発への扉を開くことを目的とする。
【００２２】
発明の簡単な要約
本発明は、膜蛋白質のプロテオーム研究のために、生体を構成する全蛋白質を膜蛋白質とそれ以外の可溶性蛋白質にグループ分けするという、本分野で現在まで誰も提起しなかった基本アイデアを提供する。本発明は、蛋白質がその機能を発揮している本来の局在部位に着目するというグループ分けのアイデアに基づく。
【００２３】
可溶性蛋白質のみを電気泳動し、膜蛋白質を新規方法により解析するというこのような洞察及び導入（即ち、膜蛋白質を、細胞膜脂質二重層モデルの人工リポソームに包埋し、膜蛋白質ライブラリーを構築する）は、電気泳動による膜蛋白質解析における困難性を解決し、そしてグループ分けした後に、可溶性蛋白質に対する生物学的親和性を利用する全蛋白質（膜蛋白質及び可溶性蛋白質）解析を通じて膜蛋白質の機能（可溶性蛋白質との相互作用）を解析するという基本原理を確立する。この本質的な技術論はまた、膜蛋白質間又は可溶性蛋白質間の相互作用のスクリーニング及び解析に適用可能であり、将来のプロテオミクスに対して革新的な理論を提供する。
【００２４】
より詳細には、本発明は、生体中の全蛋白質を膜蛋白質と可溶性蛋白質とにグループ分けし、膜蛋白質とそのリガンドの生物学的親和性に基づいてそれらを一括して解析することを特徴とするプロテオーム解析方法及びそのための種々の装置を提供する。本方法は、以下の工程を含む：
（１） 生体試料から可溶性蛋白質画分を単離し、ゲル電気泳動により画分中の可溶性蛋白質を分離し、蛋白質をその生理的機能を保持して固定化し得る表面を有するリガンド支持体に泳動後のゲルを接触させて、ゲル中の可溶性蛋白質をリガンド支持体に移行させる；
（２） 細胞試料から膜画分を単離し、膜画分をリポソームと融合させて、全ての膜蛋白質がその脂質二重層に付着若しくは貫通した膜蛋白質ライブラリー（膜蛋白質包埋リポソームのセット）を調製する；
（３） リガンド支持体上に固定された可溶性蛋白質を膜蛋白質ライブラリーと接触させて、可溶性蛋白質に対して親和性を有する膜蛋白質をリガンド支持体上に捕捉する；および
（４） 親和性を有する膜蛋白質および可溶性蛋白質の両方もしくはいずれか一方を、これら蛋白質の物理的又は化学的性質の少なくとも１つを解析し得る手段により分析する。
【００２５】
好ましくは、蛋白質の物理的又は化学的性質の少なくとも１つを解析し得る手段は、質量分析による解析であり、従って、適切なリガンド支持体は、質量分析用プレートである。
【００２６】
本発明により、具体的には以下の課題が解決される。
膜蛋白質が、蛋白質変性剤、蛋白質可溶化剤、その他膜蛋白質が存在する生理条件を逸脱させるいかなる処理条件も使用せずに、その疎水性領域及び親水性領域の生体状態を維持して人工リポソーム膜に移行するので、膜蛋白質の２次、３次、４次構造及び生理機能の保持が可能となる。受容体については、ＧＰＩ型、ＧＰＣＲ型及びオリゴマー型受容体を含む任意の生体膜型受容体の任意の構造と機能の保持を可能とする。従って、全ての膜蛋白質が、構造と機能を保持したまま調製でき、それによって医学、農学を含む全ての生物学領域において膜蛋白質研究の困難さが払拭される。
【００２７】
リガンドを含む可溶性蛋白質のみが電気泳動法により分離されるので、任意の可溶性蛋白質が、不溶性蛋白質の混入によって種々の妨害を受けることなく解析され得る。
【００２８】
一次元及び二次元電気泳動法で分離した可溶性蛋白質を質量分析用プレート上に直接転写させることにより、操作時間が劇的に短縮し、質量分析用プレートに移行すべき蛋白質量の増加により発現量が低い蛋白質の検出が可能になり、装置が小型化及び自動化し、処理すべき試料数が増加する。
【００２９】
膜蛋白質が移行したリポソームを支持体上に固定された種々のリガンドと接触させ、両者の生物学的親和性を利用して精製することによって、高度に精製された、目的とする膜蛋白質・リガンド複合体が、単離され得る。
【００３０】
本発明では、膜蛋白質とリガンド（拮抗剤を含む）の分子間の純粋な相互作用は、両分子が高純度であるか、他の多数の物質と共存しているかにかかわらず、また、細胞内情報伝達物質若しくは転写調節物質による影響を受けることなく測定され得る。換言すれば、細胞の応答性に依拠した相互作用検出法では、リガンドの生理学的作用点が、膜蛋白質か、細胞内情報伝達物質か、転写調節物質か、あるいはその他の作用点かが不明なままである。それに反して、本発明は、膜蛋白質とリガンドのみの相互作用の検出を提供する。
【００３１】
膜蛋白質・リガンド複合体を質量分析用プレート上で精製することにより、これら両者をＭＡＳＳ分光計で一括して検出することが可能となる。
【００３２】
膜蛋白質・リガンド複合体の形成と検出により、膜蛋白質の機能（当該リガンドとの相互作用）が明らかとなる。
【００３３】
本発明はまた、所定の疾患に罹患した生物（ヒト、植物、動物及び全ての他の生物を含む）から採取した試料を用いて上記方法によりプロテオームを解析し、得られた解析データを健常な同種生物のそれと比較することを含む、該疾患特異的に量又は特性において変化を示す膜蛋白質及び／又はそのリガンドを同定する方法を提供する。この方法を複数の疾患に適用し、得られたデータを集積することにより、診断用データベースが構築され得る。このように、疾患特異的な膜蛋白質とそのリガンドを見出し、その定量値をデータベースに入力し、そのデータを健常な同種生物のデータと比較することにより、膜蛋白質とリガンドという２元の蛋白質薬理学データに基づいた疾患の診断が利用可能となる。
【００３４】
ゲノム薬理学は、患者の遺伝的素因解析、あるいは静的な病因分析により課される限界を有する。ゲノム薬理学の解析結果は、患者の疾患とはほとんど直接関連がなく、それ故、動的に変化し、疾患を引き起こす蛋白質の情報を提供することはできない。これに対して、蛋白質薬理学は、生体反応を司る蛋白質の動態を直接教示しており、蛋白質の変化を通じて患者の現在の疾患状態を動的に示す。
【００３５】
ゲノム薬理学情報の収集は患者の遺伝的素因に関わる個人情報に抵触し、個人、人種及び国家によっては、しばしば解決不能な倫理上の問題であり得る。しかしながら、蛋白質薬理学情報は、患者の疾患原因の理解に関するものであり、通常病院で実施される検査及び診断と同様に収集されるので、２１世紀の生物科学観と倫理観の葛藤に巻き込まれる心配はない。
【００３６】
膜蛋白質とリガンドの２元データを一括して解析できるため、疾患が膜蛋白質を介する情報伝達の欠陥により引き起こされる場合に、疾患が膜蛋白質の量及び特性の変化、リガンドの量及び特性の変化、又はその両方により引き起こされるのか否かにつき、疾患の原因が簡便に診断され得る。
【００３７】
本発明の以上の構成を全自動装置として組み立てれば、画期的な産業上の利用分野が開拓され得る。その一例は、全自動膜蛋白質・リガンドプロテオーム解析システムである。その構成要素の概略図を図１に示す。なお、膜蛋白質の研究目的に応じて、本発明に基づいて種々の他の装置を組み立てることが可能なことは言うまでもない。
【００３８】
本発明は、ゲノム配列から相同性検索によりＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を予測することを含むオーファンリガンドの研究はもちろんのこと、ゲノム配列及びコンピューターを用いる相同性に基づく予測技術では到底発見不可能なその他の全てのタイプの受容体（ＧＰＩ型、オリゴマー型）とそのリガンドの発見、同定、解析に利用可能である。
【００３９】
その上、本発明は、今なお困難を極める全てのタイプの膜蛋白質（受容体以外の膜蛋白質）の発見、同定及び解析に多大な貢献をすると考えられ、従って、全膜蛋白質とリガンドが関与する疾患の解析、診断薬・診断法の開発、治療薬の開発を目的とする、いわゆる「受容体関連創薬型」医薬品を含むいわゆる「膜蛋白質関連創薬型」医薬品の開発を可能にする。
【００４０】
本発明は、生物学研究史上困難を極めた膜蛋白質研究に画期的な方法論を導入し、医療への貢献のみならず、２１世紀初頭の全地球的課題である食料・環境を巡る重要な問題の解決を目的とする、生物の新機能の発見と利用及びそれを応用した新しい産業を生み出す駆動力となるであろう。
【００４１】
本発明のこれら及び他の目的及び利点、並びに本発明の他の特徴は、本発明の以下の説明から明らかとなるであろう。
【００４２】
発明の詳細な説明
１．用語及び本発明の一般的態様
以下の用語は、本明細書において使用される場合、下記の一般的意味を有する。また、本発明の一般的態様は以下の通りである。
【００４３】
（ｉ） 「相補的」とは、受容体とそのリガンドが相互作用する表面の形態的（ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌ）適合性又は一致性をいう。換言すれば、受容体とそのリガンドは相補的であり、そしてそれ故、その接触表面特性は相互に相補的である。
【００４４】
（ｉｉ） 「リガンド」は、特定の受容体により認識される分子である。本発明におけるリガンドの例としては、生理学的リガンドに限定されず、細胞膜受容体に対するフルアゴニスト、パーシャルアゴニスト、アンタゴニスト及びインバースアゴニスト、毒素、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、鎮静剤、オピエート、ステロイド等）、ペプチド、酵素、酵素基質、補酵素、薬物、レクチン、糖、オリゴヌクレオチド、核酸、オリゴサッカライド、蛋白質、及びモノクローナル抗体が挙げられる。リガンドは天然分子でも人工分子でもよい。天然リガンドの局在は限定されない。それは、大気圏を含む地球表面上に存在する任意の物質、生物が分泌する物質、細胞内物質、細胞小器官内物質、核物質などであり得る。
【００４５】
（ｉｉｉ） 「受容体」とは、特定のリガンドに対する親和性を有する分子である。受容体は天然分子でも人工分子でもよい。これは、単独で又は他の分子種との複合体として機能する。受容体は、共有結合により又は非共有結合により、直接的に又は特定の結合物質を介して複合受容体（オリゴマー受容体）を形成する。本発明により使用され得る受容体としては、抗体、細胞膜受容体、特定の抗原決定基（例えばウイルス、細胞又は他の材料上にあるもの）と反応するモノクローナル抗体及び抗血清、薬物、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、補酵素、レクチン、糖、ポリサッカライド、細胞、細胞膜、及びオルガネラが挙げられるがこれらに限定されない。受容体はしばしば、当該分野において抗リガンドと称される。本明細書において「受容体」なる用語が使用される場合、意味の相違は意図されない。
【００４６】
さらに本発明においては、その構造・機能にかかわらず、任意の膜受容体、膜チャネル、膜ポンプ、膜運搬体、膜裏打ち蛋白質、及びそれら蛋白質に会合により結合する物質が、受容体もしくは膜蛋白質と広く記載される。なぜなら、本発明の方法によれば、それらを単離・同定し得ることが当業者に容易に認識されるからである。
【００４７】
２つの巨大分子が分子認識を介して結合して複合体を形成する場合、「リガンド・受容体複合体」が形成される。受容体の局在は、狭義の細胞膜（細胞外層を形成するいわゆる原形質膜）に限定されない。受容体とは、共通する構成物である脂質二重層を有する任意の膜に結合する分子をいう。例えば、核膜に結合するＤＮＡポリメラーゼ複合体は、ＤＮＡの複製及び修復に重要であり、ＲＮＡポリメラーゼは、転写に重要であり、小胞体膜に結合するリボソームは、蛋白質の翻訳に重要である。ミトコンドリア膜に結合する酸化還元酵素群は、ＡＴＰ産生に重要な役割を担っており、ペルオキシゾーム膜の代謝関連酵素群は、過酸化物の代謝や熱の発生に関わっており、ライソゾーム膜に含まれる分解酵素群は、蛋白質、核酸、糖質及び脂質の分解に関わっており、ゴルジ装置の膜蛋白質は、蛋白質合成後のグリコシル化、及び合成された蛋白質若しくは脂質の膜輸送において重要な機能を有する。さらに細胞内の情報伝達に深く関わるリン酸化酵素群、並びに脱リン酸化酵素群の作用する足場として種々の細胞内膜表面が関わっている可能性が示唆される。以上の例示は、受容体（膜蛋白質）の重要な機能をその例示範囲に限定するものではない。膜蛋白質が関わる生命現象の多様性が示されるにつれて、本発明により新たに同定される膜蛋白質及びそれらの機能は、全て本発明に包含される。
【００４８】
