一种脂肪细胞靶向的跨膜转运脂质体药物载体及其制备方法
和用途
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域,尤其涉及一种高效脂肪细胞靶向的脂质体药物载体及其制备方法和用途。
背景技术
目前,对于肥胖的临床治疗策略及临床研究主要通过控制人体能量摄取、吸收以及机体的新陈代谢等途径进行的。常用治疗方式包括药物、吸脂和物理破坏脂肪细胞,药物主要以注射和口服为主,常用的药物包括:利拉鲁肽、索马鲁肽等。药物方式大多是通过抑制食欲,减少热量的摄入来控制体重,对肠胃和肝肾功能有一定的副作用,也容易导致代谢紊乱。吸脂手术是通过皮下利用器械通过皮肤小切口伸入皮下脂肪层将脂肪碎块抽吸出以达到吸收脂肪的目的方法,适用于体态整形。吸脂手术主要是通过破坏并吸出皮下脂肪组织,手术方式的风险和创伤相对较大,容易引发栓塞、窒息等副作用。物理方式主要通过冷冻和热熔破坏皮下脂肪细胞,使脂肪细胞破坏甘油三酯溢出,对皮下有一定损伤,并且由于未彻底降解甘油三酯因而有效性比较局限。
可见,现有的医疗技术和方法多以破坏和减少脂肪组织和细胞为主,旨在减少皮下脂肪细胞,暴力破坏减少脂肪细胞数量,大量脂肪囤积在有限脂肪细胞中,当这些细胞不堪重负,就会选择死亡或者功能失调,会将脂质溢出到本不应该储存脂肪的地方。这些脂质转移到肝脏诱发脂肪肝,如转移到胰腺就会诱发糖尿病,转移至心脏会诱发心血管疾病,腹部脂肪可能会围绕在器官周围并引起炎症发生。
由于大多数抗肥胖药物和治疗方式引发严重的副作用,从而导致治疗的失败,严重时甚至威胁到患者的生命安全。因此,发展安全、有效的、通用的肥胖及其并发症的治疗策略对于提高肥胖人群的生活质量,降低能量代谢失调所引发的重大疾病产生具有非常重要的意义。
到目前为止,外用组分或者大分子药物很难通过表皮渗透达到皮下脂肪细胞,由于皮肤屏障和细胞膜的阻隔,进入皮下并达到脂肪细胞内降解甘油三酯迄今难以实现。如果可以实现药物的脂肪细胞靶向递送,在不破坏皮下组织和脂肪细胞,可以有效的将组分递送至脂肪细胞内,实现在脂肪细胞内干预甘油三酯的代谢路径,在细胞单位内更精准更安全的调控甘油三酯的含量,不仅对大分子药物靶向递送系统的研究有突破,而且探索新的脂肪细胞靶向的药物递送系统对于找寻治疗肥胖的更安全有效的方式具有重要的临床意义。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处,提供了一种高效脂肪细胞靶向的跨膜转运脂质体药物载体及其制备方法和用途。
具体地,通过以下几个方面的技术方案实现了本发明:
在第一个方面中,本发明提供了一种脂肪细胞靶向的脂质体药物载体的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
首先制备用于包载治疗剂的阳离子脂质体脂质体A,然后以脂质体A作为水相,以含有脂肪细胞靶向元件的脂质分子制备成脂质分子膜,将所述水相和所述脂质分子膜按照一定比例混合并使用脂质体挤出仪制备脂肪细胞靶向脂质体药物载体,
所述脂质体A由卵磷脂、鞘磷脂、胆固醇和阳离子脂质分子组成,其中所述阳离子脂质分子由不饱和脂肪酸与聚赖氨酸通过二硫键共价结合制成,
所述脂质分子膜由卵磷脂、鞘磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺PEG和脂肪细胞靶向元件修饰的脂质分子组成,其中所述脂肪细胞靶向元件修饰的脂质分子选自以下一种或两种的混合物:脂肪细胞靶向肽修饰的脂质分子或透明质酸修饰的脂质分子。
