ES2890676T3 - Procedimiento para la producción de D-arginil-2,6-dimetil-L-tirosil-L-lisil-L-fenilalaninamida - Google Patents

Procedimiento para la producción de D-arginil-2,6-dimetil-L-tirosil-L-lisil-L-fenilalaninamida Download PDF

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Abstract

Un procedimiento en fase líquida para la producción de H-D-Arg-(2,6-Dimetil)Tyr-Lys-Phe-NH2 de fórmula (I), en forma de la sal de ácido trifluoroacético, **(Ver fórmula)** que comprende las siguientes etapas: - acoplar el compuesto (II) H-Phe-NH2: **(Ver fórmula)** con el compuesto (III) Z-Lys(Boc)-OH: **(Ver fórmula)** para obtener un compuesto de fórmula (IV), Z-Lys(Boc)-Phe-NH2 **(Ver fórmula)** - hacer reaccionar el compuesto (IV) con hidrógeno y ácido metanosulfónico (V) MeSO3H (V) en presencia de un catalizador para obtener la sal de amina libre (VI) MeSO3H.H-Lys(Boc)-Phe-NH2: - hacer reaccionar la sal (VI) con el aminoácido protegido Z-Dmt(Boc)-OH (VII) **(Ver fórmula)** para obtener el tripéptido protegido Z-Dmt(Boc)-Lys(Boc)-Phe-NH2 (VIII): **(Ver fórmula)** - tratar el compuesto (VIII) con hidrógeno y ácido metanosulfónico (V) para obtener la sal correspondiente MeSO3.H- Dmt(Boc)-Lys(Boc)-Phe-NH2 (IX): **(Ver fórmula)** - acoplar la sal ácida (IX) con Z-D-Arg-ONa (X) **(Ver fórmula)** para formar el tetrapéptido protegido Boc-D-Arg-Dmt(Boc)-Lys(Boc)-Phe-NH2 (XI): **(Ver fórmula)** - desproteger el compuesto (XI) para obtener el tetrapéptido H-D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2 (I) y además formar la sal con ácido trifluoroacético en disolventes.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento para la producción de D-arginil-2,6-dimetil-L-tirosil-L-lisil-L-fenilalaninamida
Campo técnico
La invención se refiere a un procedimiento para la síntesis en fase de solución de D-Arginil-2,6-dimetil-L-tirosil-L-lisil-L-fenilalaninamida (abreviado HD-Arg-(2,6-Dimetil)Tyr-L-Lys-L-Phe-NH2, código de desarrollo SS-31, MTP-131, RX-31) de Fórmula (I), un principio activo desarrollado por Stealth BioTherapeutics bajo las marcas de fármacos en investigación Bendavia® y Ocuvia®, tanto para enfermedades comunes como raras, que incluye una terapia dirigida a las mitocondrias para la lesión por isquemia-reperfusión.
Figure imgf000002_0001
Antecedentes
El producto pertenece a la clase de los llamados "péptidos de Szeto-Schiller". Los péptidos Szeto-Sciller o "péptidos SS" son péptidos pequeños, aromático-catiónicos, solubles en agua y muy polares, tal como los descritos en los documentos US 6703483 y US 7576061, que pueden penetrar fácilmente las membranas celulares. Los péptidos aromático-catiónicos incluyen un mínimo de dos aminoácidos, y preferiblemente incluyen un mínimo de cuatro aminoácidos, unidos covalentemente por enlaces peptídicos. El número máximo de aminoácidos es de aproximadamente veinte aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos. Como se describe en el documento EP 2012/2436390, de manera óptima, el número de aminoácidos presentes en los péptidos SS es cuatro.
