WO2023136688A1 - 생분해성 이황화 결합을 포함하는 이온화 가능한 지질 및 이를 포함하는 지질나노입자 - Google Patents

생분해성 이황화 결합을 포함하는 이온화 가능한 지질 및 이를 포함하는 지질나노입자 Download PDF

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WO2023136688A1
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양주성
최강현
김욱일
이주영
이혁진
김민정
정예희
이예지
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에스티팜 주식회사
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    • C07C323/24—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C323/25—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D295/00—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D295/04—Heterocyclic compounds containing polymethylene-imine rings with at least five ring members, 3-azabicyclo [3.2.2] nonane, piperazine, morpholine or thiomorpholine rings, having only hydrogen atoms directly attached to the ring carbon atoms with substituted hydrocarbon radicals attached to ring nitrogen atoms

Definitions

  • the present invention relates to novel ionizable lipids comprising biodegradable disulfide bonds. Specifically, the present invention relates to ionizable lipids containing biodegradable disulfide bonds, lipid nanoparticles prepared using the same, and uses thereof.
  • a drug delivery system is a technology designed to efficiently deliver the required amount of drug by reducing side effects and maximizing efficacy and effectiveness.
  • conventional viral delivery systems have been proven to be effective as drug delivery systems in gene therapy, but the use of viruses as gene delivery systems has been limited due to several drawbacks such as immunogenicity, limitations in the size of injected DNA, and difficulty in mass production. are being limited
  • lipid-DNA conjugates lipoplex and polymer-DNA conjugates (polyplex)
  • lipid-DNA conjugates lipoplex and polymer-DNA conjugates (polyplex)
  • lipid-DNA conjugates combine with nucleic acids to deliver nucleic acids well into cells and are widely used at the cellular level. . ).
  • the present inventors have made intensive efforts to develop a novel material that has an excellent drug encapsulation rate and can efficiently deliver anionic drugs such as nucleic acids to target organs or cells.
  • the present invention was completed by confirming the excellent drug delivery effect of the novel ionizable lipid.
  • One object of the present invention is to provide an ionizable lipid containing a biodegradable disulfide bond of novel structure, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Another object of the present invention is to provide lipid nanoparticles containing the ionizable lipid, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a drug delivery composition containing the lipid nanoparticle and an anionic drug, and a pharmaceutical composition for preventing or treating liver disease.
  • the ionizable lipid containing a disulfide bond represented by Formula 1 stably and effectively delivers drugs when preparing lipid nanoparticles, and confirms that there are few side effects such as liver toxicity, completed the present invention.
  • One aspect of the present invention for achieving the above object is an ionizable lipid represented by Formula 1 below, a stereoisomer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • A is or ego
  • X is null, -O- or -NH-;
  • n is an integer from 0 to 5;
  • n is an integer from 1 to 3;
  • l is an integer from 1 to 3;
  • p is an integer from 0 to 2;
  • q 0 or 1
  • r is an integer from 2 to 10;
  • X is null, -O- or -NH-;
  • n is an integer from 0 to 3;
  • n is an integer from 1 to 3;
  • l is an integer from 1 to 3;
  • q 0 or 1
  • r may be an integer from 5 to 9.
  • X is null, -O- or -NH-;
  • n is an integer from 0 to 3;
  • n is an integer from 1 to 3;
  • l is an integer from 1 to 3;
  • p 1;
  • q 0 or 1
  • r may be an integer from 5 to 9.
  • the compound represented by Formula 1 may be selected from the group consisting of the compounds shown in Table 1 below.
  • alkyl means a straight-chain or branched-chain acyclic saturated hydrocarbon.
  • C 1-6 alkyl may mean an alkyl containing 1 to 6 carbon atoms.
  • the term “ionizable lipid” refers to an amine-containing lipid that can be easily protonated, and is also referred to as a lipidoid. Since the charge state of the ionizable lipid may change depending on the surrounding pH, it serves to encapsulate the drug with high efficiency in the lipid nanoparticle through an electrostatic interaction with the anionic drug, and the structure of the lipid nanoparticle contributes to forming
  • the ionizable lipid of the present invention is characterized in that it has a form in which an alkyl chain containing a disulfide bond is linked to an amine head containing at least one primary amine. In addition, it has excellent efficacy such as tissue specificity and gene expression rate, and is easily degraded in vivo after drug delivery, so it has the advantage of not having significant side effects such as hepatotoxicity.
  • stereoisomers means compounds of the present invention that have the same chemical formula or molecular formula but are sterically different. Each of these stereoisomers and mixtures thereof are also included within the scope of the present invention. Unless otherwise specified, solid bonds (-) connecting to asymmetric carbon atoms are wedged solid bonds ( ) or a wedge-shaped dotted line combination ( ) may be included.
  • the compound of Formula 1 of the present invention may exist in the form of a "pharmaceutically acceptable salt".
  • a pharmaceutically acceptable free acid may be useful, but is not limited thereto.
  • pharmaceutically acceptable salt is a concentration that has a relatively non-toxic and harmless effective effect on patients, and any of the compounds represented by Formula 1 do not reduce the beneficial effects of the compound represented by Formula 1 by side effects caused by the salt. means all organic or inorganic acid addition salts, or basic addition salts of
  • Acid addition salts can be prepared by conventional methods, for example, by dissolving a compound in an excess aqueous acid solution and precipitating the salt using a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. Equimolar amounts of the compound and acid or alcohol in water may be heated, and then the mixture may be evaporated to dryness, or the precipitated salt may be suction filtered.
  • a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile.
  • organic acids and inorganic acids may be used as the free acid, hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, or nitric acid may be used as the inorganic acid, and methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, Maleic acid, succinic acid, oxalic acid, benzoic acid, tartaric acid, fumaric acid, manderic acid, propionic acid, citric acid, lactic acid, glycolic acid, gluconic acid, galacturonic acid, glutamic acid, glutaric acid, glucuronic acid, aspartic acid, ascorbic acid, carbonic acid , vanillic acid, or hydroiodic acid may be used, but is not limited thereto.
  • a pharmaceutically acceptable metal salt may be prepared using a base.
  • the alkali metal salt or alkaline earth metal salt can be obtained, for example, by dissolving the compound in an excess alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the undissolved compound salt, and then evaporating and drying the filtrate.
  • the metal salt for example, sodium, potassium, or calcium salt may be prepared, but is not limited thereto.
  • Corresponding silver salts can also be obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable silver salt (eg, silver nitrate).
  • lipid nanoparticles of the present invention may contain one or two or more ionizable lipids represented by Formula 1.
  • an ionizable lipid other than the present invention may be further included.
  • the lipid nanoparticle may further include at least one selected from the group consisting of phospholipids, structural lipids, and PEG-lipids, but is not limited thereto.
  • the phospholipid serves to surround and protect the core formed by the interaction of the ionizable lipid and the drug within the lipid nanoparticle, and binds to the phospholipid bilayer of the target cell to pass through the cell membrane and escape endosomes during intracellular delivery of the drug. facilitate escape).
  • Phospholipids capable of promoting the fusion of lipid nanoparticles can be used without limitation as the phospholipids, for example, dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE), distearoylphosphatidylcholine (DSPC), palmitoyloleoylphosphatidylcholine (palmitoyloleoylphosphatidylcholine, POPC), egg phosphatidylcholine, EPC, dioleoylphosphatidylcholine, DOPC, dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC, dioleoylphosphatidylglycerol , DOPG), dipalmitoylphosphatidyl Glycerol (dipalmitoylphosphatidylglycerol, DPPG), distearoylphosphatidylethanolamine (DSPE), 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP) , Phos
  • the structural lipid imparts rigidity in terms of shape to the lipid filling within the lipid nanoparticle, and serves to improve the stability of the nanoparticle by being dispersed in the core and surface of the nanoparticle.
  • the structural lipid is, for example, cholesterol, cholesterol, spinasterol, pecosterol, sitosterol, ergosterol, ergostenol, campesterol, stigmasterol, brassicasterol, tomatidine, ursolic acid, alpha-tocopherol or these It may be a mixture of, but is not limited thereto.
  • PEG-lipid refers to a conjugated form of lipid and PEG, and means a lipid in which a polyethylene glycol polymer, which is a hydrophilic polymer, is bound to one end.
  • the PEG-lipid contributes to particle stability in serum of the nanoparticles within the lipid nanoparticles and serves to prevent aggregation between nanoparticles.
  • PEG-lipids can protect nucleic acids from degrading enzymes during in vivo delivery of nucleic acids, enhance stability of nucleic acids in vivo, and increase the half-life of drugs encapsulated in nanoparticles.
  • the PEG-lipid may be, for example, PEG-ceramide, PEG-DMG, PEG-c-DOMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC, PEG-DSPE or a mixture thereof, but is not limited thereto.
  • the molar ratio of ionizable lipid : phospholipid : structural lipid : PEG-lipid is 20 to 50 : 10 to 50 It may be 30:30 to 60:1 to 5.
  • the molar ratio may be 40 to 50:10 to 15:40 to 50:1 to 5, or 20 to 30:15 to 25:45 to 55:1 to 5, but is not limited thereto.
  • the lipid nanoparticles of the present invention exhibit a pKa of 6.0 to 7.0, specifically 6.5 to 7.0, thereby exhibiting a positive charge under acidic pH conditions, thereby easily interacting with drugs and therapeutic agents such as negatively charged nucleic acids and anionic drugs through electrostatic interaction.
  • An anionic drug can be encapsulated with high efficiency by forming a complex of , and can be used as an intracellular or in vivo drug delivery composition. Therefore, the lipid nanoparticles of the present invention can be usefully used for delivery of not only nucleic acids but also all types of anionic drugs. That is, the lipid nanoparticles of the present invention can be finally prepared in a form (encapsulated form) additionally containing an anionic drug.
  • the term "encapsulation” refers to encapsulation in order to surround and efficiently incorporate a delivery material into the living body, and the drug encapsulation rate (encapsulation efficiency) is the lipid It means the content of the drug encapsulated in the nanoparticles.
  • the anionic drug may be a nucleic acid, a small molecule compound, a peptide, a protein, a protein-nucleic acid structure or an anionic biopolymer-drug conjugate, but it can be stably and efficiently delivered by forming lipid nanoparticles together with the ionizable lipid of the present invention. It is not limited to this as far as possible.
  • the nucleic acid is siRNA, rRNA, DNA, aptamer, mRNA, tRNA, antisense oligonucleotide, shRNA, miRNA, sgRNA, tracrRNA, gRNA, ribozyme, PNA, DNAzyme, or a mixture thereof It may be, but is not limited thereto.
  • the weight ratio of ionizable lipid / nucleic acid in the lipid nanoparticles may be 1 to 20, for example, when using siRNA, the weight ratio of ionizable lipid / siRNA may be 5 to 10, and when using mRNA, the weight ratio of ionizable lipid / mRNA The weight ratio may be 7.5 to 12.5, but is not limited thereto.
