CN111269164B - 酮类化合物及其制备方法和应用、定点修饰含有半胱氨酸残基或二硫键的蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物分子共轭标记领域，公开了酮类化合物及其制备方法和应用、定点修饰含有半胱氨酸残基或二硫键的蛋白质的方法，该化合物具有式(1)所示的结构，R为由含有氨基的功能性化合物提供的基团。本发明所述的化合物，在蛋白质的双功能标记以及抗体偶联药物的制备中具有重要的实践意义。
Figure DDA0002380970090000011

Description

酮类化合物及其制备方法和应用、定点修饰含有半胱氨酸残 基或二硫键的蛋白质的方法
技术领域
本发明涉及生物分子共轭标记领域，具体涉及N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮类化合物及其制备方法和应用，以及定点修饰含有半胱氨酸残基的蛋白质的方法和定点修饰含有二硫键的蛋白质的方法。
背景技术
蛋白质和多肽的定点化学修饰是制备功能化蛋白的实用方法，也是药物化学和生物医学领域的一类重要的研究工具[Chemical Reviews.,2015,115,2174–2195]。
在20种天然氨基酸中，半胱氨酸因其天然丰度低，亲核性强，成为蛋白质化学性修饰的理想残基(位点)。除了天然存在于蛋白质中的半胱氨酸之外，它也可以很方便地通过定点突变的方式引入。
常用的半胱氨酸特异性的生物共轭标记分子包括马来酰亚胺，碘乙酰胺，卤代烷烃，吡啶二硫化物等[Nat.Chem.Biol.,2008,4,405-407；Chem-Asian J.,2009,4,630-640]。
最近，由于均一性抗体偶联药物发展的需要，催生出了一系列活性、特异性和生物相容性更高的半胱氨酸生物共轭分子，包括马来酰亚胺衍生物[Angew.Chem.Int.Ed.,2016,55,1432-1435]，脱氢丙氨酸[Chem.Sci.,2011,2,1666-1676]以及全氟代苯[J.Am.Chem.Soc.,2013,135,5946-5949]，有机金属钯试剂[Nature,2015,526,687-691]等。每一种试剂虽然具有其独特的优点，但是对于单一半胱氨酸的双修饰却很难实现。
此外，在蛋白质中，半胱氨酸常常以二硫键的形式存在，构成蛋白复杂的三级结构。如何在不破坏蛋白的三级结构的前提下实现蛋白质二硫键半胱氨酸的桥连修饰也是目前关注的热点，现存的能实现上述目标的标记分子包括溴代马来酰亚胺[J.Am.Chem.Soc.,2010,132,1960-1965]，溴代吡啶二酮[Chem.Commun.,2011,47,8781-8783]，烯丙基砜[Chem.Sci.,2013,4,1889-1894]，二乙烯基吡啶[Chem.Sci.,2019,10,694–700]等。它们或者合成复杂，或者生成共轭产物不稳定。
因此，发展新型的简便高效的半胱氨酸以及二硫键桥连的生物共轭标记分子很有必要。
发明内容
本发明的目的是为了提供新型、简便、高效的半胱氨酸以及二硫键桥连的生物共轭标记分子。
为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮类化合物，该化合物具有式(1)所示的结构：
Figure BDA0002380970070000021
其中，在式(1)中，
R为由含有氨基的功能性化合物提供的基团。
本发明的第二方面提供一种制备前述的N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮类化合物的方法，该方法包括：
(1)在溶剂存在下，将乙酸-4-溴呋喃-2-甲酯与N-溴代丁二酰胺进行第一混合，得到第一混合溶液；
(2)将所述第一混合溶液与R-NH2所示的伯氨基化合物进行第二混合，得到第二混合溶液；
其中，所述伯氨基化合物中的R与前文的定义相同。
本发明的第三方面提供前述N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮类化合物在含有半胱氨酸残基的蛋白质上定点修饰半胱氨酸残基的应用。
本发明的第四方面提供一种定点修饰含有半胱氨酸残基的蛋白质的方法，该方法包括：将前述的N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮类化合物与含有半胱氨酸残基的蛋白质进行一次共轭加成反应。
本发明的第五方面提供前述的N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮类化合物在含有二硫键的蛋白质上定点修饰二硫键的应用。
本发明的第六方面提供一种定点修饰含有二硫键的蛋白质的方法，该方法包括：将前的N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮类化合物与含有二硫键的蛋白质进行接触反应。
本发明提供的N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮类化合物与现有的半胱氨酸生物共轭标记探针相比，其显著的优点主要在于：
(1)合成方法简单，原料易得，对大多数含伯氨基的化合物都能一步转化成标记分子；
(2)对巯基的选择性高，与巯基化合物的反应条件温和，反应速率快；
(3)获得的单巯基共轭产物能继续与高当量的巯基发生反应，从而实现巯基的双标记以及二硫键的插入修饰。
本发明所述的化合物，在蛋白质的双功能标记以及抗体偶联药物的制备中具有重要的实践意义。
附图说明
图1为实施例3所述的半胱氨酸特异性的稳定双修饰的蛋白质的制备过程。
图2为15％SDS-PAGE分析实施例3中所得双修饰的蛋白质的稳定性结果。
图3为实施例4所述的二硫键插入修饰的生长素抑制肽片段(SST)的制备过程。
图4为实施例4中的SST修饰产物的比例变化结果。
图5为实施例5所述的二硫键桥连抗体Fab的制备过程。