作为可选的方式,在上述制备方法中,以摩尔比计,所述脂质体A由卵磷脂40-60%、鞘磷脂5-25%、胆固醇10-30%和阳离子脂质分子10-25%组成,所述不饱和脂肪酸包括亚油酸、亚麻酸,所述聚赖氨酸氨基酸聚合数量为5-10个,
优选地,以摩尔比计,所述脂质体A由卵磷脂45%、鞘磷脂15.5%、胆固醇30%和阳离子脂质分子9.5%组成;
以摩尔比计,所述脂质分子膜由卵磷脂35-55%、鞘磷脂10-25%、胆固醇10-25%、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺PEG 10-25%和脂肪细胞靶向元件修饰的脂质分子1-5%组成,
优选地,以摩尔比计,所述脂质分子膜由卵磷脂55%、鞘磷脂10%、胆固醇20%、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺PEG 12%和脂肪细胞靶向元件修饰的脂质分子3%组成。
作为可选的方式,在上述制备方法中,所述脂肪细胞靶向元件修饰的脂质分子为脂肪细胞靶向肽修饰的脂质分子和透明质酸修饰的脂质分子的混合物。
所述脂肪细胞靶向肽修饰的脂质分子为脂肪细胞靶向肽ATS-SH与磷脂分子的共价偶联物,所述脂肪细胞靶向肽ATS-SH的氨基酸序列为:GKGGEAKDGGC。
所述透明质酸修饰的脂质分子为透明质酸与不饱和脂肪酸共价偶联物。
所述不饱和脂肪酸包括亚麻酸、亚油酸。
作为可选的方式,在上述制备方法中,所述制备方法包括以下步骤:
(1)脂质体A的制备:
将制备所述脂质体A所需的各组分溶解于无水乙醇制备混合脂质分子溶液,以摩尔比计,所述脂质体A由卵磷脂40-60%、鞘磷脂5-25%、胆固醇10-30%和阳离子脂质分子10-25%组成,
将所述混合脂质分子溶液放入圆底烧瓶,置于旋转蒸发仪上50℃旋转蒸发,蒸干乙醇,充氮气过夜干燥,随后加入含有治疗剂的PBS溶液,置于旋转蒸发仪上旋转,氮气保护条件下进行水化12小时,直至脂质分子膜充分分散于溶液中,0-4℃水浴超声5min,使用脂质体挤出仪,采用50nm的聚碳酸酯薄膜反复挤出10次,即可得到脂质体A;
(2)脂肪细胞靶向脂质体药物载体的制备:
将制备含有脂肪细胞靶向元件的脂质分子的脂质分子膜所需的各组分溶解于无水乙醇制备混合脂质分子溶液,以摩尔比计,所述脂质分子膜由卵磷脂35-55%、鞘磷脂10-25%、胆固醇10-25%、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺PEG 10-25%和脂肪细胞靶向元件修饰的脂质分子1-5%组成,
将所述混合脂质溶液放入圆底烧瓶,置于旋转蒸发仪上蒸干乙醇,过夜干燥,随后加入步骤(1)中制备得到的脂质体A的分散溶液,置于旋转蒸发仪上旋转,进行水化,直至脂质分子膜充分分散于溶液中,0-4℃水浴超声5min,使用脂质体挤出仪反复挤出10次,即可得到脂肪细胞靶向脂质体药物载体。
作为可选的方式,在上述制备方法中,制备脂质体A所用脂质分子总质量与脂肪细胞靶向元件修饰的脂质分子总质量的质量比为1:2-1:10,
在步骤(1)中,所述治疗剂包括蛋白质、多肽,所述治疗剂与所述脂质分子总质量的质量比为1:20-1:100,所述阳离子脂质分子由不饱和脂肪酸与聚赖氨酸通过二硫键共价结合制成,所述不饱和脂肪酸包括亚油酸、亚麻酸,所述聚赖氨酸氨基酸聚合数量为5-10个;
