FR2760193A1 - Lipides et complexes de lipides cationiques et de substances actives, notamment pour la transfection de cellules - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne de nouveaux lipides de formule : (CF DESSIN DANS BOPI) dans laquelle : R identique ou différent est un atome d'hydrogène ou un groupe de formule : (CF DESSIN DANS BOPI) dans laquelle : R1 , R2 , identiques ou différents sont des radicaux C6 -C23 alkyle ou alcényle, linéaires ou ramifiés ou des radicaux -C (=O) (C6 , -C23 ) alkyle ou -C (=O) (C6 -C23 ) alcényle, linéaires ou ramifiés, p est un nombre entier positif de 1 à 4, n est un nombre entier positif de 1 à 6, m est un nombre entier positif de 1 à 6 et pouvant être différent pour chaque motif (CH2 )m -NHlorsque n >1,le nombre de groupes R présents différents de l'atome d'hydrogène étant compris entre 1 et 4, lesdits lipides étant éventuellement sous forme cationique associés avec un ou plusieurs anions biologiquement acceptables. Elle concerne également de nouveaux complexes de lipides cationiques et de substances actives comportant des charges négatives permettant l'introduction desdites substances actives dans les cellules. Elle concerne notamment de nouveaux complexes, dont la substance active consiste en un ou plusieurs acides nucléiques, utiles pour transfecter les cellules.
Description
L'invention concerne de nouveaux lipides susceptibles d'être mis sous forme cationique utiles, notamment, pour la préparation de complexes avec des substances actives comportant des charges négatives.
Elle concerne également de nouveaux complexes de lipides cationiques et de substances actives comportant des charges négatives permettant l'introduction desdites substances actives dans les cellules. Telle concerne notamment de nouveaux complexes, dont la substance active consiste en un ou plusieurs acides nucléiques, utiles pour transfecter les cellules.
Elle concerne également un procédé d'introduction de substances actives comportant des charges négatives à l'intérieur des cellules, notamment un procédé de transfection de cellules, à l'aide de ces complexes.
Elle concerne également les complexes lipides cationiques/substances actives pour leur application en tant que produits thérapeutiquement actifs.
Elle concerne enfin les kits pour préparer ces complexes, notamment des kits d'analyse ou de diagnostic.
Les complexes lipidiques tels que les liposomes sont bien connus en tant qu'agents permettant d'introduire certaines macromolécules biologiques telles que les ADN, les ARN, les protéines ou certaines substances pharmaceutiquement actives à l'intérieur des cellules.
On a déja proposé, en particulier, d'utiliser à cette fin des lipides cationiques. Les lipides cationiques sont en effet connus pour posséder une certaine affinité vis-à-vis des membranes cellulaires et vis-à-vis des acides nucléiques.
De nombreux lipides cationiques ont déjà été décrits et l'on cite notamment ceux décrits dans les demandes de brevet WO-A-9116024;
WO-A-9514651; WO-A-9405624. En particulier la demande de brevet WO-A-9 il 6024 décrit des lipides cationiques de formule
dans laquelle
R1 et R2 sont notamment des radicaux alkylc ou alcényle
Y 1, Y2 sont des radicaux -OGl-12-; -OC(=O)- ou -0-;
R3, R4 sont des radicaux allyle ou alcényle;
R5 est une chaîne aikylène
R6 est -C(=O)-(CH2)m-NII-, un acide diaminocarboxylique ou -C(=O)-(CH2)m-NH- lié audit acide diaminocarboxylique
R7 est H, spermine, spermidine, histone, une protéine, un amino acide, un polypeptide.
WO-A-9514651; WO-A-9405624. En particulier la demande de brevet WO-A-9 il 6024 décrit des lipides cationiques de formule
dans laquelle
R1 et R2 sont notamment des radicaux alkylc ou alcényle
Y 1, Y2 sont des radicaux -OGl-12-; -OC(=O)- ou -0-;
R3, R4 sont des radicaux allyle ou alcényle;
R5 est une chaîne aikylène
R6 est -C(=O)-(CH2)m-NII-, un acide diaminocarboxylique ou -C(=O)-(CH2)m-NH- lié audit acide diaminocarboxylique
R7 est H, spermine, spermidine, histone, une protéine, un amino acide, un polypeptide.
Il est néanmoins souhaitable de proposer d'autres lipides cationiques, ayant éventuellement des propriétés améliorées ou différentes de ceux déjà décrits. On sait en effet que l'interaction entre les complexes et les membranes cellulaires peut varier considérablement en fonction de la cellule considérée. Les mécanismes qui permettent l'interaction des complexes avec les membranes cellulaires et le transfert des complexes à l'intérieur de la cellule sont, de ce fait, largement méconnus et les chercheurs en sont donc réduits à une approche pour l'essentiel empirique.
D'autres facteurs rendent le choix des lipides a priori non évidents tels que : formation des complexes, stabilité, comportement in vivo, éventuelle toxicité.
L'objet de la présente invention est donc en premier lieu de résoudre un ou plusieurs des problèmes évoqués ci-dessus en proposant de nouveaux lipides permettant notamment de réaliser lorsqu'ils sont sous forme cationique de nouveaux complexes utiles pour le transfert de substances à l'intérieur des cellules.
Un autre objet de la présente invention est de réaliser des complexes de faible taille (inférieure à 500 nm, avantageusement à 200 nm et de préférence à 100 nm).
L'invention concerne un lipide de formule
R-NH-[(CH2)m-NR]-(CH2)m-NH-R
n-l dans laquelle
R identique ou différent est un atome d'hydrogène ou un groupe de formule
dans laquelle
R1, R2, identiques ou différents sont des radicaux C6-C23 alkyle ou alcényle, linéaires ou ramifiés ou des radicaux -C(=O)-(C(,-C23) alkyle ou -C(=O)-(C6-C23) alcényle, linéaires ou ramifiés,
p est un nombre entier positif de 1 à 4,
n est un nombre entier positif de 1 à G,
m est un nombre entier positif de 1 à G et pourtant être différent pour chaque motif -(CH2)m-NH- lorsque n > 1,
le nombre de groupes R présents différents de l'atome d'hydrogène étant compris entre 1 et 4, lesdits lipides étant éventuellement sous forme cationique associés avec un ou plusieurs anions biologiquements acceptables,
Le nombre de groupes K pourra être égal à 3 ou 4, notamment lorsque R1 et R2 seront des radicaux de 6 à 10 atomes de carbone.