图6为激光共聚焦显微镜分析实施例5中的二硫键桥连抗体Fab作为二抗的活性结果。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
如前所述，本发明的第一方面提供了一种N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮类化合物，该化合物具有式(1)所示的结构：
Figure BDA0002380970070000041
其中，在式(1)中，
R为由含有氨基的功能性化合物提供的基团。
本发明提供的前述化合物能够作为蛋白质双修饰以及二硫键插入修饰的共轭标记分子。
具体地，本发明提供的前述化合物具有在巯基的选择性标记和双功能化以及二硫键的桥连修饰的功能。
优选情况下，R为由氨基酸、氨基糖、含有氨基的荧光分子、含有氨基的生物素、含有氨基的C2-C6的炔基化合物和含有氨基的抗癌活性化合物中的至少一种提供的基团。
本发明所述“氨基酸”表示丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、蛋氨酸(Met)、甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)中的至少一种。
本发明所述“氨基糖”包括含有氨基的单糖、含有氨基的二糖和含有氨基的多糖中的任意一种，例如所述氨基糖可以为氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基葡萄二糖等。
本发明所述“含有氨基的荧光分子”包括但不限于5-氨基荧光素、4-氨基荧光素、氨基香豆素、氨基花菁素、6-氨基四甲基罗丹明等。
本发明所述“含有氨基的生物素”包括但不限于生物素酰肼、生物素-聚乙二醇-氨基、N-(2-氨基乙基)生物素酰胺等。
本发明所述“含有氨基的C2-C6的炔基化合物”表示化合物中的总碳原子数为2-6，且化合物中至少含有一个氨基和一个炔基，可以为直链或者支链的化合物。例如可以为炔丙基胺、氨基-聚乙二醇-炔基、二苯并环辛炔胺、N-[(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基羰基]-1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷、氨基聚乙二醇环辛炔等。
本发明所述“含有氨基的抗癌活性化合物”包括但不限于阿霉素及其盐、甲磺酸艾瑞布林(Eribulin mesylate)、新霉素、卡那霉素等。
根据一种特别优选的具体实施方式，R为由甘胺酰胺、葡萄糖胺、炔丙胺、生物素酰肼、5-氨基荧光素、阿霉素及其盐和对溴苯胺中的至少一种物质提供的基团。
如前所述，本发明的第二方面提供了一种制备前述的N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮类化合物的方法，该方法包括：
(1)在溶剂存在下，将乙酸-4-溴呋喃-2-甲酯与N-溴代丁二酰胺进行第一混合，得到第一混合溶液；
(2)将所述第一混合溶液与R-NH2所示的伯氨基化合物进行第二混合，得到第二混合溶液；
其中，所述伯氨基化合物中的R与前文中的定义相同。
优选地，在步骤(1)中，所述溶剂选自四氢呋喃、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜中的至少一种。
优选情况下，所述第一混合在pH调节剂存在下进行。
特别优选所述pH调节剂为磷酸钠缓冲液。本发明所述磷酸钠缓冲液的pH值例如可以为7.0-8.5。本发明所述磷酸钠缓冲液的浓度例如可以为0.01M-1.0M。
优选情况下，在步骤(1)中，所述四氢呋喃和所述磷酸钠缓冲液的用量体积比为1：0.5-2。
优选地，在步骤(1)中，所述第一混合的温度为-20℃至20℃。
优选地，在步骤(2)中，所述第二混合的温度为0℃至50℃。
优选情况下，在步骤(1)中，所述乙酸-4-溴呋喃-2-甲酯与所述N-溴代丁二酰胺的用量摩尔比为1：1-3。
本发明的步骤(1)获得的所述第一混合溶液可以不经过纯化处理直接用于下一步反应。
特别优选地，本发明所述伯氨基化合物为甘胺酰胺、葡萄糖胺、炔丙胺、生物素酰肼、5-氨基荧光素、阿霉素和对溴苯胺中的至少一种物质。
优选地，在步骤(2)中，所述乙酸-4-溴呋喃-2-甲酯与所述伯氨基化合物的用量摩尔比为1：1-1.5。
本发明对所述第一混合和所述第二混合的具体操作时间没有特别的限制，本领域技术人员可以通过采用本领域合适的方法(例如HPLC、TLC等手段)监测反应进程确定合适的反应时间。本发明的具体实例部分提供了具体反应的操作时间，本领域技术人员不应理解为对本发明的限制。
本发明的方法中还可以包括对中间体或者目标产物进行常规的后处理操作，例如可以采用蒸发、过滤、重结晶、干燥、柱层析等手段进行后处理；本发明在后文的实例中提供了具体的后处理操作步骤，本领域技术人员不应理解为对本发明的限制。
如前所述，本发明的第三方面提供了前述N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮类化合物在含有半胱氨酸残基的蛋白质上定点修饰半胱氨酸残基的应用。
优选地，所述定点修饰为定点单修饰和/或定点双修饰。
在含有半胱氨酸残基的蛋白质上定点修饰半胱氨酸残基的应用中，本发明“定点单修饰”表示每个半胱氨酸残基上共价偶联单个功能修饰基团。
在含有半胱氨酸残基的蛋白质上定点修饰半胱氨酸残基的应用中，本发明“定点双修饰”表示每个半胱氨酸残基上共价偶联两个功能修饰基团。
如前所述，本发明的第四方面提供了一种定点修饰含有半胱氨酸残基的蛋白质的方法，该方法包括：将前述的N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮类化合物与含有半胱氨酸残基的蛋白质进行一次共轭加成反应。
优选情况下，所述一次共轭加成反应的条件包括：反应温度为20℃至45℃，反应时间为5min至150min，pH值为7.0-8.5。
根据一种优选的具体实施方式，该方法还包括：将所述一次共轭加成反应后得到的产物与含有巯基的分子进行二次共轭加成反应。