在步骤(2)中,以摩尔比计,所述脂肪细胞靶向元件修饰的脂质分子由脂肪细胞靶向肽修饰的脂质分子0.5-1.5%和透明质酸修饰的脂质分子1-3%组成,所述脂肪细胞靶向肽修饰的脂质分子为脂肪细胞靶向肽ATS-SH与磷脂分子的共价偶联物,所述脂肪细胞靶向肽ATS-SH的氨基酸序列为:GKGGEAKDGGC,所述透明质酸修饰的脂质分子为透明质酸与不饱和脂肪酸共价偶联物,所述不饱和脂肪酸包括亚麻酸、亚油酸。
作为可选的方式,在上述制备方法中,所述制备方法还包括以下步骤:
(3)脂肪细胞靶向的脂质体药物载体冻干粉的制备:
按照一定比例将透明质酸钠、甘露糖、EDTA和甘油加入到步骤(2)制备得到的脂肪细胞靶向的脂质体药物载体溶液中,4℃条件下进行充分搅拌4小时,然后置于-20℃条件下冷冻24小时,采用冻干机冻干即获得冻干粉制剂。
作为可选的方式,在上述制备方法中,(A)阳离子脂质分子(即二硫键连接的寡聚赖氨酸-不饱和脂肪酸共价偶联物)的制备:在氩气保护作用下,将不饱和脂肪酸(包括亚油酸、亚麻酸等)、碳二亚胺(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC),N-琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide, NHS)按照摩尔比1:5:5的处方量精密称定,溶解于无水DMSO中,使得不饱和脂肪酸的浓度为50mg/mL,室温避光搅拌4小时,然后按照不饱和脂肪与H2N-PEG2000-NH2摩尔比1:1加入H2N-PEG2000-NH2,室温避光搅拌24小时,然后将事先用无水DMSO溶解的3,3-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺)酯(Di(N-succinimidyl)3,3'-Dithiodipronate,DSP)与不饱和脂肪按照摩尔比2:1加入上述反应体系,室温避光继续搅拌4小时,反应结束,加水稀释,然后转移至透析袋(Mw=5000),透析3天,冻干,即得到不饱和脂肪酸-PEG-NHS,然后将不饱和脂肪酸-PEG-NHS以不饱和脂肪酸的摩尔数计量,与寡聚赖氨酸以摩尔比1:2在中性磷酸缓冲溶液中混合反应24小时,然后转移至透析袋,Mw=5000,透析3天,冻干即得到二硫键连接的寡聚赖氨酸-不饱和脂肪酸共价偶联物。
(B)透明质酸不饱和脂肪酸共价偶联物的制备:称取透明质钠(Mw约4万)约100 g,溶解于2000 mL水中,称取高碘酸钠5 g溶解于40 mL水中,之后将高碘酸钠溶液缓慢滴加到透明质钠溶液中,室温避光反应4小时后,加入2 mL乙二醇终止反应,将反应体系旋转蒸发浓缩成一定体积后,转入超滤装置,使用纯净水进行透析3天,每隔1天换一次水,然后冻干,即得到氧化透明质酸钠,在氩气保护作用下,将不饱和脂肪酸(包括亚油酸、亚麻酸等)、碳二亚胺(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, EDC),N-琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide, NHS)按照摩尔比1:5:5的处方量精密称定,溶解于无水DMSO中,使得不饱和脂肪酸的浓度为50mg/mL,室温避光搅拌4小时,然后按照不饱和脂肪与H2N-PEG2000-NH2摩尔比1:1加入H2N-PEG2000-NH2,室温避光搅拌24小时,反应结束后,按照不饱和脂肪酸与透明质酸摩尔比1:1的量,加入氧化透明质酸钠,使用10 mM的NaOH调节pH至7-8,避光搅拌24小时,反应结束,加水稀释,然后转移至透析袋,Mw=10000,透析3天,冻干,即得到透明质酸不饱和脂肪酸共价偶联物。