  • the lipid nanoparticle may have a diameter of, for example, 60 to 100 nm, specifically 70 to 90 nm, more specifically 75 to 85 nm, but is not limited thereto. .
  • Another aspect of the present invention is a drug delivery composition comprising the anionic drug-containing lipid nanoparticles according to the present invention.
  • Another aspect of the present invention is a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the anionic drug-containing lipid nanoparticles according to the present invention as an active ingredient.
  • Lipid nanoparticles and anionic drugs are as described above.
  • the lipid nanoparticles of the present invention form stable complexes with anionic drugs such as nucleic acids and exhibit low cytotoxicity and effective cell absorption, they are effective in delivering anionic drugs. Therefore, the lipid nanoparticles have preventive or therapeutic effects on related diseases depending on the type of anionic drug and nucleic acid used, and can be used without limitation as a drug delivery composition.
  • treatment refers to intervening to alter the natural process of a diseased individual or cell, which may be performed during the course of a pathological condition or to prevent it. Desired therapeutic effects include preventing occurrence or recurrence of the disease, alleviating symptoms, reducing any direct or indirect pathological consequences of the disease, preventing metastasis, reducing the rate of disease progression, and alleviating the disease state. or providing temporary relief, remission or improving prognosis.
  • all activities that improve the course of diseases by administering lipid nanoparticles containing ionizable lipids containing disulfide bonds, stereoisomers thereof or pharmaceutically acceptable salts thereof, and anionic drugs as active ingredients include
  • the term "prevention" refers to all activities that suppress or delay the onset of a disease by administering the lipid nanoparticles.
  • the lipid nanoparticles of the present invention are used for treatment or prevention purposes, they are administered to a subject in a therapeutically effective amount.
  • therapeutically effective amount used in the present invention refers to an effective amount of anionic drug-containing lipid nanoparticles.
  • therapeutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type and severity of the subject, age, sex, type of disease, It may be determined according to the activity of the drug, the sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the rate of excretion, the duration of treatment, factors including drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, or may be administered sequentially or simultaneously with a commercially available therapeutic agent.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may be determined by an expert according to various factors such as the patient's condition, age, sex, and complications. Since the active ingredient of the composition of the present invention is excellent in safety, it can be used even at a dose determined above.
  • composition containing the lipid nanoparticles as an active ingredient may be administered orally, intramuscularly, intravenously, arterially, subcutaneously, intraperitoneally, pulmonaryly, and nasally by injection, but is not limited thereto.
  • composition of the present invention may further include one or more pharmaceutically acceptable carriers for administration.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may be a mixture of saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and one or more of these components, and, if necessary, antioxidants and buffers.
  • bacteriostatic agents and other conventional additives may be added.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders, and lubricants may be additionally added to prepare formulations for injections such as aqueous solutions, suspensions, and emulsions, pills, capsules, granules, or tablets.
  • composition of the present invention may be a patch, liquid, pill, capsule, granule, tablet, suppository or the like.
  • formulations may be prepared by a conventional method used for formulation in the art or a method disclosed in the literature [Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA], and may be formulated into various formulations according to each disease or component. can
  • Embodiments of the present invention may be modified in various other forms, and the scope of the present invention is not limited to the embodiments described below.
  • embodiments of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those skilled in the art.
  • "include” a certain component throughout the specification means that other components may be further included without excluding other components unless otherwise stated.
  • the ionizable lipid containing a disulfide bond according to the present invention stably delivers anionic drugs when preparing lipid nanoparticles and shows excellent effects in delivering nucleic acids, so that it can be usefully used in related technical fields such as lipid nanoparticle-mediated gene therapy.
  • Figure 2 is a picture taken of the internal structure of 221-SS lipid nanoparticles through a cryo-TEM electron microscope.
  • Figure 3 shows the results of measuring the luminescence intensity to test the efficacy of the siRNA-encapsulated lipid nanoparticles containing the ionizable lipid of the present invention in hepatocytes as an in vitro efficacy experiment.
  • Figure 4 shows the results of measuring the luminescence intensity in order to test the efficacy of mRNA-encapsulated lipid nanoparticles containing the ionizable lipid of the present invention in hepatocytes as an in vitro efficacy experiment.
  • Figure 5 shows the results of confirming the knockout effect of siFVII (Factor VII) in order to test the hepatocyte targeting potential of the siRNA-encapsulated lipid nanoparticles containing the ionizable lipid of the present invention as an in vivo efficacy experiment.
  • FIG. 6 is a photograph confirming bioluminescence after intravenous injection into mice to confirm in vivo delivery of mRNA-encapsulated 221-SS 3 tail lipid nanoparticles.
  • Figure 7 is a graph comparing bioluminescence after intravenous injection to mice to confirm the in vivo delivery efficiency according to the number of chains of mRNA-encapsulated 221-SS lipid nanoparticles.
  • FIG. 8 is a photograph confirming bioluminescence after intramuscular injection into a mouse in order to confirm in vivo delivery of mRNA-encapsulated 221-SS lipid nanoparticles.
  • FIG. 9 is a graph comparing and confirming bioluminescence after intramuscular injection into mice in order to confirm the in vivo delivery efficiency according to the number of chains of mRNA-encapsulated 221-SS lipid nanoparticles.
  • Figure 10 is to confirm the cytotoxicity of 221-SS lipid nanoparticles after preparing lipid nanoparticles that are not encapsulated with nucleic acid drugs and treating the lipid nanoparticles by concentration in four cell lines HepG2, MEF, Hela, and KB-GFP This is the result of confirming cytotoxicity.
  • 11 is a result of preparing and administering mFLuc-encapsulated lipid nanoparticles to confirm liver toxicity of silver 221-SS lipid nanoparticles, confirming AST and ALT levels, and comparing them with SM-102 lipids.
  • Example 1-1 Synthesis of ionizable lipids containing disulfide bonds
  • the disulfide bond-containing ionizable lipid of the present invention was prepared by combining several types of amine head groups with disulfide bond-containing alkyl chains using the synthesis methods of Schemes 1 and 2 above.
  • disulfide bond-containing ionizable lipids of the present invention are shown in Table 2 below.
  • Example 1-2 Identification of the synthesis of ionizable lipids containing disulfide bonds
  • MS analysis was performed by diluting the prepared compounds in ethanol at a concentration of 0.5 ppm or less.
  • a 6230 LC/MS from Agilent Technologies (Palo Alto, USA) was used for the analysis, and a Zorbax SB-C18 (100 mm ⁇ 2.1 mm i.d., 3.5 ⁇ m) from Agilent Technologies was used as a separation tube.
  • the MS analysis results are shown in Table 3 below.
  • Lipid nanoparticles containing the ionizable lipid of the present invention were prepared as shown in Tables 4 and 5 below.
  • siRNA-encapsulated LNPs (molar ratio, %) mRNA encapsulated LNPs (molar ratio, %) ionizable lipids 42.5 26.5 helper lipids 13 (DSPCs) 20 (DOPE) cholesterol 43 52 PEG-lipids 1.5 (Ceramide C16 PEG) 1.5 (Ceramide C16 PEG)
  • the ionizable lipid prepared in Example 1-1 cholesterol (Cholesterol powder, BioReagent, suitable for cell culture, ⁇ 99%, sigma, Korea), phospholipid (DSPC) (Avanti, USA), and C16-PEG2000 ceramide ( Avanti, USA) was dissolved in ethanol at a molar ratio of 42.5:13:43:1.5.
  • siRNA was dissolved in 50 mM sodium acetate (Sigma, Korea) buffer, and ethanol and acetate buffer in which ionizable lipid, cholesterol, phospholipid, and lipid-PEG were dissolved were mixed at a volume ratio of 1:3 at a flow rate of 12 ml/min. were mixed through a microfluidic mixing device (Benchtop Nanoassemblr; PNI, Canada) to prepare lipid nanoparticles.
  • a microfluidic mixing device Benchtop Nanoassemblr; PNI, Canada
  • the ionizable lipid prepared in Example 1-1 cholesterol (Cholesterol powder, BioReagent, suitable for cell culture, ⁇ 99%, sigma, Korea), phospholipid (DOPE) (Avanti, USA), and C16-PEG2000 ceramide ( Avanti, USA) was dissolved in ethanol at a molar ratio of 26.5:20:52:1.5.
  • lipid nanoparticles were prepared by a microfluidic mixing device (Benchtop Nanoassemblr; PNI, Canada) to prepare lipid nanoparticles.
  • a microfluidic mixing device Benchtop Nanoassemblr; PNI, Canada
  • lipid nanoparticles encapsulated with Firefly luciferase mRNA (SEQ ID NO: 1) or FVII siRNA (SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3) prepared in Example 2 was measured. Specifically, after preparing 221-SS 3 tail lipid nanoparticles encapsulated with mRNA or siRNA, respectively, the mRNA or siRNA contained in each lipid nanoparticle was diluted with PBS so that the concentration was 1 ⁇ g / ml.
  • the diameter, polydispersity index (PDI), and surface charge (zeta potential) of the lipid nanoparticles were measured using dynamic light scattering (DLS) in a Malvern Zetasizer Nano (Malvern Instruments, UK).
  • the encapsulation efficiency (drug encapsulation rate, %) of the lipid nanoparticles encapsulated with the mRNA or siRNA was measured through Ribogreen analysis (Quant-iT TM RiboGreen® RNA, Invitrogen). Lipid nanoparticles encapsulated with mRNA or siRNA were diluted with 50 ⁇ l of 1xTE buffer so that the final concentration of mRNA or siRNA was 4 to 7 ⁇ g / ml in a 96-well plate.
  • Triton-x LNP(-) The group not treated with Triton-X (Triton-x LNP(-)) added 50 ⁇ l of 1xTE buffer, and the group treated with Triton-X (Triton-X LNP(+)) added 50 ⁇ l of 2% Triton-X buffer. ⁇ l was added. After incubation at 37° C. for 10 minutes, the lipid nanoparticles were decomposed with Triton-X to release encapsulated nucleic acids. Then 100 ⁇ l of Ribogreen reagent was added to each well.
  • Fluorescence intensities (FL) of Triton LNP(-) and Triton LNP(+) were measured in Infinite® 200 PRO NanoQuant (Tecan) with a wavelength bandwidth (excitation: 485 nm, emission: 528 nm), and the drug encapsulation rate (encapsulation efficiency) , %) was calculated as in Equation 1 below.
  • Drug encapsulation rate (%) (Fluorescence of Triton LNP(+) - Fluorescence of Triton LNP(-))/(Fluorescence of Triton LNP(+)) X 100
  • the firefly luciferase mRNA (SEQ ID NO: 1) encapsulated lipid nanoparticles formulated in Examples 2-3 was analyzed by in vitro TNS (2-(p-toluidino)naphthalene-6-sulfonic acid) analysis. The pKa of was calculated.