R-NH-[(CH2)m-NR]-(CH2)m-NH-R
n-l dans laquelle
R identique ou différent est un atome d'hydrogène ou un groupe de formule
dans laquelle
R1, R2, identiques ou différents sont des radicaux C6-C23 alkyle ou alcényle, linéaires ou ramifiés ou des radicaux -C(=O)-(C(,-C23) alkyle ou -C(=O)-(C6-C23) alcényle, linéaires ou ramifiés,
p est un nombre entier positif de 1 à 4,
n est un nombre entier positif de 1 à G,
m est un nombre entier positif de 1 à G et pourtant être différent pour chaque motif -(CH2)m-NH- lorsque n > 1,
le nombre de groupes R présents différents de l'atome d'hydrogène étant compris entre 1 et 4, lesdits lipides étant éventuellement sous forme cationique associés avec un ou plusieurs anions biologiquements acceptables,
Le nombre de groupes K pourra être égal à 3 ou 4, notamment lorsque R1 et R2 seront des radicaux de 6 à 10 atomes de carbone.
Selon une variante, I'invention concerne un lipide de formule
H2N[-(CH2)m-NH-]nR; RNH-[(CH2)m-NH]-nH ; H2N[-(CH2)n-NR]-(CH2)m-NH2
n-l
II lla llb dans laquelle
R a l'une des significations indiquée à la formule I et un seul groupe R différent de l'atome d'hydrogène étant présent dans la polyamine dc formule llb,
n est un nombre entier positif de 1 à G,
m est un nombre entier positif de 1 à G et pouvant être différent pour chaque motif -(CH2)m-NH- lorsque n > 1, lesdits lipides étant éventuellement sous forme cationique associés avec un OU plusieurs anions biologiquement acceptables.
H2N[-(CH2)m-NH-]nR; RNH-[(CH2)m-NH]-nH ; H2N[-(CH2)n-NR]-(CH2)m-NH2
n-l
II lla llb dans laquelle
R a l'une des significations indiquée à la formule I et un seul groupe R différent de l'atome d'hydrogène étant présent dans la polyamine dc formule llb,
n est un nombre entier positif de 1 à G,
m est un nombre entier positif de 1 à G et pouvant être différent pour chaque motif -(CH2)m-NH- lorsque n > 1, lesdits lipides étant éventuellement sous forme cationique associés avec un OU plusieurs anions biologiquement acceptables.
Par l'expression "alcényle", on entend que la chaîne carbonée peut comprendre une ou plusieurs double(s) liaison(s) le long de ladite chaîne.
Par forme cationique, on entend que les lipides sont sous forme protonée par fixation d'un proton sur un ou plusieurs atomes d'azote présents sur la chaîne polyamine linéaire ou ramifiée.
Par "anions biologiquement acceptables", on entend que les anions sont tels que les lipides cationiques peuvent être introduits dans la cellule ou être présents dans la membrane cellulaire. On cite par exemple
I'anion trifluoroacétate, les anions iodure ou chlorure ou bromure.
I'anion trifluoroacétate, les anions iodure ou chlorure ou bromure.
L'invention concerne également les conjugués du lipide avec un ligand d'intérêt par l'intermédiaire d'un des atomes d'azote secondaire ou primaire de la chaîne polyamine ou de l'acide diaminocarboxylique.
L'invention concerne encore une composition comportant un OU plusieurs lipides décrits ci-dessus et au moins un colipide neutre susceptible d'améliorer la formation de complexes entre lesdits lipides et les substances actives, ou d'améliorer le fonctionnement de ces complexes v is-â-vis de la cellule.
De tels colipides neutres stabilisent pour certains lipides les complexes avec les substances actives. Parmi de tels lipides neutres, on peut citer les trigycérides, les diglycérides, le cholestérol et ceux-ci sont bien connus dans l'art, par exemple par le brevet américain n" 5 438 044. Ln particulier, on préférera les phospholipides neutres et avantageusement les aminophospholipides neutres. De préférence encore, le colipide neutre comprend la phosphatidyléthanolamine (PE) ou un dérivé de la phosphatidyléthanolamine tel que la DOPE ou dioléoyl -phosphatidyléthanolamine.
Le rapport en poids entre les lipides et les colipides neutres est généralement compris entre 0,1 et 10, étant entendu que ce rapport peut varier selon la nature des lipides et des colipides neutres. On peut également utiliser des mélanges de colipides neutres. De même, la composition peut comprendre un mélange de lipides cationiques et de colipides neutres.
On indique ci-après des variantes préférées dc réalisation prises ou non en combinaison entre elles.
De préférence, R1, R2, identiques ou différents sont des radicaux -C(=O)- aikyle linéaires ou -C(=O)- alcényle linéaires.
De préférence, R1, R2, identiques ou différents sont des radicaux -C(=O)- aikyle ou -C(=O)- alcényle, comprenant 12 à 20 atomes de carbone lorsque le lipide comporte 1 ou 2 groupements R, de préférence comprellallt 18 atomes de carbone.
De préférence, n est un nombre entier choisi parmi les nombres 2, 3 ou 4.
De préférence, m est un nombre entier choisi parmi les nombres 2, 3 ou 4.
De préférence, les lipides sont choisis dans le groupe constitué par les composés de formule suivante
R1, R2 identiques étant choisis parmi les radicaux stéaroyle ou oléoylc.
Les lipides cationiques selon l'invention sont préparés par réaction d'un composé de formule
dans laquelle:
R3, R4 sont des groupes protecteurs, notamment Fmoc avec une amine de formule
R5NH[(-CH2)m-NR5]n-1-(CH2)m-NHR5 V
m, n ayant la même signification que dans la formule I,
R5 étant un groupe protecteur, notamment le t-butoxycarbonyle (BOC) ou un atome d'hydrogène, au moins un des radicaux R5 et au plus quatre des radicaux Rs correspondant à l'atome d'hydrogène.
dans laquelle:
R3, R4 sont des groupes protecteurs, notamment Fmoc avec une amine de formule
R5NH[(-CH2)m-NR5]n-1-(CH2)m-NHR5 V
m, n ayant la même signification que dans la formule I,
R5 étant un groupe protecteur, notamment le t-butoxycarbonyle (BOC) ou un atome d'hydrogène, au moins un des radicaux R5 et au plus quatre des radicaux Rs correspondant à l'atome d'hydrogène.
Les fonctions N-R3, -N-R4 sont déprotégées ensuite pour fixer par amidation ou alkylation les radicaux R1 et R2 de manière connue, notamment par action de l'ester -N-hydroxysuccinimide correspondant.
I.e composé obtenu est déprotégé en présence d'acide trifluoroacétique. Les amines de formule V sont préparés de manière connue.
Dans le cas où le composé de formule V est l.t 1-4 di-boc-spermidine on se référera aux exemples indiqués ci-après pour connaitre les modalités pratiques de synthèse. Les procédés décrits sont applicables en général aux synthèses des lipides selon l'invention moyennant des adaptations à la portee de l'homme du métier.