受容体と脂質二重層の位置関係は変動する。最も一般的なものは、蛋白質の疎水性領域と脂質二重層の疎水性領域との疎水性相互作用によって安定化され、且つ数回折り畳まれた膜貫通型のもの（Ｇ蛋白質共役型受容体）である。これには、脂質二重層の外側の脂質層に埋め込まれたＧＰＩアンカー型受容体（グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型受容体）も含まれる。例としては、細胞の外側の表層に固定された糖蛋白質、糖脂質、オリゴマー糖質、細胞の内側に固定されたＧＴＰ／ＧＤＰ共役蛋白質群を含む広義のオリゴマー受容体構成分子群、膜の形状の維持及び変化に重要な役割を果たす膜の裏打ち蛋白質群、それらと結合する機能性蛋白質群などが挙げられる。以上は、受容体（膜蛋白質）と脂質二重層の位置関係の例示である。例示は限定的ではない。本発明によりさらに多彩な位置関係が明らかにされるにつれ、本発明はこのような任意の関係を含むものである。
【００４９】
本発明において研究対象となり得る受容体は未知なものを含め多数存在する。以下の例示は、これらの一部である。
【００５０】
ａ） 癌特異的膜蛋白質
癌細胞膜に発現し機能する膜蛋白質を同定し、その機能を解析することにより、癌細胞に対する増殖抑制、アポトーシス誘導、転移抑制等の作用機序を持った医薬品の開発が期待される。当該膜蛋白質に特異的な抗体自体が、有効な医薬品として使用され得るとともに、毒素等を標的癌細胞に送達するターゲッティング療法にも適用可能である。
【００５１】
ｂ） 自己免疫疾患において自己抗体（リガンド）、又は臓器移植において自己組織障害性リンパ球が攻撃する組織の細胞膜に発現する膜蛋白質を同定することによって、自己抗体あるいは自己抗原特異的組織障害性リンパ球との結合をブロックするのに有用な関連診断薬又は医薬品を開発することができる。特に、自己免疫疾患の疾患多様性は、組織特異性に基づくと考えられており、アジソン貧血、糸球体腎炎（原発性、ＩｇＡ）、グレーブス甲状腺機能亢進症、インスリン依存性糖尿病、多発性硬化症、悪性貧血、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、乾癬、全身性エリテマトーデス、甲状腺炎、白斑、クローン病、特発性血小板減少性紫斑病及び他の疾患において自己抗体又は自己組織障害性リンパ球が攻撃する膜抗原を単離及び同定することができれば、副作用が軽減され、且つ個々の自己免疫疾患に特異的な医薬品を開発することができる。
【００５２】
ｃ） 人工リガンド（拮抗剤）は存在するが、内因性のリガンドが未知であるベンゾジアゼピン受容体、カンナビノール受容体、シグマ受容体１、シグマ受容体２の内因性リガンドを特定することによって、及びＮＭＤＡ受容体のフェンシクリジン結合サイトに結合する内因性リガンドを特定することによって、中枢神経疾患の画期的な治療薬を開発することができる。
【００５３】
ｄ） 微生物に発現する受容体
微生物の生存に必須な膜運搬体に結合するリガンドの決定は、新しい作用機序を有する抗生物質の開発に有用である。特に、日和見真菌、原生動物及び現在使用されている抗生物質に耐性を有する細菌に対する抗生物質が価値がある。
【００５４】
ｅ） リガンドとしての核酸に対する受容体
核酸配列を合成し、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列にハイブリダイズする膜蛋白質を単離、同定及び機能解析し、外因性核酸と細胞膜機能の全く新しい相互作用を解明し、有用な関連診断薬又は医薬品の開発を導くことができる。例えば、アンチセンス技術に基づく医薬品の細胞内への有効な輸送系、又はＤＮＡ，ＲＮＡウイルスの新しい感染防御機構を開発することができる。
【００５５】
ｆ） リガンドとしての脂質又は脂質代謝物に対する受容体
これらの低分子量化合物を合成し、交差反応する膜蛋白質を単離、同定、機能解析し、有用な関連診断薬又は医薬品を開発することができる。例えば、アラキドン酸カスケード中の多くの代謝物の平滑筋の収縮及び弛緩作用に関与する全く新しい受容体の発見、並びに細胞の形態、移動、増殖及び接着に関与するＥＤＧ（内皮分化遺伝子）受容体の新規サブタイプの発見によって、中枢神経疾患、循環器疾患、癌、消化器系疾患、免疫系疾患の領域において全く新しい作用機序を有する医薬品を開発することができる。
【００５６】
ｇ） 膜蛋白質プリオン
正常プリオンから病原性プリオンへの転化機構の解明のためには、その本来の構造であるＧＰＩ型プリオン膜蛋白質をリポソームに包埋させた再構成系を使用し、リポソーム膜からの遊離機構、遊離促進分子の単離、膜蛋白質型プリオンと遊離プリオンの病原性プリオンへの転化率の解析等を、本発明に基づき研究する。結果として、病原性プリオンの測定系、病原性プリオンの除去法、病原性プリオン感染防御法、ＣＪＤ発症の遅延法、ＣＪＤ発症患者の治療法等を開発することができる。
【００５７】
（ｉｖ） 「生体膜」とは、構成成分として脂質二重層を有する任意の膜をいい、細胞膜、並びに任意の生物の細胞内小器官を構成する膜（例えば、小胞体膜、ゴルジ体膜、核膜等）が挙げられる。
【００５８】
（ｖ） 「リポソーム」とは、脂質二重層により外界から仕切られた粒子を意味する。リポソームの脂質二重層は、物理的、化学的及び生物学的に生体膜に類似する。好ましくは、リポソームは、植物から抽出された脂質等の膜構成成分から構成される。
【００５９】
（ｖｉ） 「膜会合物質」とは、生体膜を貫通する、又は生体膜の内側若しくは外側に結合する任意の物質をいう。膜会合物質としては、細胞の外側から内側へと情報を伝達する膜受容体、細胞の外側及び内側の間で生理物質の輸送のために膜チャネルを構成する膜蛋白質、動的膜構造を保持する膜裏打ち蛋白質、蛋白質翻訳酵素、リボソーム及び共有結合又は非共有結合を介して生体膜に結合する任意の他の物質が挙げられる。
【００６０】
（ｖｉｉ） 「膜蛋白質包埋リポソーム」とは、膜蛋白質が共有結合又は非共有結合を介して結合するリポソームをいう。
【００６１】
（ｖｉｉｉ） 「膜蛋白質ライブラリー」とは、所定の細胞の生体膜、所定の細胞の全ての生体膜、所定の組織の全ての生体膜、所定の器官の全ての生体膜、所定の個体の全ての生体膜、又は任意の他の可能な生体膜試料に含まれる膜蛋白質から構成される膜蛋白質包埋リポソームのセットを意味する。
【００６２】
（ｉｘ） 「リガンド支持体」とは、一般にリガンドと称される可溶性分子を結合させるための基材をいう。この基材は、その形状と特性を維持するための基本構造、及びリガンドの結合形態と結合量を最適化するためのリガンド吸着素材（表面）からなる。
【００６３】
リガンド吸着素材は、リガンドの結合形態に応じて共有結合性であっても非共有結合性吸着素材であってもよい。後者の吸着形態としては、典型的には、順相、逆相、疎水性、陰イオン性、陽イオン性及び他の非共有結合性吸着素材が挙げられる。
【００６４】
吸着素材は、リガンドと基材の基本構造表面との間に、距離（１０Å〜１００００Å、好ましくは約１００Å）を置くスペーサー分子を含んでいてもよい。このスペーサー分子の素材は、網目状又は多孔性の生体ポリマーであっても合成ポリマーであってもよい。如何なる場合であっても、膜蛋白質とリガンドは、直径１０ｎｍ〜５０００ｎｍのリポソームに包埋された膜蛋白質をリガンドに非常に強い結合力で結合させるために、親和性よりもアビディティー （ａｖｉｄｉｔｙ） をもたらすように形成される。
【００６５】
多くの実施態様では、基材の形状は実質的に平面であるが、幾つかの実施態様では、それは、磁性粒子、非磁性粒子、ストランド、沈澱、ゲル、シート、チューブ、球状体、容器、毛細管、パッド、スライス、フィルム、プレート、スライド及び他の種々の表面構造の形態である。本質的には、任意の都合の良い形状を、本発明において使用することができる。
【００６６】
基材表面は、生物学的、非生物学的、有機若しくは無機物質又はこれらの組合せであってもよく、本明細書記載の反応が生じる硬質支持体表面上に形成される。
【００６７】
基材表面は、適切な蛋白質吸着特性を与えるように選択される。その例としては、官能基付加ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ２、ＳｉＮ４、改質シリコン、広範囲のゲル又はポリマー（例えば、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネート、又はこれらの組合せなど）が挙げられる。複数のモノマー又はポリマー配列を有する基材表面としては、例えば、核酸の直鎖状及び環状ポリマー、ポリサッカライド、脂質、α−、β−又はω−アミノ酸を有するペプチド、クロマトグラフィーで使用されるゲル表面の担体（陰イオン性／陽イオン性化合物、炭素鎖１〜１８からなる疎水性化合物、親水性化合物（例えば、シリカ、ニトロセルロース、セルロースアセテート、アガロース等）と架橋した担体など）、人工ホモポリマー（例えば、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、ポリアセテート等）、上記化合物のいずれかに既知の薬物又は天然化合物が結合（共有及び非共有結合）したヘテロポリマー、並びに本開示の概観後に適していることが明らかになるであろう他のポリマーが挙げられる。
【００６８】
（ｖｉｉ） 「質量分析用プレート」とは、一般にリガンドと称される可溶性分子を結合させるための基材（リガンド支持体）の中で、リガンドを一次元及び二次元電気泳動法や高速液体クロマトグラフ法等の高精度分析法で分離し、基材表面上に直接移行させた後に、その後の高感度質量分析計に自動的且つ瞬間的に適合させ得る基材を意味する。基材は、その形状と特性を維持するための基本構造、及びリガンドの結合形態と結合量を最適化するためのリガンド吸着素材（基材表面）からなる。
【００６９】
リガンド吸着素材は、リガンドの結合形態に応じて共有結合性であっても非共有結合性吸着素材であってもよい。後者の吸着形態としては、典型的には、順相、逆相、疎水性、陰イオン性、陽イオン性及び他の非共有結合性吸着素材が挙げられる。
【００７０】
吸着素材は、リガンドと基材の基本構造表面との間に、距離（１０Å〜１００００Å、好ましくは約１００Å）を置くスペーサー分子を含んでいてもよい。このスペーサー分子の素材は、網目状又は多孔性の生体ポリマーであっても合成ポリマーであってもよい。如何なる場合であっても、膜蛋白質とリガンドは、直径１０ｎｍ〜５０００ｎｍのリポソームに包埋された膜蛋白質をリガンドに非常に強い結合力で結合させるために、親和性よりもアビディティーをもたらすように形成される。
【００７１】
基材表面は、生物学的、非生物学的、有機若しくは無機物質又はこれらの任意の組合わせであってもよく、本明細書記載の反応が生じる硬質支持体表面上に形成される。
【００７２】
基材表面は、適切な蛋白質吸着特性を与えるように選択される。その例としては、官能基付加ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ２、ＳｉＮ４、改質シリコン、広範囲のゲル又はポリマー（例えば、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネート、又はこれらの組合せなど）が挙げられる。複数のモノマー又はポリマー配列を有する基材表面としては、例えば、核酸の直鎖状及び環状ポリマー、ポリサッカライド、脂質、α−、β−又はω−アミノ酸を有するペプチド、クロマトグラフィーで使用されるゲル表面の担体（陰イオン性／陽イオン性化合物、炭素鎖１〜１８からなる疎水性化合物、親水性化合物（例えば、シリカ、ニトロセルロース、セルロースアセテート、アガロース等）と架橋した担体など）、人工ホモポリマー（例えば、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、ポリアセテート等）、上記化合物のいずれかに既知の薬物又は天然化合物が結合（共有及び非共有結合）したヘテロポリマー、並びに本開示の概観後に適していることが明らかになるであろう他のポリマーが挙げられる。
【００７３】
（ｖｉｉｉ） 「質量分析計」とは、気体状の試料をイオン化した後、イオン化分子及びその分子断片を電磁場に投入し、その移動状況から質量数／電荷数によってそれらを分離し、物質のスペクトルを求めることにより、物質の分子量を測定、検出する装置を意味する。好ましく利用され得る数種のタイプが存在するが、他のタイプもまた使用され得る。
【００７４】