(C)脂肪细胞靶向肽ATS-SH与脂质分子的共价偶联物的制备:将磷脂分子衍生物DSPE-PEG-MAL,PEG分子量2000,与靶向肽ATS-SH(其氨基酸序列为GKGGEAKDGGC)以摩尔比1.5:1在中性磷酸缓冲溶液中混合反应24小时,然后转移至透析袋,Mw=3500,透析3天,冻干即得到脂肪细胞靶向肽ATS-SH与脂质分子的共价偶联物。
在第二个方面中,本发明提供了上述第一个方面所述的制备方法制备得到的脂肪细胞靶向的脂质体药物载体。
在第三个方面中,本发明提供了上述第二个方面所述的脂肪细胞靶向的脂质体药物载体在制备脂肪细胞靶向药物递送系统中的用途。
作为可选的方式,在上述用途中,在所述药物载体中,脂肪细胞靶向肽修饰的脂质分子和透明质酸修饰的脂质分子协同提高所述药物载体对脂肪细胞的靶向性。
本发明相对于现有技术,具有以下有益效果:
本发明首次结合透明质酸和脂肪细胞靶向肽ATS-SH修饰改造的脂质体,协同提高载体对脂肪细胞的靶向。
本发明首次借助寡聚赖氨酸修饰的阳离子脂质分子提高脂质体对大分子蛋白质的包载效率。可以实现蛋白(分子量66KD以上)、核酸等靶向进入脂肪细胞。
附图说明
图1:本发明脂肪细胞靶向的跨膜转运脂质体药物载体示意图。
图2:本发明脂肪细胞靶向脂质体的表征结果。图2A表示脂肪细胞靶向脂质体的TEM图片;图2B表示脂肪细胞靶向脂质体的粒径分布。
图3:MTT实验分析脂肪靶向脂质体对皮下常见正常细胞的毒性(36小时和72小时)。其中,图3A、图3B和图3C是不同浓度脂质体分别对脂肪细胞、成纤维细胞和人永生化表皮细胞的生长与增殖作用的影响。
图4:激光共聚焦显微镜观察人皮下脂肪细胞对不同脂质体搭载的白蛋白的吞噬情况。图4A白蛋白,图4B无靶向元件脂质体包载白蛋白,图4C含透明质酸靶向元件脂质体包载白蛋白,图4D含多肽序列靶向元件脂质体包载白蛋白,图4E含双靶向元件脂质体包载的白蛋白。
图5:流式细胞仪分析人皮下脂肪细胞对白蛋白的吞噬情况。图5A各组代表性数据的直观分布图。图5B每组数据荧光强度平均值。其中,1代表对照组、2代表单独白蛋白、3代表不含靶向元件脂质体搭载的白蛋白、4代表含透明质酸脂质体搭载的白蛋白、5代表含靶向肽ATS-SH脂质体搭载的白蛋白、6代表含双靶向元件脂质体搭载的白蛋白。图中abcdef表示在p<0.05水平具有显著性差异。
图6:流式细胞仪分析人皮下脂肪细胞、HFF-1人皮肤成纤维细胞和Hacat人永生化表皮细胞对脂肪细胞靶向脂质体吞噬情况。图6A各组代表性数据的直观分布图。图6B每组数据荧光强度平均值。其中,1代表对照组、2代表Hacat人永生化表皮细胞、3代表HFF-1人皮肤成纤维细胞、4代表皮下脂肪细胞。图中abc表示在p<0.05水平具有显著性差异。
图7:激光共聚焦显微镜观察人皮下脂肪细胞绿色荧光蛋白表达情况。图7A质粒,图7B无靶向元件脂质体包载质粒,图7C含透明质酸靶向元件脂质体包载质粒,图7D含多肽序列靶向元件脂质体包载质粒,图7E含双靶向元件脂质体包载质粒。