Bendavia® se está ensayando para el tratamiento de la lesión por isquemia-reperfusión en pacientes con infarto agudo de miocardio (IAM), para el tratamiento de la insuficiencia renal aguda (IRA) y la disfunción microvascular renal en la hipertensión, para el tratamiento de la disfunción del músculo esquelético, para el tratamiento de la miopatía mitocondrial y para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca crónica. Se están realizando ensayos para evaluar el potencial de Ocuvia para tratar la Neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON) una enfermedad hereditaria devastadora que causa ceguera repentina, a menudo en adultos jóvenes.
Las mitocondrias son la fuente de energía de las células, responsables de más de 90% de la energía que nuestros cuerpos necesitan para mantener la vida y apoyar el crecimiento. La energía de las mitocondrias mantiene una fisiología saludable y previene enfermedades. En muchas enfermedades comunes y raras, las mitocondrias disfuncionales son un componente clave de la progresión de la enfermedad.
La D-Arginil-2,6-dimetil-L-tirosil-L-lisil-L-fenilalaninamida es un péptido permeable a las células y dirigido a las mitocondrias que mostró actividad antioxidante y se concentraba en la membrana mitocondrial interna. El compuesto (<1 nM) reducía significativamente las especies de oxígeno reactivo intracelular, aumentaba el potencial mitocondrial y prevenía la apoptosis inducida por tBHP en las líneas celulares neuronales tanto N2A como SH-SY5Y. En ratas, el tratamiento intraperitoneal (1 y 3 mg/kg) 1 día antes de obstrucción ureteral unilateral y todos los días a partir de entonces durante 14 días disminuía significativamente el daño tubular, la infiltración de macrófagos y la fibrosis intersticial. El compuesto (3 mg/kg i.p. una vez al día durante 2 semanas) también prevenía la apoptosis y la reducción de insulina en islotes pancreáticos de ratón causada por estreptozotocina.
Estudios adicionales realizados en un modelo de ratón G93A de esclerosis lateral amiotrófica (ELA) demostraron que el compuesto (5 mg/kg/día i.p. comenzando a los 30 días de edad) conducía a un retraso significativo en el inicio de la enfermedad. Potencialmente útil para el tratamiento de la ELA y puede ser beneficioso en el tratamiento del envejecimiento y las enfermedades asociadas con el estrés oxidativo.
En los últimos años, el péptido H-D-Arg-(2,6-Dimetil)Tyr-L-Lys-L-Phe-NH2, que se muestra en la Fig. 1, y su actividad terapéutica se han descrito y reivindicado en varias solicitudes de patente.
Los documentos EP 2436390, US 20110245182 y US 20110245183 reivindican composiciones anestésicas tópicas para aplicación a la piel para el tratamiento del dolor o agentes anti-envejecimiento de la piel, respectivamente, que comprenden péptidos de Szeto-Schiller; se reivindica específicamente el SS-31 como principio activo. La secuencia de síntesis en fase sólida se indica como el procedimiento de preparación preferido.
El documento US 7718620 reivindica un procedimiento para tratar o prevenir la lesión por isquemia-reperfusión del riñón en un mamífero mediante la administración de una cantidad eficaz de un péptido aromático-catiónico. Se reivindica específicamente el SS-31 como principio activo.
El documento WO2005/001023 describe un método genérico y complejos de vehículos para administrar moléculas a las células que comprenden una molécula y un péptido catiónico aromático de tipo D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2. El tetrapéptido SS-31 se reivindica específicamente como producto útil para el procedimiento en la reivindicación 18.
Los documentos WO2012/174117 y WO2014/210056 reivindican composiciones terapéuticas basadas en péptidos SS y el péptido aromático-catiónico D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2 como agente activo.
Los documentos WO 2013/086020, WO 2004/070054 y WO 2005/072295 proporcionan procedimientos para prevenir la transición de permeabilidad mitocondrial y reducir el daño oxidativo en un mamífero, un órgano extraído o una célula que lo necesite y específicamente reivindica el procedimiento en donde el péptido no tiene actividad agonista del receptor opioide mu, es decir, D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2.