L'invention concerne encore les conjugués d'un lipide selon l'invention avec un ou plusieurs ligands d'intérêt par intermédiaire cl'un des atomes d'azote primaire ou secondaire de la chaîne polyamine ou de
I'acide diaminocarboxilique. De tels conjugués peuvent être obtenus cn utilisant un ou plusieurs groupes protecteurs orthogonaux tels que ceux décrits dans Protective Groups in Organic Synthesis (p. 309-406, 1991, eds. T.W.
I'acide diaminocarboxilique. De tels conjugués peuvent être obtenus cn utilisant un ou plusieurs groupes protecteurs orthogonaux tels que ceux décrits dans Protective Groups in Organic Synthesis (p. 309-406, 1991, eds. T.W.
Greene, P.G.M. Wuts, Wiley) sur la polyamine ou l'acide diaminocarboxylique.
La déprotection sélective d'un groupe protecteur permet alors de coupler le ligand et l'on déprotège ensuite le lipide.
De tels ligands peuvent permettre le ciblage vers un type cellulaire particulier, faciliter la pénétration à l'intérieur de la cellule, la lyse des endosomes ou encore le transport intracellulaire et sont largement décrits dans la littérature. Il peut s'agir par exemple de sucre, peptide, hormone, vitamine, anticorps, peptide fusogénique, peptide de localisation nucléaire. On peut citer plus particulièrement les résidus galactosyl permettant de cibler le récepteur asyaloglycoprotéique à la surface des cellules hépatiques, le peptide fusogénique INF-7 derivé de la sous-unite HA-2 de l'hémagglutinine du virus influenza (Plank et al. 1994, J. Biol. Chem. 269, 12918-12924) ou d'un signal de localisation nucléaire dérivé de l'antigène T du virus SV40 (Lanford et Butel, 1984, Cell 37, 801-813) ou de la protéine EBNA1 du virus Epstein Barr (Ambinder et al., 1991, J. Virol, 65, 1466-1478).
L'invention concerne également un procédé de préparation des complexes lipides cationiques-substances actives anioniques, ledit procede étant caractérisé en ce que l'on met en présence un ou plusieurs lipides sous forme cationique ou une composition selon l'invention dont le lipide est sous forme cationique avec une ou plusieurs substances actives et en ce que l'on récupère ledit complexe. telle concerne également les kits pour preparer de tels complexes comprenant un ou plusieurs lipides ou une ou plusieurs compositions selon l'invention.
Selon une première variante, un OU plusieurs lipides cationiques sont mis en solution avec une quantité appropriée de solvant ou mélange de solvant miscible dans l'eau, notamment l'éthanol ou le diméthylsulfoxy(le, de manière à former des agrégats lipidiques selon une méthode connue décrite par exemple dans la demande de brevet WO-A-9G03977.
La suspension mise dans un milieu tampon est ensuite mélangée avec une solution de substance active comportant des charges négatives.
Dans le cas où un lipide neutre est présent dans le complexe, on forme préalablement à la mise en solution dans le sol'ant miscible à l'eau, un film du mélange de lipide cationique et de lipide neutre comme la DOPE, de manière connue.
Une des caractéristiques importantes du procédé réside dans le choix du rapport entre les charges positives du lipide cationique et les charges négatives de la substance active,
Sans vouloir être limité par un rapport spécifique, on choisira des quantités des différentes charges de manière à ce que le rapport entre les charges positives du lipide cationique et les charges négatives de la substance active soit compris entre 0,05 et 20, notamment entre 0,1 et 1 5 et de préférence environ de 5 à 10.
Sans vouloir être limité par un rapport spécifique, on choisira des quantités des différentes charges de manière à ce que le rapport entre les charges positives du lipide cationique et les charges négatives de la substance active soit compris entre 0,05 et 20, notamment entre 0,1 et 1 5 et de préférence environ de 5 à 10.
Le calcul pour arriver à un tel rapport prendra en considératioll les charges négatives portées par la substance active et on ajustera la quantité de lipides nécessaires pour satisfaire au rapport indiqué ci-dessus.
Les quantités et les concentrations pour les autres composés sont ajustées cn fonction de leur masse molaire respective et de leur nombre de charges positives.
On a trouvé que, dans le cas des lipides selon l'invention, Cette première variante conduisait à d'excellents résultats en termes de tailles des complexes obtenus.
Selon une seconde variante, un ou piusieurs lipides cationiques sont mis en suspension avec une quantité appropriée d'une solution de détergent comme un octylglucoside tel que le n-octyl ss-D-glucopyr.lllosidc ou le G-O-(N-heptylcarbamoyl)-méthyl-c-D-glucopyranosidc.
La suspension mise dans un milieu tampon est ensuite mélangée avec une solution de substance active comportant des charges négaties.
Dans le cas où un lipide neutre est présent dans le complexe, on forme préalablement à la mise en suspension dans la solution de détergent, un film du mélange lipide cationique et de lipide neutre comme la D()ill. de manière connue. Les mêmes remarques concernant le rapport entre les charges positives du lipide cationique et les charges négatives de la substance active que celles indiquées dans la première variante sont applicables à cette seconde variante.
De manière optionnelle, on peut procéder à une dialyse subséquente pour réduire le détergent et récupérer les complexes. Le principe d'une telle méthode est par exemple décrit par lloíland et al. (1')')(),
PNAS 93, p 7305-7309) et dans le chapitre 11 du document I'hilippot et al. ((;.
PNAS 93, p 7305-7309) et dans le chapitre 11 du document I'hilippot et al. ((;.
Gregoriadis, 81-89, CRC Press 1993).
Selon une troisième variante, un ou plusieurs lipides cationiques, sont mis en suspension dans un tampon puis la suspension est soumise à une sonication jusqu'à homogénéité visuelle. La suspension lipidique est extrudée au travers de deux membranes microporeuses sous pression appropriée avant d'être mélangée à une solution de substance active comportant des charges négatives.
Dans le cas où un lipide neutre est présent dans le complexe, on forme préalablement à la mise en suspension, un film du mélange de lipide cationique et de lipide neutre comme la DOPE de manière connue. Les mêmes remarques concernant le rapport entre les charges positives du lipide cationique et les charges négatives de la substance active que celles indiquées dans la première variante sont applicables à cette troisième variante. Cette technique dite de sonication-extrusion est bien connue dans l'art.
Les caractéristiques des complexes formés sont évaluées par plusieurs moyens permettant de déterminer
- I'état de complexation avec la substance active, notamment par recherche des acides nucléiques libres par électrophorèse sur gel dans Ic cas où les substances sont des acides nucléiques.