优选情况下，所述含有巯基的分子包括但不限于前述的含有半胱氨酸残基的蛋白质中的任意一种，例如还可以为生物素-巯基、荧光素-巯基、罗丹明-巯基、花菁素-巯基、PEG-巯基、环辛炔-巯基等。
优选地，所述二次共轭加成反应的条件包括：反应温度为20℃至45℃，反应时间为5min至150min，pH值为7.0-8.5。
根据另一种优选的具体实施方式，该方法还包括：将所述一次共轭加成反应后得到的产物和/或所述二次共轭加成反应后得到的产物与硼氢化钠接触以进行还原反应。
优选地，所述一次共轭加成反应后得到的产物或所述二次共轭加成反应后得到的产物与所述硼氢化钠的用量摩尔比为1：1-40。
优选地，所述还原反应的条件包括：反应温度为20℃至45℃，反应时间为10min至120min。
如前所述，本发明的第五方面提供了前述N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮类化合物在含有二硫键的蛋白质上定点修饰二硫键的应用。
优选地，所述定点修饰为定点插入修饰和/或定点双修饰。
在含有二硫键的蛋白质上定点修饰二硫键的应用中，本发明“定点插入修饰”表示二硫键的两个巯基与单个N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮分子反应得到单一加成产物。
在含有二硫键的蛋白质上定点修饰二硫键的应用中，本发明“定点双修饰”表示二硫键的两个巯基分别与两个N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮分子反应得到双加成产物。
如前所述，本发明的第六方面提供了一种定点修饰含有二硫键的蛋白质的方法，该方法包括：将前述的N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮类化合物与含有二硫键的蛋白质进行接触反应。
优选地，所述接触反应的条件包括：反应温度为20℃至45℃，反应时间为5min至300min，pH值为7.0-8.5。
优选地，所述含有二硫键的蛋白质为含有二硫键的抗体。优选所述抗体二硫键的还原采用二硫苏糖醇(DTT)。示例性地，本发明所述抗体为Fab片段化山羊抗人IgG二抗。
优选地，本发明采用氧化剂脱氢抗坏血酸钠对分子内被还原的二硫键进行重新氧化以恢复抗体的天然结构和活性。
以下将通过实例对本发明进行详细描述。以下实例中，在没有特别说明的情况下，使用的各种原料均来自商购。
乙酸-4-溴呋喃-2-甲酯(自制)、甘氨酰胺盐酸盐(Acros，货号A0285314)、N-溴代丁二酰亚胺(阿拉丁，货号B105057)、D-(+)-葡萄糖胺盐盐酸盐(TCI，货号G0044)、炔丙基胺(innochem，货号A42615)、生物素酰肼(阿拉丁，货号B122221)、5-氨基荧光素(Acros，货号400770010)、阿霉素盐酸盐(adamas，货号41701A)、乙腈(百灵威，货号10071765)、硼氢化钠(阿拉丁，货号S108355)、四氢呋喃(天津市化学试剂供销公司，货号2287)巯基生物素(自制)、乙硫醇(麦克林，货号E809004)。
在没有特别说明的情况下，以下所述的室温均表示(25±3)℃。
本发明利用UPLC-MS(MS/MS)进行探针的动力学研究。所用到的条件包括以下内容：
质谱仪waters(UPLC-Xevo-G2-XS-ESI-Q-TOF)。液相色谱包含流动相A(H2O)，B(MeCN)和C(1体积％甲酸水溶液)。如果无特殊说明，采用A、B二组分线性梯度。柱I:ACQUITYUPLC BEH C18,
Figure BDA0002380970070000092
1.7μm,2.1mm×50mm.流速0.4mL/min,温度35℃.柱II:ACQUITY UPLCBEH C18,
Figure BDA0002380970070000093
1.7μm,2.1mm×100mm.流速0.4mL/min,温度35℃.柱III:ACQUITY UPLCprotein BEH C4,
Figure BDA0002380970070000091
1.7μm,2.1mm×50mm.流速0.4mL/min,温度35℃。ESI质谱的参数设置为正离子模式，毛细管电压3Kv,锥孔电压40V，锥孔气流50L/h、脱溶剂气流800L/h。脱溶剂温度和离子源温度分别设置400℃和100℃。检测的质荷比范围为100-1500。
实施例1：本实施例在于说明本发明的N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮化合物的合成。
其合成步骤如下：
Figure BDA0002380970070000101
实施例1-1：连接氨基酸的3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮化合物的合成。本实施例代表性的氨基酸分子为甘氨酰胺。
Figure BDA0002380970070000102
称取0.46mmol(1.0eq.)乙酸-4-溴呋喃-2-甲酯溶于10mL的体积比为1:1的四氢呋喃和0.2M磷酸钠缓冲液(pH值为7.5)形成的混合液中，0℃下加入0.55mmol(1.2eq.)N-溴代丁二酰亚胺，0℃下搅拌1h。向得到的混合物中加入0.55mmol(1.2eq.)甘胺酰胺，室温反应4h。旋干溶剂，用甲醇/二氯甲烷(v/v,1/20-1/10)柱层析梯度洗脱分离，得白色固体(2)(产率60％)。
1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ7.66(s,1H),7.53(s,1H),7.19(s,1H),5.06(s,2H),4.20(s,2H).13C NMR(101MHz,d6-DMSO)δ168.5,164.6,143.8,136.6,117.2,99.0,42.1.HRMS(ESI):C7H7N2NaBrO2,[M+Na]+计算值252.9589,实测值252.9608.