典型的な実施態様（図１）では、本発明のプロテオーム解析方法は、可溶性蛋白質のみをゲル電気泳動により分離し、分離した可溶性蛋白質をゲルから直接質量分析用プレート上に転写する工程（工程Ａ）、膜蛋白質を人工リポソーム膜に付着または貫通させる工程（工程Ｂ）、膜蛋白質包埋リポソームを可溶性蛋白質が転写された質量分析用プレートと接触させ、生物学的親和性（アビディティー）を利用してリガンド・受容体複合体を形成させる工程（工程Ｃ）、及び該複合体を質量分析により一括して検出し、得られたデータを集積し、データベース化する工程（工程Ｄ）を含む。
【００７５】
工程Ａ〜Ｄの具体的な実施態様及び当該工程を実施するための各装置、並びにこれら構成要素から派生する本発明の他の局面を以下に詳細に説明する。
【００７６】
２．迅速蛋白質転写装置（装置Ａ）
本装置は、電気泳動装置、蛋白質転写装置及び質量分析用プレートを主要な構成要素として構成される。電気泳動装置は、市販の入手可能なものであっても独自に考案された装置であってもよい。目的に応じて一次元ゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動のどちらも使用することができる。二次元ゲル電気泳動では、一次元の泳動は蛋白質の等電点による分離が基本であり、二次元の泳動は蛋白質の分子量による分離が基本である。電気泳動に使用されるゲルのサイズは特に制限されない。１０ｃｍｘ１０ｃｍが一般的であるが、必要ならば２０ｃｍｘ２０ｃｍあるいは他のサイズも使用できる。また、ゲルの素材もポリアクリルアミドが基本であるが、目的によってはアガロースゲル、セルロースアセテート膜等の異なる基材もまた使用できる。ゲル濃度は、均一であっても、勾配を有していてもよい。
【００７７】
電気泳動に供される可溶性蛋白質は、任意の公知の方法によって生物学的試料から調製することができる。試料の例としては、動植物や微生物等の任意の生物の細胞、組織又は細胞外液（例えば、血液、血漿、尿、骨髄液、腹水等）などが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、標的細胞を入手後、適切なバッファー溶液中で種々の蛋白質分解酵素阻害剤の存在下にてホモゲナイズするか、ポリトロン等の細胞ホモジナイザーで懸濁化するか、低浸透圧ショックにより細胞を破壊するか、超音波処理により細胞膜を破壊した後、遠心分離して上清を採取することにより可溶性画分を得ることができる。
【００７８】
第２の工程は、蛋白質を泳動後のゲルから質量分析用プレート上に移行させることを含む。本発明の好ましい態様においては、質量分析用プレートの形状は、その後に使用される質量分析計の試料導入口に完全に一致するように考案される。例えば、電気泳動後のゲルのサイズに合わせた集合型の質量分析用プレートに蛋白質を転写した後に、質量分析計の試料導入口にフィットするように、各スプリット型プレートへとクラスターを簡単に分離できるように予め切れ目を入れた「クラスター型質量分析用プレート」が挙げられる。図２に本発明の好ましい質量分析用プレートの一実施態様を示す。
【００７９】
従来の質量分析においては、試料を逐一測定するか、又は限られた試料のみが一度に測定される。これは、前述のスプリット型質量分析用プレートの如く、質量分析用プレートが一次元に移行していたからである。対照的に、本発明の完全自動化プロテオーム解析では、レーザー射出口又は質量分析用プレートを乗せた架台を二次元方向へ移動させ、連続全面スキャンすることにより、電気泳動により二次元に展開された蛋白質を全て解析することが可能となる（断続的なスキャン法では、レーザー光の照射されない蛋白質、即ち、未解析の蛋白質が残存する）。この方法と断続スキャン法を組合わせれば、９６穴プレートに分注された９６種の試料を一括して質量分析用プレートにマウントし（矩形チップに９６種類の試料が等間隔で整列する）、そのチップを質量分析に直接供することが可能である。
【００８０】
好ましい実施態様では、質量分析用プレートの素材は、基盤としてアルミプレート及び吸着素材としてシリカから構成される。アルミプレートは、電気力による転写のために使用され、異なる通電体（例えばステンレス鋼等）もまた使用可能である。拡散による転写については、絶縁体（セラミック、プラスチック等）を使用することができる。吸着素材としては、任意の蛋白質を移行させることができるシリカを使用するが、目的によっては先に挙げた他の素材も使用することができる。
【００８１】
泳動後ゲルに展開された蛋白質は、種々の方法（拡散、電気力など）によって質量分析用プレートに移行される。この工程は一般に転写（ｂｌｏｔｔｉｎｇ）と呼ばれる。転写の効率は、その後の質量分析による解析の測定限界との関連で重要な因子である。さらに、泳動時及び転写時の蛋白質の変性は極力避ける必要がある。なぜならば、可溶性蛋白質を膜蛋白質に結合させるときに、両者の一方が変性、即ち、本来の三次元構造を維持しない限り、結合が完成しないからである。また、本装置が広くプロテオミクス研究に応用可能であるためには、質量分析用プレートの表面を覆う分子の構成が重要である。転写の効率を上げるためには、蛋白質の吸着容量が大きいこと、（特定の蛋白質を吸着するのではなく）任意の蛋白質を吸着できること、任意の蛋白質においてその吸着率が一定であることが必要とされ、また、膜蛋白質との結合を実現するためには、質量分析用プレート上への転写及び吸着後に蛋白質の三次元構造が保持されることが、本質的に必要とされる。さらに、表面の素材によっては、膜蛋白質とリガンドを一括で、あるいは膜蛋白質のみもしくはリガンドのみをＭＡＳＳ分析で検出、同定及び定量してもよい。
【００８２】
本発明で膜蛋白質をＭＡＳＳ分析する場合には、リガンドと支持体との間に蛋白質又は他の生体ポリマー若しくは合成ポリマーからなるスペーサーを介在させ、膜蛋白質とリガンドとをその生物学的親和性（アビディティー）に基づいて効率的に結合させることが好ましい。なぜなら、膜蛋白質は、リポソーム上に固定され、リガンドもまた、支持体上に固定されるからである。「用語及び本発明の一般的態様」で述べたようにアビディティーを向上させる必要がある。実施例で使用される生体ポリマーは、プロテインＧ、抗体及びビオチンである。リガンドと基材の基本構造表面との間の距離は１０Å〜１００００Å、好ましくは約１００Åである。スペーサーの形状は、網目状であっても多孔性であってもよい。
【００８３】
支持体とスペーサーとの間、及びスペーサーとリガンドとの間の結合形態については、後に詳述するが、プロテオーム解析の目的に応じて共有結合又は非共有結合のいずれかを選択することができる。それにより、膜蛋白質と可溶性蛋白質の両者を一括して、又はそれぞれ別々に、質量分析によって高感度に測定することができる。
【００８４】
本発明の方法によれば、ゲル中を泳動した蛋白質が一工程の処理により質量分析用プレート上に転写される。従って、従来のプロテオーム分析で必要とされた、泳動後から質量分析開始までの煩雑な工程を全て省略でき、操作時間が大幅に短縮化される。結果として、プロテオーム解析に必要な膨大な量の試料処理が可能となる。
【００８５】
さらに、本発明では、電気泳動後のゲルの小片への切断工程が不要である。結果として、切断点（線）上の蛋白質、並びにＭＡＳＳで測定されないロス画分が節約される。これにより、ゲル中の全ての蛋白質を質量分析用プレートに添加することが可能となる。さらに、ゲルから蛋白質を抽出する工程（抽出効率は１０％未満）の代わりに、電気力あるいは拡散力による直接的な転写を用いたことにより１００％の転写効率が可能となり、質量分析用プレート上に転写される蛋白質量は、従来抽出されていた蛋白質量の数倍から数十倍である。
【００８６】
本発明の典型的な実施態様では、膜蛋白質とリガンドは、以下に説明する膜蛋白質包埋リポソームとリガンドの複合体形成後に、一括して検出及び解析される。異なる実施態様では、本発明は、リガンド（可溶性蛋白質）が転写された質量分析用プレートを単独で質量分析に供することによる、リガンドの解析方法を提供する。
【００８７】
すなわち、質量分析用プレート上の蛋白質は、質量分析用プレートをそのまま質量分析計にかけることにより解析することができる。本発明による、質量分析用プレート上に固定されたリガンドの解析は、市販の任意のタイプの質量分析計を用いて行なわれ得るが、レーザー光を吸収するマトリックスと試料を混合し、乾燥させて結晶化し、次いで結晶化した試料を、マトリックスからのエネルギー移動及び強力なレーザー照射によりイオン化し、真空中に導入する、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）と、初期加速による試料分子イオンの飛行時間差で質量数を解析する飛行時間型質量分析（ＴＯＦＭＳ）とから構成されるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ法；１蛋白質を１液滴にのせて液体から直接電気的にイオン化する方法；試料溶液を電気的に大気中にスプレーして、個々の蛋白質多価イオンを折り畳まれていない状態で気相に導くナノエレクトロスプレー質量分析（ｎａｎｏ−ＥＳＭＳ）法等を利用する質量分析計を使用することがより好ましい。
【００８８】
本発明のリガンド支持体は、プロテオーム解析の標的及び目的に最適な支持体と超高感度な検出系とを組み合わせることにより、種々の実施態様が利用可能である。詳しくは後述するが（例えば、表１および図３を参照）、質量分析用プレートの他、非磁性粒子及び磁性粒子が例示される。
【００８９】
本発明の検出系についても、プロテオーム解析の標的及び目的に最適なリガンド支持体との組み合わせにより、種々の実施態様が利用可能である。詳しくは後述するが、質量分析の他、蛍光測定、放射活性測定などが例示される。リガンド支持体が粒子の場合、膜蛋白質・リガンド複合体は、予め蛍光標識されたリポソームを使用することにより、高感度に検出、単離及び定量することができる。
【００９０】
本工程（工程Ａ）は、可溶性蛋白質のみならず、細胞を構成する脂質二重層（例えば、細胞膜、核膜、小胞体膜等）に付着も貫通もせず、細胞外液（例えば、血液、血漿、尿、骨髄液、腹水等の各種体液）若しくは細胞内液又は細胞小器官内液に存在するペプチド、糖質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等や、生体由来のその他の任意の可溶性分子、人工的に合成された任意の化合物、気体状物質（例えば酸素分子、酸化窒素など）等にも適用できる。すなわち、その特性を利用して各解析標的物質を高度に精製し、最適な支持体に移行させ、膜蛋白質等を包埋したリポソームとの相互作用解析に供する。
【００９１】
３．膜蛋白質包埋リポソーム製造装置（装置Ｂ）
本装置は、細胞からの膜画分分離、リポソーム作製、膜画分とリポソームの融合、融合リポソーム（膜蛋白質包埋リポソーム）の粒子サイズ調整、さらに必要ならば融合リポソームの保存のための装置を含んでなる。
【００９２】
細胞からの膜画分の抽出に際しては、従来の方法が使用できる。例えば、標的細胞を入手し、種々の蛋白質分解酵素阻害剤の存在下に適切な緩衝溶液中でホモゲナイズするか、ポリトロン等の細胞破壊装置で懸濁化するか、低浸透圧ショックにより破壊するか、又は超音波処理により細胞膜を破壊する方法が使用できる。その後、細胞膜画分、細胞小器官膜画分は、種々の媒体を用いた濃度勾配遠心法にて調製される。
【００９３】
リポソームの作製法としては、種々の既知の方法を用いることができる。選ばれた脂質の混合液を有機溶媒中に均一に溶解し、アルゴンガス中で溶媒を完全に気化し、緩衝溶液中で水和させてリポソームを作製することがその代表であるが、これに限定されない。リポソームの組成は重要である。一般に、細胞膜は、コレステロールを豊富に含むが、小胞体等の細胞内小器官を構成する脂質二重層は、コレステロールを殆ど又は全く含まない。従って、リポソームに移行させる細胞膜蛋白質の種類を決定する上で、膜蛋白質の受け皿となるリポソームの組成は非常に重要な因子となる。当業者は、膜蛋白質の由来に応じてリポソームを構成する脂質を適宜決定することができる。
【００９４】
膜画分とリポソームの融合法としては、種々の公知の方法を用いることができる。例えば、両者を適切な割合で混合した後に、凍結融解を繰り返すことを含む方法、選ばれた脂質の混合液から作製されたフィルム上に膜画分を含む水溶液を置いた後、水和法により膜蛋白質を脂質二重層に移行させることを含む方法又はその他の方法が本目的に使用できる。好ましくは、凍結融解法であり、本方法を用いることで、膜蛋白質のリポソームへの包埋率（移行率）を１００％にすることができる。
【００９５】