El documento WO 2009/108695 describe un procedimiento para proteger un riñón de una lesión renal que puede estar asociada con un flujo sanguíneo reducido o bloqueado en el riñón del sujeto o la exposición a un agente nefrotóxico, tal como un tinte de radiocontraste. Los procedimientos incluyen administrar al sujeto una cantidad eficaz de un péptido aromático-catiónico a un sujeto que lo necesite y uno de los péptidos seleccionados es D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2.
El documento US 6703483 describe un procedimiento detallado para la preparación de nuevos análogos de DALDA [H-Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2], en concreto H-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2 utilizando las técnicas en fase sólida y resina de p-metilbencidrilamina y protocolos que han sido ampliamente utilizados por el laboratorio de los autores de la invención.
La mayoría de los procedimientos de la técnica anterior para preparar el compuesto comprenden típicamente la síntesis de péptidos en fase sólida realizada convencionalmente con purificación adicional por cromatografía con el fin de obtener la pureza requerida para uso terapéutico.
Es bien sabido que la síntesis en fase sólida seguida de purificación cromatográfica consume mucho tiempo, es muy cara y muy difícil de cambiar de escala a escala industrial, por lo que es obvia la necesidad de desarrollar un procedimiento para la producción a gran escala. El compuesto se aísla como sal de ácido orgánico, como acetato o trifluoroacetato.
Reddy et al., Adv. Exp. Med. Biol., 2009, 611, 473 describen en general la síntesis en fase líquida de péptidos antioxidantes de la Figura 1 y otros similares (SS-02, SS-20), que implican grupos protectores de cadena lateral usados de manera rutinaria para unidades estructurales de aminoácidos. El grupo guanidina se protegía con NO2 y el £-NH2 de Lys se protegía mediante Cbz o 2-Cl-Cbz. Estos péptidos se sintetizaron usando química de Boc/Cbz y acoplamiento con el reactivo BOP. Comenzando con el resto de Lys C-terminal protegido como H-Lys(2-Cl-Cbz)-NH2, (preparado a partir del Boc-Lys(2-Cl-Cbz)-OH disponible comercialmente en dos etapas por amidación con NH4HCO3 en presencia de DCC/HOBt siguiendo un procedimiento de la bibliografía [Ueyama et al., Biopolymers, 1992, 32, 1535, PubMed: 1457730], seguido de exposición a TFA). La eliminación selectiva del 2-Cl-Cbz en presencia del grupo NO2 se realizó por hidrogenolisis de transferencia catalítica (CTH) [Gowda et al., Lett. Pept. Sci., 2002, 9, 153].
Un procedimiento por etapas mediante síntesis de péptidos en solución convencional para la preparación de un potente agonista de p [Dmt]DALDA y su conversión en un potente antagonista de ó H-Dmt-Tic-Phe-Lys(Z)-OH por sustitución de D-Arg por Tic para mejorar la actividad agonista de opioide ó se describe en Balboni et al., J. Med. Chem., 2005, 48, 5608]. Un procedimiento sintético general para un tetrapéptido similar ([Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2 se describe en Ballet et al., J. Med. Chem. 2011, 54, 2467].
Se prepararon tetrapéptidos análogos de DALDA similares mediante la técnica manual en fase sólida utilizando protección Boc para el grupo a-amino y DIC/HOBt o HBTU/DIEA como agente de acoplamiento [Berezowska et al., J. Med. Chem., 2009, 52, 6941; Olma et al., Acta Biochim. Polonica, 2001,48, 4, 1121; Schiller et al., Eur. J. Med. Chem., 2000, 35, 895.