图8:流式细胞仪分析人皮下脂肪细胞绿色荧光蛋白的表达情况。图8A各组代表性数据的直观分布图。图8B每组数据荧光强度平均值。其中,1代表对照组、2代表单独质粒、3代表不含靶向元件脂质体搭载的质粒、4代表含透明质酸脂质体搭载的质粒、5代表含靶向肽ATS-SH脂质体搭载的质粒、6代表含双靶向元件脂质体搭载的质粒。图中abcdef表示在p<0.05水平具有显著性差异。
图9:流式细胞仪分析人皮下脂肪细胞、HFF-1人皮肤成纤维细胞和Hacat人永生化表皮细胞的绿色荧光蛋白表达情况。图9A各组代表性数据的直观分布图。图9B每组数据荧光强度平均值。其中,1代表对照组、2代表Hacat人永生化表皮细胞、3代表HFF-1人皮肤成纤维细胞、4代表皮下脂肪细胞。图中abc表示在p<0.05水平具有显著性差异。
具体实施方式
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明,并不用于限定本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
下面实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为市售产品。
制备实施例:
本发明脂肪细胞靶向的跨膜转运脂质体药物载体示意图如图1所示。本发明脂肪细胞靶向的跨膜转运脂质体药物载体的制备方法如下所示:
二硫键连接的寡聚赖氨酸-亚油酸共价偶联物(阳离子脂质分子)的制备过程:
在氩气保护作用下,将亚油酸、碳二亚胺(EDC),N-琥珀酰亚胺(NHS)按照摩尔比1:5:5的处方量精密称定,溶解于无水DMSO中,使得亚油酸的浓度为50 mg/mL。室温避光搅拌4小时,然后按照亚油酸与H2N-PEG2000-NH2摩尔比1:1加入H2N-PEG2000-NH2,室温避光搅拌24小时,然后将事先用无水DMSO溶解的3,3-二硫代二丙酸二(N-琥珀酰亚胺)酯(Di(N-succinimidyl)3,3'-Dithiodipronate, DSP)与亚油酸按照摩尔比2:1加入上述反应体系,室温避光继续搅拌4小时。反应结束,加水稀释,然后转移至透析袋(Mw=5000),透析3天,冻干。即得到亚油酸-PEG-NHS。然后将亚油酸-PEG-NHS以亚油酸的摩尔数计量,与寡聚赖氨酸以摩尔比1:2在中性磷酸缓冲溶液中混合反应24小时,然后转移至透析袋(Mw=5000),透析3天,冻干即可得到二硫键连接的寡聚赖氨酸-亚油酸共价偶联物。
透明质酸-亚油酸共价偶联物的制备过程:
称取透明质钠(Mw约4万)约100 g,溶解于2000 mL水中,称取高碘酸钠5 g溶解于40 mL水中,之后将高碘酸钠溶液缓慢滴加到透明质钠溶液中,室温避光反应4小时后,加入2 mL乙二醇终止反应。将反应体系旋转蒸发浓缩成一定体积后,转入超滤装置,使用纯净水进行透析3天,每隔1天换一次水,然后冻干,即得到氧化透明质酸钠。
在氩气保护作用下,将亚油酸、碳二亚胺(EDC),N-琥珀酰亚胺(NHS)按照摩尔比1:5:5的处方量精密称定,溶解于无水DMSO中,使得亚油酸的浓度为50 mg/mL。室温避光搅拌4小时,然后按照亚油酸与H2N-PEG2000-NH2摩尔比1:1加入H2N-PEG2000-NH2,室温避光搅拌24小时。反应结束后,按照亚油酸与透明质酸摩尔比1:1的量,加入氧化透明质酸钠,使用10mM的NaOH调节pH至7-8,避光搅拌24小时,反应结束,加水稀释,然后转移至透析袋(Mw=10000),透析3天,冻干即得到透明质酸-亚油酸共价偶联物。
靶向肽-脂质分子共价偶联物的制备过程:
然后将磷脂聚乙二醇马来酰亚胺(DSPE-PEG-MAL,PEG分子量2000)与靶向肽ATS-SH(其序列为GKGGEAKDGGC)以摩尔比1.5:1在中性磷酸缓冲溶液中混合反应24小时,然后转移至透析袋(Mw=3500),透析3天,冻干即可得到靶向肽-脂质分子共价偶联物。
脂质体A的制备过程:
脂质体A的组成脂质分子按照一定比例(摩尔比)溶解于无水乙醇制备20 mL的5mg/mL的混合脂质分子溶液,各脂质分子比例(摩尔比)如下:卵磷脂45%、鞘磷脂15.5%、胆固醇30%和上文制备得到的阳离子脂质分子9.5%。
将上述混合脂质分子溶液放入圆底烧瓶,置于旋转蒸发仪上50℃旋转蒸发,蒸干乙醇,充氮气过夜干燥,随后加入含有20 mg的FITC标记的白蛋白(或者2 mg绿色荧光蛋白质粒)的PBS溶液5 mL,置于旋转蒸发仪上旋转,氮气保护条件下进行水化12小时,直至脂质分子膜充分分散于溶液中,0-4℃水浴超声5 min,使用脂质体挤出仪,采用50 nm的聚碳酸酯薄膜反复挤出10次,即可得到脂质体A。
脂肪细胞靶向脂质体药物载体的制备过程:
脂肪细胞靶向脂质体的组成脂质分子按照一定比例(摩尔比)溶解于无水乙醇制备40 mL的5 mg/mL的混合脂质分子溶液,各脂质分子比例(摩尔比)如下:卵磷脂55%、鞘磷脂10%、胆固醇20%、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺PEG 12%、上文制备得到的靶向肽-脂质分子共价偶联物1.5%和上文制备得到的透明质酸不饱和脂肪酸共价偶联物1.5%。
将上述混合脂质分子溶液放入圆底烧瓶,置于旋转蒸发仪上蒸干乙醇,过夜干燥,随后加入上一步骤制备的脂质体A的分散溶液,置于旋转蒸发仪上旋转,进行水化,直至脂质分子膜充分分散于溶液中,0-4℃水浴超声5 min,使用脂质体挤出仪反复挤出10次,即可得到脂肪细胞靶向脂质体。
本发明脂肪细胞靶向脂质体的TEM照片如图2A所示。图2B显示了本发明脂肪细胞靶向脂质体的粒径分布。实验结果表明,最终制备的脂质体大小为120-150 nm范围,纳米载体的水和半径为200±25 nm。
效果实施例:
以下效果实验采用上述制备实施例部分制备得到的脂肪细胞靶向脂质体进行。
以下效果实验均使用SPSS软件中的单因素ANOVA对实验结果进行统计学分析,以p<0.05表示具有统计学显著差异。
效果例1:本发明脂肪细胞靶向脂质体药物载体的细胞毒性考察
通过对皮下组织常见三种正常细胞(人皮肤成纤维细胞HFF-1、永生化表皮细胞Hacat和人皮下脂肪细胞均购自ATCC,以下实验所使用的细胞具有相同来源)的毒性实验结果分析表明(见图3),本发明脂质体药物载体对正常细胞的生长和增殖影响非常小,说明本发明设计的脂肪细胞靶向脂质体的安全性高。
效果例2:以FITC修饰的白蛋白作为蛋白类治疗剂考察脂肪细胞对蛋白类治疗剂
的吞噬情况
该部分使用FITC修饰的白蛋白作为蛋白类治疗剂,包载到脂肪细胞靶向脂质体中,然后通过激光共聚焦显微镜观察脂肪细胞对白蛋白的吞噬情况(图4)。
实验步骤:将人皮下脂肪细胞以20000个/孔铺板于10 mm的玻底皿,等待贴壁培养24小时后,加入10 μg/mL的白蛋白,置于细胞培养箱继续培养4小时后,使用PBS洗涤3次,采用激光共聚焦扫描显微镜观察。
结果表明,在所有设置的实验组中,FITC标记的白蛋白都能够被脂肪细胞吞噬,普通脂质体和含单靶向元件脂质体能够提高脂肪细胞对白蛋白的吞噬,但是与其他组相比,脂肪细胞对含有双靶向元件的脂质体搭载的白蛋白吞噬效率最高,这也证实了本发明所设计的脂质体具有脂肪细胞靶向性。