あるいは、リポソームを形成した後に膜蛋白質と融合する際には、リポソームと膜蛋白質画分との融合は、粒子径を１０ ｎｍ〜５０００ ｎｍ、好ましくは１０ ｎｍ〜５００ ｎｍに調整することにより促進することができる。
【００９６】
作製された膜蛋白質包埋人工リポソームは、超音波処理法、ホモジナイザー法又は他の方法によりサイジングすることができる。本発明では、膜蛋白質の変性を最小にし、且つ粒子経を１０ｎｍ〜５０００ｎｍ、好ましくは１０ｎｍ〜５００ｎｍに調整するために濾過法（エクストルーダー法）を使用することが好ましい。
【００９７】
膜画分とリポソームの混合比率を注意深く調整することにより、リポソームに包埋される膜蛋白質の種類と数を所望の通りに制御することができる。この技術は、後述する装置Ｃによる、本発明の複合体を形成したリガンドと膜蛋白質の両者の分子量の測定及び決定に際して、ノイズ蛋白質（ノイズピーク）を減少させることにより解析を容易にするために決定的に重要である。
【００９８】
こうして得られる標的膜蛋白質が脂質二重層に付着もしくは貫通したリポソーム（膜蛋白質包埋リポソーム）を安定に保存する方法の開発は、プロテオーム研究をいつでもどこでも、また質量分析計などを保有しない研究機関で利用可能にするために、非常に重要である。単純リポソームの保存用に開発された幾つかの添加剤をこの目的のために用いることができる。
【００９９】
本発明の方法は膜蛋白質の種類を問わず適用可能である。従って、ゲノム配列から相同性検索により予測されるＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）のオーファンリガンドの探索はもちろんのこと、コンピューターによるゲノム配列相同性予測の方法からは到底発見不可能な、その他全てのタイプの受容体（ＧＰＩ型、オリゴマー型）とそのリガンドの発見、同定及び解析にも応用が可能であり、それにより、全てのタイプの受容体を標的とした受容体創薬型医薬品の開発が可能となる。また、本発明は、受容体以外の膜蛋白質の発見、同定及び解析に多大な貢献をする。従って、全ての膜蛋白質とリガンドが関与する疾患の解析、診断薬・診断法の開発、治療薬の開発を目的とする、膜蛋白質創薬型医薬品の開発が可能となる。
【０１００】
本発明の方法は、その構成成分の脂質部分により脂質二重層の内層に固定（貫通）されたタイプや、一般に生体膜の裏打ち蛋白質と呼ばれる脂質二重層の内側層に固定されたタイプのような、通常では細胞膜表層に現われない細胞内膜蛋白質の発見、同定及び解析にも適用可能である。
【０１０１】
さらに、本発明は、抗体を疾患の解析、診断及び治療に利用することを目的とする抗体創薬（抗体医薬を含む）研究に多大な貢献をする。疾患の解析、診断及び治療に有効な抗原は膜蛋白質として存在しており、対応する抗体の作製のためには、構造と機能を保持した膜抗原（膜蛋白質）の取得が必須条件である。本発明の方法、すなわち、膜抗原をその構造と機能を保持したままでリポソームに包埋する方法のみが抗体創薬に必須の上記条件を満たすことができる。抗体創薬の方法は、本発明がカバーする全ての膜蛋白質とリガンドが関与する疾患の解析、診断薬・診断法の開発、及び治療薬の開発を目指す包括的な方法の中で、リガンドを抗体に置き換えた一つの特殊な方法であることが明らかである。従って、本発明は、受容体創薬型医薬品の開発と同様に、抗体創薬型医薬品の開発を提供する。
【０１０２】
本発明は、膜蛋白質とそのリガンドのプロテオーム解析のために、膜蛋白質とそのリガンドの両方を一括発見、一括定量すること、及び両方の機能（相互作用）を解析すること、あるいはいずれか一方を発見、定量すること、及び両方の相互作用を解析することを可能にする。この場合、膜蛋白質とそのリガンドが既知であるか未知であるかは問われない。リガンドとしては、固有の内因性リガンド、拮抗剤（フルアゴニスト、パーシャルアゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニスト）、医薬品、試薬、抗体、及び膜蛋白質に結合するように人工的に修飾したあらゆる他の物質が挙げられる。
【０１０３】
本工程（工程Ｂ）で得られる膜蛋白質包埋人工リポソームは、正常な膜蛋白質を新剤型の膜蛋白質包埋人工リポソーム医薬として、膜蛋白質の欠損、変異及び他の変調が原因となる疾患を患う患者に直接投与することができる。脂質二重層の構成成分が動物以外の生物種から得られる場合、病原物質のヒトへの感染を避けることができる。
【０１０４】
本工程で得られる膜蛋白質包埋人工リポソームと内因性リガンドとの複合体、あるいは膜蛋白質包埋人工リポソームと拮抗剤（フルアゴニスト、パーシャルアゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニストを問わない）との複合体は、新規作用機序を有する、新剤型の膜蛋白質包埋人工リポソーム医薬として、膜蛋白質とリガンドの両方又はいずれか一方の変調が原因となる疾患を患う患者に直接投与することができる。
【０１０５】
本発明はまた、蛍光物質や他の標識物質を共有結合あるいは非共有結合により人工リポソームの脂質二重層に架橋する方法、疎水性相互作用により挿入する方法、及び人工リポソーム内の水相に可溶性の標識物質に封入する方法のいずれかを単独で又は組合わせて用いることで、新規且つ超高感度な膜蛋白・リガンド（拮抗剤を含む）相互作用検出の原理、方法及び装置を提供することができる。蛍光物質及び他の標識物質に代えて、第二シグナルを発生する物質（例えば、アルカリホスファターゼのような酵素）を、アビジン・ビオチンシステム又はニッケル・ヒスチジン又は他の架橋システムを利用して人工リポソームに架橋、挿入又は封入して、検出感度を増幅することもできる。
【０１０６】
下記実施例で示されるように、ＦＡＣＳで認識可能な蛍光分子及び他の標識分子を、遺伝子工学的手法や他の考えうる手法によりＤＮＡレベル、ＲＮＡレベルあるいは蛋白質レベルで導入した標識膜蛋白質を包埋した人工リポソームが、エクストルーダー法及び他の方法により１０ｎｍ〜５０００ｎｍ、好ましくは５００ｎｍ以下にサイジングされる場合、ＦＡＣＳ解析によれば、標識膜蛋白質包埋リポソームのポピュレーションが当該サイズ領域に明瞭に出現する。従って、例えば、膜蛋白質をコードするｃＤＮＡを遺伝子配列から作製し、当該ｃＤＮＡを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換して膜蛋白質（ＦＡＣＳで認識可能な蛍光分子及び他の標識分子を導入したもの）を発現させる場合に、発現宿主の細胞膜画分から調製された標識膜蛋白質包埋非標識リポソームを当該サイズに調整してＦＡＣＳで解析すれば、膜蛋白質の発現の有無、及び発現量を検出することができる。この場合、現在利用可能な他の方法と異なり、当該膜蛋白質のＤＮＡ配列以外の情報又は試薬（抗体、リガンド、拮抗剤、細胞の応答性又は他の膜蛋白質検出薬）がなくとも、検出が可能となる。抗体等の膜蛋白質検出薬が存在すれば、蛋白質レベルでの標識が可能となり、同様にＦＡＣＳによる発現解析が可能となる。もちろん同様の原理がリガンドの探索に応用可能である。
【０１０７】
本工程は、膜蛋白質だけでなく、細胞膜、核膜、小胞体膜等の細胞を構成する脂質二重層に付着もしくは貫通する糖質、ＤＮＡ、ＲＮＡを含む生体ポリマーを１個あるいは複数個、予め検討された脂質組成と形状を有する人工リポソームの脂質二重層に付着または貫通させるという応用が可能である。
【０１０８】
４．膜蛋白質・可溶性蛋白質結合装置（装置Ｃ）
本装置は、質量分析用プレート上に転写されたリガンドと膜蛋白質包埋リポソームとの結合反応装置、質量分析用プレート上に非特異的に結合したリポソームの洗浄・除去装置、及びリポソームを溶解除去して質量分析用プレート上にリガンドと膜蛋白質のみからなる複合体を形成させる装置を含んでなる。例えば、これらの装置は、質量分析用プレートを反応混液や洗浄液等に浸漬させるのに十分な底面積を有する反応槽であってもよく、必要に応じて振盪手段を有する。これら複数の工程を１つの装置で実行することが可能であり、また、目的に応じて所定の装置を省略することも考えられる。
【０１０９】
結合反応装置では、結合反応の前処理として、質量分析用プレート上における生理的なリガンド・膜蛋白質相互作用以外の非特異的な吸着反応を防止する目的で、質量分析用プレートの吸着表面を適切な物質で被覆する（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）工程を加えることができる。ブロッキング剤の要件としては、脂質二重層の親水ヘッドの非特異吸着を防止できること、リポソームに移行した標的膜蛋白質以外の膜蛋白質の非特異吸着を防止できること、その後の質量分析による解析を不能にする多成分系ではなく成分が既知であり且つ分子量が均一な系であること、イオン化エネルギーを吸収しない分子であること等である。
【０１１０】
反応方法としては、単純浸漬、振盪等を用いてもよい。質量分析用プレート近傍で膜蛋白質包埋リポソーム濃度を上昇させる方法としては、電気力によるリポソームの濃縮が推奨される。リポソームは全体として負に荷電しているため、質量分析用プレートの下部に陽極を、反応槽の上部に陰極を差し込めば、リポソームは質量分析用プレート表面に移行し、リガンド近傍の濃度が上昇する。
【０１１１】
質量分析用プレート上に非特異的に結合したリポソームの洗浄による除去は、洗浄緩衝液の塩濃度及び組成を適切に選択することにより可能となる。洗浄時の温度条件が重要であるが、当業者は好適な条件を適宜決定することができる。
【０１１２】
リポソームの溶解除去法としては、適切な有機溶媒（グリセロール、アセトニトリル、アルコール、ジオキサン、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ等）を緩衝液等によって濃度を適宜調節して、質量分析用プレートと接触させる方法が例示される。穏やかな界面活性剤（例えば、オクチルグルコース等）の使用も効果的である。
【０１１３】
以上は、図１に示される全自動膜蛋白質・リガンドプロテオーム解析装置の仕様説明であり、検出系として質量分析による解析を想定している。しかしながら、本発明の多様な目的適合性を勘案すれば、可溶性蛋白質の支持体の形態は、図３及び表１に示すように多岐にわたることは自明であり、それは図３及び表１の例示範囲に留まらない。
【０１１４】
【表１】
図３の例示では、電気泳動後の被転写支持体の基本構造に通電性の磁性金属を使用し、本発明によって開発されたアビディティーを向上させる目的のスペーサーを結合させた磁性粒子を支持体の表面素材として用いた。本磁性粒子を、二次元電気泳動により分離した可溶性蛋白質に共有又は非共有結合によって結合させた。カラムを使用する例では、６２５画分への分別後に、各々６２５本のミクロファイバー内腔に磁力で保持させた。膜蛋白質包埋リポソームを通過させ、通過、洗浄及び溶出画分をそれぞれ連続的にＬＣ−ＭＳ−ＭＳで測定した。プレートを使用する別の適応では、６２５画分への分別後に、磁性粒子を各々６２５本のチャンバーに磁力で保持させた。膜蛋白質包埋リポソーム及び拮抗剤候補の添加、反応、洗浄及び検出をＨＴＳ様式で達成した。チップの適応は、先に例示した質量分析用プレートの作製に転用できる例示である。表１には、支持体の種類による本発明の応用範囲の一例を示し、最後の例示は、非磁性粒子（ポリサッカライドゲル、合成ポリマーゲル等）に本発明のスペーサー分子を介して可溶性蛋白質を共有結合させた後に、可溶性蛋白質を膜蛋白質包埋リポソームに結合させた例を示したものである。検出系としては、質量分析システム以外の蛍光、放射活性、二次シグナル増幅系などが、プロテオーム分析の目的に応じて柔軟に用いることができ、未知のリガンド、特にオーファンリガンド等の探索に最適のシステムが提供される。
【０１１６】
５．質量分析装置
本発明で使用される生理活性物質の検出は質量分析計に限定されない。しかしながら、物質固有の物理量の一つである分子量が直接測定できること、検出限界がピコグラムに迫ること、さらにＭＳ−ＭＳ法によりアミノ酸の配列解析が可能であるという理由のため、質量分析計は、本発明においても重要な検出装置であると考えられる。上記の装置Ｃにより本発明の質量分析用プレート上に固定されたリガンド・膜蛋白質複合体の解析は、市販される任意のタイプの質量分析計に適合が可能である。例えば、上記の装置Ａにより質量分析用プレート上に固定されたリガンドのみの解析に好ましく使用される質量分析計が、同様に使用可能である。
【０１１７】