- I'état de complexation avec la substance active, notamment par recherche des acides nucléiques libres par électrophorèse sur gel dans Ic cas où les substances sont des acides nucléiques.
- la taille des particules par diffusion quasi élastique de la lumière.
L'invention concerne les complexes de lipides cationiqucs ou d'une composition selon l'invention et d'une ou plusieurs substances actives comportant des charges négatives, notamment les acides nucléiques et les protéines. De préférence, leur taille est inférieure a z()() nm, avantageusement à 200 nm et de préférence à 1OO nm.
Ledit acide nucléique peut être un ADN ou un ARN sens ou antisens. Les applications sens et anti sens sont bien connues de l'homme de l'art.
En bref, on entend par:
- "anti sens" un acide nucléique ayant une séquence complémentaire à une séquence cible, par exemple une séquence d'ARNm dont on cherche à bloquer l'expression par hybridation sur la séquence cible; et
- "sens" un acide nucléique ayant une séquence homologue ou identique à une séquence cible, par exemple une séquence qui se lie à un facteur de transcription protéiquc et impliquée dans l'expression d'un gène donné.
- "anti sens" un acide nucléique ayant une séquence complémentaire à une séquence cible, par exemple une séquence d'ARNm dont on cherche à bloquer l'expression par hybridation sur la séquence cible; et
- "sens" un acide nucléique ayant une séquence homologue ou identique à une séquence cible, par exemple une séquence qui se lie à un facteur de transcription protéiquc et impliquée dans l'expression d'un gène donné.
Selon un mode de réalisation préféré, I'acide nucléique comporte un gène d'intérêt et des éléments permettant l'expression dudit gène d'intérêt. Dans ce mode de réalisation, ledit fragment d'acide nucléique est avantageusement sous forme de plasmide.
Dans le cadre de la présente invention, I'acide nucléique peut être homologue ou hétérologue à la cellule cible. Il peut être avantageux d'utiliser un acide nucléique codant pour une cytokine (interleukine dont l'H-2, interféron, facteur stimulateur de colonies...), un récepteur ccllulaire ou nucléaire, un ligand, un facteur de coagulation (Facteur Vll, Facteur VIII,
Facteur IX...), la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance
Regulator en anglais), I'insuline, la dystrophine, une hormone dc croissance, une enzyme (uréase, rénine, thrombine...), un inhibiteur d'cnzyme (inhibiteur d'une protéase viralc, a 1-antitrypsine...), un polypeptide à effet antitumoral (produit de gènes suppresseurs de tumeurs, polypeptide stimulant le système immunitaire...), un polypeptide capable d'inhiber ou de ralentir le développement d'une infection bactérienne, virale ou parasitaire (polypeptide antigénique, variant trans-dominant...), un anticorps, une toxine, une immunotoxine et enfin un marqueur (lucilérasc, ss-galactosidase, produit conférant la résistance à un antibiotiquc...). Ricn entcndu, cette listc n'est pas limitative et d'autres gènes peuvent également être employés.
Facteur IX...), la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance
Regulator en anglais), I'insuline, la dystrophine, une hormone dc croissance, une enzyme (uréase, rénine, thrombine...), un inhibiteur d'cnzyme (inhibiteur d'une protéase viralc, a 1-antitrypsine...), un polypeptide à effet antitumoral (produit de gènes suppresseurs de tumeurs, polypeptide stimulant le système immunitaire...), un polypeptide capable d'inhiber ou de ralentir le développement d'une infection bactérienne, virale ou parasitaire (polypeptide antigénique, variant trans-dominant...), un anticorps, une toxine, une immunotoxine et enfin un marqueur (lucilérasc, ss-galactosidase, produit conférant la résistance à un antibiotiquc...). Ricn entcndu, cette listc n'est pas limitative et d'autres gènes peuvent également être employés.
Avantageusement, l'acide nucléique est placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression dans la cellule hôte. tzar "éléments nécessaires", on désigne l'ensemble des éléments permettant la transcription dudit fragment d'ADN en ARN (ARN antisens ou ARNm) et la traduction de l'ARNm en polypeptide. Ces éléments comprennent un promoteur régulable ou constitutif, lequel peut être hétérologue ou au contraire homologue au gène d'intérêt. On peut citcr, à titre d'exemples, le promoteur du gène I'(,K (Phospho Glycérate Kinase) humain ou murin, Ic promotcur précoce du virus
SV40 (Simian Virus), CMV cytomegalovirus, le LTR (long Terminal Repeat) du
RSV (Rous Sarcoma Virus), Ic promoteur TK (Thymidine Kinase) du virus
HSV-1 (llerpes Simplex virus) ct les promoteurs adénoviraux E1A et MLP. Les éléments nécessaires peuvent, en outre, inclure des éléments additionncls (séquence intronique, séquence signal de sécrétion, séquence de localisation nucléaire, site d'initiation de la traduction, signal poly A de terminaison de la transcription...).
SV40 (Simian Virus), CMV cytomegalovirus, le LTR (long Terminal Repeat) du
RSV (Rous Sarcoma Virus), Ic promoteur TK (Thymidine Kinase) du virus
HSV-1 (llerpes Simplex virus) ct les promoteurs adénoviraux E1A et MLP. Les éléments nécessaires peuvent, en outre, inclure des éléments additionncls (séquence intronique, séquence signal de sécrétion, séquence de localisation nucléaire, site d'initiation de la traduction, signal poly A de terminaison de la transcription...).
Les expériences de transfection montrent qu'avantageusement le rapport en poids du composé lipidique selon l'invention audit Fragment d'ADN est de 0,01 à 100. Le rapport optimal se situe de 0,05 à 10.
L'invention concerne également les complexes lipides substances actives tels qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par mise en solution dans un solvant miscible à l'eau, notamment l'éthanol ou Ic diméthylsulloxyde, des lipides ou composition selon l'invention ou par mise en suspension dans une solution de détergent des lipides ou composition selon l'invention ou par sonication-extrusion d'une suspension de lipides cationiques ou composition selon l'invention et mélange avec une substance active.
L'invention concerne également un procédé pour introduire une substance active comportant des charges négatives à l'intérieur d'une cellule, caractérisé en ce que l'on met en contact des cellules cultivées sur un milieu approprié avec une suspension de complexes lipides-substances actives comportant des charges négatives. Après un certain temps d'incubation les cellules sont lavées et récupérées.
La vérification de l'introduction de la substance activc est effectuée (éventuellement aprés lyse de la cellule) par tout moyen approprie.
Le procédé d'introduction est bien connu en soi. Par Ic terme "introduction" on entend que la substance active comportant des charges négatives est transférée dans la cellule et est localisée, en fin dc procède, à l'intérieur de ladite cellule ou au niveau de la membranc dc celle-ci.