A pesar del alto rendimiento general en el enfoque de fase sólida, tiene varios inconvenientes para el procedimiento de cambio de escala, tales como:
a. uso del fluoruro de hidrógeno altamente tóxico y corrosivo para la escisión del péptido de la resina,
b. demostró ser necesaria una carga baja (0,3-0,35 mmol/g de resina) para el éxito de la etapa final, y
c. uso de cantidades excesivas de reactivos (3 veces DIC, 2,4 veces HOBt, etc.) en cada etapa [Ryakhovsky et al., Beilstein J. Org. Chem., 2008, 4 (39), 1, doi: 10.376/bjoc.4.39]
Resumen
La invención se refiere a un procedimiento más eficaz que evita la síntesis en fase sólida o la purificación cromatográfica, más adecuado para la producción a gran escala. El procedimiento de la invención se describe en el esquema A.
Se utilizan las siguientes abreviaturas:
Dmt = 2,6-dimetiltirosina; Z = benciloxicarbonilo; MeSO3H = ácido metanosulfónico; Boc = terc-butiloxicarbonilo; NMM = N-metilmorfolina; TBTU = tetrafluoroborato de N,N,N',N'-tetrametil-O-(benzotriazol-1-il)uronio; DMF = dimetilformamida; TFA = ácido trifluoroacético.
El esquema A muestra que el procedimiento para la síntesis en fase de solución del péptido de Fórmula 1 era por ensamblaje de la cadena principal del tetrapéptido usando el grupo O-bencilo (Bzl) y el grupo benciloxicarbonilo (Z) respectivamente, como protección temporal para los extremos N de los aminoácidos (Esquema Figura 2), seguido de una hidrogenolisis catalítica final. El producto final se aísla como sal de ácido orgánico, por ejemplo, sal de ácido acético.
H-Phe-NH Z-Lys(Boc)-OH
Figure imgf000004_0001
Esquema A
Este procedimiento es una mejora notable con respecto al estado de la técnica y sus ventajas se pueden resumir de la siguiente manera:
• La síntesis se realiza en fase líquida permitiendo el cambio de escala a escala industrial sin necesidad de equipo especial;
• La selección del grupo protector en las unidades estructurales permite una síntesis sencilla con una desprotección muy simple en cada etapa y minimiza la formación de subproducto no deseado;
• Cada compuesto intermedio se puede cristalizar permitiendo la eliminación de impurezas que no se transfieren a la siguiente etapa;
• La pureza de cada compuesto intermedio es muy alta y generalmente cercana a 99%.
Descripción detallada
La presente invención proporciona, en un primer aspecto, un procedimiento novedoso y eficaz que proporciona una sal de SS-31, especialmente la sal de ácido acético, que es conveniente para la escala industrial y proporciona el producto deseado con buenos rendimientos. En particular, los autores de la invención encontraron que la sal de acetato de SS-31 se puede obtener ventajosamente con un procedimiento, en el que la etapa de desprotección global es la etapa n-1 del procedimiento.
En consecuencia, es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para preparar H-D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2 de fórmula (I) como la sal del ácido trifluoroacético
Figure imgf000005_0001
que comprende las etapas de:
- acoplar el compuesto (II) H-Phe-NH2:
Figure imgf000005_0002
con el compuesto (III) Z-Lys (Boc)-OH:
Figure imgf000005_0003
para obtener un compuesto de fórmula (IV), Z-Lys(Boc)-Phe-NH2:
Figure imgf000005_0004
y
- hacer reaccionar el compuesto (IV) con hidrógeno y ácido metanosulfónico (V)
MeSO3H (V)
en presencia de un catalizador para obtener la sal de amina libre (VI) MeSO3H.H-Lys(Boc)-Phe-NH2:
Figure imgf000006_0001
para obtener el tripéptido protegido Z-Dmt(Boc)-Lys(Boc)-Phe-NH2 (VIII):
Figure imgf000006_0002
que se trata con hidrógeno y ácido metanosulfónico (V) para obtener la sal correspondiente MeSO3.H-Dmt(Boc)-Lys(Boc)-Phe-NH2 (IX):
Figure imgf000006_0003
La sal ácida (IX) se acopla con Z-D-Arg-ONa (X)
Figure imgf000006_0004
para formar el tetrapéptido protegido Boc-D-Arg-Dmt(Boc)-Lys(Boc)-Phe-NH2 (XI):
Figure imgf000007_0001
El tetrapéptido H-D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2 (I) se obtiene por desprotección y formación adicional de la sal con ácido trifluoroacético en disolventes de (XI). La desprotección se realiza por acidólisis simple de los tres grupos Boc sin el uso de catalizadores de Pd que pueden producir la presencia de Pd en el compuesto final.