本発明では、質量分析用プレート上に膜蛋白質と可溶性蛋白質が共存する場合、試料に添加する溶媒の選択に応じて、両方を同時に、又はいずれか一方のみを質量解析により高感度で測定することができる。
【０１１８】
６．データベースの構築・解析装置（装置Ｄ）
上記の本発明装置Ａ、Ｂ及びＣから得られる上記膜蛋白質・リガンド複合体の測定結果を、あらかじめ設定された「リガンド・受容体（膜蛋白質）マトリックス表」（図４）に入力し、随時新しいデータを追加して診断確定用データベースとして構築する。
【０１１９】
先に例示的に紹介した質量分析用プレートの全域をカバーするように行番号（１〜２５）と列記号（Ａ〜Ｙ）を振り、合計６２５（２５ｘ２５）画分の各画分（４ｍｍｘ４ｍｍ）に１対１に対応する番地（Ａ１〜Ｙ２５）を振り当てる（図２）。その結果、泳動後に質量分析用プレート上に移行した全リガンドは、リガンド・受容体（膜蛋白質）マトリックス番地により分類することが可能となる。もちろん、その後に受容体包埋リポソームと反応させて得られる対応受容体も同じ番地により分類され、ある番地に収束する物質群は、相互にそして生理的に結合することが推定される。
【０１２０】
一つの特定の実施態様では、最初に、健常人の血清等の標的体液（可溶性リガンドを含むと考えられるもの）及び特定の疾患を有する患者の同じ標的体液を、別々に二次元ゲル電気泳動し、質量分析用プレートに転写後、質量分析等により測定する。この時点で、疾患によるリガンドの増減が判明し、データベースに登録が可能となる。
【０１２１】
次に、健常人の血清等の標的体液を電気泳動し、二枚のゲルに移行させ、健常人のリガンドが転写された二枚の質量分析用プレートを調製する。他方、健常人及び患者から同種細胞を採取し、上述の本装置Ｂ（膜蛋白質分離・リポソーム移行装置）を用いてそれぞれの膜蛋白質をリポソームに移行させ、膜蛋白質包埋リポソームを調製する。次いで、本装置Ｃ（可溶性蛋白質・膜蛋白質結合装置）を用いて、健常人のリガンドを移行した各質量分析用プレートに、健常人と患者由来の膜蛋白質包埋リポソームを別々に反応させ、リガンドと受容体の結合反応を行い、その後の洗浄操作等により、質量分析用プレート上に高度に精製されたリガンド・受容体複合体を得る。質量分析での解析により、疾患による受容体の増減が判明し、データベースに登録が可能となる。
【０１２２】
データベースの項目は、疾患名、リガンド採取体液名、膜蛋白質採取細胞名、と共にリガンド・受容体（膜蛋白質）マトリックス番地、質量分析結果の分子量・定量値（もしくはピーク高、ピーク面積等の分析機器から出力される信号強度）等である。
【０１２３】
質量分析による解析結果は、自動化プログラムのデータベースに入力され、その結果は、デイファレンシャルデイスプレイとして、例えば、図４の「リガンド・受容体（膜蛋白質）マトリックス表」の右半分の三角形にリガンドが増加した場合は赤色で、減少した場合は青色で、無変化の場合は黄色で表示され、同様に左半分の三角形に受容体が増加した場合は赤色で、減少した場合は青色で、無変化の場合は黄色で表示される。図４では、パターンで表示している。
【０１２４】
以上のおおよその操作時間は、４枚同時の電気泳動で終夜（約１２時間）、膜画分２種類同時の調製で約６時間、試料２種類同時のリポソーム移行に約２時間、２種類同時のリガンド・受容体結合反応で約１時間（上記工程の合計時間、約２１時間）、市販のＴＯＦ型質量分析計による解析に６２５画分で約５２時間である。質量分析計一台の場合は全工程２１＋５２ｘ４＝２２９時間を要し、質量分析計四台の場合は２１＋５２ｘ１＝７３時間を要する。律速工程は電気泳動、膜画分の調製、質量分析による解析である。これらが改良され自動化されれば、操作時間の大幅な短縮化が可能となる。例えば、電気泳動装置により一度に１００試料を５時間で処理可能にし、膜画分の調製、リポソーム移行、リガンド・受容体結合反応を全て自動化し、一台の装置により同時に２０試料を３時間で処理可能とする。また、質量分析計による解析時間を１／５に短縮することができる。
【０１２５】
かかる短縮化の後の、疾患確定のための本データベースの構築に要するおおよその時間を推定すると、１００疾患について、各群１００例に対して、血清と疾患の標的細胞一種類を試料に、本装置１０台、質量分析計１００台で上記の分析を実施すると、電気泳動に１００ｘ１００ｘ３ｘ５／９９／１０（１５２）時間、質量分析用質量分析用プレートの調製に１００ｘ１００ｘ２／１９／１０（１０５）時間、質量分析に１００ｘ１００ｘ１０．４ｘ３／１００（３１２０）時間を要すると見積もられ、質量分析には３１２０時間（１３０日）を要すると規定される。従って、所定の１００疾患についての確定用データベースは半年以内に構築され、その後は１００疾患の一括同日診断が可能となる。以上のことから、本装置と本データベースの医療分野に与えるインパクトは計り知れないであろう。
【０１２６】
本目的のために用いられるリガンド試料は、血液、血清、尿、脳骨髄液、精液、唾液、汗、涙液等の体液、全ての細胞内液、全ての細胞内小器官内液等である。膜蛋白質試料としては、身体を構成する任意の細胞、及びそれらの細胞内に含まれる全ての小器官が意図される。ＩＣＤ−１０の疾患分類表では、約１０，０００の疾患が示されている。全ての生物を標的とすると、本装置を使用して構築されるデータベースの記録数は天文学的な数字になることが予想されるが、コンピューターのハードウェア及びソフトウェアを含めた情報工学分野における急速な進歩は、かかる網羅的なデータベースの構築を可能にするだろう。
【０１２７】
本発明はまた、リガンド・膜会合蛋白質が関与する疾患の治療薬の開発に有用なツールを提供する。リガンド・膜会合蛋白質の機能解析は、２１世紀生物学（医学、農学を含む）の重要な分野を占め、分子生物学による生命機能解明の大半が何らかの膜会合蛋白質との関連で明らかにされるであろう。上記の診断用データベースから、特定疾患に関わるリガンドの増減、受容体の増減が明らかにされるが（ここまでのデータは診断確定に利用される）、本発明のさらなる利点は、特定のリガンドが特定の膜蛋白質と生理的に結合する、いわゆるリガンド・膜蛋白質双方のカウンター分子を同時に決定できることにある。本領域の新規物質は、偶然に又は他の目的で一方（例えばリガンド）が発見された後に、標識リガンドを用いて対応する受容体を発見することによって、又はその逆の道筋によるリガンド・受容体一対の発見により発見されてきた。ここまでは、偶然と長い忍耐が必要とされてきた。機能が不明なリガンド及び膜蛋白質、並びに人工物質（医薬品）と結合するが、その生理リガンドが同定されていない受容体が数多く存在する。本方法による測定結果を入力して得られるリガンド・受容体（膜蛋白質）マトリックス番地のどこかに複数の分子種（少なくとも一つのリガンドと一つの対応する受容体の二分子種）が認められ、かつ疾患特異的に存在量が増減していれば、その番地に帰属された全ての分子を、疾患関連リガンド・膜蛋白質として、及び創薬研究の成功確度の高い候補として提供できる。この目的には、タンデム型質量分析計を使用する。それによって、特定番地に帰属される全分子種のアミノ酸配列の推定が可能となる。
【０１２８】
本発明の方法によれば、ある細胞膜の任意の膜蛋白質を解析できるため、疾患に関連した個別の膜蛋白質を偶然性に依拠しながら一つ一つ発見していくのではなく、関連する疾患と標的細胞膜蛋白質を体系的に一つのサイクルによって解析することが可能となる。
【０１２９】
表２に示すように、細胞小器官、例えば、ミトコンドリア膜の膜蛋白質に照準を設定すれば、ＡＴＰ産生能の変化に基づく、疾患の分類、疾患間の関連性の解明、群特異的な治療薬の開発といった、現在までに誰もが考え及ばなかった創薬戦略を打ち出すことも可能となる。
【０１３０】
【表２】
７．他の好ましい実施態様
本発明はまた、水溶液中で不溶性の分子と他の可溶性あるいは不溶性分子との相互作用を、水溶液中で観察、解析が可能な測定原理と方法を提供する。従って、本発明の範囲は、生体に由来する膜蛋白質・リガンド複合体の発見、定量及び解析にとどまるものではなく、膜蛋白質と相互作用する人工的に創出した物質の発見、定量及び解析、互いに相互作用可能な２以上の膜蛋白質の発見、定量及び相互作用解析、膜蛋白質以外の生体由来不溶性物質と不溶性あるいは可溶性物質との相互作用の解析、並びに、生体に由来しない物質（物体）の発見、定量及び解析にまで及ぶ。
【０１３２】
構成成分として糖鎖及び脂質を含む蛋白質のＭＳ解析において、事前に蛋白質分解酵素又はフォスホリパーゼ、エステラーゼ等の処理が必要とされる従来法に比べ、本発明では、質量分析用プレート上で試料に添加する溶媒の組成を変化させるだけで、全て（条件によっては一部）の糖鎖及び脂質が除去された単純蛋白質のスペクトルを得ることができる。詳細は下記実施例８で説明する。
【０１３３】
本発明はまた、病原性プリオン蛋白質等の変性した不溶性蛋白質の超高感度な検出法を提供する。詳細は下記実施例９で説明する。
【０１３４】
本発明の意義と目標は、全自動膜蛋白質・リガンド用プロテオミクス解析装置の完成に限られず、生命現象の基幹部分を担いながら方法・技術の壁から研究が大きく遅れてきた膜蛋白質科学の興隆に技術的貢献を行うことにある。本発明は、上述のように、プロテオームを膜蛋白質と可溶性蛋白質にグループ分けを行い、膜蛋白質をリポソームに包埋することで、膜蛋白質を可溶性蛋白質と同様に取り扱うことを可能にする原理、方法及び結果を提供する。
【０１３５】
本原理と方法は、ゲノム創薬の方法論が切り開いた創薬の新しい流れに合流し、受容体創薬、抗体創薬、ＨＴＳ創薬、蛋白質立体構造解析、遺伝子発現解析、他のプロテオーム解析等の技術とも絡み合う膜蛋白質創薬として近い将来必ず認められるであろう。
【０１３６】
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【０１３７】
実施例
本発明の方法及び装置が、膜蛋白質とそのリガンドの同時スクリーニング及び両者の相互作用の解析に有効であり、プロテオーム解析のための新規な方法及び装置であることを示すために、以下に具体的な態様と結果を示す。
【０１３８】
受容体は、その構造からＧＰＩアンカー型、ＧＰＣＲ型及びオリゴマー型の３種類に分類される。本発明が膜蛋白質のプロテオーム解析に有用である証明を得るためには、これら全てのタイプの受容体を標的として各特異リガンドとの相互作用の解析を検討する必要がある。Ｕ９３７細胞はヒト単球由来の株化細胞であり、その膜表面上に多数の受容体が発現している。その中から、ＧＰＩアンカー型としてはウロキナーゼ受容体を選定し、ＧＰＣＲ型としては血清補体成分Ｃ５ａ受容体を選定し、オリゴマー型としてはインターフェロンγ受容体を選定した。
【０１３９】
参考例１：３種類の受容体の発現確認
Ｂｔ２ｃＡＭＰ刺激前後で、Ｕ９３７細胞を、予めＦＩＴＣで標識した３種類のリガンドとそれぞれ反応させ、ＦＡＣＳで分析し、受容体発現の存在を観察した。その結果、図５に示すように３種類全ての受容体の発現が確認された。
【０１４０】
実施例１：ウロキナーゼ受容体包埋リポソームの調製
（１）膜画分の調製
Ｕ９３７はヒト単球由来の株化細胞であり、ホルボールエステル（ＰＭＡ）刺激によりウロキナーゼ受容体を高濃度に発現することから、膜画分分離用の試料として用いた。洗浄後、氷冷下、ポリトロンで２−５秒×３回：１分間の間隔で細胞を破砕し、４０％蔗糖密度勾配遠心分離（９５，０００ ｇ ｘ ６０ ｍｉｎ）により、界面に膜画分を集積させた（図６）。
【０１４１】
（２）膜蛋白質包埋リポソームの調製
精製卵黄レシチン （１．２５ ｇ） 及びコレステロール （０．１２５ ｇ） を ２５ ｍＬ の生理食塩水中に懸濁させ、氷冷下でプローブ型超音波発生装置により１５分間処理した。得られたリポソームの平均粒子径は ８０ ｎｍ であった。先に調製したＵ９３７膜画分をこのリポソーム溶液に加え、−８０℃及び室温下で凍結融解を３回繰り返したところ、混合液は白濁した。リポソームのみを含有する溶液で同様の処理を行なったところ、リポソーム溶液は白濁した。一方、Ｕ９３７膜画分は、凍結融解を繰り返しても、半透明のままであった。これらの試料に塩化セシウムを添加し、終濃度を４０％に調製した溶液の上に、塩化セシウム濃度が３０％及び１５％の溶液、並びに生理食塩水の順で重層し、密度勾配遠心分離（９５，０００ ｇ ｘ １ｈ）を行なった。その結果、Ｕ９３７膜画分は塩化セシウム濃度３０％と１５％の界面にバンドを形成し、白濁したリポソームは塩化セシウム濃度１５％と生理食塩水の界面にバンドを形成した。リポソームとＵ９３７膜画分の混合液では、白濁したリポソームと同様の位置にバンドが認められ、Ｕ９３７膜画分の位置にはバンドが認められなかった。この結果より、Ｕ９３７膜画分はリポソームと融合し、膜蛋白質包埋リポソームを形成したと推察された（図７）。