实施例1-2：连接葡萄糖的3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮化合物的合成。本实施例代表性的葡萄糖分子为葡萄糖胺。
Figure BDA0002380970070000111
称取0.46mmol(1.0eq.)乙酸-4-溴呋喃-2-甲酯溶于10mL的体积比为1:1的四氢呋喃和0.2M磷酸钠缓冲液(pH值为7.5)形成的混合液中，0℃下加入0.55mmol(1.2eq.)N-溴代丁二酰亚胺，0℃下搅拌1h。向得到的混合物中加入0.55mmol(1.2eq.)甘氨基葡萄糖，室温反应4h。旋干溶剂，用甲醇/二氯甲烷(v/v,1/8)柱层析分离，得白色固体(3)(产率50％)。
1H NMR(400MHz,D2O)δ7.50(s,1H),5.53(d,J＝8.0Hz,1H),5.39(d,J＝2.8Hz,1H),5.28(d,J＝2.8Hz,1H),4.41-4.36(m,1H),.3.92-3.91(m,1H),3.79-3.77(m,1H),3.64-3.46(m,3H).13C NMR(101MHz,D2O)δ167.2,144.8,137.3,116.3,102.0,91.9,76.1,70.6,70.3,60.7,60.4.HRMS(ESI):C11H14NaBrNO6,[M+Na]+计算值357.9902,实测值357.9907.
实施例1-3：连接炔基的3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮化合物的合成。本实施例代表性的炔基分子为炔丙基胺。
Figure BDA0002380970070000112
称取0.46mmol(1.0eq.)乙酸-4-溴呋喃-2-甲酯溶于10mL的体积比为1:1的四氢呋喃和0.2M磷酸钠缓冲液(pH值为7.5)形成的混合液中，0℃下加入0.55mmol(1.2eq.)N-溴代丁二酰亚胺，0℃下搅拌1h。向得到的混合物中加入0.55mmol(1.2eq.)炔丙胺，室温反应4h。旋干溶剂，用乙酸乙酯/石油醚(v/v,1/9)柱层析分离，得黄色固体(4)(产率52％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.15(s,1H),5.16(d,J＝2.0Hz,1H),4.99(d,J＝2.0Hz,1H),4.46(d,J＝2.4Hz,2H),2.25(t,J＝2.4Hz,1H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.3,142.8,135.8,118.5,98.6,77.4,72.6,29.5.HRMS(ESI):C8H7BrNO,[M+H]+计算值211.9711,实测值211.9712.
实施例1-4：连接生物素的3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮化合物的合成。本实施例代表性的生物素分子为生物素酰肼。
Figure BDA0002380970070000121
称取0.46mmol(1.0eq.)乙酸-4-溴呋喃-2-甲酯溶于10mL的体积比为1:1的四氢呋喃和0.2M磷酸钠缓冲液(pH值为7.5)形成的混合液中，0℃下加入0.55mmol(1.2eq.)N-溴代丁二酰亚胺，0℃下搅拌1h。向得到的混合物中加入0.55mmol(1.2eq.)生物素酰肼，室温反应4h。旋干溶剂，用甲醇/二氯甲烷(v/v,1/20-1/10)柱层析梯度洗脱分离，得黄色固体(5)(产率86％)。
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.56(s,1H),5.12(d,J＝1.6Hz,1H),5.10(d,J＝1.6Hz,1H),4.52-4.49(m,1H),4.34-4.31(m,1H),3.24-3.21(m,1H),2.94(dd,J＝12.8,4.8Hz,1H),2.73-2.68(m,1H),2.41(t,J＝7.2Hz,2H),1.79-1.64(m,4H),1.60-1.50(m,2H).13CNMR(101MHz,CD3OD)δ175.2,166.3,164.5,144.3,136.7,117.9,99.3,63.5,61.8,57.1,41.2,34.3,29.7,29.5,26.4.HRMS(ESI):C15H20BrN4O3S,[M+H]+计算值415.0439,实测值415.0451.