  • the pH of a solution containing 20 mM sodium phosphate, 25 mM citric acid, 20 mM ammonium acetate, and 150 mM sodium chloride was adjusted from pH 3.5 to pH 11 at an interval of 0.5 using 0.1 N sodium hydroxide and/or 0.1 N hydrochloric acid. was adjusted to prepare solutions of various pH units. 100 ⁇ l of each solution having each pH was added to a black 96-well plate, and 300 ⁇ M of the TNS stock solution was added to each solution to a final concentration of 6 ⁇ M.
  • the formulated lipid nanoparticles were added to the mixed solution to a final concentration of 20 ⁇ M, and fluorescence intensity was measured (excitation: 325 nm, emission: 435 nm) using a Tecan instrument.
  • the pKa of the lipid nanoparticles was calculated as a pH value reaching half of the maximum fluorescence.
  • the lipid nanoparticles of the present invention had a pKa value of about 6.8 and exhibited an s-shaped curve on the graph (FIG. 1).
  • Anionic TNS interacts with positively charged ionizable lipids to become lipophilic, and as the pH value approaches the pKa value of LNP, the lipophilicity of TNS becomes lower and more water molecules quench TNS fluorescence, thus 6.0
  • Lipid nanoparticles having a pKa of 7.0 to 7.0 have excellent drug delivery efficiency in vivo.
  • lipid nanoparticles showing an "s-shaped curve" in a graph showing fluorescence according to pH means that they can easily interact with the endosome membrane and easily escape the endosome when acidified.
  • the mRNA-encapsulated lipid nanoparticles were concentrated to a final total lipid concentration of 15 to 25 mg/ml, and 2 to 4 ⁇ l of the LNP solution was placed on a copper grid and blotted. After that, the internal image of the lipid nanoparticles was measured using the cryo-TEM (FEI Tecnai F20 G2) equipment of the KIST Characterization Center (FIG. 2).
  • the test was carried out using each of the lipid nanoparticles (Compound 1 to Compound 5, Compound 11 and Compound 12) synthesized using various amine head groups in Hela cells engineered to express luciferase (Hela-Luc). Luciferase The expression of the gene was confirmed by measuring the luminescence intensity by delivering siRNA that inhibits the expression of .
  • Luc siRNA (SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5) encapsulated lipid nanoparticles 5 nM / well (based on siRNA concentration) HeLa cell line (Nexel, Korea) dispensed in 96-well at 1 x 10 6 cells / well processed on. After 24 hours, Bright-Glo TM luciferase assay solution (promega, USA) was treated with 100 ⁇ l/well, placed at room temperature for 10 minutes, and the luminescence intensity of the lysed cells was measured using an Infinite M200 luminometer (Tecan, US). measured (FIG. 3).
  • GFP mRNA was delivered to hepatocytes (HeLa) using each of the lipid nanoparticles (Compound 1 to Compound 5, Compound 11 and Compound 12) synthesized using various amine head groups, and the luminescence intensity was measured to detect the gene It was carried out in a way to confirm the expression of
  • lipid nanoparticles encapsulated with 100 ng GFP mRNA (SEQ ID NO: 6) was treated at 1 x 10 5 cells/well in a 96-well dispensed hepatocyte cell line (Nexel, Korea) did After 24 hours, the cell lysis buffer (Thermofischer, US) was treated with 100 ⁇ l/well and placed at room temperature for 10 minutes, and the fluorescence intensity of the lysed cells was measured using an Infinite M200 luminometer (Tecan, US). (Fig. 4).
  • FVII is specifically expressed in hepatocytes, the possibility of targeting lipid nanoparticles to hepatocytes was confirmed through FVII (Factor VII knockout effect) using siFVII.
  • 221-SS 3 tail lipid nanoparticles encapsulated with FVII-targeting siRNA (SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3) were prepared by the method of Example 2-2 (Table 7).
  • mice C57BL/6 female 7-week-old 20 g mice were intravenously injected with the lipid nanoparticles prepared above at a dose of 0.2 mg mg/kg (based on siRNA). After 3 days, blood was collected via tail vein and analyzed according to the protocol of coaset FVII assay kit. A standard curve was plotted with the blood of mice administered with PBS to measure the amount of FVII expression.
  • the lipid nanoparticles prepared using the ionizable lipids of the present invention effectively suppressed FVII expression in vivo, and from this, the lipid nanoparticles of the present invention target hepatocytes to target nucleic acids. It was confirmed that it could be delivered.
  • luciferase mRNA was delivered to mice, and then bioluminescence was confirmed to confirm gene expression.
  • 221-SS 3 tail lipid nanoparticles encapsulated with Luc mRNA were prepared by the method of Example 2-3.
  • the prepared lipid nanoparticles were intravenously injected at a dose of 0.1 mg/kg (mRNA basis) into 7-week-old C57BL/6 mice, and 3 hours later, 0.25 mg/kg of luciferin was administered intraperitoneally to emit bioluminescence through IVIS (PerkinElmer, USA) equipment. confirmed. As a result, it was confirmed that most of the lipid nanoparticles were delivered to the liver (Table 8 and FIG. 6).
  • each lipid nanoparticle was intravenously injected at a dose of 0.1 mg/kg (mRNA basis) into a 7-week-old C57BL/6 mouse, and 3 hours later, 0.25 mg/kg of luciferin was intraperitoneally administered through IVIS (PerkinElmer, USA) equipment. Bioluminescence was confirmed.
  • both 221-SS 3 tail and 221-SS 4 tail alone showed superior effects than the negative control group.
  • lipid nanoparticles were prepared by mixing two ionizable lipids, It was confirmed that an excellent effect was exhibited (FIG. 7).
  • lipid nanoparticles (221-SS 3 tail, 221-SS 4 tail alone or mixed) containing Luc mRNA as described above
  • 0.1 mg / kg concentration (mRNA basis) in C57BL / 6 mice was injected intramuscularly with After 3 hours, 0.25 mg/kg of luciferin was intraperitoneally administered, and bioluminescence was confirmed using IVIS (PerkinElmer, USA) equipment.
  • both 221-SS 3 tail and 221-SS 4 tail alone showed better effects than the negative control group, and especially when mixed, the effect was equivalent to that of SM-102. It was confirmed that the effect was shown (FIG. 9).
  • CCK-8 tetrazolium salt
  • lipid nanoparticles without encapsulating mRNA were prepared by mixing the components of the lipid nanoparticles except for mRNA using a microfluidic mixing device (Benchtop Nanoassemblr; PNI, Canada). 24 hours after cell seeding, lipid nanoparticles (based on ionizable lipids) corresponding to an amount of 0.5 ⁇ g, 5 ⁇ g, 50 ⁇ g or 100 ⁇ g per well were treated.
  • HepG2 and MEF cells showed some cytotoxicity even at low concentrations, but no cytotoxicity was shown in cancer cell lines such as HeLa and KB-GFP up to 0.5 ⁇ g (FIG. 10).
  • AST Aspartate transaminase
  • ALT Alanine transaminase
  • 221-SS 3 tail lipid nanoparticles encapsulated with Firefly luciferase mRNA were prepared, and 7-week-old C57BL/6 mice were then administered 1 mg/kg or 2 mg/kg of A single dose (based on mRNA) was administered.
  • SM-102 was used as a control. 24 hours after administration, blood was collected and the levels of AST and ALT were checked.
  • AST was confirmed to be at a level similar to that of FDA-approved SM-102 lipid, and in the case of ALT, the level was significantly reduced in the lipid nanoparticles of the present invention, indicating less liver toxicity (FIG. 11).

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Abstract

본 발명은 생분해성 이황화 결합을 포함하는 신규한 이온화 가능한 지질에 관한 것이다. 본 발명의 이황화 결합을 포함한 이온화 가능한 지질은 지질나노입자 제조 시 음이온성 약물을 안정적으로 전달하고, 특히 핵산 전달 시 우수한 효과를 보여 지질나노입자 매개 유전자치료 등 관련 기술분야에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

생분해성 이황화 결합을 포함하는 이온화 가능한 지질 및 이를 포함하는 지질나노입자
본 발명은 생분해성 이황화 결합을 포함하는 신규한 이온화 가능한 지질에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 생분해성 이황화 결합을 포함하는 이온화 가능한 지질, 이를 이용해 제조된 지질나노입자 및 그 용도에 관한 것이다.
약물전달시스템 (DDS; Drug Delivery System)은 약물의 부작용을 줄이고 효능 및 효과를 극대화시켜 필요한 양의 약물을 효율적으로 전달할 수 있도록 설계한 기술이다. 특히, 유전자 치료에 있어서 약물 전달체로는 종래 바이러스 전달체가 효과적임이 입증되었으나, 면역원성 (immunogenicity), 주입된 DNA 크기의 한계 및 대량생산의 어려움과 같은 여러 결점으로 인해 유전자전달 시스템으로서 바이러스의 이용이 제한되고 있다.
이에, 바이러스성 시스템의 대체 수단으로서 핵산을 세포 내로 운반하는 방법으로는 현재까지 양전하 지질 또는 중합체와 섞어 운반하는 방법 (각각 지질-DNA 접합체(lipoplex) 및 폴리머-DNA 접합체(polyplex)라 명명됨)이 주로 사용되고 있다 (Hirko et al., Curr, Med, Chem., 10, 1185-1193, 2003; Merdan et al., Adv. Drug. Deliv.Rev., 54, 715-758, 2002; Spagnou et al., Biochemistry, 43, 13348-13386, 2004). 특히, 지질-DNA 접합체는 핵산과 결합하여 세포 내로 핵산을 잘 전달시켜 세포수준에서 많이 사용되고 있으나, 생체 내에서는 국부적으로 주사 시 많은 경우 체내에서 염증을 유발시키며 (Filonand and Phillips, Biochim. Biophys/Acta, 1329, 345-356, 1997), 혈관 내 주사 시 주로 1 차 통과기관들인 폐, 간, 비장 등과 같은 조직에 축적되는 단점이 있다 (Ren et al., Gene Therapy. 7, 764-768, 2000).