La misma acidólisis se puede realizar con otros ácidos tales como HCl o HBr, dando lugar a las correspondientes sales. Este procedimiento permite obtener el péptido como un sólido que se puede utilizar en la formulación como tal o se puede convertir en cualquier otra sal si se requiere. La pureza del compuesto final bruto así obtenido es de 97% sin ninguna cristalización adicional y puede mejorarse fácilmente hasta 99% mediante la selección de la mezcla de cristalización apropiada.
En una realización del procedimiento, el acoplamiento entre (II) y (III) se realiza en presencia de tetrafluoroborato de N,N,N',N'-tetrametil-O-(benzotriazol-1-il)uranio (conocido como TBTU) y una base orgánica perteneciente a la clase de aminas terciarias tales como NMM, trietilamina y diisopropilamina, así como disolventes polares tales como NMM, DMF, acetonitrilo, tetrahidrofurano (THF), 2-metil-tetrahidrofurano (2-Me-THF), etc.
En una realización, el acoplamiento entre (II) y (III) se realiza en un intervalo de temperatura entre 0°C y 60°C, preferiblemente entre 20°C y 30°C.
La hidrogenación de (IV) se puede llevar a cabo con diversas técnicas tales como hidrogenación catalítica homogénea, hidrogenación catalítica heterogénea o hidrogenación por transferencia catalítica. En una realización particular, la hidrogenación se realiza con hidrógeno gaseoso y Pd sobre carbono como catalizador.
En otra realización, la formación de la sal metanosulfónica (VI) se obtiene con ácido metanosulfónico (V) en dimetilformamida como disolvente y se cristaliza en el mismo disolvente. Otros disolventes adecuados para la cristalización son THF, acetato de etilo y acetonitrilo.
En otra realización, la formación de la sal metanosulfónica (IX) se obtiene en cloruro de metileno como disolvente y se cristaliza en el mismo disolvente. Otros disolventes para la cristalización son THF, acetato de etilo y acetonitrilo.
En una realización del procedimiento, la reacción de acoplamiento entre el compuesto (VI) y el compuesto (VII) se realiza en presencia de tetrafluoroborato de N,N,N',N'-tetrametil-O-(benzotriazol-1-il)uranio (TBTU) y una base orgánica perteneciente a la clase de aminas terciarias tales como NMM, trietilamina y diisopropilamina, así como disolventes polares tales como NMM, DMF, acetonitrilo, THF, 2-Me-THF, etc.
En otra realización, la hidrogenación de (VIII) se puede realizar con diversas técnicas como la hidrogenación catalítica homogénea, hidrogenación catalítica heterogénea o hidrogenación por transferencia catalítica. En una realización particular, la hidrogenación se realiza con hidrógeno gaseoso y Pd sobre carbono como catalizador.
En otra realización, la formación de la sal metanosulfónica (IX) se obtiene con ácido metanosulfónico (V) en dimetilformamida como disolvente y se cristaliza en el mismo disolvente. Otros disolventes para la cristalización son THF, acetato de etilo y acetonitrilo.
En una realización del procedimiento, la reacción de acoplamiento entre el compuesto (IX) y el compuesto (X) se realiza en presencia de tetrafluoroborato de N,N,N',N'-tetrametil-O-(benzotriazol-1-il)uranio (conocido como TBTU) y una base orgánica perteneciente a la clase de aminas terciarias tales como NMM, trietilamina y diisopropilamina, así como disolventes polares tales como NMM, DMF, acetonitrilo, THF, 2-Me-THF, etc. En una realización, la desprotección de (XI) se realiza con ácido trifluoroacético y disolventes. Los disolventes más adecuados son heptanos, IPA, etc.