实施例1-5：连接荧光分子的3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮化合物的合成。本实施例代表性的荧光分子为5-氨基荧光素。
Figure BDA0002380970070000131
称取0.46mmol(1.0eq.)乙酸-4-溴呋喃-2-甲酯溶于10mL的体积比为1:1的四氢呋喃和0.2M磷酸钠缓冲液(pH值为7.5)形成的混合液中，0℃下加入0.55mmol(1.2eq.)N-溴代丁二酰亚胺，0℃下搅拌1h。向得到的混合物中加入0.55mmol(1.2eq.)5-氨基荧光素，室温反应4h。旋干溶剂，RP-HPLC分离，得红色固体(6)(产率45％)。
RP-HPLC分离条件:反向柱：C18,10μm,21.2mm X 250mm。流速，室温15mL/min。溶剂A：水，溶剂B：乙腈。0-10-20min,B:5体积％-40体积％-85体积％。(6)的保留时间在21.5min。
1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ7.93(d,J＝1.6Hz,1H),7.92(s,1H),7.73(dd,J＝8.0,1.6Hz,1H),7.40(d,J＝8.0Hz,1H),6.70-6.88(m,3H),6.66(s,1H),6.59(d,J＝2.4Hz,1H),6.57(d,J＝2.4Hz,1H),5.27(d,J＝2.0Hz,1H),5.12(d,J＝2.0Hz,1H).13C NMR(101MHz,d6-DMSO)δ168.0,164.1,160.3,152.2,144.0,137.4,135.4,134.7,129.4,128.0,125.5,123.9,116.9,113.2,109.5,102.5,101.2.HRMS(ESI):C25H15BrNO6,[M+H]+计算值504.0083,实测值504.0086.
实施例1-6：连接抗癌药物的3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮化合物的合成。本实施例代表性的抗癌药物为阿霉素。
Figure BDA0002380970070000141
称取0.46mmol(1.0eq.)乙酸-4-溴呋喃-2-甲酯溶于10mL的体积比为1:1的四氢呋喃和0.2M磷酸钠缓冲液(pH值为7.5)形成的混合液中，0℃下加入0.55mmol(1.2eq.)N-溴代丁二酰亚胺，0℃下搅拌1h。向得到的混合物中加入0.55mmol(1.2eq.)盐酸阿霉素，室温反应4h。旋干溶剂，RP-HPLC分离，得红色固体(7)(产率47％)。
RP-HPLC分离条件:反向柱：C18,10μm,21.2mm X 250mm。流速，室温15mL/min。溶剂A：水，溶剂B：乙腈。0-10-20min,B:5体积％-40体积％-85体积％。(7)的保留时间在23.0min。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ13.88(s,1H),13.15(s,1H),7.97(d,J＝7.6Hz,1H),7.76(t,J＝8.0Hz,1H),7.37(d,J＝8.4Hz,1H),7.08(s,1H),5.62(m,1H),5.33(s,1H),5.17(s,1H),4.95(d,J＝2.4Hz,1H),4.90(d,J＝2.4Hz,1H),4.76(brs,1H),4.74(s,1H),4.13-4.09(m,2H),4.06(s,3H),3.94(brs,1H),3.22(d,J＝18.8Hz,1H),3.05(brs,1H),2.95(d,J＝19.2Hz,1H),2.85-2.79(m,1H),2.40(d,J＝14.8Hz,1H),2.20-2.15(m,1H),1.71-1.67(m,2H),1.36(d,J＝6.4Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ213.5,186.9,186.6,167.0,161.0,156.1,155.5,143.5,136.3,135.8,135.3,133.5,120.7,119.8,118.5,118.2,111.5,111.4,100.6,99.8,76.8,70.0,69.6,69.0,65.4,56.7,52.6,35.4,33.9,28.0,17.3.HRMS(ESI):C32H30NaBrNO12,[M+Na]+计算值722.0849,实测值722.0894.
实施例1-7：连接对溴苯的3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮化合物的合成。本实施例代表性的化合物为对溴苯胺。
Figure BDA0002380970070000151
称取0.46mmol(1.0eq.)乙酸-4-溴呋喃-2-甲酯溶于10mL的体积比为1:1的四氢呋喃和0.2M磷酸钠缓冲液(pH值为7.5)形成的混合液中，0℃下加入0.55mmol(1.2eq.)N-溴代丁二酰亚胺，0℃下搅拌1h。向得到的混合物中加入0.55mmol(1.2eq.)对溴苯胺，室温反应4h。旋干溶剂，用乙酸乙酯/石油醚(v/v,1/9)柱层析分离，得黄色固体(8)(产率65％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.61(d,J＝8.0Hz,2H),7.29(s,1H),7.18(d,J＝8.0Hz,2H),4.96(s,1H),4.91(s,1H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.4,144.5,135.8,133.0,132.8,129.4,122.2,118.7,99.3.HRMS(ESI):C11H8Br2NO,[M+H]+计算值327.8973,实测值327.8976.