이러한 배경하에, 본 발명자들은 약물의 봉입률이 우수하며 목적하는 기관 또는 세포에 핵산 등 음이온성 약물을 효율적으로 전달할 수 있는 신규 물질을 개발하고자 예의 노력한 결과, 본 발명의 생분해성 이황화 결합을 포함하는 신규 이온화 가능한 지질의 우수한 약물 전달 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 신규한 구조의 생분해성 이황화 결합을 포함하는 이온화 가능한 지질, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 이온화 가능한 지질, 이의 입체 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 지질나노입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 다른 목적은 상기 지질나노입자 및 음이온성 약물을 포함하는 약물 전달용 조성물 및 간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들이 연구 노력한 결과, 하기 화학식 1로 표시되는 이황화 결합을 포함하는 이온화 가능한 지질이 지질나노입자 제조 시 약물을 안정적이고 효과적으로 전달하고, 간 독성 등 부작용이 적음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
이황화 결합을 포함하는 이온화 가능한 지질
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 하기 화학식 1로 표시되는 이온화 가능한 지질, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2023000738-appb-img-000001
여기서, A는
Figure PCTKR2023000738-appb-img-000002
또는
Figure PCTKR2023000738-appb-img-000003
이고,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -C1-6알킬, -C1-6알킬-NR3R4, -C1-3알킬-S-S-C6-16알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)O-C4-12알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)-C4-12알킬 또는 -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)NH-C4-12알킬로부터 선택된 어느 하나이고,
R3 및 R4는 각각 독립적으로 -H, -C1-6알킬, -C1-3알킬-S-S-C6-16알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)O-C4-12알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)-C4-12알킬 또는 -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)NH-C4-12알킬로부터 선택된 어느 하나이고,
R5는 -C1-6알킬-NR3R4, -C1-3알킬-S-S-C6-16알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)O-C4-12알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)-C4-12알킬 또는 -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)NH-C4-12알킬이고,
X는 아무 것도 아니거나 (null), -O- 또는 -NH-이고,
m은 0 내지 5의 정수이고,
n은 1 내지 3의 정수이고,
l은 1 내지 3의 정수이고,
p는 0 내지 2의 정수이고,
q는 0 또는 1이고, 및
r은 2 내지 10의 정수이다.
이에 제한되는 것은 아니나, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 구체적으로, 상기 화학식 1에서,
A는
Figure PCTKR2023000738-appb-img-000004
이고,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -C1-3알킬, -C1-4알킬-NR3R4, -C1-3알킬-S-S-C8-14알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)O-C6-10알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)-C6-10알킬 또는 -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)NH-C6-10알킬로부터 선택된 어느 하나이고,
R3 및 R4는 각각 독립적으로 -H, -C1-3알킬, -C1-3알킬-S-S-C8-14알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)O-C6-10알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)-C6-10알킬 또는 -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)NH-C6-10알킬로부터 선택된 어느 하나이고,
X는 아무 것도 아니거나 (null), -O- 또는 -NH-이고,
m은 0 내지 3의 정수이고,
n은 1 내지 3의 정수이고,
l은 1 내지 3의 정수이고,
q는 0 또는 1이고, 및
r은 5 내지 9의 정수일 수 있다.
또한, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 상기 화학식1에서,
A는
Figure PCTKR2023000738-appb-img-000005
이고,
R3 및 R4는 각각 독립적으로 -H, -C1-3알킬, -C1-3알킬-S-S-C8-14알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)O-C6-10알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)-C6-10알킬 또는 -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)NH-C6-10알킬로부터 선택된 어느 하나이고,
R5는 -C1-4알킬-NR3R4, -C1-3알킬-S-S-C8-14알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)O-C6-10알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)-C6-10알킬 또는 -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)NH-C6-10알킬 이고,
X는 아무 것도 아니거나 (null), -O- 또는 -NH-이고,
m은 0 내지 3의 정수이고,
n은 1 내지 3의 정수이고,
l은 1 내지 3의 정수이고,
p는 1이고,
q는 0 또는 1이고, 및
r은 5 내지 9의 정수일 수 있다.
또한 본 발명의 구체예에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기에 표 1에 기재된 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
Figure PCTKR2023000738-appb-img-000006
Figure PCTKR2023000738-appb-img-000007
본 발명에 있어서, 용어 "알킬"은 다른 기재가 없는 한, 직쇄 또는 분지쇄의 비고리형 포화 탄화수소를 의미한다. 예를들어, "C1-6알킬"은 탄소원자를 1 내지 6 개 포함하는 알킬을 의미할 수 있다. 본 발명의 알킬 구조에서 단순한 치환기의 부가 등을 한 경우라도, 본 발명의 이온화 가능한 지질과 동등한 효과를 가지는 한 모두 균등 범위로 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명에 있어서, 용어 "이온화 가능한 지질 (ionizable lipid) "은 용이하게 양성자화 될 수 있는 아민-함유 지질을 의미하고, 지질 유사체 (lipidoid)로도 명명된다. 상기 이온화 가능한 지질은, 주변 pH에 따라 전하상태가 변할 수 있으므로, 음이온성 약물과 정전기적 상호작용을 통하여 상기 약물이 지질나노입자 내에 높은 효율로 봉입되도록 하는 역할을 수행하며, 지질나노입자의 구조를 형성하는데 기여한다. 본 발명의 이온화 가능한 지질은 적어도 하나 이상의 일차 아민을 포함하는 아민 헤드에 이황화 결합을 포함하는 알킬 사슬이 결합된 형태를 갖는 것을 특징으로 하며, 핵산 전달 시 기존에 알려진 다른 이온화 가능한 지질에 비하여 생체 내에서 조직 특이성, 유전자 발현율과 같은 효능이 우수하고 약물 전달 이후 생체 내에서 쉽게 분해되어 간독성과 같은 부작용이 크지 않다는 장점을 갖는다.
본 발명에 있어서, 용어 "입체이성질체"는 동일한 화학식 또는 분자식을 가지지만 입체적으로 다른 본 발명의 화합물을 의미한다. 이러한 각각의 입체이성질체 및 그것의 혼합물들 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 다른 설명이 없는 한, 비대칭 탄소 원자와 연결되는 실선 결합 (-)은 입체 중심의 절대적 배열을 나타내는 쐐기형 실선 결합(
Figure PCTKR2023000738-appb-img-000008
) 또는 쐐기형 점선 결합 (
Figure PCTKR2023000738-appb-img-000009
)을 포함할 수 있다.
본 발명의 화학식 1의 화합물은 "약학적으로 허용가능한 염"의 형태로 존재할 수 있다. 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산 (free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한 염"이란 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 화학식 1로 표시되는 화합물의 이로운 효능을 저하시키지 않는 상기 화합물의 임의의 모든 유기산 또는 무기산 부가염, 또는 염기부가염을 의미한다.
산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토나이트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.
이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 또는 질산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메테인설폰산, p-톨루엔설폰산, 아세트산, 트라이플루오로아세트산, 말레인산, 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산, 구연산, 젖산, 글리콜산, 글루콘산, 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산, 글루쿠론산, 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 또는 아이오딘화수소산 등을 사용할 수 있으나, 이들에 제한되지 않는다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 이때, 금속염으로는 예컨대 나트륨, 칼륨, 또는 칼슘염을 제조할 수 있으나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
이황화 결합을 포함하는 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질나노입자
본 발명의 다른 하나의 양태는 상술한 화학식 1로 표시되는 이온화 가능한 지질 (ionizable lipid), 이의 입체이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 지질나노입자이다. 본 발명의 지질나노입자는 화학식 1로 표시되는 이온화 가능한 지질을 1 종 포함하거나, 또는 2 종 이상 포함하는 것일 수 있다. 또한, 목적에 따라 본 발명 외의 이온화 가능한 지질을 추가적으로 더 포함할 수 있다.
상기 지질나노입자는 인지질, 구조적 지질, 및 PEG-지질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 인지질은 지질나노입자 내에서 이온화 가능한 지질 및 약물이 상호 작용하여 형성된 코어를 감싸서 보호하는 역할을 수행하며, 타겟 세포의 인지질 이중층과 결합하여 약물의 세포 내 전달 시 세포막 통과 및 엔도좀 탈출 (endosomal escape)을 용이하게 한다. 상기 인지질은 지질나노입자의 융합을 촉진할 수 있는 인지질을 제한 없이 사용할 수 있으며, 예컨대, 디올레일포스파티딜에탄올아민 (dioleoylphosphatidylethanolamine, DOPE), 디스테아로일포스파티딜콜린 (distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린 (palmitoyloleoylphosphatidylcholine, POPC), 에그 포스파티딜콜린 (egg phosphatidylcholine, EPC), 디올레오일포스파티딜콜린 (dioleoylphosphatidylcholine, DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린 (dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤 (dioleoylphosphatidylglycerol, DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (dipalmitoylphosphatidylglycerol, DPPG), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민 (distearoylphosphatidylethanolamine, DSPE), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모니움-프로판 (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane, DOTAP), 포스파티딜에탄올아민 (Phosphatidylethanolamine, PE), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민 (dipalmitoylphosphatidylethanolamine), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트 (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate, 18-PA), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-diarachidoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, ME 16:0 PE), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, POPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[포스포-L-세린] (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[phospho-L-serine], DOPS), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DLPC), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-포스포콜린 (1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, DMPC), 1,2-디운데카노일-sn-글리세로-포스포콜린 (1,2-diundecanoyl-sn-glycero-phosphocholine, DUPC), 1,2-디-O-옥타데세닐-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1,2-di-O-octadecenyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 18:0 디에테르 PC), 1-올레오일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1-oleoyl-2-cholesterylhemisuccinoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, OChemsPC), 1-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린 (1-hexadecyl-sn-glycero-3-phosphocholine, C16 Lyso PC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-diarachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-didocosahexaenoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), 스핑고미엘린, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
상기 구조적 지질은 지질나노입자 내에서 지질 충전에 형태적 측면에서 견고성을 부여하며, 나노입자의 코어 및 표면에 분산되어 나노입자의 안정성을 향상시키는 역할을 한다. 상기 구조적 지질은 예컨대, 콜레스테롤, 콜레스테놀, 스피나스테롤, 페코스테롤, 시토스테롤, 에르고스테롤, 에르고스테놀, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 토마티딘, 우르솔산, 알파-토코페롤 또는 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 PEG-지질은 지질과 PEG가 컨쥬게이트된 형태를 지칭하는 것으로, 일측 단부에 친수성 중합체인 폴리에틸렌글리콜 중합체가 결합된 지질을 의미한다. 상기 PEG-지질은 지질나노입자 내에서 나노입자의 혈청 내 입자 안정성에 기여하며, 나노입자 간 응집을 막는 역할을 수행한다. 또한, PEG-지질은 핵산의 생체 내 전달 시 분해효소로부터 핵산을 보호하여 핵산의 체내 안정성을 강화시키며, 나노입자 내 봉입된 약물의 반감기를 증가시킬 수 있다. 상기 PEG-지질은 예컨대, PEG-세라마이드, PEG-DMG, PEG-c-DOMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC, PEG-DSPE 또는 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체예로서, 본 발명의 이온화 가능한 지질과 인지질, 구조적 지질 및 PEG 지질을 혼합하여 지질나노입자를 제조할 경우, 이온화 가능한 지질 : 인지질 : 구조적 지질 : PEG-지질의 몰비는 20 내지 50 : 10 내지 30 : 30 내지 60 : 1 내지 5일 수 있다. 또한, 상기 몰비는 40 내지 50 : 10 내지 15 : 40 내지 50 : 1 내지 5일 수 있고, 또는 20 내지 30 : 15 내지 25 : 45 내지 55 : 1 내지 5 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 지질나노입자는 6.0 내지 7.0, 구체적으로 6.5 내지 7.0의 pKa를 나타냄으로써 산성 pH 조건에서 양전하를 나타내어 음전하를 나타내는 핵산 및 음이온성 약물 등의 치료제와 정전기적 상호작용을 통해 용이하게 약물과의 복합체를 형성하여 높은 효율로 음이온성 약물을 봉입할 수 있으며, 약물의 세포 내 또는 생체 내 약물 전달 조성물로서 사용될 수 있다. 따라서 본 발명의 지질나노입자는 핵산뿐만 아니라 음이온을 띄는 모든 형태의 약물의 전달에 유용하게 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 지질나노입자는 최종적으로 음이온성 약물을 추가로 포함하는 형태 (봉입된 형태)로 제조될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "봉입 (encapsulation)"은 전달물질을 둘러싸서 효율적으로 생체 내로 함입 시키기 위해 캡슐화하는 것을 말하고, 약물 봉입률 (캡슐화 효율, Encapsulation efficiency)은 제조에 사용된 전체 약물 함량에 대하여 지질나노입자 내에 봉입된 약물의 함량을 의미한다.