En un aspecto del procedimiento, los compuestos intermedios (IV), (VI), (VIII), (IX) y (XI) se aíslan y cristalizan. Cuando se aíslan los compuestos intermedios, su pureza supera el 98%.
En un aspecto preferido, la cristalización del compuesto intermedio (VIII), Z-Dmt(Boc)-Lys(Boc)-Phe-NH2 es capaz de evitar la transferencia de una impureza crítica a las siguientes etapas del procedimiento.
En un aspecto preferido, la impureza crítica es el compuesto (XII), H-D-Dmt(Boc)-Lys(Boc)-Phe-NH2.
Figure imgf000008_0001
En otro aspecto preferido el procedimiento de cristalización del tetrapéptido protegido (XI), Boc-D-Arg-Dmt(Boc)-Lys(Boc)-Phe-NH2 permite obtener el producto en forma de un sólido con una pureza cercana a 99%.
En otro aspecto preferido la desprotección final se realiza por reacción con ácido trifluoroacético y permite obtener el producto final en forma sólida cristalina de la sal de trifluoroacetato tras cristalización simple sin ninguna necesidad de purificación por HPLC ni de ninguna liofilización, que son procedimientos de purificación y aislamiento extremadamente caros pero comúnmente utilizados en la fabricación de péptidos como fármacos.
En un aspecto preferido, el procedimiento permite obtener el péptido como un sólido que puede usarse en la formulación como tal o puede convertirse fácilmente en cualquier otra sal si se requiere. La pureza del compuesto final así obtenido es de 99% y cada impureza es de aprox. 0,2% o menos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Preparación de Z-Lys(Boc)-Phe-NH2 (IV)
Se cargan 100 ml de DMF, 9,5 g de H-Phe-NH2, 20 g de Z-Lys(Boc)-OH y 10,6 g de N-metilmorfolina en un matraz. Se agita la mezcla a 20-22°C durante 15 min. Se añaden 18,6 g de TBTU y se agita la mezcla a temperatura ambiente durante la noche. Se añaden 200 ml de metanol y 250 ml de agua a la mezcla y se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 1 h. Se filtra la mezcla para aislar el producto sólido. Se transfiere la torta de filtración a un matraz que contiene 200 ml de metanol. Se calienta la mezcla a reflujo durante 1 hora y luego se enfría a temperatura ambiente. Se filtra la mezcla para aislar el producto sólido. Se seca la torta de filtración a 35-40°C y a vacío para obtener 20,5 g del producto sólido blanco.
Ejemplo 2: Preparación de MeSO3H.H-Lys(Boc)-Phe-NH2 (VI)
Se cargan 100 ml de DMF, 12,5 g de Pd/C al 5% (60% de contenido de agua), 10 g de Z-Lys(Boc)-Phe-NH2 y 1,83 g de ácido metanosulfónico en un matraz. Se cambia la atmósfera del matraz con hidrógeno. Se agita la mezcla a 20-25°C y bajo 1 atm de hidrógeno durante 3 h. El análisis de HPLC muestra que se ha convertido todo el Z-Lys(Boc)-Phe-NH2. La mezcla resultante se utilizó directamente en la siguiente etapa.