实施例2：本实施例在于制备实施例1中的N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮化合物与巯基加成反应的模型底物。
具体合成步骤如下：
实施例2-1：乙硫醇与标记分子(2)的一次共轭加成反应：
Figure BDA0002380970070000152
称取6.5mmol(1.0eq.)(2)溶于70mL水和80mL乙腈的混合溶液中，室温下加入9.8mmol(1.5eq.)乙硫醇和6.5mmol(1.0eq.)碳酸氢钠，室温搅拌1h。旋干溶剂，用甲醇/二氯甲烷(v/v,1/20)柱层析分离，得黄色油状液体(9)(产率80％)。
1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ7.24(brs,1H),7.14(brs,1H),7.12(d,J＝6.0Hz,1H),6.40(s,1H),6.12(d,J＝6.0Hz,1H),3.77(d,J＝17.2Hz,1H),3.69(d,J＝17.2Hz,1H),2.91(d,J＝14.0Hz,1H),2.82(d,J＝14.0Hz,1H),2.50-2.45(m,2H),1.10(t,J＝7.2Hz,3H).13CNMR(101MHz,d6-DMSO)δ170.9,169.3,150.4,126.0,91.3,41.2,36.9,26.7,14.8.HRMS(ESI):C9H14N2O3SNa,[M+Na]+计算值253.0623,实测值253.0611.
实施例2-2：乙硫醇与巯基一次加成产物(9)的二次共轭加成反应：
Figure BDA0002380970070000161
称取2.61mmol(1.0eq.)(9)溶于20mL水和30mL乙腈的混合溶液中，室温下加入3.91mmol(1.5eq.)乙硫醇和2.61mmol(1.0eq.)碳酸氢钠，室温搅拌30min。旋干溶剂，用甲醇/二氯甲烷(v/v,1/20)柱层析分离，得黄色油状液体(10)(产率85％)为一对非对映异构体。
1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ7.40(s,1H),7.27(s,1H),7.16(s,1H),7.14(s,1H),6.26(s,2H),3.77-3.64(m,4H),2.89-2.38(m,16H),2.12(dd,J＝7.7,13.6Hz,1H),1.82(dd,J＝8.0,13.6Hz,1H),1.16-1.09(m,12H).13C NMR(101MHz,d6-DMSO)δ173.5,172.4,171.0,170.8,89.6,89.5,42.6,42.4,41.7,40.9,40.7,40.0,39.7,26.9,26.8,24.9,24.8,15.4,15.3,15.0,14.9.HRMS(ESI):C11H20N2O3S2Na,[M+Na]+计算值315.0813,实测值315.0828.
实施例2-3：乙硫醇与巯基一次加成产物(9)的还原反应：
Figure BDA0002380970070000171
称取0.69mmol(1.0eq.)(9)溶于3mL水和6mL乙腈的混合溶液中，加入0.76mmol(1.1eq.)硼氢化钠，室温搅拌1h。旋干溶剂，用甲醇/二氯甲烷(v/v,1/9)柱层析分离，得无色透明油状液体(11)(产率85％)。
1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ8.30(t,J＝6.0Hz,1H),7.36(s,1H),7.04(s,1H),5.96(dd,J＝11.6,7.2Hz,1H),5.88(d,J＝12.0Hz,1H),5.32(d,J＝5.2Hz,1H),5.21-5.15(m,1H),3.69(d,J＝6.0Hz,2H),2.59-2.50(m,4H),1.17(t,J＝7.2Hz,3H).13C NMR(101MHz,d6-DMSO)δ170.8,165.5,147.1,121.9,66.4,41.7,37.8,25.6,14.8.HRMS(ESI):C9H16N2O3SNa,[M+Na]+计算值255.0779,实测值255.0798.
实施例2-4：乙硫醇与巯基二次加成产物(10)的还原反应：
Figure BDA0002380970070000172
称取0.96mmol(1.0eq.)(10)溶于9mL水和21mL乙腈的混合溶液中，加入1.05mmol(1.1eq.)硼氢化钠，室温搅拌1h。旋干溶剂，用甲醇/二氯甲烷(v/v,1/20-1/10)柱层析梯度洗脱分离，得白色固体(12)(产率90％)。
1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ8.19(t,J＝5.6Hz,1H),7.23(s,1H),7.04(s,1H),4.91(d,J＝5.2Hz,1H),3.79-3.77(m,1H),3.70(dd,J＝16.8,6.0Hz,1H),3.59(dd,J＝16.8,5.6Hz,1H),3.48(dd,J＝6.0,2.8Hz,1H),2.61-2.48(m,6H),1.87-1.69(m,2H),1.18(t,J＝7.2Hz,3H),1.15(t,J＝7.2Hz,3H).13C NMR(101MHz,d6-DMSO)δ172.0,170.9,67.4,44.3,41.9,38.3,37.6,25.8,24.1,14.9,14.6.HRMS(ESI):C11H22N2O3S2Na,[M+Na]+计算值317.0970,实测值317.0974.