同样,使用流式细胞仪分析了脂肪细胞对搭载白蛋白的不同脂质体的吞噬情况。
实验步骤:将细胞以20000个/孔铺板于6孔板,等待贴壁培养24小时后,加入10 μg/mL的白蛋白,置于细胞培养箱继续培养4小时后,使用PBS洗涤3次,消化收集细胞,PBS洗涤2次,采用流式细胞仪分析细胞内荧光强度。
如图5所示,所获得的结果与激光共聚焦扫描显微镜观察结果相似,当脂质体含有透明质酸和脂肪细胞靶向多肽双靶向元件时,脂肪细胞对白蛋白的吞噬量最大。
然后,实验比较了人皮下脂肪细胞、HFF-1人皮肤成纤维细胞和Hacat人永生化表皮细胞三种正常细胞对搭载白蛋白的的不同脂质体的吞噬情况。
实验步骤:将细胞以20000个/孔铺板于6孔板,等待贴壁培养24小时后,加入10 μg/mL的白蛋白,置于细胞培养箱继续培养4小时后,使用PBS洗涤3次,消化收集细胞,PBS洗涤2次,采用流式细胞仪分析细胞内荧光强度。
如图6所示,结果表明,人皮下脂肪细胞对白蛋白的吞噬量最大,说明双靶向元件修饰的脂质体具有脂肪细胞的靶向性作用,进而增加白蛋白进入脂肪细胞的量。
效果例3:以绿色荧光蛋白质粒作为核酸类治疗剂考察脂肪细胞对核酸类治疗剂
的吞噬情况
该部分使用绿色荧光蛋白质粒(pCMV-C-EGFP)作为核酸类治疗剂,包载到脂肪细胞靶向脂质体中,然后通过激光共聚焦显微镜观察脂肪细胞对绿色荧光蛋白的吞噬情况(图7)。结果表明,相比于普通脂质体,脂肪细胞靶向脂质体能够提高脂肪细胞对绿色荧光蛋白的吞噬。
实验步骤:将人皮下脂肪细胞以20000个/孔铺板于10 mm的玻底皿,等待贴壁培养24小时后,加入包载质粒的不同脂质体,置于细胞培养箱继续培养24小时后,使用PBS洗涤3次,采用激光共聚焦扫描显微镜观察。
结果表明,在所有设置的实验组中,均能够观察到绿色荧光蛋白的表达。同样普通脂质体和含单靶向元件脂质体能够提高脂肪细胞对质粒的摄入,进而提高绿色荧光蛋白的表达。但是与其他组相比,含有双靶向元件的脂质体搭载的质粒组绿色荧光蛋白的荧光强度最强,这说明本发明所设计的脂质体具有脂肪细胞靶向性。
同样,使用流式细胞仪分析了脂肪细胞绿色荧光蛋白的表达情况。
实验步骤:将脂肪细胞以20000个/孔铺板于6孔板,等待贴壁培养24小时后,加入含质粒的不同脂质体,置于细胞培养箱继续培养24小时后,使用PBS洗涤3次,消化收集细胞,PBS洗涤2次,采用流式细胞仪分析细胞内荧光强度。
如图8所示,所获得的结果与激光共聚焦扫描显微镜观察结果相似,当脂质体含有透明质酸和脂肪细胞靶向多肽双靶向元件时,脂肪细胞的绿色荧光蛋白表达量最大。
然后,利用流式细胞仪比较了人皮下脂肪细胞、HFF-1人皮肤成纤维细胞和Hacat人永生化表皮细胞三种正常细胞与不同处理的质粒共同孵育后的绿色荧光蛋白表达情况。
实验步骤:将细胞以20000个/孔铺板于6孔板,等待贴壁培养24小时后,加入含质粒的不同脂质体,置于细胞培养箱继续培养24小时后,使用PBS洗涤3次,消化收集细胞,PBS洗涤2次,采用流式细胞仪分析细胞内荧光强度。
如图9所示,结果表明,人皮下脂肪细胞的绿色荧光蛋白表达量最大,这说明双靶向元件修饰的脂质体具有脂肪细胞的靶向性作用,进而增加质粒进入脂肪细胞,进而增加了脂肪细胞的绿色荧光蛋白表达。
显然,本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。