Ejemplo 3: Preparación de Z-Dmt(Boc)-Lys(Boc)-Phe-NH2 (VIII)
Se cargan 8,5 g de Z-Dmt(Boc)-OH y 6,1 g de TBTU en la solución en DMF de MeSO3H.H-Lys(Boc)-Phe-NH2 obtenida en la último etapa. Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 15 min. Se enfría la mezcla a 10-15°C. Se añaden 5,8 g de N-metilmorfolina lentamente manteniendo la temperatura por debajo de 20°C. Se agita la mezcla a 10-15°C durante 18 h. Se filtra la mezcla para eliminar el catalizador de Pd/C y otros precipitados y se lava la torta de filtración con DMF. Se combinan el filtrado y la solución de lavado y se añaden 32 ml de cloruro de metileno al filtrado. Se añade la solución resultante a un matraz que contiene 500 ml de agua y luego se agita la mezcla durante 20 min. Se filtra la mezcla para aislar el producto sólido y se lava la torta de filtración con agua tres veces. Se transfiere la torta de filtración a un matraz que contiene 450 ml de acetona y se calienta la mezcla a reflujo con agitación. A reflujo y con agitación se añaden 200 ml de hexanos y se enfría la mezcla a temperatura ambiente. Se filtra la mezcla para aislar el producto sólido. Se repiten las operaciones de tratamiento anteriores. Se seca la torta de filtración resultante a 40°C y a vacío para dar 12,4 g del producto.
Ejemplo 4: Preparación de MeSO3H.H-Dmt(Boc)-Lys(Boc)-Phe-NH2 (IX)
Se cargan 12,4 g de Z-Dmt(Boc)-Lys(Boc)-Phe-NH2, 100 ml de DMF, 12,4 g de Pd/C al 5% (60% de contenido de agua) y 1,46 g de ácido metanosulfónico en un matraz. Se cambia la atmósfera del matraz con hidrógeno. Se agita la mezcla a 20-25°C y bajo 1 atm de hidrógeno durante 3 h. El análisis de HPLC muestra que se ha convertido todo el Z Lys(Boc)-Phe-NH2 (pureza por HPLC 98,1%). La mezcla resultante se usa directamente en la siguiente etapa.
Ejemplo 5: Preparación de Boc-D-Arg-Dmt(Boc)-Lys(Boc)-Phe-NH2 (XI)
Se cargan 8,5 g de Boc-D-Arg-OH, 8,84 g de TBTU y 9,7 g de N-metilmorfolina en la mezcla en DMF de H-Dmt(Boc)-Lys(Boc)-Phe-NHe.MeSO3H a temperatura ambiente. Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 40 h. Se filtra la mezcla para eliminar el Pd/C y otros precipitados. Se añaden 250 ml de acetato de etilo al filtrado. Se lava la solución orgánica con agua (200 ml X 4). Se concentra la solución orgánica a 40-45°C y a vacío para eliminar la mayor parte del disolvente. Se añaden 100 ml de MTBE al residuo y se agita la mezcla vigorosamente a temperatura ambiente durante 1 h. Se filtra la mezcla para aislar el producto sólido. Se transfiere la torta de filtración a un matraz que contiene 200 ml de acetato de etilo. Se calienta la mezcla a 50-55°C y con agitación durante 3 h, y luego se enfría a temperatura ambiente. Se filtra la mezcla para aislar el producto sólido. Se repiten las operaciones de tratamiento anteriores. Se seca la torta de filtración a 40-45°C y a vacío para obtener 10,7 g de producto sólido blanco. Pureza por HPLC 98,2%.