实施例3：本实施例用于说明由实施例1制备的N-取代-3-溴5-亚甲基吡咯-2-酮类化合物能够用于蛋白质半胱氨酸的定点修饰，制备半胱氨酸特异性的稳定双修饰的蛋白质。
包括以下步骤(具体合成过程如图1)：
(1)将实施例中合成的化合物(6)(终浓度200M)与含有一个半胱氨酸的蛋白质H3-V35C(终浓度100M)在37℃混合于100mM的NaCl，20mM的pH值为7.5的HEPES缓冲液中，孵育1h。
(2)利用GE PD Minitrap脱盐柱纯化，得到蛋白质半胱氨酸选择性修饰的产物(13)。
(3)直接往前述反应体系中加入巯基生物素(终浓度700M)，37℃下孵育2h，得到蛋白质半胱氨酸双修饰的产物(14)。
(4)往体系中加入新配制的硼氢化钠溶液(终浓度3mM)，37℃下孵育40min，得到双标记的还原产物(15)。
为了进一步验证共轭标记产物的稳定性，将所得到的双标记还原产物(15)(终浓度40M)与谷胱甘肽(终浓度1mM)在37℃混合于100mM的NaCl，20mM的pH值为7.5的HEPES缓冲液中，不同时间点取样，利用SDS-PAGE跑胶检测。荧光信号通过GE Typhoon凝胶成像仪在488nm激发波长和520nm发射波长下检测。生物素信号由Western-blot，利用链霉亲和素的二抗，通过化学发光检测定量。考马斯亮蓝染色确定蛋白条带。
如图2所示，孵育72h后，巯基生物素以及荧光素信号均未发生明显强度的减弱。
因此，本发明设计的N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮能够用于蛋白质稳定双标记。
实施例4：本实施例在于说明由本发明设计合成的探针分子，除了能实现单巯基双标记修饰之外，还能实现蛋白质二硫键的插入修饰以及二硫键的双修饰，而且插入桥连产物与双巯基修饰产物的比例随着探针分子的加入当量呈线性变化。
本实施例利用生长素抑制肽片段SST作为模型底物。如图3(图3中的氨基酸缩写为本领域公知)所示的流程，SST(终浓度0.05mM)与TCEP(终浓度0.075mmol，1.5eq)在37℃混合于100mM的NaCl，20mM pH7.5HEPES缓冲液中，孵育2h，无需纯化，直接往体系中加入实施例1合成的分子(2)(1.3,3,7,9,11,13,15,20,25eq.)相同条件下孵育1h。UPLC-MS检测产物的结构，液相谱图积分阐述生成产物的比例(如图4)。
如图4所示，随着加入的标记分子含量的增加，产物由二硫键插入的结构(16)转变成半胱氨酸双标记的结构(17)，且双标记产物的含量呈线性递增。因此，本发明设计N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮能够用于蛋白质二硫键的插入修饰以及二硫键的双修饰。
实施例5：本实施例在于说明由实施例1制备的N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮化合物能够用于桥连抗体，且修饰不影响抗体的生物学功能和结构。
包括以下步骤：
(1)山羊抗人IgG的Fab(浓度0.5mg/mL)与二硫苏糖醇DTT(终浓度0.56mM,40eq.)在37℃混合于20mM的pH值为8.2的磷酸钠缓冲液中，孵育2h。
(2)PD spintrap脱盐柱纯化除去过量的小分子，nanodrop测量纯化后抗体蛋白的浓度。
(3)依据所得抗体的浓度，在体系中加入实施例1中合成的化合物(6)(终浓度0.02mM,1.4eq.)，相同条件下孵育1h。
(4)直接往体系中加入新配制的硼氢化钠溶液(终浓度3mM)，室温孵育40min。
(5)为了重建还原步骤可能造成的链内二硫键的断裂，在体系中加入脱氢抗坏血酸钠(终浓度0.14mM,14eq.)室温孵育3h。
(6)PD spintrap脱盐柱纯化除去过量的小分子。链间二硫键插入修饰的效率通过15％SDS-PAGE分析(分析结果如图5所示)。
在该实施例中，胶的上样缓冲液采用非还原体系(50mM Tris,pH值6.8,丙三醇10％(v/v),SDS 2％(w/v),溴酚蓝0.1％(w/v))。荧光信号通过GE Typhoon凝胶成像仪在488nm激发波长和520nm发射波长下检测，考马斯亮蓝染色确定蛋白条带。
图5中表明，DTT还原后，抗体之间的二硫键打开，能与加入的探针分子发生高效的桥连反应重新构建链间桥连的抗体。通过UV-Vis测量得到的荧光素桥连抗体，表明标记效率DOL为1.1(说明一分子抗体上连接了约一分子的标记分子)，证明本发明设计的探针分子能够高效的插入Fab的链间二硫键，实现桥连抗体的制备。
为了探究插入修饰后抗体的生物活性。本发明将所得的荧光素修饰的抗体作为二抗，用于检测其与癌细胞SK-BR-3表面Her2抗原的结合。本发明中所使用的乳腺癌细胞SK-BR-3，其表面的Her2抗原高度表达，能够与人IgG曲妥珠单抗特异性结合，利用识别人IgG的二抗即能实现癌细胞的检测。SK-BR-3细胞培养在含有10体积％的胎牛血清和1体积％的青霉素-链霉素的DMEM培养基中。将计过数的SK-BR-3细胞接种于24孔板(密度1.0×105个/孔)，置于37℃含有5体积％的CO2的恒温培养箱中过夜培养。过夜培养后细胞用PBS洗涤2次，4％(4g/100mL)多聚甲醛室温固定20分钟。PBS浸洗2次后，10体积％山羊血清室温封闭30分钟。清除血清，500nM的Trastuzumab室温孵育细胞30分钟，PBS浸洗2次后，加入山羊抗人AF488抗体(1:200)和上述得到的二硫键桥连的抗体Fab(1:200)继续孵育30分钟。PBS浸洗3次，DAPI(300μL,10g/mL)室温染色7分钟PBS充分洗涤、抗褪色固定剂固定，封片，激光共聚焦显微镜的油镜物镜(Nikon A1+,Nikon,Tokyo,Japan)进行拍摄观察(DAPI通道:激发波长408nm,发射波长:425-475nm),AF488通道:激发波长486nm,发射波长:500-550nm)。结果如图6中所示。