【０１４２】
（３）膜蛋白質包埋リポソームの確認
膜画分を分離・調製後、膜蛋白質を蛍光（ＦＩＴＣ）標識した。この膜画分を上記（２）の方法によりリポソームと反応させ、膜蛋白質包埋リポソームを形成させた。膜画分、膜蛋白質包埋リポソーム及び単純リポソームの各試料を、ＦＡＣＳによりそれぞれ解析した。その結果、図８に見られるように、１個の粒子あたりの蛍光強度（ｙ軸）は、膜画分が最も高く、単純リポソーム（蛋白質は存在せず、ＦＩＴＣの蛍光ではなく弱い散乱光が検出される）が最も低く、膜蛋白質包埋リポソームはその中間に位置した。膜蛋白質包埋リポソーム試料は、単純リポソームで検出される弱い散乱光を発する粒子をほとんど含まなかったことから、膜画分と単純リポソーム画分は、ほぼ１００％融合したと推察される。すなわち、膜画分と単純リポソームが融合して多重層リポソームが形成され、多重層リポソームのリポソーム内表面にも膜蛋白質が移行した結果、外膜表面上の膜蛋白質数が減少したために、膜蛋白質包埋リポソームでは蛍光強度が低減した。以上のことから、本調製法により、細胞及びそれから調製した細胞膜画分に結合した膜蛋白質が、リポソームの脂質二重層に移行することが示された。
【０１４３】
（４）ウロキナーゼ受容体の同定（Ｕ９３７細胞）
ＰＭＡの存在・非存在下で培養したＵ９３７細胞を可溶化し、ヤギ抗ヒトウロキナーゼ受容体抗体で免疫沈降し、電気泳動後ウエスタンブロッティングを行いＵ９３７細胞膜上でのウロキナーゼ受容体の存在を確認した。ウエスタンブロッティングの１次反応は、ビオチン化ヤギ抗ヒトウロキナーゼ受容体抗体を２５０倍希釈で２時間反応させ、２次反応は、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを１００倍希釈で１時間反応させた。反応後、ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴで検出した。その結果、図９で示すように、抗ヒトウロキナーゼ受容体抗体で染色される分子量 ５０ ｋＤａ の幅広いバンドが認められた。このことから、糖鎖構造の異なるウロキナーゼ受容体の存在が、Ｕ９３７細胞表面上に確認された。
【０１４４】
（５）ウロキナーゼ受容体包埋リポソームの確認
上記（３）の方法で得られた膜蛋白質包埋リポソームに、ヤギ抗ヒトウロキナーゼ受容体抗体を１次抗体として４℃で１時間反応させた後、ＦＩＴＣ標識ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体を２次抗体として４℃で１時間反応させた。１次抗体および２次抗体を１０倍希釈で反応させ、反応後、０．１％ ＢＳＡ−ＰＢＳ（プロテアーゼ阻害剤含む）で４回洗浄した。その後、共焦点レーザー顕微鏡 （ＬＳＭ４１０，カールツァイス株式会社）を使用し３２０倍で観察した（図１０）。抗ウロキナーゼ受容体特異抗体を添加した融合リポソームでは蛍光が観察されたが（図１０Ａ）、抗ウロキナーゼ受容体特異抗体を添加しない融合リポソームでは蛍光は観察されなかった（図１０Ｂ）。以上のことから、ウロキナーゼ受容体がリポソームの脂質二重層に移行することが示された。同様に、得られた膜蛋白質包埋リポソームを可溶化し、ヤギ抗ヒトウロキナーゼ受容体抗体で免疫沈降し、ウエスタンブロッティングに供した。ウエスタンブロッティングの一次反応は、ビオチン化ヤギ抗ヒトウロキナーゼ受容体抗体を２５０倍希釈で２時間反応させ、二次反応は、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを１００倍希釈で１時間反応させた。反応後、試料をＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴで検出した。その結果、図１１で示すように抗ヒトウロキナーゼ受容体抗体で染色される分子量 ５０ ｋＤａ の幅広いバンドが認められた。この結果は、Ｕ９３７細胞で先に確認された分子量分布と同じ分子量分布を示した。以上より、膜蛋白質包埋リポソームの脂質二重層に移行したウロキナーゼ受容体が、本来の細胞に存在する糖鎖構造等を保持したまま移行することが示された。
【０１４５】
（６）ウロキナーゼ受容体のリガンド結合能
Ｕ９３７細胞から調製した膜画分はその脂質二重層にウロキナーゼ受容体を保持していることが示されたので、ウロキナーゼ受容体のウロキナーゼ（リガンド）結合能を検討した。ウロキナーゼをＦＩＴＣで蛍光標識し、膜画分と反応させ、受容体とリガンドの結合を検討した。コントロールとしてＦＩＴＣで蛍光標識したヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を使用した。結果を図１２に示す。図から明らかなように、本方法で調製した膜画分は、その内因性リガンドであるウロキナーゼと結合したが（図１２Ａ）、ＨＳＡとは結合しなかった（図１２Ｂ）。このことは、本膜蛋白質調製法で得られた膜画分に保持されたウロキナーゼ受容体が、その三次元構造及び生理機能（リガンド結合能）を保持したことを意味する。次に、膜蛋白質包埋リポソームのウロキナーゼ結合能を調べた。ウロキナーゼをＦＩＴＣで蛍光標識し、先の方法で得られた膜蛋白質包埋リポソーム（ウロキナーゼ受容体包埋リポソームを含む）と反応させ、受容体とリガンドの結合を検討した。コントロールとしてＦＩＴＣで蛍光標識したヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を使用した。結果を図１３に示す。図から明らかなように、本方法で調製したウロキナーゼ受容体包埋リポソームは、その内因性リガンドであるウロキナーゼとは結合したが（図１３Ａ）、ＨＳＡとは結合しなかった（図１３Ｂ）。ウロキナーゼ受容体包埋リポソーム及びウロキナーゼの結合特異性を確認するために、ＲＩ標識したウロキナーゼ及び非標識ウロキナーゼの混合液を１：１〜１：１００００の種々のモル比で調製し、Ｕ９３７細胞及びウロキナーゼ受容体包埋リポソームとそれぞれ反応させ、細胞及びウロキナーゼ受容体包埋リポソームに結合した放射活性を測定した。図１４に示すように、両者とも、非標識リガンドの増加に伴ない、受容体に結合した放射活性は減少したことから、リポソーム包埋ウロキナーゼ受容体及びウロキナーゼの結合は特異的であると推察された。
【０１４６】
更に、ＰＭＡ刺激によるウロキナーゼ受容体の発現量変化を、膜蛋白質包埋リポソームへのウロキナーゼ結合量により検討した。図１５に示した通り、ＰＭＡ刺激したＵ９３７細胞から調製した膜蛋白質包埋リポソームでは、未処理の細胞から調製したものに比較して、明らかに、蛍光標識ウロキナーゼと結合したリポソーム粒子数は増加した。
【０１４７】
以上の結果は、リポソームに包埋された膜蛋白質の構造及び機能が、生細胞膜上に発現する膜蛋白質のそれと同じであることを示す。従って、本発明による方法は、疾患における受容体及びリガンドの量及び特性の変化を、生細胞の代わりに評価し得ることが示された。
【０１４８】
実施例２：粒子径の縮小後における受容体包埋リポソームの出現
膜蛋白質包埋リポソームの粒子サイズをエクストルーダー法で変化させ、蛍光 （ＦＩＴＣ） 標識ウロキナーゼでウロキナーゼ受容体包埋リポソームの出現を検討した。その結果、図１６に示すように、ろ過孔サイズが ０．６ μｍ 以下のフィルターで整粒されたリポソーム溶液では、目的の受容体を包埋したリポソームの数が明らかに増加した。これは、融合直後の多重層リポソームでは目的受容体の多くがラージリポソームの内側に封入され蛍光検出されなかったこと、並びにさらに重要なことであるが、リポソームサイズを小さくすることにより、一個のリポソームに包埋される受容体の数が減少し、目的受容体を包埋するリポソームと目的受容体を含まないリポソームとが峻別され、包埋するリポソームの数が増加したという事実により引き起こされたと推察される。リポソームをエクストルーダー法又は他の方法で １０ ｎｍ − ５０００ ｎｍ、好ましくは５００ ｎｍ 以下の粒子経にサイジングすると、ＦＡＣＳ解析によれば、標識膜蛋白質包埋リポソームの集団が当該サイズ領域に明瞭に出現する。
【０１４９】
従って、例えば、膜蛋白質の遺伝子配列からｃＤＮＡを調製し、当該ｃＤＮＡを含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、膜蛋白質（ＦＡＣＳで認識可能な蛍光分子及び他の標識分子を導入したもの）を発現させる場合、また、本発明の方法により、発現宿主の細胞膜画分から調製された標識膜蛋白質を包埋する非標識リポソームを当該サイズに調製しＦＡＣＳで解析する場合に、当該膜蛋白質の発現の有無、並びに発現量が検出されるのは自明である。この場合、現在使用し得る方法と異なり、膜蛋白質のＤＮＡ配列以外一切の情報及び試薬（抗体、リガンド、拮抗剤、細胞の応答性及び膜蛋白質の他の検出試薬）が存在しない条件下で、膜蛋白質の検出が可能となる。さらに、抗体等の膜蛋白質検出試薬が存在すれば、蛋白質レベルでの標識が可能となり、同様にＦＡＣＳでの発現の解析が可能となる。もちろん、本方法は、同様の原理によりリガンドの探索にも応用が可能である。
【０１５０】
実施例３：ウロキナーゼの質量分析用プレート上への転写
ウロキナーゼ（１０， １３， １６， ２０， ３３ μｇ）を、一定時間間隔をおきながらポリアクリルアミドゲルの同一ウェルにローディングして電気泳動を行った。泳動終了後、ゲルをガラスプレートから剥がし、転写緩衝液（５％アセトニトリル／１２５ ｍＭ ＮａＣｌ／ＰＢＳ）で５分間ゲル内溶液を置換した後、炭素数１６の疎水性基剤で表面加工されたアルミプレートに熱転写（拡散転写）を行った。５％アセトニトリルと１２５ ｍＭ ＮａＣｌ とを含有するリン酸緩衝液を転写緩衝液として用いて、３５℃で４時間転写を行った。図１７は、転写後の質量分析用プレート、及びクマシーブリリアントブルーで染色した転写前後のゲルを示す写真である。目視では質量分析用プレート上にウロキナーゼのバンドを確認することはできないが、転写後では、ゲル上のウロキナーゼのバンドが薄くなっていることから、ある程度のウロキナーゼが質量分析用プレート上に移行していることが示唆された。
【０１５１】
実施例４：質量分析での解析による、質量分析用プレート上のウロキナーゼの同定
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、熱転写（拡散転写）により質量分析用プレートに移行したウロキナーゼを質量分析計で直接測定した。その結果を図１８に示す。質量分析の条件は、エネルギー吸収物質としてシナピン酸 （５０％アセトニトリル／０．５％トリフルオロ酢酸に溶解した飽和溶液）を用い、これを０．５ μｌ／ｓｐｏｔ添加・風乾したのち、再度同量を添加・風乾した。測定はＣｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＳＥＬＤＩ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＲ Ｓｙｓｔｅｍにより行った。質量校正はβ−ラクトグロブリンＡ （ウシ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びコンアルブミン （ニワトリ） を用いる外部校正であった。ＳＥＬＤＩ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＲ Ｓｙｓｔｅｍの測定パラメータはＤｅｔｅｃｔｏｒ ｖｏｌｔａｇｅ ２２００Ｖ， Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ １０， Ｌａｓｅｒ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ２８５であった。その結果、分子量４９４６１．２の位置に１本のピークが観察された。検討に用いたウロキナーゼは前駆体であり、かつアミノ酸配列から予測される理論分子量は、４８，５２５であることから、糖鎖分子が付加していることが示唆される。
【０１５２】
実施例５：質量分析用プレート上へのウロキナーゼの移行率