상기 음이온성 약물은 핵산, 저분자 화합물, 펩타이드, 단백질, 단백질-핵산 구조체 또는 음이온성 생체고분자-약물 접합체 등일 수 있으나, 본 발명의 이온화 가능한 지질과 함께 지질나노입자를 형성하여 안정적이고 효율적으로 전달될 수 있는 한 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 핵산은 siRNA, rRNA, DNA, 앱타머 (aptamer), mRNA, tRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, shRNA, miRNA, sgRNA, tracrRNA, gRNA, 리보자임 (ribozyme), PNA, DNAzyme, 또는 이들의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 지질나노입자에서 이온화 가능한 지질/핵산의 중량비는 1 내지 20일 수 있으며, 예컨대 siRNA를 사용할 경우 이온화 가능한 지질/siRNA의 중량비는 5 내지 10일 수 있고, mRNA를 사용할 경우 이온화 가능한 지질/mRNA의 중량비는 7.5 내지 12.5일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 지질나노입자는 예컨대 60 내지 100 nm의 지름 크기를 갖는 것일 수 있고, 구체적으로 70 내지 90 nm, 더욱 구체적으로 75 내지 85 nm의 지름 크기를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
지질나노입자를 포함하는 약물 전달용 및 약학적 조성물
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명에 따른 음이온성 약물 함유 지질나노입자를 포함하는, 약물 전달용 조성물이다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 본 발명에 따른 음이온성 약물 함유 지질나노입자를 유효성분으로 포함하는, 약학적 조성물이다.
지질나노입자 및 음이온성 약물에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.
본 발명의 지질나노입자는 핵산 등의 음이온성 약물과 안정된 복합체를 형성하고 낮은 세포독성 및 효과적인 세포 흡수성을 나타내므로, 음이온성 약물을 전달하는데 효과적이다. 따라서, 상기 지질나노입자는 사용되는 음이온성 약물의 종류, 핵산의 종류에 따라 관련 질환에 예방 또는 치료 효과를 가지며, 약물 전달용 조성물로서 제한 없는 활용 가능성이 있다.
본 발명에서 용어, "치료"는 질병을 갖는 개개인 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위해 개입하는 것을 지칭하고, 이는 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행될 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 전이를 예방하고, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 특히, 본 발명에서는 이황화 결합을 포함한 이온화 가능한 지질, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 및 음이온성 약물을 유효성분으로 포함하는 지질나노입자의 투여로 질병의 경과를 호전시키는 모든 행위를 포함한다. 또한, 용어 "예방"은 상기 지질나노입자의 투여로 질병의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다. 본 발명의 지질나노입자가 치료 또는 예방 목적으로 사용될 경우, 개체에 치료학적으로 유효한 양으로 투여된다.
본 발명에서 사용되는 "치료학적으로 유효한 양"이라는 용어는 음이온성 약물 함유 지질나노입자의 유효한 양을 나타낸다. 구체적으로, "치료학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 시판되는 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여 용량은, 환자의 상태, 연령, 성별 및 합병증 등의 다양한 요인에 따라 전문가에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 유효성분은 안전성이 우수하므로, 결정된 투여 용량 이상으로도 사용될 수 있다.
상기 지질나노입자를 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 근육, 정맥, 동맥, 피하, 복강, 폐, 및 비강 주사 등으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 투여를 위해서 추가로 약학적으로 허용가능한 담체를 1 종 이상 더 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 패치제, 액제, 환약, 캡슐, 과립, 정제, 좌제 등일 수 있다. 이들 제제는 당 분야에서 제제화에 사용되는 통상의 방법 또는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA]에 개시되어 있는 방법으로 제조될 수 있으며 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 다양한 제제로 제제화될 수 있다.
본 발명의 실시 형태는 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함"한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 이황화 결합을 포함한 이온화 가능한 지질은 지질나노입자 제조 시 음이온성 약물을 안정적으로 전달하고, 특히 핵산 전달 시 우수한 효과를 보여 지질나노입자 매개 유전자치료 등 관련 기술분야에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 221-SS 지질나노입자의 TNS 실험을 통한 pKa 측정 결과이다.
도 2는 Cryo-TEM 전자현미경을 통해 221-SS 지질나노입자의 내부 구조를 찍은 사진이다.
도 3은 시험관 내 효능 실험으로, 간세포에서 본 발명의 이온화 가능한 지질을 포함한 siRNA 봉입 지질나노입자의 효능을 실험하기 위하여 발광 강도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 4는 시험관 내 효능 실험으로, 간세포에서 본 발명의 이온화 가능한 지질을 포함한 mRNA 봉입 지질나노입자의 효능을 실험하기 위하여 발광 강도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 5는 생체 내 효능 실험으로, 본 발명의 이온화 가능한 지질을 포함한 siRNA 봉입 지질나노입자의 간세포 타겟 가능성을 실험하기 위하여 siFⅦ (Factor Ⅶ 녹아웃 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 mRNA 봉입 221-SS 3 tail 지질나노입자의 생체 내 전달을 확인하기 위하여 마우스에 정맥주사한 후 생체발광을 확인한 사진이다.
도 7은 mRNA 봉입 221-SS 지질나노입자의 사슬 개수에 따른 생체 내 전달효능을 확인하기 위하여 마우스에 정맥주사한 후 생체발광을 확인하고 비교한 그래프이다.
도 8은 mRNA 봉입 221-SS 지질나노입자의 생체 내 전달을 확인하기 위하여 마우스에 근육주사한 후 생체발광을 확인한 사진이다.
도 9는 mRNA 봉입 221-SS 지질나노입자의 사슬 개수에 따른 생체 내 전달효능을 확인하기 위하여 마우스에 근육주사한 후 생체발광을 확인하고 비교한 그래프이다.
도 10은 221-SS 지질나노입자의 세포독성을 확인하기 위하여 핵산 약물이 봉입되지 않은 지질나노입자를 제조해 HepG2, MEF, Hela, KB-GFP 4 가지 세포주에 지질나노입자를 농도별로 처리한 후 세포독성을 확인한 결과이다.
도 11은 은 221-SS 지질나노입자의 간 독성을 확인하기 위하여 mFLuc가 봉입된 지질나노입자를 제조해 투여한 후 AST, ALT 수준을 확인하고 SM-102 지질과 비교한 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 이황화 결합 포함 이온화 가능한 지질 (ionizable lipid)의 제조
실시예 1-1. 이황화 결합 포함 이온화 가능한 지질의 합성
[반응식 1]
Figure PCTKR2023000738-appb-img-000010
[반응식 2]
Figure PCTKR2023000738-appb-img-000011
상기 반응식 1과 2의 합성법을 이용하여 여러 종류의 아민 헤드그룹과 이황화 결합을 포함하는 알킬 사슬을 결합시켜 본 발명의 이황화 결합 포함 이온화 가능한 지질을 제조하였다.
화합물 1의 제조
화합물 1은 반응식 1을 이용하여 합성하였다. THF (Tetrahydrofuran) 용매에 아민 헤드 201 (N1,N1-dimethylethane-1,2-diamine) 1 당량과 에틸렌 설파이드를 2.4 당량의 비율대로 넣었다. 그 후, 전자자기파 반응기를 이용하여 150 ℃에서 한 시간 반 동안 반응시켰다. 생성물의 1 당량에 3 당량의 2,2'-디피리딜설파이드를 넣고, 25 ℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응물 농축 후, 생성물을 DCM (Dichloromethane)에 녹여 알칸티올을 3.6 당량 넣고, 밤새 반응시켰다. 그 후, CombiFlash 컬럼을 이용하여 DCM/MeOH (5 : 1 v/v ratio)에서 정제를 진행하여 화합물 1을 합성하였다.
화합물 2의 제조
화합물 2은 반응식 1을 이용하여 합성하였다. 아민 헤드 202 (N1,N1-diethylpropane-1,3-diamine)를 이용하여 화합물 1의 제조 합성과 유사한 방법으로 진행하여 화합물 2를 합성하였다.
화합물 3의 제조
화합물 3은 반응식 1을 이용하여 합성하였다. 아민 헤드 205 (N1,N1-dimethylpropane-1,3-diamine)를 이용하여 화합물 1의 제조 합성과 유사한 방법으로 진행하여 화합물 3을 합성하였다.
화합물 4의 제조
화합물 4는 반응식 1을 이용하여 합성하였다. THF (Tetrahydrofuran) 용매에 아민 헤드 211 (N1-(3-aminopropyl)-N3,N3-dimethylpropane-1,3-diamine) 1 당량과 에틸렌 설파이드를 3.6 당량의 비율대로 넣었다. 그 후, 전자자기파 반응기를 이용하여 150 ℃에서 한 시간 반 동안 반응시켰다. 생성물의 1 당량에 4.5 당량의 2,2'-디피리딜설파이드를 넣고, 25 ℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응물 농축 후, 생성물을 DCM (Dichloromethane)에 녹여 알칸티올을 6 당량 넣고, 밤새 반응시켰다. 그 후, CombiFlash 컬럼을 이용하여 DCM/MeOH (5 : 1 v/v ratio)에서 정제를 진행하여 화합물 4를 합성하였다.
화합물 5의 제조
화합물 5는 반응식 2를 이용하여 합성하였다. 톨루엔 (Toluene) 용매에 아민 헤드 221 (N1-(3-aminopropyl)-N1-methylpropane-1,3-diamine) 1 당량과 에틸렌 설파이드를 6 당량의 비율대로 넣었다. 그 후, 봉인된 튜브에서 100 ℃, 16 시간 동안 반응시켰다. 반응물은 필터 후 농축하고, C18 역상컬럼을 이용하여 MeCN/water(15 :85 v/v ratio)에서 정제하여 중간체를 얻었다. 생성물 1 당량과 3.5 당량의 2-(알킬다이설파닐)피리딘을 넣고, 메탄올에 녹여 20 ℃에서 16 시간 동안 반응시켰다. 그 후, CombiFlash 컬럼을 이용하여 EA/MeOH (93: 7 v/v ratio)에서 정제를 진행하여 화합물 5를 합성하였다.