L'invention concerne également un procédé pour transfecter une cellule, caractérisé en ce que l'on met en contact des cellules cultivées sur un milieu approprié avec une suspension de complexes lipides cationiques-substances actives comportant des charges négatives. Après un certain temps d'incubation les cellules sont lavées et récupérées.
La vérification de la transfection de l'acide nucléique est effectuée par tout moyen approprié, par exemple par mesure de l'expression du gène considéré et de la concentration de la protéine exprimée.
Le procédé de transfection est bien connu en soi. Par Ic terme "transfection" on entend l'introduction d'un acide nucléique exprimable dans une cellule aux fins d'expression dudit acide nucléique. l.e termc "acide nucléique" recouvre les acides ribonucléiques ou deoxyribonucléiques.
Parmi les cellules, on cite les cellules de mammifères ct cn particulier une cellule humaine. Ladite cellule peut être une cellule primaire ou tumorale d'une origine hématopoietique (cellule souche totipotente, leucocyte, lymphocyte, monocyte ou macrophage...) hépatique, épithéliale, fibroblaste... et tout particulièrement une cellule musculaire (myoblaste, cardiomyocytc..), une cellule trachéale ou pulmonaire.
L'invention concerne enfin les complexes lipides cationiques/substances actives pour leur application cn tant que produits thérapeutiquement actifs et les compositions thérapeutiques comportant de tels complexes et un véhicule inerte approprié au mode d'administration. Ilnc telle composition est particulièrement adaptée à la thérapie génique par transfert d'un acide nucléique à l'intérieur d'une cellule cible.
Une composition selon l'invention peut être administrée par voie intragastrique, sous-cutanée, intraveineuse, intrapéritonéalc, intratumorale ou nasale. On préférera tout particulièrement les voies d'administration intracardiaque, intramusculaire, intrapulmonaire ou intratrachéale.
L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. La voie d'administration et le dosage appropriés varient en fonction de divers paramètres, par exemple, dc l'invidu ou de la maladie à traiter ou encore de l'acide nucléique à transférer.
Une composition selon l'invention est destinée à la préparation d'un médicament destiné au traitement du corps humain ou animal et, préférentiellement, par thérapie génique. Selon une première possibilité, le médicament peut être administré directement in "i"o (par exemple dans un muscles, dans les poumons par aérosol...). On peut également adopter l'approche ex vivo qui consiste à prélever des cellules du patient (ccllulcs souches de la moelle osseuse, lymphocytes du sang périphérique, cellules musculaires...), de les transfecter in vitro selon les techniques de l'art et de les réadministrer au patient. Une composition particulièrement intéressante comporte des complexes dont le lipide est le pc'l'G37 (voir exemple).
Cette dernière composition est avantageusement utilisée pour transférer un acide nucléique dans une cellule musculaire ou une cellule pulmonaire.
L'invention concerne enfin un procédé de thérapie génique consistant à administrer à un patient une quantité appropriée d'une composition selon l'invention, éventuellement à renouveler plusieurs I.( > is le traitement.
Les exemples ci-après illustrent l'invention sans la limiter en aucune façon. Un schéma de synthèse explicatif faisant partie intégrante de la description est annexe.
La préparation du lipide cationique de formule I dans laquelle R1,
R2 identiques sont les radicaux oléoyle ou stéaroyle n = 2; mα = 3, mss = 4 est décrite ci-dessous en liaison avec le schéma de synthèse représenté à la figure 1. α et ss sont les positions des motifs -(CH2)m-NH- à partir du carbonyle.
R2 identiques sont les radicaux oléoyle ou stéaroyle n = 2; mα = 3, mss = 4 est décrite ci-dessous en liaison avec le schéma de synthèse représenté à la figure 1. α et ss sont les positions des motifs -(CH2)m-NH- à partir du carbonyle.
Svnthèse du lipide cationique de formule I dans laquelle n = 2, mtx = B, mss = 4,
R = oléovle (pcTG37) (voir figure 1)
Svnthèse de l'intermédiaire 1-4 di-boc-spermidine
Le protocole appliqué pour obtenir le 1 ,4-di-boc-spermidine est publié par Goodnow et al. (1990, Tetrahedron 46, 3267-3286). En pratique,
I'intermédiaire N-propionitrile 1,4-diaminobutane est obtenu par réaction de 37,6 mmoles de diaminobutane (Fluka; référence 32790) dilué dans 3,8 ml de dichlorométhane + 2 ml de méthanol à 0 C avec 18,8 mmoles d'acrylonitrile (Fluka ; référence 01710) pendant 1 heure à 20 C. Les groupements aminés du produit de la réaction sont protégés par 99 mmoles de BOC-ON [(2-bocoxyimino)-2-phénylacétonitrile] (Fluka ; référence 15475) dans 50 ml de solvant CH2Cl2/
R = oléovle (pcTG37) (voir figure 1)
Svnthèse de l'intermédiaire 1-4 di-boc-spermidine
Le protocole appliqué pour obtenir le 1 ,4-di-boc-spermidine est publié par Goodnow et al. (1990, Tetrahedron 46, 3267-3286). En pratique,
I'intermédiaire N-propionitrile 1,4-diaminobutane est obtenu par réaction de 37,6 mmoles de diaminobutane (Fluka; référence 32790) dilué dans 3,8 ml de dichlorométhane + 2 ml de méthanol à 0 C avec 18,8 mmoles d'acrylonitrile (Fluka ; référence 01710) pendant 1 heure à 20 C. Les groupements aminés du produit de la réaction sont protégés par 99 mmoles de BOC-ON [(2-bocoxyimino)-2-phénylacétonitrile] (Fluka ; référence 15475) dans 50 ml de solvant CH2Cl2/
Svnthèse du pcTG37
On ajoute à 140 moles de N-a N-0, di-Fmoc-diaminopropionique (Bachem B2265) 140 moles de N-hydroxybenzotriazole (Sigma ; H2006), puis 140 moles de di-boc-spermidine dans 1 ml de tétrahydrofuranne anhydre, et enfin 180 moles de dicyclohéxylcarbodiimide (Sigma D3128) dilué dans 2 ml
CH2Cl2. Après 2 heures de réaction, on filtre le dicyclohexylurée formé et on purifie le produit sur colonne de silice dans un solvant CH2Cl2/CH3OH 99/1.
On ajoute à 140 moles de N-a N-0, di-Fmoc-diaminopropionique (Bachem B2265) 140 moles de N-hydroxybenzotriazole (Sigma ; H2006), puis 140 moles de di-boc-spermidine dans 1 ml de tétrahydrofuranne anhydre, et enfin 180 moles de dicyclohéxylcarbodiimide (Sigma D3128) dilué dans 2 ml
CH2Cl2. Après 2 heures de réaction, on filtre le dicyclohexylurée formé et on purifie le produit sur colonne de silice dans un solvant CH2Cl2/CH3OH 99/1.