質量分析での解析により、質量分析用プレート上へ移行したウロキナーゼの定量を行った。まず標準ウロキナーゼ ２５， １２．５， ６．２５ ｎｇ を用いて、質量分析により得られたピーク高と濃度の標準曲線を求めた。その後、ウロキナーゼ （２５００ ｎｇ） をポリアクリルアミドゲルにローディングして電気泳動を行った。熱転写（拡散転写）により質量分析用プレートに移行したウロキナーゼを質量分析計で直接測定した。その結果、図１９に示すように、２５ ｎｇ に相当するピーク高が検出された。この結果から、熱転写法によるゲルから質量分析用プレートへの移行率は約１％と見積もられた。
【０１５３】
実施例６：質量分析用プレート上のバクテリオロドプシン包埋リポソームの質量分析による解析
質量分析計を用いてバクテリオロドプシン（Ｓｉｇｍａ、Ｂ３６３６）を測定して得られた結果を図２０に示す。試料をチップ上に載せ、風乾し、２，５−ジヒドロ安息香酸 （エタノール中１７０ ｍｇ／ｍＬ） を０．５ μＬ／ｓｐｏｔ 添加、風乾した後、ＳＥＬＤＩ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＲ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ） に測定した。質量校正は、β−ラクトグロブリンＡ （ウシ）、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびコンアルブミン（ニワトリ）を用いる外部校正であった。ＳＥＬＤＩ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＲ Ｓｙｓｔｅｍの測定パラメータはＤｅｔｅｃｔｏｒ ｖｏｌｔａｇｅ ２１００Ｖ， Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ １０， Ｌａｓｅｒ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ２８５であった。その結果、いずれの場合にも２７０２７．３及び２８１２０．２の２本のピークが観測された。バクテリオロドプシンの理論分子量は２７０６８．０であることから、前者はバクテリオロドプシンであり、後者は、有機溶媒での処理の際にレチナールの脱離が見られたことから、バクテリオロドプシン様蛋白質であると示唆された。
【０１５４】
図２０Ａは、バクテリオロドプシン単独測定時の蛋白質濃度とピーク強度との相関を示し、比例関係より、検出限界は ２０ ｆｍｏｌ であった。図２０Ｂは、バクテリオロドプシン単独、単純リポソームとの共存条件下のバクテリオロドプシン及びリポソーム包埋バクテリオロドプシンの測定結果を示す。同一の溶媒条件下では、これら３つの様式では、同一濃度でのバクテリオロドプシンのＭＳシグナル強度は異なっていた。このことにより、単純リポソーム及びリポソーム包埋バクテリオロドプシンとの共存条件下でさえも、バクテリオロドプシンを質量分析により解析できることが示された。
【０１５５】
実施例７：質量分析用プレート上のウロキナーゼ受容体の質量分析による解析
質量分析用プレートにプロテインＧを共有結合で架橋し、抗ウロキナーゼ受容体抗体を非共有結合で結合させて、質量分析用プレートを作製した。図２１に示したウロキナーゼ受容体の精製品（図２１Ａ）をこのプレートに塗布後、常法により質量分析で解析した（図２１Ｂ）。その結果、分子量４９９７８．１の位置にウロキナーゼ受容体のピークが見出され（図２１Ｃ，上段）、ウロキナーゼ受容体のリガンドと考えられる抗ウロキナーゼ受容体ＩｇＧ抗体もまた理論分子量域に認められた。コントロールとして非特異的ＩｇＧを使用した場合には、ウロキナーゼ受容体の質量ピークは観察されなかった（図２１Ｃ，下段）。次に、Ｕ９３７細胞膜画分を質量分析に供した。その結果、同様の位置にウロキナーゼ受容体ピークが認められた。このことにより、Ｕ９３７細胞膜画分由来のウロキナーゼ受容体もまた、抗ウロキナーゼ受容体ＩｇＧに特異的に結合し得るというアイデアが支持される。さらに、質量分析用プレートにプロテインＧを共有結合させ、抗ウロキナーゼ受容体ＩｇＧ（ヤギ）を結合させ、プレート上にスペーサーとしてプロテインＧ／抗体の複合体を提供した。ウロキナーゼ精製品をこのプレートに塗布後、Ｕ９３７細胞から常法で調製したプロテオリポソーム溶液をプレート上４℃で一晩反応させた。オクチルグルコシドを含む緩衝液を用いてリポソームを除去した後、質量分析による解析を行なった。その結果、おおよそ ５０，０００ Ｄａ の位置にウロキナーゼ受容体とウロキナーゼの両者から構成されるピークを認めた（図２５，上段）。プロテオリポソームの代わりに蛋白質を含まない単純リポソームを使用した場合には、この領域にピークが見出されはしたものの（図２５Ｃ，中段）、ピーク強度は明らかに低減していた。即ち、２つのピーク間の差異は、ウロキナーゼ受容体が存在するか否かに起因している。このことは、プロテオリポソームに包埋されているウロキナーゼ受容体が、プレート上に結合したウロキナーゼに結合できるという事実を示す。ウロキナーゼ受容体及びウロキナーゼの両者のピークは、抗ウロキナーゼＩｇＧの代わりに、ウロキナーゼに結合し得ないウシＩｇＧを使用した場合には観察されなかった（図２５Ｃ、下段）。
【０１５６】
ここで特に言及されるべきことは、脂質二重層に包埋されたウロキナーゼ受容体が、質量分析により、そのリガンド（ウロキナーゼ）と共に一括して検出、同定されたという事実である。このことにより、本発明の基本原理が証明された。
【０１５７】
実施例８：質量分析用プレート上での糖成分の除去
糖鎖を有する膜蛋白質（ウロキナーゼ受容体、ウシロドプシン）および可溶性蛋白質（ウロキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、並びに糖鎖を有しない膜蛋白質（バクテリオロドプシン）および可溶性蛋白質（β−ラクトグロブリン、チトクロームｃ）を質量分析用プレート上に捕捉し、風乾し、５０％アセトニトリル・０．５％トリフルオロ酢酸で溶解した飽和シナピン酸（ＳＰＡ）、飽和２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）およびインドールアクリル酸（ＩＡＡ）を０．５ μｌ／ｓｐｏｔ 添加し、風乾した。測定はＳＥＬＤＩ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐＲ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ）により行った。質量校正はユビキチン（ウシ）、ミオグロビン（ウマ）、血清アルブミン（ウシ）を用いる外部校正であった。その結果を表３および図２２に示す。
【０１５８】
【表３】
膜蛋白質・可溶性蛋白質にかかわらず、ＳＰＡ又はＩＡＡを用いて得られた分子量は、そのアミノ酸配列から予測される理論値と同様であるものの、ＤＨＢを用いて得られた分子量は、蛋白質の糖鎖の存在に依存していた。例えば、糖鎖を含まない蛋白質であるチトクロームＣは、両方の場合においてほぼ同じ分子量を示したものの（ＳＰＡによれば１２，２５１、ＤＨＢによれば１２，２９７）、糖鎖を有する蛋白質であるウロキナーゼ受容体は、ＤＨＢ及びＳＰＡを用いた場合の間において約 ３，０００ Ｄａ の差異を示した（ＳＰＡによれば４７，４６６、ＤＨＡによれば５０，４６５）。ＤＨＢを用いて得られた糖鎖を有する他の蛋白質の分子量もまた、ＳＰＡ又はＩＡＡを用いて得られた分子量よりも １０００〜３０００ Ｄａ 大きいものであった。
【０１６０】
糖鎖又は脂質を構成成分として含む蛋白質の質量分析による解析において、蛋白質分解酵素あるいはフォスホリパーゼ、エステラーゼ等の前処理が必要とされる従来法と著しい対照を示し、本発明の方法では、質量分析用プレート上の試料に添加する溶媒の組成を単に変化させることにより、全て（条件によっては一部）の糖鎖及び脂質が除去された単純蛋白質スペクトルを得ることができる。
【０１６１】
本発明は、膜蛋白質・可溶性蛋白質に関わらず如何なる蛋白質にも適用が可能であり、溶媒は、蛋白質を組成とする触媒、いわゆる酵素と定義される物質以外の如何なる物質を含んでいてもよく、それらの濃度、添加順序等及び質量分析計の測定原理、種類等は限定されない。
【０１６２】
実施例９：質量分析による変性蛋白質の検出
質量分析による解析において、シナピン酸（ＳＰＡ）を溶媒としてチトクロームｃ、β−ラクトグロブリン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ウロキナーゼ等の可溶性蛋白質を測定すると正常なＭＡＳＳシグナル強度が出現するが、溶媒として２，５−ジヒドロキシ安息香酸 （ＤＨＢ） を使用するとＭＡＳＳピークは極端に減弱化した（図２３右）。膜蛋白質（バクテリオロドプシン、ウロキナーゼ受容体）では、この溶媒効果は逆であった（図２３左）。これにより、膜蛋白質群のみを高感度に検出すること、又は可溶性蛋白質群のみを高感度に検出することが可能となる。本発明の重要な局面は、本来の生理的状態では可溶性である蛋白質が何らかの原因（自身のペプチド断片の遊離、遺伝子の変異、同一配列を有するヘテロ構造分子間での熱力学的により安定な構造への相互変換等）で変性し、非可溶性蛋白質となったときに、可溶性蛋白質と非可溶性蛋白質の選別検出を可能とする測定法を提供することである。これは、既存の如何なる技術によっても想到し得ない。
【０１６３】
従って、本発明によれば、病原性プリオン蛋白質（ヒト、ヒツジ、ウシ、酵母等の生物種を問わない）の超高感度な検出及び定量が提供される。またこの測定原理は、アミロイドβ蛋白質（Ａβ）の変性（不溶化）に伴ない発症するアルツハイマー病、トランスサイレチン蛋白質 （ｔｒａｎｓｔｈｙｒｅｔｉｎ） の変性（不溶化）に伴ない発症する家族性アミロイドーシスポリニューロパシー （Ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｌｏｙｔｉｃ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ） 等の他の神経変性疾患に応用が可能であるのみならず、変性（不溶性）蛋白質が関与する任意の疾患の検出、動物の検疫、食肉検査等に応用が可能である。本発明は、試験管内での蛋白質の再構成度の測定等、可溶性分子の変性状態（不溶性）と生理状態（可溶性）とを選別する測定法に対し広範な応用が可能である。
【０１６４】
実施例１０：支持体に結合したリガンドと膜蛋白質包埋リポソームとの結合
膜蛋白質の支持体としてリポソーム、生体膜（膜画分）又は生体膜（細胞）を、リガンド支持体として質量分析用プレート、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂゲル又は磁性鉄粒子を、スペーサーとしてプロテインＧ又はビオチンを、表４に示される通りに組み合わせて用いることにより、膜蛋白質・リガンド複合体を形成させた。
【０１６５】
【表４】
その結果、支持体とリガンドの間にスペーサー分子が存在することが好ましいことが判明した。リガンドの種類によって異なるが、スペーサーが存在しない場合は、膜蛋白質包埋リポソームは全く結合しないか、又は結合力が弱かった。これは、両分子が異なる固体表面に固定されるため、一点での結合による親和性効果の相互作用よりも、複数の点での結合によるアビディティー効果の相互作用が必要とされるからである。複数の点での結合を可能にするために、両分子会合時の立体障害を減弱化し衝突回数を増加させるような適切なスペーサー分子を介在させることが必要である。スペーサー分子は、リガンドと支持体の間に存在し、生体ポリマー（タンパク質など）、合成ポリマー又は金属等からなり、解析の目的に応じて共有結合・非共有結合による結合が可能であり、三次元的な空間を有する微小な網目状、多孔性等の形状であり得る。
【０１６７】
実施例１１：Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂゲルに固定化されたリガンドと受容体包埋リポソームとの結合