Ejemplo 6: Preparación de H-D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2 (I), (MTP-131)
Se cargan 1,0 g y 10 ml de TFA en un matraz. Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 20 min. Se añaden 10 ml de IPA a la mezcla de reacción. Se añade la mezcla resultante lentamente a un matraz que contiene 40 ml de heptano con agitación vigorosa. Se filtra la mezcla para aislar el producto sólido y se lava la torta de filtración con IPA. Se seca la torta de filtración a 40-45°C y a vacío para obtener 0,5 g de producto sólido. Datos analíticos: pureza por HPLC: 96,6%

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento en fase líquida para la producción de H-D-Arg-(2 ,6-Dimetil)Tyr-Lys-Phe-NH2 de fórmula (I), en forma de la sal de ácido trifluoroacético,
Figure imgf000010_0001
que comprende las siguientes etapas:
- acoplar el compuesto (II) H-Phe-NH2:
Figure imgf000010_0002
con el compuesto (III) Z-Lys(Boc)-OH:
Figure imgf000010_0003
para obtener un compuesto de fórmula (IV), Z-Lys(Boc)-Phe-NH2
Figure imgf000010_0004
- hacer reaccionar el compuesto (IV) con hidrógeno y ácido metanosulfónico (V)
MeSO3H (V)
en presencia de un catalizador para obtener la sal de amina libre (VI) MeSO3H.H-Lys(Boc)-Phe-NH2:
Figure imgf000010_0005
- hacer reaccionar la sal (VI) con el aminoácido protegido Z-Dmt(Boc)-OH (VII)
Figure imgf000011_0001
para obtener el tripéptido protegido Z-Dmt(Boc)-Lys(Boc)-Phe-NH2 (VIII):
Figure imgf000011_0002
- tratar el compuesto (VIII) con hidrógeno y ácido metanosulfónico (V) para obtener la sal correspondiente MeSO3.H-Dmt(Boc)-Lys(Boc)-Phe-NH2 (IX):
Figure imgf000011_0003
- acoplar la sal ácida (IX) con Z-D-Arg-ONa (X)
Figure imgf000011_0004
para formar el tetrapéptido protegido Boc-D-Arg-Dmt(Boc)-Lys(Boc)-Phe-NH2 (XI):
Figure imgf000011_0005
- desproteger el compuesto (XI) para obtener el tetrapéptido H-D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2 (I) y además formar la sal con ácido trifluoroacético en disolventes.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en donde la desprotección se realiza por acidólisis simultánea de los tres grupos Boc con ácidos orgánicos.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1, en donde la desprotección se realiza por acidólisis simultánea de los tres grupos Boc con ácido trifluoroacético, sin usar catalizadores de Pd.
4. Un procedimiento según la reivindicación 1, en donde la acidólisis se puede realizar con otros ácidos tales como HCl o HBr, dando lugar a las correspondientes sales.
5. Un procedimiento según la reivindicación 1, en donde el producto final (I) se obtiene en forma cristalina sólida de la sal de trifluoroacetato después de cristalización simple sin ninguna necesidad de purificación por HPLC o ninguna liofilización.
6. Un procedimiento según la reivindicación 1, en donde el acoplamiento entre (II) y (III) se realiza en presencia de tetrafluoroborato de N,N,N',N'-tetrametil-O-(benzotriazol-1-il)uranio (conocido como TBTU) y disolventes polares tales como NMP, DMF, acetonitrilo, DMSO y THF.
7. Un procedimiento según la reivindicación 1, en donde el acoplamiento entre (II) y (III) se realiza en un intervalo de temperatura entre -10°C y 50°C, preferiblemente entre 5°C y 15°C.
8. Un procedimiento según la reivindicación 1, en donde la formación de la sal metanosulfónica (VI) se obtiene en metanol, NMP, acetonitrilo o THF como disolvente y se cristaliza en el mismo disolvente.
9. Un procedimiento según la reivindicación 1, en donde la reacción de acoplamiento entre el compuesto (IX) y el compuesto (X) se realiza en presencia de tetrafluoroborato de N,N,N',N'-tetrametil-O-(benzotriazol-1-il)uranio (conocido como TBTU) y disolventes polares seleccionados de NMP, DMF, acetonitrilo, DMSO y THF.
10. Un compuesto seleccionado de un compuesto de fórmula (VIII) Z-(2 ,6-dimetil)Tyr(Boc)-Lys(Boc)-Phe-NH2
Figure imgf000012_0001
un compuesto de fórmula (XIV) H-(2 ,6-dimetil)Tyr(Boc)-Lys(Boc)-Phe-NH2 o una sal del mismo
Figure imgf000012_0002
y un compuesto de fórmula (XI) Boc-D-Arg-(2 ,6-dimetil)Tyr(Boc)-Lys(Boc)-Phe-NH2:
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