Après évaporation, on élimine les groupements Fmoc du produit dans une solution de 20% pipéridine, 20% tétrahydrofurane et 60% Cl12CI2 pendant I heure. Après évaporation, on procède à une nouvelle purification sur colonne de silice dans un solvant CH2Cl2/CH3OH 1/1. On détermine par chromatographie sur couche mince les fractions contenant le produit. Le produit est sèché avant le dernier couplage. Au di-boc-spermidine-diaminopropionamide, on ajoute 510 moles de l'ester
N-hydroxysuccinimide de l'acide oléique (Sigma O 9506) dilué dans 5 ml de
CH2Cl2 anhydre. Après évaporation, le produit est purifié sur colonne de silice (éther / acétate d'éthyle ; 1/1) . Le produit final, repris dans I ml de Cl17CIZ est déprotégé Boc dans 10 ml d'acide trifluoroacétique (Fluka 91699). Pour éliminer l'acide trifluoroacétique on évapore à pression réduite après dilution dans 50 ml de n-hexane.
N-hydroxysuccinimide de l'acide oléique (Sigma O 9506) dilué dans 5 ml de
CH2Cl2 anhydre. Après évaporation, le produit est purifié sur colonne de silice (éther / acétate d'éthyle ; 1/1) . Le produit final, repris dans I ml de Cl17CIZ est déprotégé Boc dans 10 ml d'acide trifluoroacétique (Fluka 91699). Pour éliminer l'acide trifluoroacétique on évapore à pression réduite après dilution dans 50 ml de n-hexane.
Rendement global de synthèse : 64 % (89 mg ; 90 mol)
RMN-H(200 MHz, CDCl3/CD3OD: 0,81 ppm (t,j=6,4Hz, 6H, -CH3), 1,22-1,3 ppm (m, 44 H, -CH2-), 1,51 ppm (m, 4 H, -CH2-CH2-CO-NH-), 1,72-1,90 ppm (m, 6 II,
NH3+ -CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+ -CH2-CH2-CH2-NH-), 1,92 ppm (m, 8H, CH2-CH=), 2,07-2,2 ppm (m, 4 H, CH2-CO-NH-), 2,89 ppm (m: G Il, NI 13+ -CH2-CH2-CH2-CH2-
NH2+ -CH2-CH2-CH2-NH-), 4,22 ppm (t, 1H, NH-CO-CHR-NH-), 5,27 ppm (m, 4H, -CH=). Spectrométrie de masse : mesurée 759,7 Da (calculée 760,2 Da).
RMN-H(200 MHz, CDCl3/CD3OD: 0,81 ppm (t,j=6,4Hz, 6H, -CH3), 1,22-1,3 ppm (m, 44 H, -CH2-), 1,51 ppm (m, 4 H, -CH2-CH2-CO-NH-), 1,72-1,90 ppm (m, 6 II,
NH3+ -CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+ -CH2-CH2-CH2-NH-), 1,92 ppm (m, 8H, CH2-CH=), 2,07-2,2 ppm (m, 4 H, CH2-CO-NH-), 2,89 ppm (m: G Il, NI 13+ -CH2-CH2-CH2-CH2-
NH2+ -CH2-CH2-CH2-NH-), 4,22 ppm (t, 1H, NH-CO-CHR-NH-), 5,27 ppm (m, 4H, -CH=). Spectrométrie de masse : mesurée 759,7 Da (calculée 760,2 Da).
Svnthèse du lipide cationique de formule I dans laquelle n = 2, m(t = 3, mss= 4;
R = stéarovle (lipide pcTG39)
Le composé pcTG39 est préparé à l'échelle de 140 mol de la même façon en utilisant l'acide stéarique et le dicyclohexylcarbodiimide ou de la (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) comme agent de couplage.
R = stéarovle (lipide pcTG39)
Le composé pcTG39 est préparé à l'échelle de 140 mol de la même façon en utilisant l'acide stéarique et le dicyclohexylcarbodiimide ou de la (benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) comme agent de couplage.
Rendement global de synthèse: 22 % (30 mg; 30 mol)
RMN-H(200 MHz, CDCl3/CD3OD/D2O): 0,68 ppm (t,j=6,8Hz, 6H, -CH3), 1,06 ppm (m, 48 II, -CH2-), 1,37 ppm (m, 4 II, -CH2-CH2-CO-NH-), 1,53-1,75 ppm (m, 6
H, NH3+ -CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+ -CH2-CH2-CH2-NH-), 1,90-2,30 ppm (m, 4H, CH2
CO-NH=), 2,74 ppm (m, 6H, NH3+ -CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+ -CH2-CH2-CH2-NH-), 3,25-3,55 ppm (m, 4 H, -Cl12-NII-CO-).
RMN-H(200 MHz, CDCl3/CD3OD/D2O): 0,68 ppm (t,j=6,8Hz, 6H, -CH3), 1,06 ppm (m, 48 II, -CH2-), 1,37 ppm (m, 4 II, -CH2-CH2-CO-NH-), 1,53-1,75 ppm (m, 6
H, NH3+ -CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+ -CH2-CH2-CH2-NH-), 1,90-2,30 ppm (m, 4H, CH2
CO-NH=), 2,74 ppm (m, 6H, NH3+ -CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+ -CH2-CH2-CH2-NH-), 3,25-3,55 ppm (m, 4 H, -Cl12-NII-CO-).
Spectrométrie de masse : mesurée 7G4,5 Da (calculée 764,3 Da).
Préparation des complexes liPides-ADN par mise en suspension dans l'méthanol
1. Préparation des complexes lipides pcTG37, éventuellement DOPE,-ADN
Les quantités de lipides sont calculées en se basant sur la concentration d'ADN final (0,1 mg/ml pour les essais in vitro), le rapport de charges désiré, la masse molaire et le nombre de charges positives du lipide cationique choisi. Pour obtenir un complexe entre pcTG37/DOPE et de l'ADN plasmidique à un ratio de 10 entre charges positives apportées par le lipide cationique et charges négatives apportées par 1'ADN à une concentration d'ADN finale de 0,1 mg/ml, on mélange les différents ingrédients selon le calcul suivant
0,1 mgd'ADN/ml soit (0,1/330) mmoles de charges négatives (330 Da est le poids moléculaire moyen d'un nucléotide) par ml correspondent à 0,30 Fmole/ml de charges négatives. Pour obtenir 10 fois plus de charges positives il faut une concentration de 3,0 mole/ml de charges positives apportées par le lipide cationique. La masse molaire de pcTG37 sous forme de trifluoroacétate est de 988 g/mole et la molécule contient 2 charges positi\ es.