화합물 6의 제조
화합물 6은 반응식 2를 이용하여 합성하였다. 톨루엔 (Toluene) 용매에 아민 헤드 221 (N1-(3-aminopropyl)-N1-methylpropane-1,3-diamine) 1 당량과 에틸렌 설파이드를 10 당량의 비율대로 넣었다. 그 후, 봉인된 튜브에서 100 ℃, 16 시간 동안 반응시켰다. 반응물은 필터 후 농축하고, C18 역상컬럼을 이용하여 MeCN/water(0:100 v/v ratio)에서 정제하여 중간체를 얻었다. 생성물 1 당량과 4.3 당량의 2-(알킬다이설파닐)피리딘을 넣고, 메탄올에 녹여 20 ℃에서 16 시간 동안 반응시켰다. 그 후, CombiFlash 컬럼을 이용하여 EA/MeOH (93: 7 v/v ratio)에서 정제를 진행하여 화합물 6을 합성하였다.
화합물 7의 제조
화합물 7은 반응식 1을 이용하여 합성하였다. THF (Tetrahydrofuran) 용매에 아민 헤드 221 (N1-(3-aminopropyl)-N1-methylpropane-1,3-diamine) 1 당량과 에틸렌 설파이드를 4.8 당량의 비율대로 넣었다. 그 후, 전자자기파 반응기를 이용하여 150 ℃에서 한 시간 반 동안 반응시켰다. 생성물의 1 당량에 6 당량의 2,2'-디피리딜설파이드를 넣고, 25 ℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응물 농축 후, 생성물을 DCM (Dichloromethane)에 녹여 알칸티올을 8 당량 넣고, 밤새 반응시켰다. 그 후, CombiFlash 컬럼을 이용하여 DCM/MeOH (5 : 1 v/v ratio)에서 정제를 진행하여 화합물 7을 합성하였다.
화합물 8의 제조
화합물 8은 반응식 1을 이용하여 합성하였다. 아민 헤드 221 (N1-(3-aminopropyl)-N1-methylpropane-1,3-diamine)을 이용하여 화합물 7의 제조 합성과 유사한 방법으로 진행하여 화합물 8을 합성하였다.
화합물 9의 제조
화합물 9는 반응식 1을 이용하여 합성하였다. 아민 헤드 221 (N1-(3-aminopropyl)-N1-methylpropane-1,3-diamine)을 이용하여 화합물 7의 제조 합성과 유사한 방법으로 진행하여 화합물 9를 합성하였다.
화합물 10의 제조
화합물 10은 반응식 1을 이용하여 합성하였다. 아민 헤드 221 (N1-(3-aminopropyl)-N1-methylpropane-1,3-diamine)을 이용하여 화합물 7의 제조 합성과 유사한 방법으로 진행하여 화합물 10을 합성하였다.
화합물 11의 제조
화합물 11은 반응식 1을 이용하여 합성하였다. 아민 헤드 244 (1-(2-Aminoethyl)piperazine)을 이용하여 화합물 4의 제조 합성과 유사한 방법으로 진행하여 화합물 11을 합성하였다.
화합물 12의 제조
화합물 12는 반응식 1을 이용하여 합성하였다. THF (Tetrahydrofuran) 용매에 아민 헤드 246 (1,4-bis(3aminopropyl)piperazine) 1 당량과 에틸렌 설파이드를 6 당량의 비율대로 넣었다. 그 후, 전자자기파 반응기를 이용하여 150 ℃에서 한 시간 반 동안 반응시켰다. 생성물의 1 당량에 8 당량의 2,2'-디피리딜설파이드를 넣고, 25 ℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응물 농축 후, 생성물을 DCM (Dichloromethane)에 녹여 알칸티올을 10 당량 넣고, 밤새 반응시켰다. 그 후, CombiFlash 컬럼을 이용하여 DCM/MeOH (5 : 1 v/v ratio)에서 정제를 진행하여 화합물 12를 합성하였다.
본 발명의 이황화 결합 포함 이온화 가능한 지질의 구체적인 실시예는 하기 표 2에 나타내었다.
Figure PCTKR2023000738-appb-img-000012
Figure PCTKR2023000738-appb-img-000013
실시예 1-2. 이황화 결합 포함 이온화 가능한 지질의 합성 확인
상기 실시예 1-1에서 제조한 이온화 가능한 지질의 합성을 확인하기 위하여 1H NMR을 수행하였다.
구체적으로 합성된 이온화 가능한 지질 5 μg을 DMSO (sigma, USA) 0.5 ml에 희석하여 100 mmol 농도가 되도록 준비한 후, 400 MHz NMR 전용 튜브에 0.5 ml씩 넣고 상부를 막은 후 파라필름으로 실링하여 Agilent 400MHZ FT-NMR (Agilent, USA)을 이용하여 NMR 스펙트라를 얻었다.
221-SS 3 tail의 중간체 및 최종 생성물의 1H-NMR 결과값은 다음과 같다.
중간체의 1H-NMR (400MHz, METHANOL-d4) δ(ppm): 3.40-3.32 (m, 4H), 3.31-3.13 (m, 12H), 2.93 (s, 3H), 2.91-2.80(m, 4H), 2.32-2.08 (m,4H)
최종생성물의 1H-NMR (400MHz, CHLOROFORM-d) δ(ppm): 2.98-2.91 (m, 2H), 2.86-2.74 (m, 10H), 2.73-2.62 (m, 8H), 2.51 (m, 2H), 2.44-2.34 (m, 4H), 2.22 (s,3H), 1.71-1.65 (m, 8H), 1.38-1.25 (m,56H), 0.88 (t, J = 6.7Hz, 9H)
또한, 상기 실시예 1-1에서 제조한 화합물들의 합성을 확인하기 위하여, 제조된 화합물을 0.5 ppm 이하 농도로 에탄올에 희석하여 MS 분석을 수행하였다. 분석에 사용된 기기는 Agilent Technologies사 (Palo Alto, USA)의 6230 LC/MS, 분리관은 Agilent Technologies사 Zorbax SB-C18 (100 mmХ2.1 mm i.d., 3.5 μm)를 사용하였다. MS 분석 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
화합물 화학식 계산된 m/z 비율 관찰된 m/z 비율
1 C32H68N2S4 609.1557 609.4369
2 C33H70N2S4 623.1823 623.4511
3 C35H74N2S4 651.2354 651.5721
4 C50H105N3S6 940.7788 940.6706
5 C49H103N3S6 926.7522 926.6560
6 C63H131N3S8 1187.2543 1186.8182
10 C46H91N3O6S6 974.5305 974.5297
11 C48H99N3S6 910.7097 910.6240
12 C66H136N4S8 1242.33 1241.8603
실시예 2. 지질나노입자의 제조
실시예 2-1. 제제 파라미터
본 발명의 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질나노입자는 하기 표 4 및 표 5와 같이 제조되었다.
중량 비
이온화 가능한 지질/siRNA 7.5
이온화 가능한 지질/mRNA 10
siRNA 봉입 LNP
(몰비, %) 		mRNA 봉입 LNP
(몰비, %)
이온화 가능한 지질 42.5 26.5
헬퍼 지질 13 (DSPC) 20 (DOPE)
콜레스테롤 43 52
PEG-지질 1.5 (세라마이드 C16 PEG) 1.5 (세라마이드 C16 PEG)
실시예 2-2. siRNA가 봉입된 지질나노입자의 제조
상기 실시예 1-1에서 제조한 이온화 가능한 지질, 콜레스테롤 (Cholesterol powder, BioReagent, suitable for cell culture, ≥99%, sigma, 한국), 인지질 (DSPC)(Avanti, 미국), 및 C16-PEG2000 세라마이드 (Avanti, 미국)를 에탄올에 42.5 : 13 : 43 : 1.5의 몰 비로 용해시켰다.
그 후 siRNA를 50 mM 아세트산나트륨 (sigma, 한국) 완충액에 용해시켰고, 이온화 가능한 지질, 콜레스테롤, 인지질, 및 지질-PEG가 용해된 에탄올 및 아세테이트 완충액을 1 : 3의 부피비로 12 ml/min의 유속으로 미세 유체 혼합 장치 (Benchtop Nanoassemblr; PNI, Canada)를 통해 혼합하여, 지질나노입자를 제조하였다.
실시예 2-3. mRNA가 봉입된 지질나노입자의 제조
상기 실시예 1-1에서 제조한 이온화 가능한 지질, 콜레스테롤 (Cholesterol powder, BioReagent, suitable for cell culture, ≥99%, sigma, 한국), 인지질 (DOPE)(Avanti, 미국), 및 C16-PEG2000 세라마이드 (Avanti, 미국)를 에탄올에 26.5 : 20 : 52 : 1.5의 몰 비로 용해시켰다.
그 후 mRNA를 10 mM 시트르산 나트륨 (sigma, 한국) 완충액에 용해시켰고, 이온화 가능한 지질, 콜레스테롤, 인지질, 및 지질-PEG가 용해된 에탄올 및 시트르산 완충액을 1 : 3의 부피비로 12 ml/min의 유속으로 미세 유체 혼합 장치 (Benchtop Nanoassemblr; PNI, Canada)를 통해 혼합하여, 지질나노입자를 제조하였다.
실험예 1: 지질나노입자의 물리화학적 특성 확인
실험예 1-1. 입자 크기, 다분산도 (PDI, polydispersity index), 표면 전하 (zeta potential) 및 약물 봉입률 측정
상기 실시예 2에서 제조된 파이어플라이 루시퍼라아제 mRNA (서열번호 1) 또는 FVII siRNA (서열번호 2 및 서열번호 3)가 봉입된 지질나노입자의 크기를 측정하고자 하였다. 구체적으로, mRNA 또는 siRNA가 봉입된 221-SS 3 tail 지질나노입자를 각각 제조한 후, 각 지질나노입자에 포함된 mRNA 또는 siRNA의 농도가 1 μg/ml가 되도록 PBS를 사용하여 희석하였다. 그 후, Malvern Zetasizer Nano (Malvern Instruments, UK)에서 동적 광산란 (DLS)을 사용하여 지질나노입자의 지름, 다분산도 (PDI; polydispersity index), 표면 전하 (zeta potential)를 측정하였다.
다음으로, Ribogreen 분석 (Quant-iTTM RiboGreen® RNA, Invitrogen)을 통해 상기 mRNA 또는 siRNA를 봉입한 지질나노입자의 캡슐화 효율 (약물 봉입률, %)을 측정하였다. mRNA 또는 siRNA를 봉입한 지질나노입자를 96-웰 플레이트에서 mRNA 또는 siRNA의 최종 농도가 4 ~ 7 μg /ml이 되도록 1xTE 완충액 50 μl로 희석하였다. Triton-X를 처리하지 않은 그룹 (Triton-x LNP(-))은 1xTE 완충액 50 μl를 첨가하고, Triton-X를 처리한 그룹 (Triton-X LNP(+))은 2% Triton-X 완충액 50 μl를 첨가하였다. 37 ℃에서 10 분간 인큐베이션하여, Triton-X로 지질나노입자를 분해하여 캡슐화된 핵산을 방출시켰다. 그 후 Ribogreen 시약 100 μl를 각 웰에 첨가하였다. Triton LNP(-)와 Triton LNP(+)의 형광 강도(FL)는 Infinite® 200 PRO NanoQuant (Tecan)에서 파장 대역폭 (excitation: 485 nm, emission: 528 nm)으로 측정하였으며, 약물 봉입률 (캡슐화 효율, %)은 하기 수학식 1과 같이 계산하였다.