ビオチン化したリガンド３種（ウロキナーゼ、インターフェロン−γ、補体Ｃ５ａ）を、アビジン化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂゲルに結合させた。この場合のリガンド支持体はＳｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂゲルで、スペーサーはアビジン（蛋白質）である。膜蛋白質包埋リポソームを、上記実施例１（２）の方法によりＦＩＴＣ標識蛍光リポソームとＵ９３７膜画分から調製し、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂゲルに固定した３種類のリガンドと反応させ、ＰＢＳで３回洗浄した後、可視光及び蛍光で観察した。その結果、図２４に示すように、可視光 （Ｂ） では全てのゲルで白色が観察された。暗視野における蛍光 （Ａ） では、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂゲルのみでは発色は観察されなかったが、組み合わせて結合させた３種類のリガンドを用いた他のゲルでは、蛍光を発した。この結果は、本発明の原理が、前述の質量分析用プレート／質量分析に加えて、任意のリガンド支持体／任意の検出系の組み合わせ（例えば、粒子／蛍光、粒子／放射活性、粒子／二次シグナル発生試薬等）に応用が可能であることを示す。
【０１６８】
上記実施例では、受容体の任意のタイプについて本発明が応用可能であることを示すために、ウロキナーゼ受容体（ＧＰＩアンカー型）、活性化補体Ｃ５ａ受容体（ＧＰＣＲ型）及びインターフェロン−γ受容体（オリゴマー型）と、それらのリガンド（ウロキナーゼ、Ｃ５ａ、ＩＦＮγ）とを用いて相互作用（機能）の検出結果を示している。これらの結果により、分子の構造・機能にかかわらず任意の膜関連受容体、膜関連チャネル、膜関連ポンプ、膜関連トランスポーター並びにそれら蛋白質に付随的に結合する物質が本発明の原理及び方法に従ってリガンドと共に単離・同定され得ることが、当業者には容易に理解されるであろう。
【０１６９】
また、測定法として質量分析を想定した、膜蛋白質・リガンド用全自動プロテオーム解析装置の各構成部分の基本仕様及び検討結果を示したが、蛍光分析を想定した蛍光標識リポソーム及びリガンド・粒子結合体を用いる実施例が示すように、本発明は多岐にわたり応用可能であることが当業者には容易に理解されるだろう。
【０１７０】
このように、本発明を好ましい実施態様を強調して説明してきたが、好ましい実施態様が変更され得ること、並びに本発明が本明細書に具体的に記載された以外によっても実施され得ることは、当業者には自明であろう。従って、本発明は上記の特許請求の範囲によって定義される発明の精神と範囲に包含される全ての改変を含むものである。
【０１７１】
本出願は、２００１年１月９日付で出願された米国仮特許出願第６０／２６０，４３３号及び２００１年３月２日付で出願された同第６０／２７２，９８１号を基礎とするものであり、それらの内容はすべて本明細書中に包含されるものである。
本明細書で引用した、特許、特許出願及び刊行物を含むすべての参考文献は、ここで言及することによりそのすべてが組み込まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明のプロテオーム解析システム及びその構成要素の代表的な実施態様を模式的に示す。
【図２】
図２は、本発明で用いられる質量分析用プレートの１つの実施態様を示す。
【図３】
図３は、本発明で用いられる可溶性蛋白質（リガンド）支持体の種々の実施態様を示す。
【図４】
図４は、本発明で用いられるリガンド・受容体（膜蛋白質）マトリクス表の１つの実施態様を示す。
【図５】
図５は、Ｂｔ２ｃＡＭＰ刺激前（図５Ｂ）及び後（図５Ａ）でのＵ９３７細胞膜に対するウロキナーゼ受容体（リガンド：ＦＩＴＣ−ＵＫ）、Ｃ５ａ受容体（リガンド：ＦＩＴＣ−Ｃ５ａ）、及びインターフェロン−γ受容体（リガンド：ＦＩＴＣ−ＩＦＮγ）の発現を示す。
【図６】
図６は、Ｕ９３７細胞からの膜画分の分離を示す写真である。この写真では、左は、４０％スクロース密度勾配遠心分離前を示し、右は、４０％スクロース密度勾配遠心分離後を示す。
【図７】
図７は、Ｕ９３７膜蛋白質包埋リポソームの単離を示す写真である。Ａ：リポソーム（２００μｌ）＋膜画分；Ｂ：リポソーム（５０μｌ）＋膜画分；Ｃ：膜画分；Ｄ：リポソーム（２００μｌ）。
【図８】
図８は、ＦＩＴＣ標識膜画分（図８Ａ）、ＦＩＴＣ標識膜蛋白質包埋リポソーム（図８Ｂ）、単純なリポソーム（図８Ｃ）のＦＡＣＳ解析の結果を示す。
【図９】
図９は、Ｕ９３７細胞膜上でのウロキナーゼ受容体の発現を示すウエスタンブロット解析の結果である。
【図１０】
図１０は、抗ウロキナーゼ受容体抗体の存在下（図１０Ａ）及び非存在下（図１０Ｂ）におけるウロキナーゼ受容体包埋リポソームの共焦点レーザー顕微鏡写真である。
【図１１】
図１１は、可溶化膜蛋白質包埋リポソームのウエスタンブロット解析の結果である。
【図１２】
図１２は、膜画分中のウロキナーゼ受容体のリガンド（ＦＩＴＣ標識ウロキナーゼ）結合能を示す（図１２Ａ）。ＦＩＴＣ標識ＨＳＡをコントロールとして用いた（図１２Ｂ）。
【図１３】
図１３は、リポソーム包埋ウロキナーゼ受容体のリガンド（ＦＩＴＣ標識ウロキナーゼ）結合能を示す（図１３Ａ）。ＦＩＴＣ標識ＨＳＡをコントロールとして用いた（図１３Ｂ）。
【図１４】
図１４は、Ｕ９３７細胞（図１４Ａ）及びウロキナーゼ受容体包埋リポソーム（図１４Ｂ）との標識リガンドの結合のモル比依存性を示す。
【図１５】
図１５は、ＰＭＡ刺激（図１５Ｂ）及び非刺激（図１５Ａ）のＵ９３７細胞から調製された膜蛋白質包埋リポソームのリガンド（ＦＩＴＣ標識ウロキナーゼ）結合能を示す。
【図１６】
図１６は、リポソーム粒子サイズの縮小化によるウロキナーゼ受容体包埋リポソームの出現を示す。
【図１７】
図１７は、ウロキナーゼが転写された質量分析用プレート及び該プレート上への転写前後のポリアクリルアミドゲルのクマシーブリリアントブルー染色の写真である。
【図１８】
図１８は、質量分析用プレート上に転写されたウロキナーゼの質量分析による解析の結果を示す。
【図１９】
図１９は、質量分析用プレート上に転写されたウロキナーゼの定量の結果を示す。
【図２０】
図２０は、バクテリオロドプシンの質量分析による解析の結果を示す。図２０Ａは、種々の濃度のバクテリオロドプシンでの結果を示し、図２０Ｂは、バクテリオロドプシン単独、単純リポソーム共存下のバクテリオロドプシンおよびリポソーム包埋バクテリオロドプシンの結果を示す。
【図２１】
図２１は、質量分析用プレート上のウロキナーゼ受容体の質量分析による解析の結果を示す。図２１Ａは、電気泳動した精製ウロキナーゼ受容体の写真であり、図２１Ｂは、質量分析用プレート上に形成された複合体の模式図であり、図２１Ｃは、抗ウロキナーゼ受容体ＩｇＧ（上）及びコントロールＩｇＧ（下）をリガンドとして使用した場合における、質量分析による解析の結果を示す。
【図２２】
図２２は、ＩＡＡ又はＤＨＢの添加による、ウシロドプシンの質量分析による解析の結果を示す。
条件：
ウシロドプシン：２．５６ｐｍｏｌ膜懸濁液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、１００μＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）
マトリクス：０．１７ｍｇ／μＬ ＤＨＢ（エタノール０．５μＬ中）又はＩＡＡ飽和溶液（エタノール１．０μＬ中）。
【図２３】
図２３は、変性蛋白質モデルとしてのウロキナーゼ受容体（図２３Ａ）及び生理学的蛋白質モデルとしてのウロキナーゼ（図２３Ｂ）の質量分析による選択的測定を示す。
【図２４】
図２４は、種々の受容体を包埋するリポソームとＳｅｐｈａｒｏｓｅ−４Ｂゲル上に固定されたそれらのリガンドとの結合を示す。
【図２５】
図２５は、リガンドとしてのウロキナーゼ及び受容体としてのウロキナーゼ受容体の質量分析による一括解析を示す。
Claims (17)
- プロテオームを、その本来の構造及び機能を保持しつつ、膜蛋白質と該膜蛋白質と相互作用し得る化合物とにグループ分けし、該膜蛋白質と該化合物の両方を生物学的親和性に基づいて解析することを含む、プロテオーム解析法。
- 膜蛋白質とそれと相互作用し得る化合物の両方を生物学的親和性に基づいて解析することを含むプロテオーム解析法であって、該方法が、以下を含む方法：
（１）その本来の機能を保持しつつ、化合物を含む検体を支持体上に固定する工程；
（２）生体試料から膜蛋白質を有する膜画分を単離することによって脂質二重層を調製する工程、又は膜画分をリポソームと融合させる工程；
（３）（２）の脂質二重層に包埋された膜蛋白質を、（１）の支持体上に固定された化合物を含む検体に接触させ、該化合物と相互作用し得る該膜蛋白質を脂質二重層に捕捉する工程；並びに
（４）（３）の脂質二重層に捕捉された膜蛋白質と（１）の支持体上に固定された化合物の両方又はいずれかの物理的又は化学的情報の少なくとも一部を入手し得る手段によって解析する工程。 - 固定する工程が、検体をゲル電気泳動に供し、検体をゲルから支持体上に転写することを含む、請求項２記載の方法。
- 手段が、質量分析、蛍光法、ＲＩ法及び表面プラズモン共鳴法からなる群より選択される、請求項２又は３記載の方法。
- 支持体が、プレート、非磁性粒子及び磁性粒子からなる群より選択される、請求項２又は３記載の方法。
- 膜蛋白質と相互作用し得る化合物をゲル電気泳動後に固定するための支持体であって、化合物の本来の機能を保持しつつ、支持体の表面上に化合物を共有結合又は非共有結合させるスペーサーを有する、支持体。
- 少なくとも以下の装置を含む、プロテオーム解析装置：
（ａ）膜蛋白質と相互作用し得る化合物の本来の機能を保持しつつ、該化合物を支持体上に固定する装置；
（ｂ）膜蛋白質包埋脂質二重層を調製する装置；
（ｃ）膜蛋白質を支持体上に固定された化合物と接触させることにより、脂質二重層中に包埋された該膜蛋白質を捕捉する装置であり、該膜蛋白質が該化合物と相互作用し得るものである、装置；
（ｄ）該膜蛋白質と該化合物の両方又はいずれかの物理的又は化学的情報の少なくとも一部を入手する装置。 - 固定する装置が、化合物を含む検体を電気泳動ゲルから支持体に転写する装置である、請求項７記載の装置。
- 該膜蛋白質及び／又は該化合物の物理的又は化学的情報の少なくとも一部を入手し得る装置が、質量分析、蛍光法、ＲＩ法及び表面プラズモン共鳴法からなる群より選択される、請求項７又は８記載のプロテオーム解析装置。
- 支持体が、プレート、非磁性粒子及び磁性粒子からなる群より選択される、請求項７又は８記載のプロテオーム解析装置。
- 質量分析用プレートであって、該プレートは、化合物を含む検体の電気泳動後に、プレートをゲルと接触させることにより、該プレート上に固定された化合物を含み、該化合物が膜蛋白質と相互作用し得るものである、質量分析用プレート。
- 量又は特性において疾患特異的な変化を示す膜蛋白質及び／又はそれと相互作用し得る化合物の同定法であって、所定の疾患に罹患した生物から収集した試料を、請求項１〜３のいずれか１項記載のプロテオーム解析法に供し、入手した解析データを健常な同種生物のデータと比較することを含む、方法。
- 請求項１２記載の方法を、少なくとも１つの疾患に適用し、入手したデータを集積することを含む、データベースの構築法。
- 請求項１３記載の方法により構築されたデータベース。
- 標的生物の疾患の診断確定法であって、以下の工程を含む方法：
（１）所定の疾患に罹患した生物から収集した試料を、請求項１〜３のいずれかのプロテオーム解析に供し、入手した解析データを健常の同種生物のデータと比較し、量又は特性において疾患特異的な変化を示す膜蛋白質及び／又はそれと相互作用し得る化合物を同定する工程；
（２）（１）の工程を少なくとも１つの疾患に適用し、入手したデータを集積してデータベースを構築する工程；
（３）診断標的生物から収集した試料を工程（１）に供し、入手したデータを、工程（２）により構築された診断用データベースに集積されたデータと比較し、それによって標的の疾患を確定する工程。 - 診断標的生物の疾患を決定するためのシステムであって、少なくとも以下の装置を含むシステム：
（ａ）膜蛋白質と相互作用し得る化合物の本来の機能を保持しつつ、該化合物を支持体上に固定する装置；
（ｂ）膜蛋白質包埋脂質二重層を調製する装置；
（ｃ）膜蛋白質を支持体上に固定された化合物と接触させることにより、脂質二重層中に包埋された該膜蛋白質を捕捉する装置であり、該膜蛋白質が該化合物と相互作用し得るものである、装置；
（ｄ）該膜蛋白質と該化合物の両方又はいずれかの物理的又は化学的情報の少なくとも一部を入手する装置；
（ｅ）請求項１４記載のデータベース。 - 固定する装置が、化合物を含む検体を電気泳動ゲルから支持体上に転写する装置である、請求項１６記載のシステム。
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