1. Préparation des complexes lipides pcTG37, éventuellement DOPE,-ADN
Les quantités de lipides sont calculées en se basant sur la concentration d'ADN final (0,1 mg/ml pour les essais in vitro), le rapport de charges désiré, la masse molaire et le nombre de charges positives du lipide cationique choisi. Pour obtenir un complexe entre pcTG37/DOPE et de l'ADN plasmidique à un ratio de 10 entre charges positives apportées par le lipide cationique et charges négatives apportées par 1'ADN à une concentration d'ADN finale de 0,1 mg/ml, on mélange les différents ingrédients selon le calcul suivant
0,1 mgd'ADN/ml soit (0,1/330) mmoles de charges négatives (330 Da est le poids moléculaire moyen d'un nucléotide) par ml correspondent à 0,30 Fmole/ml de charges négatives. Pour obtenir 10 fois plus de charges positives il faut une concentration de 3,0 mole/ml de charges positives apportées par le lipide cationique. La masse molaire de pcTG37 sous forme de trifluoroacétate est de 988 g/mole et la molécule contient 2 charges positi\ es.
Donc il faut 1,5 mole/ml de pcTG37 ce qui correspond à 1,49 mg/'ml.
Pour obtenir une concentration équimolaire en L-α-Dioleoyl-phosphatidyléthanolamine (DOPE, 744 g/mole, Sigma; P0510), il en faut 1,12 mg/ml dans la préparation lipidique. Les quantités et les concentrations pour les autres composés sont ajustées en conséquence de leurs masses molaires respectives et de leur nombre de charges positives.
Les lipides sont repris dans du chloroforme, séchés par évaporation puis solubilisés dans du chloroforme/méthanol (\ :\ ) et à nouveau séchés. Les lipides cationiques sont pesés et la quantité de DOPE est ajoutée à partir d'une solution mère de 10 ou 2() mg/ml dans du chloroforme dans un tube en verre stérilisé à l'alcool et aux UV pour obtenir une concentration de 2 mM en lipide cationique. Les solvants sont évaporés sous vide (0,2.105 Pa (200 mbar)) pendant 45 min à 45C en utilisant un vortex de 40 tours par minute (Labconco, Rapidvap, Uniequip, Martinsried, Allemagne).
Le film lipidique est repris dans de l'éthanol pour être à la concentration de 50 mg/ml en lipide cationique.
pcTG37/DOPE 1,49 mg + 1,12 mg = 2,61 mg dans 30 l d'éthanol. Cette solution est complétée avec 270 ,1l d'HEPES 2()mNl pl-l 7,5 (ajusté avec Na()ll) pour préparer une solution à 5 mg/ml finale.
pcTG37/DOPE 1,49 mg + 1,12 mg = 2,61 mg dans 30 l d'éthanol. Cette solution est complétée avec 270 ,1l d'HEPES 2()mNl pl-l 7,5 (ajusté avec Na()ll) pour préparer une solution à 5 mg/ml finale.
L'ADN plasmidique est préparé à partir d'une solution mère à 1 mg/ml (Tris 10 mNl, EDTA I mM, pi-I 7,5).
Pour une solution de 0,5 ml finale, on prelève 50 l dc la solution mère (50 g ADN) auxquels on ajoute 300 l d'HEPES 20mM pH 7,5.
Pour complexer l'ADN avec des préparations lipidiques, on ajoute des lipides sur l'ADN. La suspension est mélangée par aspiration/refoulage à la pipette (10 fois). Les complexes sont conservés à + 4"C.
150 l de pcTG37/DOPEsont ajoutés à 350 > 1 1 de la solution ADN pour obtenir 0,5 ml de complexe à 0,1 mg/ml ADN et un rapport de charges de 1().
La préparation des complexes se fait sous une hotte à flux laminaire.
On obtient les complexes dont les caractéristiques sont indiquées dans le tableau 1 ci-après.
2. Préparation des complexes lipides pcTG39, éventuellement DOPE,-
ADN
On obtient les complexes selon le même protocole que précédemment.
ADN
On obtient les complexes selon le même protocole que précédemment.
Préparation des complexes lipides-ADN par mise en suspension dans une solution de détergent
1. Préparation des complexes lipides pcTG37, éventuellement DOPE,-
ADN
Les quantités de lipides sont calculées comme décrit ci-dessus en se basant sur la concentration d'ADN final (0,1 mg/ml pour les essais in vitro), le rapport de charges désiré, la masse molaire et le nombre de charges positives du lipide cationique choisi. Le mélange des lipides se fait dans un tube en verre stérilisé à l'alcool et aux UV, pour obtenir une solution 2 mil en lipide cationique (voir ci dessus). Les solvants sont évaporés et le film lipidique est repris dans une solution de n-octyl, ss-D-glucopyranoside (octylglucoside, Sigma, O 9882) selon un rapport lipide cationique/détergent de 1/5 (mole:mole).
1. Préparation des complexes lipides pcTG37, éventuellement DOPE,-
ADN
Les quantités de lipides sont calculées comme décrit ci-dessus en se basant sur la concentration d'ADN final (0,1 mg/ml pour les essais in vitro), le rapport de charges désiré, la masse molaire et le nombre de charges positives du lipide cationique choisi. Le mélange des lipides se fait dans un tube en verre stérilisé à l'alcool et aux UV, pour obtenir une solution 2 mil en lipide cationique (voir ci dessus). Les solvants sont évaporés et le film lipidique est repris dans une solution de n-octyl, ss-D-glucopyranoside (octylglucoside, Sigma, O 9882) selon un rapport lipide cationique/détergent de 1/5 (mole:mole).
On prélève 375 l d'une solution d'octylglucoside 20 mM dans de l'HEPES 20 mM pH 7,5, avec lesquels on reprend le film de mélange lipidique pcTG37/DOPE. L'ADN plasmidique est préparé à partir d'une solution mère d'ADN plasmidique à 1 mg/ml dont on prélève 50 lt1 pour un volume final de 0,5 ml (0,1 mg/ml final) auxquels on ajoute 262,5 l d'HEPES 20 mM pH 7,5.
187,5 cil de la suspension lipidique sont ajoutés sur l'ADN en aspirant et refoulant 10 fois à la pipette pour obtenir la suspension finale à (),1 mg/ml en
ADN et un rapport de charges +/- de 10. Pour éliminer le détergent une dialyse de 3 fois 4 heures à température ambiante contre de l'IIEI'ES 2() mM pli 7,5 est entreprise dans des microdoigts de dialyse (seuil d'exclusion dc i 13,2 ? kD ;
Sartorius, Göttingen, Allemagne). Les complexes ADN/lipides dialysés sont conservés à + 4"C. La préparation se fait dans une hotte à flux laminaire.