图6中表明，插入修饰后的抗体仍然保持良好的一抗结合活性，且结合效率和商业化的AF488标记的二抗相当。因此，本发明合成的N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮类化合物能够用于活性桥连抗体的制备。揭示了本发明涉及的探针分子在抗体偶联药物的制备中具有潜在的应用价值。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮类化合物，其特征在于，该化合物具有式(1)所示的结构：
Figure 909512DEST_PATH_IMAGE001
式(1)
其中，在式(1)中，
R为由R-NH2所示的伯氨基化合物氨基葡萄糖、氨基半乳糖、氨基葡萄二糖、5-氨基荧光素、4-氨基荧光素、氨基香豆素、氨基花菁素、6-氨基四甲基罗丹明、生物素酰肼、生物素-聚乙二醇-氨基、N-(2-氨基乙基)生物素酰胺、炔丙基胺、氨基-聚乙二醇-炔基、二苯并环辛炔胺、N-[（1R,8S,9s）-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基羰基]-1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷、氨基聚乙二醇环辛炔、阿霉素及其盐、甲磺酸艾瑞布林、新霉素、卡那霉素中的至少一种物质提供的R基团。
2.一种N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮类化合物，其特征在于，该化合物具有式(2)所示的结构：
Figure 317359DEST_PATH_IMAGE002
式(2)，
Figure 874243DEST_PATH_IMAGE003
式（2-1）
其中，在式(2)中，R’为由R’-NH2所示的伯氨基化合物葡萄糖胺、炔丙胺、生物素酰肼、5-氨基荧光素、阿霉素及其盐和对溴苯胺中的至少一种物质提供的R’基团，或者
R’为式（2-1）所示的基团。
3.一种制备权利要求1或2所述的N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮类化合物的方法，其特征在于，该方法包括：
（1）在溶剂存在下，将乙酸-4-溴呋喃-2-甲酯与N-溴代丁二酰胺进行第一混合，得到第一混合溶液；所述乙酸-4-溴呋喃-2-甲酯与所述N-溴代丁二酰胺的用量摩尔比为1：1-3，所述第一混合的温度为0℃；所述溶剂为四氢呋喃；
所述第一混合在pH调节剂存在下进行，且所述pH调节剂为磷酸钠缓冲液；
（2）将所述第一混合溶液与R-NH2或R’-NH2所示的伯氨基化合物进行第二混合，得到第二混合溶液；所述第二混合的温度为0℃至50℃；
其中，所述伯氨基化合物中的R与权利要求1中的R基团具有相同定义，或所述伯氨基化合物中的R’与权利要求2中的R’基团具有相同定义。
4.权利要求1或2所述的N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮类化合物在含有半胱氨酸残基的蛋白质上定点修饰半胱氨酸残基的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述定点修饰为定点单修饰和/或定点双修饰。
6.一种定点修饰含有半胱氨酸残基的蛋白质的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1或2所述的N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮类化合物与含有半胱氨酸残基的蛋白质进行一次共轭加成反应，所述一次共轭加成反应的条件为：反应温度为20oC至45oC，反应时间为5min至150min，pH值为7.0-8.5。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，该方法还包括：将所述一次共轭加成反应后得到的产物与含有巯基的分子进行二次共轭加成反应，所述二次共轭加成反应的条件为：反应温度为20oC至45oC，反应时间为5min至150min，pH值为7.0-8.5。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，该方法还包括：将权利要求6所述一次共轭加成反应后得到的产物和/或权利要求7所述二次共轭加成反应后得到的产物与硼氢化钠接触以进行还原反应，所述还原反应的条件为：反应温度为20oC至45oC，反应时间为10min至120min。
9.权利要求1或2所述的N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮类化合物在含有二硫键的蛋白质上定点修饰二硫键的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述定点修饰为定点插入修饰和/或定点双修饰。
11.一种定点修饰含有二硫键的蛋白质的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1或2所述的N-取代-3-溴-5-亚甲基吡咯-2-酮类化合物与含有二硫键的蛋白质进行接触反应，所述接触反应的条件为：反应温度为20oC至45oC，反应时间为5min至300min，pH值为7.0-8.5。
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