[수학식 1]
약물 봉입률 (%) = (Triton LNP(+)의 형광도 - Triton LNP(-)의 형광도)/(Triton LNP(+)의 형광도) X 100
각각의 결과값은 다음과 같다 (표 6).
221-SS 3 tail LNP
(mFLuc) 		221-SS 3 tail LNP
(FVII siRNA)
크기 (nm) 81.7 64.5
다분산도 0.133 0.118
표면 전하 (mV) -1.31 -1.81
약물 봉입률 (%) 95.3 94.5
실험예 1-2. pKa 측정
본 실험예에서는 인비트로 TNS (2-(p-toluidino)naphthalene-6-sulfonic acid) 분석을 통해 상기 실시예 2-3에서 제형화된 파이어플라이 루시퍼라아제 mRNA (서열번호 1) 봉입 지질나노입자의 pKa를 계산하였다.
구체적으로, 20 mM 인산나트륨, 25 mM 시트르산, 20 mM 암모늄 아세테이트, 및 150 mM 염화나트륨을 포함하는 용액의 pH를 0.1 N 수산화나트륨 및/또는 0.1 N 염산을 이용하여 pH 3.5에서 pH 11까지 0.5의 간격으로 조정하여 다양한 pH 단위의 용액을 제조하였다. 각각의 pH를 갖는 용액을 100 μl씩 블랙 96-웰 플레이트에 첨가하고, 300 μM의 TNS 스톡 용액을 이용하여 6 μM의 최종 농도가 되도록 상기 용액에 각각 첨가하였다. 제형화 된 지질나노입자를 최종 농도가 20 μM이 되도록 혼합용액에 첨가하였고, Tecan 기기를 통해 형광강도를 측정 (excitation: 325 nm, emission: 435 nm)하였다. 여기서, 지질나노입자에 대한 pKa는 최대형광의 절반에 도달하는 pH값으로 계산하였다.
그 결과, 본 발명의 지질 나노입자는 pKa 값이 약 6.8 정도이며, 그래프 상 s-형 곡선의 형태를 나타내는 것으로 확인되었다 (도 1). 음이온성 TNS는 양으로 하전된 이온화 가능한 지질과 상호 작용하여 친유성이 되고, pH 값이 LNP의 pKa 값에 근접함에 따라 TNS의 친유성이 낮아지고 더 많은 물분자가 TNS 형광을 퀀칭시키므로, 6.0 내지 7.0의 pKa를 갖는 지질나노입자는 생체 내 약물전달 효율이 우수하다. 또한, pH에 따른 형광을 나타내는 그래프에서 "s-형 곡선"을 나타내는 지질나노입자는 엔도좀 막과 상호작용이 용이하고, 산성화시에 용이하게 엔도좀을 탈출할 수 있음을 의미한다.
실험예 1-3. Cryo-TEM 측정
Cryo-TEM으로 지질나노입자의 내부 구조를 이미지를 측정하였다.
구체적으로, mRNA를 봉입한 지질나노입자를 총 지질의 최종 농도가 15 ~ 25 mg/ml이 되도록 농축하여, 2 ~ 4 μl의 LNP 솔루션을 구리 그리드에 올린 후 블로팅 시켰다. 그 후, KIST 특성분석센터의 cryo-TEM (FEI Tecnai F20 G2) 장비를 통해 지질나노입자의 내부 이미지를 측정하였다 (도 2).
실험예 2: 핵산 봉입 지질나노입자의 시험관 내 효능 확인
실험예 2-1. siRNA 봉입 지질나노입자의 효능 확인
시험관 내에서 siRNA를 봉입한 지질나노입자의 효능을 확인하기 위하여 여러 아민 헤드 그룹으로 합성한 지질나노입자를 이용하여 스크리닝을 수행하였다.
시험은 여러 아민 헤드그룹을 이용하여 합성한 각각의 지질나노입자 (화합물 1 내지 화합물 5, 화합물 11 및 화합물 12)를 이용하여 루시퍼라제를 발현하도록 세포 조작된 헬라 세포 (Hela-Luc)에 루시퍼라제의 발현을 저해하는 siRNA를 전달하여 발광 강도를 측정하여 상기 유전자의 발현을 확인하는 방식으로 진행되었다.
구체적으로, Luc siRNA (서열번호 4 및 서열번호 5)가 봉입된 지질나노입자 5 nM/웰 (siRNA 농도 기준)을 1 x 106 세포/웰로 96-웰에 분주된 헬라 세포주 (Nexel, Korea)에 처리하였다. 24 시간 후, Bright-GloTM 루시퍼라제 어세이 용액 (promega, USA)을 100 μl/웰로 처리하여 10 분간 상온에 둔 후 Infinite M200 발광 측정기 (Tecan, US)을 이용하여 용해된 세포의 발광 강도를 측정하였다 (도 3). 도 3에서 확인되는 바와 같이, 시험된 모든 지질나노입자에서 발광 강도가 현저히 감소된 것을 확인하였으며, 특히 화합물 1 (201-SS) 또는 화합물 5 (221-SS 3 tail)를 포함하는 지질나노입자는 다른 아민 헤드그룹으로 제조된 이온화 가능한 지질을 사용한 경우에 비해 더욱 높은 효율로 세포에 약물을 전달할 수 있음을 확인하였다.
실험예 2-2. mRNA 봉입 지질나노입자의 효능 확인
시험관 내에서 mRNA를 봉입한 지질나노입자의 효능을 확인하기 위하여 여러 아민 헤드 그룹으로 합성한 지질나노입자를 이용하여 스크리닝을 수행하였다.
시험은 여러 아민 헤드그룹을 이용하여 합성한 각각의 지질나노입자 (화합물 1 내지 화합물 5, 화합물 11 및 화합물 12)를 이용하여 간세포 (HeLa)에 GFP mRNA를 전달하고, 발광 강도를 측정하여 상기 유전자의 발현을 확인하는 방식으로 진행되었다.
구체적으로, 100 ng GFP mRNA (서열번호 6)가 봉입된 지질나노입자 0.1 μg/웰 (mRNA 농도 기준)을 1 x 105 세포/웰로 96-웰에 분주된 간세포 세포주 (Nexel, Korea)에 처리하였다. 24 시간 후, 세포 용해 완충액 (Thermofischer, US)을 100 μl/웰로 처리하여 10 분간 상온에 둔 후 Infinite M200 발광 측정기(Tecan, US)을 이용하여 용해된 세포의 형광 강도(fluorescence intensity)를 측정하였다 (도 4). 도 4에서 확인되는 바와 같이, 시험된 대부분의 지질나노입자에서 발광 강도가 현저히 증가된 것을 확인하였으며, 특히 화합물 1 (201-SS), 화합물 3 (205-SS) 또는 화합물 5 (221-SS 3 tail)를 포함하는 지질나노입자는 다른 아민 헤드그룹으로 제조된 이온화 가능한 지질을 사용한 경우에 비해 더욱 높은 효율로 세포에 약물을 전달할 수 있음을 확인하였다.
실험예 3: 지질나노입자의 생체 내 효과 확인
실험예 3-1. siRNA 봉입 지질나노입자의 전달 효과
FⅦ은 간세포에서 특이적으로 발현되므로 지질나노입자의 간세포 타겟 가능성을 siFⅦ를 이용한 FⅦ (Factor Ⅶ 녹아웃효과를 통하여 확인하고자 하였다.
구체적으로, FⅦ 표적 siRNA (서열번호 2 및 서열번호 3)가 봉입된 221-SS 3 tail 지질나노입자를 상기 실시예 2-2의 방법으로 제조하였다 (표 7).
샘플 사이즈 PDI 캡슐화(%)
221-SS 3 tail 64.5 0.118 94.5
C57BL/6 암컷 7 주령 20 g 마우스에 상기 제조된 지질나노입자를 0.2 mg mg/kg의 용량 (siRNA 기준)으로 정맥주사 하였다. 3 일 후, 꼬리 정맥을 통해 혈액을 수집하였고, coaset FⅦ 어세이 키트의 프로토콜에 따라 혈액을 분석하였다. PBS가 투여된 마우스의 혈액으로 표준 곡선을 도시하여 FⅦ 발현양을 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 이온화 가능한 지질을 이용하여 제조된 지질나노입자는 생체 내에서 FⅦ 발현을 효과적으로 억제하였으며, 이로부터 본 발명의 지질나노입자가 간세포를 타겟으로 핵산을 전달할 수 있는 것을 확인하였다.
실험예 3-2. 정맥주사를 통한 mRNA 봉입 지질나노입자의 전달 효능 확인
221-SS 지질나노입자의 mRNA 전달을 알아보기 위하여, 루시퍼라아제 mRNA를 마우스에 전달한 후, 생체발광을 확인하여 유전자 발현을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2-3의 방법으로 Luc mRNA (서열번호 1)가 봉입된 221-SS 3 tail 지질나노입자를 제조하였다. 제조된 지질나노입자를 0.1 mg/kg 용량 (mRNA 기준)으로 7 주령 C57BL/6 마우스에 정맥주사 하고, 3 시간 후 루시페린 0.25 mg/kg을 복강 투여하여 IVIS (PerkinElmer, USA) 장비를 통해 생체발광을 확인하였다. 그 결과, 대부분의 지질나노입자가 간으로 전달됨을 확인하였다 (표 8 및 도 6).
샘플 221-SS LNP
히트 1.04 x 107
백그라운드 6.89 x 103
히트/백그라운드 1,509
크기 (nm) 73.24
PDI 0.185
약물 봉입률 (%) 98.4
다음으로, 이황화 결합 사슬 (tail)의 개수에 따른 효과를 확인하기 위하여, 221-SS 3 tail (화합물 5) 또는 221-SS 4 tail (화합물 6)을 포함하는 Luc mRNA (서열번호 1) 2 μg (0.1 mg/kg) 봉입 지질나노입자에 대한 생체 내 어세이를 정맥주사를 통해 진행하였다. 또한, 3 사슬 및 4 사슬 221-SS를 1 : 1로 혼합하여 제조된 지질나노입자를 이용하여 동일한 실험을 수행하였으며, 대조군으로는 FDA 승인된 이온화 가능한 지질인 SM-102를 사용하였다.
실험에 사용된 각 지질나노입자의 약물 봉입률, 크기, PDI를 하기 표 9에 나타내었다.
