CN113683659B - 一类蛋白质赖氨酸探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一类蛋白质赖氨酸探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，提供了一种形成蛋白质赖氨酸探针的方法，所述的方法是探针反应，包括以下步骤：S1，在弱酸性水溶液环境中，实现无自由基作用下巯基‑炔偶联反应，形成炔丙基锍盐；S2，在弱碱性条件下，通过炔丙基锍盐活化4‑戊炔酸羧基，形成烯酯；S3，通过USP7蛋白的共价配体导向，烯酯与USP7蛋白的赖氨酸残基上的氨基发生反应，将炔修饰转移到蛋白上；S4，炔与N3‑FAM发生点击化学反应，产生绿色荧光。本发明适用于蛋白质赖氨酸残基的化学修饰，通过点击化学在短时间内实现反应的快速进行。本发明使用的试剂毒性较小、成本低廉，适合实验室和工业化生产，并适合实验室和工业化蛋白质组学研究应用。

Description

一类蛋白质赖氨酸探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于化学生物学领域，涉及一类蛋白质赖氨酸探针及其应用，还包括一类结合胺酯交换和肽配体导向作用、选择性修饰蛋白质赖氨酸残基的化学方法。
背景技术
赖氨酸(Lysine)是一种碱性氨基酸，侧链氨基极不稳定，具有很强的亲核活性，可以与多种基团发生亲核反应，从而发生甲基化、乙酰化等多种翻译后修饰(PTMs)。除了已修饰的赖氨酸残基，那些未修饰的赖氨酸残基被发现位于许多功能蛋白的活性位点附近，常呈现良好的可生物正交活性。随着生物正交反应技术的发展，蛋白上赖氨酸的选择性修饰也成为了目前一种蛋白修饰策略，特别是锚定一些特定官能团在赖氨酸残基上，这些官能团将赋予靶蛋白新功能或标记，以区别于复杂生物体系或作为药物发现的新工具。NHS酯(N-羟基琥珀酰亚胺酯)是广泛用于赖氨酸与其他官能团偶联的活性基团分子，但是其水解倾向、修饰速度慢、化学选择性差等问题限制了其细胞蛋白水平的应用。所以，科学家们需要不断开发新型的赖氨酸修饰试剂。
锍盐是带一个正电荷的正四价S化合物，一般可以通过卤代烃、三氟甲磺酸酯或碘鎓盐、氧鎓盐等对硫醚的烃基化反应制得。S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，一种生物锍盐化合物，是人体中生物甲基化反应(DNA、RNA、蛋白质、脂质和其他生物小分子等)最重要的甲基供体。综上，锍盐具有亲核取代反应的化学性质，通过调节锍盐中心取代基的电正性，可以明显改变其亲核取代反应活性，以实现取代基与赖氨酸氨基的一系列生物正交反应试剂。因此，锍盐反应中心在理论上是一种可断裂的亲电基团，并已经被应用于蛋白上赖氨酸氨基的选择性修饰：在多肽SAH-p53配体序列的导向作用下，炔丙基锍盐侧链被拉近与MDM4蛋白上赖氨酸的距离，实现了温和条件下蛋白上赖氨酸位点与肽配体的共价结合。但是炔丙基锍盐主要以半胱氨酸的反应活性为主而表现出较差的赖氨酸选择性，因此如何提升赖氨酸选择性是本领域的重要课题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种赖氨酸蛋白质化学修饰的方法，以实现蛋白质赖氨酸残基的高效选择性化学修饰。
为了解决上述技术问题，本发明通过炔丙基锍盐活化4-戊炔酸羧基形成的烯酯，进一步在弱碱性条件下亲核取代氨基完成“胺酯交换”形成新的酰胺键从而实现赖氨酸氨基的选择性修饰，并在此基础上实现本发明。
本发明提供了一种形成蛋白质赖氨酸探针的方法，所述的方法是探针反应，包括以下步骤：
S1，在弱酸性水溶液环境中，实现无自由基作用下巯基-炔偶联反应，形成炔丙基锍盐；
S2，在弱碱性条件下，通过炔丙基锍盐活化4-戊炔酸羧基，形成烯酯；
S3，通过USP7蛋白的共价配体导向，烯酯与去泛素化酶7(USP7)蛋白的赖氨酸残基上的氨基发生反应，将炔修饰转移到蛋白上；
S4，炔与N3-FAM发生点击化学反应，产生绿色荧光。
优选的，探针反应的溶剂为水或PBS缓冲溶液，例如使用市售的PBS缓冲液干粉2L，索莱宝。
优选的，探针反应的时间为1小时至5小时。
优选的，所述的弱酸性水溶液，是指其pH＝6-7。
优选的，所述的弱碱性条件下是指pH＝7-10。例如，pH＝7.5，7.8，8.0，8.3，8.5，9.0，9.5，等等。