샘플 약물 봉입률 (%) 크기 (nm) PDI
221-SS 3 사슬 91.4 115 0.07
1:1 (3 + 4 사슬) 93.4 80.9 0.118
221-SS 4 사슬 87.6 82 0.12
SM-102 90.6 72.7 0.015
루시퍼라아제 mRNA가 봉입된 각각의 지질나노입자를 마우스에 전달한 후, 생체발광을 확인하여 유전자 발현을 확인하였다.
구체적으로, 각 지질나노입자를 0.1 mg/kg 용량 (mRNA 기준)으로 7 주령 C57BL/6 마우스에 정맥주사 하고, 3 시간 후 루시페린 0.25 mg/kg을 복강 투여하여 IVIS(PerkinElmer, USA) 장비를 통해 생체발광을 확인하였다.
실험 결과, 221-SS 3 tail 및 221-SS 4 tail 모두 단독으로도 음성대조군보다 우수한 효과를 나타냈으며, 특히 두 이온화 가능한 지질을 혼합하여 지질나노입자를 제조한 경우 SM-102와 동등한 수준의 더 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였다 (도 7).
실험예 3-3. 근육주사를 통한 mRNA 봉입 지질나노입자의 전달 효과
Luc mRNA (서열번호 1)를 마우스에 근육주사로 전달한 후, 생체발광 (bioluminescence)을 확인하여 유전자 발현을 확인하였다.
구체적으로, 상술한 바와 같이 Luc mRNA를 포함하는 지질나노입자 (221-SS 3 tail, 221-SS 4 tail 단독 및 혼합)를 제조한 후, C57BL/6 마우스에 0.1 mg/kg 농도 (mRNA 기준)로 근육주사 하였다. 3 시간 후, 루시페린 0.25 mg/kg을 복강 투여하여 IVIS(PerkinElmer, USA) 장비를 통해 생체발광을 확인하였다.
그 결과, 221-SS 3 tail 지질나노입자를 근육주사 하였을 때, 대부분의 지질나노입자가 주사부위에 전달되는 것을 확인할 수 있었다 (표 10 및 도 8).
샘플 221-SS
히트 3.23 x 106
백그라운드 9.31 x 103
히트/백그라운드 347
크기 (nm) 94.5
PDI 0.135
약물 봉입률(%) 95.3
또한, 사슬 개수에 따른 효과 차이를 비교한 결과, 221-SS 3 tail 및 221-SS 4 tail 모두 단독으로도 음성대조군보다 우수한 효과를 나타냈으며, 특히 혼합한 경우 SM-102와 동등한 수준의 더 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였다 (도 9).
실험예 4: 지질나노입자의 세포독성 확인
CCK-8 (tetrazolium salt) 물질은 살아있는 세포의 미토콘드리아 내 탈수소 효소에 의한 환원을 통해 주황색 포르마잔을 형성하므로, 흡광도 분석을 통해 세포 생존능력 확인이 가능하다.
다양한 종류의 세포 (HeLa, HepG2, MEF, KB-GFP)를 투명한 96-웰 플레이트 (SPL, 30096)에 시딩 (0.1 x 105 개)하였다. 그 후, mRNA를 제외한 지질나노입자 구성 성분들을 미세 유체 혼합 장치 (Benchtop Nanoassemblr; PNI, Canada)를 통해 혼합하여 mRNA를 봉입하지 않은 221-SS 3 tail 지질나노입자를 제조하였다. 세포 시딩 24 시간 후, 1 웰 당 0.5 μg, 5 μg, 50 μg 또는 100 μg의 양에 해당하는 지질나노입자 (이온화 가능한 지질 기준)를 처리하였다. 지질나노입자 처리 24 시간 후, 세포 Counting Kit - 8(Sigma-Aldrich, 96992)를 1 웰 당 10 μl씩 추가하였다. 4 시간 동안 인큐베이션 한 후, Infinite® 200 PRO NanoQuant(Tecan)를 통해 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, HepG2, MEF 세포에서는 낮은 농도에서도 일부 세포 독성을 나타내었으나, HeLa, KB-GFP와 같은 암세포주에서는 0.5 μg까지 세포독성을 보이지 않음을 확인하였다 (도 10).
실험예 5: 지질나노입자의 간독성 확인
AST (Aspartate transaminase), ALT (Alanine transaminase)는 간세포성 질환이나 간염과 같은 질환의 유무를 측정할 수 있는 수치이며, 평소 낮은 농도로 혈액 중에 존재하다가 간세포가 손상 받으면 흘러나와서 농도가 높아진다.
간 독성의 확인을 위하여, 파이어플라이 루시퍼라아제 mRNA (서열번호 1)가 봉입된 221-SS 3 tail 지질나노입자를 제조한 후 7 주령 C57BL/6 마우스에 1 mg/kg 또는 2 mg/kg의 용량 (mRNA 기준)으로 단 회 투여하였다. 대조군으로는 SM-102를 사용하였다. 투여 24 시간 후, 채혈하여 AST, ALT의 수준을 확인하였다.
그 결과, AST는 FDA 승인받은 SM-102 지질과 유사한 수준으로 확인되었으며, ALT의 경우 본 발명의 지질나노입자에서 그 수준이 현저히 감소되어 간 독성이 덜 나타나는 것으로 확인되었다 (도 11).
이상의 설명으로부터, 본 발명의 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (15)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 이온화 가능한 지질 (ionizable lipid), 이의 입체 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2023000738-appb-img-000014
    여기서, A는
    Figure PCTKR2023000738-appb-img-000015
    또는
    Figure PCTKR2023000738-appb-img-000016
    이고,
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -C1-6알킬, -C1-6알킬-NR3R4, -C1-3알킬-S-S-C6-16알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)O-C4-12알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)-C4-12알킬 또는 -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)NH-C4-12알킬로부터 선택된 어느 하나이고,
    R3 및 R4는 각각 독립적으로 -H, -C1-6알킬, -C1-3알킬-S-S-C6-16알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)O-C4-12알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)-C4-12알킬 또는 -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)NH-C4-12알킬로부터 선택된 어느 하나이고,
    R5는 -C1-6알킬-NR3R4, -C1-3알킬-S-S-C6-16알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)O-C4-12알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)-C4-12알킬 또는 -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)NH-C4-12알킬이고,
    X는 아무 것도 아니거나 (null), -O- 또는 -NH-이고,
    m은 0 내지 5의 정수이고,
    n은 1 내지 3의 정수이고,
    l은 1 내지 3의 정수이고,
    p는 0 내지 2의 정수이고,
    q는 0 또는 1이고, 및
    r은 2 내지 10의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서,
    A는
    Figure PCTKR2023000738-appb-img-000017
    이고,
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 -H, -C1-3알킬, -C1-4알킬-NR3R4, -C1-3알킬-S-S-C8-14알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)O-C6-10알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)-C6-10알킬 또는 -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)NH-C6-10알킬로부터 선택된 어느 하나이고,
    R3 및 R4는 각각 독립적으로 -H, -C1-3알킬, -C1-3알킬-S-S-C8-14알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)O-C6-10알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)-C6-10알킬 또는 -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)NH-C6-10알킬로부터 선택된 어느 하나이고,
    X는 아무 것도 아니거나 (null), -O- 또는 -NH-이고,
    m은 0 내지 3의 정수이고,
    n은 1 내지 3의 정수이고,
    l은 1 내지 3의 정수이고,
    q는 0 또는 1이고, 및
    r은 5 내지 9의 정수인, 이온화 가능한 지질, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제1항에 있어서,
    A는
    Figure PCTKR2023000738-appb-img-000018
    이고,
    R3 및 R4는 각각 독립적으로 -H, -C1-3알킬, -C1-3알킬-S-S-C8-14알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)O-C6-10알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)-C6-10알킬 또는 -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)NH-C6-10알킬로부터 선택된 어느 하나이고,
    R5는 -C1-4알킬-NR3R4, -C1-3알킬-S-S-C8-14알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)O-C6-10알킬, -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)-C6-10알킬 또는 -C1-3알킬-S-S-C1-3알킬-(C=O)NH-C6-10알킬 이고,
    X는 아무 것도 아니거나 (null), -O- 또는 -NH-이고,
    m은 0 내지 3의 정수이고,
    n은 1 내지 3의 정수이고,
    l은 1 내지 3의 정수이고,
    p는 1이고,
    q는 0 또는 1이고, 및
    r은 5 내지 9의 정수인, 이온화 가능한 지질, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 이온화 가능한 지질은 하기 표에 기재된 화합물 1 내지 화합물 12로 이루어진 군에서 선택되는, 이온화 가능한 지질, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    Figure PCTKR2023000738-appb-img-000019
    Figure PCTKR2023000738-appb-img-000020
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 이온화 가능한 지질 (ionizable lipid), 이의 입체 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 지질나노입자.
  6. 제5항에 있어서, 상기 지질나노입자는 인지질, 구조적 지질, 및 PEG-지질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 더 포함하는, 지질나노입자.
  7. 제6항에 있어서, 상기 인지질은 DOPE, DSPC, POPC, EPC, DOPC, DPPC, DOPG, DPPG, DSPE. DOTAP, 포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트, 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, POPE, DOPS, DLPC, DMPC, DUPC, 1,2-디-O-옥타데세닐-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1-올레오일-2-콜레스테릴헤미숙시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1-헥사데실-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디도코사헥사에노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 및 스핑고미엘린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 지질나노입자.
  8. 제6항에 있어서, 상기 PEG-지질은 PEG-세라마이드, PEG-DMG, PEG-c-DOMG, PEG-DLPE, PEG-DMPE, PEG-DPPC 및 PEG-DSPE로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, 지질나노입자.
  9. 제6항에 있어서, 상기 구조적 지질은 콜레스테롤, 콜레스테놀, 스피나스테롤, 페코스테롤, 시토스테롤, 에르고스테롤, 에르고스테놀, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 토마티딘, 우르솔산 및 알파-토코페롤로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, 지질나노입자.
  10. 제6항에 있어서, 상기 지질나노입자는 이온화 가능한 지질 : 인지질 : 구조적 지질 : PEG-지질을 20 내지 50 : 10 내지 30 : 30 내지 60 : 1 내지 5의 몰비로 포함하는, 지질나노입자.
  11. 제6항에 있어서, 상기 지질나노입자는 음이온성 약물을 추가로 포함하는 지질나노입자.
  12. 제11항에 있어서, 상기 음이온성 약물은 핵산, 저분자 화합물, 펩타이드, 단백질, 단백질-핵산 구조체, 및 음이온성 생체고분자-약물 접합체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, 지질나노입자.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 핵산은 siRNA, rRNA, DNA, 앱타머 (aptamer), mRNA, tRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, shRNA, miRNA, sgRNA, tracrRNA, gRNA, 리보자임 (ribozyme), PNA, 및 DNAzyme로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인, 지질나노입자.
  14. 제13항에 있어서, 상기 지질나노입자에서 이온화 가능한 지질/핵산의 중량비는 1 내지 20인, 지질나노입자.
  15. 제11항에 따른 지질나노입자를 포함하는, 약물 전달용 조성물.
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