优选的，探针反应的反应温度为35.8-38.5摄氏度。例如，36.0-37.5摄氏度，在本发明的一个优选实施例中，使用了37摄氏度。
优选的，所述的探针反应中使用催化剂，使用无毒的有机化合物或金属有机化合物为催化剂。
优选的，探针反应的反应温度为37摄氏度。
优选的，所述的炔丙基锍盐是5.0当量的溴丙炔。
优选的，可以使用1％的甲酸或者5％N,N-二异丙基乙胺作为催化剂。
优选的，USP7邻近赖氨酸残基的距离能达到距离为
本发明还提供了一种蛋白质赖氨酸探针，在赖氨酸残基段连接酰胺键。
该赖氨酸探针可以通过上述方法制备，或者其他常规方法制备。
使用该方法获得赖氨酸探针，可以应用于化学蛋白质组学研究。例如，所述的赖氨酸探针用于检测赖氨酸的存在和/或含量。
具体而言，本发明提供了一类蛋白质赖氨酸探针及其应用，其中蛋白质赖氨酸探针的反应条件具有以下特点：
1)探针反应通过炔丙基锍盐活化4-戊炔酸羧基形成的烯酯，进一步在弱碱性条件下亲核取代氨基完成“胺酯交换”形成的新的酰胺键；在本发明的一个优选实施例中，所述的弱碱性条件为pH 8.0。
2)所修饰的为蛋白质赖氨酸残基。
3)反应溶剂为水溶液生理条件或者PBS缓冲溶液，容许的pH范围为7至10；
4)所需的反应时间为1小时至5小时，反应温度为37摄氏度。
优选的，所述的炔丙基锍盐是溴丙炔。
所述的探针反应中，通过炔丙基锍盐活化的步骤如图5所示。其中，所述的化学修饰位点为蛋白质赖氨酸残基。所述的点击化学反应，其反应特征如图7所示。
进一步的，所述的反应溶剂为水或PBS缓冲溶液。
本发明公开了一类可用于蛋白质赖氨酸残基化学修饰的探针及其应用。主要通过结合胺酯交换和肽配体导向作用，选择性修饰去泛素化酶7(USP7)邻近赖氨酸残基。本发明使用无毒的有机化合物或金属有机化合物为催化剂，使用的是典型的点击化学方法，同时反应体系为PBS缓冲溶液，适合实验室和工业化蛋白质组学研究应用。和现有技术相比，本发明的技术进步是显著的：
1.本发明适用于蛋白质赖氨酸残基的化学修饰，通过点击化学在短时间内实现反应的快速进行。
2.本发明使用的试剂毒性较小、成本低廉，适合实验室和工业化生产，并适合实验室和工业化蛋白质组学研究应用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是大肠杆菌表达USP7蛋白及其突变体蛋白电泳图。
图2是USP7三种蛋白以及其他蛋白与USP7探针反应的荧光显色蛋白胶图。
其中，左图为普通电泳图，右图为荧光检测图。右图中条带越浅表示荧光越强。
图3是USP7三种蛋白和不同当量的2号探针反应的荧光显色蛋白胶图。
其中，左图为荧光检测图，条带越浅表示荧光越强。右图为普通电泳图。
图4是USP7-wt蛋白被NHS或IAA封闭后与探针反应的荧光显色蛋白胶图。
其中，左图为荧光检测图，条带越浅表示荧光越强。右图为普通电泳图。
图5是炔丙基锍盐活化反应示意图。
其中，通过炔丙基锍盐活化4-戊炔酸羧基形成的烯酯。
图6是烯酯与蛋白上的氨基反应示意图。
其中，在USP7蛋白的共价配体导向作用下，探针与蛋白的赖氨酸空间位置邻近，烯酯与氨基反应后将炔转移到蛋白上。
图7是点击化学反应示意图。
其中，蛋白上的炔与N3-FAM发生点击化学反应，使蛋白产生绿色荧光。
图8是探针修饰的反应总路线图。
具体实施方式
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例1赖氨酸探针的合成
(1)称取Rink amide MBHA树脂于接肽管中，加入二氯甲烷(DCM)，鼓氮气溶胀10min。加入50％(v/v)吗啡啉的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，鼓氮气30min，脱去Fmoc保护基团，并重复1次。用DMF和DCM交替洗涤树脂之后，将配好的Fmoc-AA-OH(5eq,DMF)溶液，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，5eq，DMF)溶液，N,N二异丙基乙胺(DIPEA，10eq)混匀后加入树脂中鼓氮气2h。
(2)加入50％(v/v)吗啡啉的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，鼓氮气30min，脱去Fmoc保护基团，并重复一次。用DMF和DCM交替洗涤树脂，按上述接氨基酸至多肽合成完毕。
(3)用三氟乙酸将多肽从树脂上剪切下来，溶于50％乙腈中，加入锍盐A(例如5eq溴丙炔)溶液，再加入1％甲酸试剂，室温摇床反应12个小时，形成炔丙基锍盐多肽，通过HPLC纯化得到纯的锍盐多肽。
(4)将纯的锍盐多肽溶于50％乙腈中，加入4-戊炔酸(10eq)和5％DIPEA试剂室温静置反应3-4小时，通过HPLC纯化后得到该赖氨酸探针。
实施例2表达USP7的蛋白和突变体蛋白
用大肠杆菌的感受态细胞表达USP7的蛋白和突变体蛋白，提取蛋白后纯化蛋白，跑胶观察纯化结果，结果如图1所示，三种蛋白的表达量都很高，并且纯化后的纯度也比较好。突变体蛋白在洗脱液1中的蛋白也能够捕获。
实施例3USP7蛋白与探针反应特异性
将包括USP7野生型、USP7突变型蛋白、溶菌酶、牛乳清蛋白BSA、SND等多种不同的蛋白与探针反应，每个泳道的蛋白量控制在10μM左右，探针的浓度控制在5个当量左右，在PBS缓冲溶液中反应，放置在37度水浴锅中1-5个小时。
跑胶后观察荧光的分布和强度。结果如图2所示，多种蛋白同一条件同步反应，并且不同蛋白的当量均在10μM左右，但是检测荧光后发现只有USP7蛋白(包括野生型和突变型)处有荧光。
这说明，本发明的探针与蛋白的反应的特异性好。
实施例4蛋白探针反应的浓度依赖性
USP7三种蛋白分别与0.5、1.0、2.0、5.0当量的探针进行反应，检测蛋白含量和荧光强度之间的关系。结果如图3所示，在3种蛋白表达量基本相同的情况下，可以看到荧光信号强度随着探针当量的增加逐步加强，具有明显的线性递增趋势。
这说明，本发明的探针不仅能够与蛋白反应，而且荧光反应信号与探针的数量具有浓度依赖性。
实施例5探针与赖氨酸残基位点作用
为了确定探针与蛋白的反应位点，将USP7-wt蛋白在与探针反应之前分别用浓度为0、10、50、100、150、200μM的NHS(封闭赖氨酸)或IAA(封闭半胱氨酸)封闭，再与探针反应。结果如图4所示，在蛋白含量基本相当的情况下，IAA封闭后蛋白在与探针反应与IAA浓度没有差异关系，但是与NHS浓度有明显的浓度依赖关系，尤其是当NHS达到150μM)以上时，荧光强度明显变弱。
本实验结果表明，探针主要是与赖氨酸的残基进行反应的，该探针反应的反应条件更加温和且安全，反应的特异性更强，反应效率更高，反应毒性更小。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种形成蛋白质赖氨酸探针的方法，其特征在于，所述的方法是探针反应，包括以下步骤：
S1，在弱酸性水溶液环境中，实现无自由基作用下巯基-炔偶联反应，形成炔丙基锍盐多肽；弱酸性水溶液，是指其pH=6-7；
S2，在弱碱性条件下，通过炔丙基锍盐多肽活化4-戊炔酸羧基，形成烯酯；弱碱性条件下是指pH=7-10；
S3，通过USP7蛋白的共价配体导向，步骤S2所得的烯酯与USP7蛋白的赖氨酸残基上的氨基发生反应，将炔修饰转移到蛋白上；
S4，炔与N3-FAM发生点击化学反应，产生绿色荧光；
所述的炔丙基锍盐多肽的结构如下：
。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，探针反应的溶剂为水或PBS缓冲溶液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，探针反应的时间为1小时至5小时。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的弱碱性条件下是指pH=8.0。
5.如权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于，探针反应的反应温度为35.8-38.5摄氏度。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，探针反应的反应温度为37摄氏度。
7.一种蛋白质赖氨酸探针，其特征在于，在赖氨酸残基段连接酰胺键，通过权利要求1-4中任意一项所述的方法制备。
8.如权利要求7所述的蛋白质赖氨酸探针，其特征在于，所述的探针反应含有荧光基团。
9.如权利要求8所述的蛋白质赖氨酸探针，其特征在于，所述的探针反应中的荧光基团为FAM。
10.如权利要求7所述的蛋白质赖氨酸探针，其特征在于，所述的赖氨酸是指去泛素化酶7邻近位置的赖氨酸。
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