ADN et un rapport de charges +/- de 10. Pour éliminer le détergent une dialyse de 3 fois 4 heures à température ambiante contre de l'IIEI'ES 2() mM pli 7,5 est entreprise dans des microdoigts de dialyse (seuil d'exclusion dc i 13,2 ? kD ;
Sartorius, Göttingen, Allemagne). Les complexes ADN/lipides dialysés sont conservés à + 4"C. La préparation se fait dans une hotte à flux laminaire.
On obtient les complexes dont les caractéristiques sont indiquées dans le tableau 1 ci-dessous.
2. Préparation des complexes lipides pcTG39. éventuellement DOPE,- ADN
Selon le même protocole on obtient les complexes dont les caractéristiques sont indiquées dans le tableau 1 ci-après.
Selon le même protocole on obtient les complexes dont les caractéristiques sont indiquées dans le tableau 1 ci-après.
Préparation des complexes lipides-ADN par sonication extrusion
Les quantités de lipides sont calculées comme décrit ci-dessus en se basant sur la concentration d'ADN final (0,1 mg/ml pour les essais in vitro), le rapport de charges désiré, la masse molaire et le nombre de charges positives du lipide cationique choisi. La mélange des lipides se fait dans un tube en verre stérilisé à l'alcool et aux UV, pour obtenir une solution 2 mM en lipide cationique, comme indiqué ci-dessus. Les solvants sont évaporés et le film lipidique est repris dans 900 l d'llEPES 20 mM pll 7,5 à 4 C pendant environ 16 h. La suspension est soniquée dans un bain de sonication (Bransonic 221) jusqu'à homogéneité visuelle. La suspension lipidique est extrudée au travers de deux membranes de 0,2 m de diamètre de pores (Nucleopore, Costar, Cambridge, MA, USA) et rinçée avec de l'HEPES 20mM pll 7,5 (Extruder de Lipex Biomembranes, Vancouver, Canada) à une pression maximale de 50 bars. La suspension lipidique est maintenue à température ambiante pendant 1 heure. 450 l de la suspension lipidique sont ajoutés sur 50 l d'une solution mère de l'ADN plasmidique (1 mg/ml) et mélangés en aspirant/refoulant 10 fois à la pipette. Les complexes lipide/ADN sont conservés à +4 C. Les préparations sont faites sous une hotte à flux laminaire.
Les quantités de lipides sont calculées comme décrit ci-dessus en se basant sur la concentration d'ADN final (0,1 mg/ml pour les essais in vitro), le rapport de charges désiré, la masse molaire et le nombre de charges positives du lipide cationique choisi. La mélange des lipides se fait dans un tube en verre stérilisé à l'alcool et aux UV, pour obtenir une solution 2 mM en lipide cationique, comme indiqué ci-dessus. Les solvants sont évaporés et le film lipidique est repris dans 900 l d'llEPES 20 mM pll 7,5 à 4 C pendant environ 16 h. La suspension est soniquée dans un bain de sonication (Bransonic 221) jusqu'à homogéneité visuelle. La suspension lipidique est extrudée au travers de deux membranes de 0,2 m de diamètre de pores (Nucleopore, Costar, Cambridge, MA, USA) et rinçée avec de l'HEPES 20mM pll 7,5 (Extruder de Lipex Biomembranes, Vancouver, Canada) à une pression maximale de 50 bars. La suspension lipidique est maintenue à température ambiante pendant 1 heure. 450 l de la suspension lipidique sont ajoutés sur 50 l d'une solution mère de l'ADN plasmidique (1 mg/ml) et mélangés en aspirant/refoulant 10 fois à la pipette. Les complexes lipide/ADN sont conservés à +4 C. Les préparations sont faites sous une hotte à flux laminaire.
Protocole d'évaluation de la complexation de l'ADN par les lipides
Un gel à 1% (w:v) d'agarose est préparé dans un tampon TAE (TAE : Tris 4,86g/1 + acétate de sodium 0,68g/1 + EDTA 0,336g/1 pll 7,8. Si nécessaire,
I'échantillon est dilué dans du'l'AE puis on ajoute le tampon d'échantillon bleu de bromophénol 0,083%, cyanol xylène FF 0,083%, glycérol 10% dans l'eau) de façon à se trouver à 50 ng d'ADN/ l. L'échantillon est brièvement soumis à un vortex et laissé 30 min à température ambiante. A titre dc témoin, on utilise le plasmide non complexé préparé à la même concentration. 10 l(500 ngd'ADN) sont déposés sur le gel et la migration s'effectue à 60mV pendant 3 heures. I.e gel est révélé dans du TAE contenant 0,006% (v:v) dc bromurc d'éthidium à 1 () mg/ml pendant au moins 30 min. Ensuite le gel est rincé dans du TAE et analysé sous UV.
Un gel à 1% (w:v) d'agarose est préparé dans un tampon TAE (TAE : Tris 4,86g/1 + acétate de sodium 0,68g/1 + EDTA 0,336g/1 pll 7,8. Si nécessaire,
I'échantillon est dilué dans du'l'AE puis on ajoute le tampon d'échantillon bleu de bromophénol 0,083%, cyanol xylène FF 0,083%, glycérol 10% dans l'eau) de façon à se trouver à 50 ng d'ADN/ l. L'échantillon est brièvement soumis à un vortex et laissé 30 min à température ambiante. A titre dc témoin, on utilise le plasmide non complexé préparé à la même concentration. 10 l(500 ngd'ADN) sont déposés sur le gel et la migration s'effectue à 60mV pendant 3 heures. I.e gel est révélé dans du TAE contenant 0,006% (v:v) dc bromurc d'éthidium à 1 () mg/ml pendant au moins 30 min. Ensuite le gel est rincé dans du TAE et analysé sous UV.
Protocole de mesure de la taille des particules par diffusion quasi élastique de la lumière
Les analyses sont faites sur un Coulter N4Plus (Coultronics Francs S.A.,
Margency, France) à 25 C après équilibration de l'échantillon pendant 2() min. Une aliquote de l'échantillon est aspirée et refoulée plusieurs fois avant d'être pipettée. l'échantillon est dilué dans la cuve de mesure et homogénéisé.
Les analyses sont faites sur un Coulter N4Plus (Coultronics Francs S.A.,
Margency, France) à 25 C après équilibration de l'échantillon pendant 2() min. Une aliquote de l'échantillon est aspirée et refoulée plusieurs fois avant d'être pipettée. l'échantillon est dilué dans la cuve de mesure et homogénéisé.
La mesure de la lumière diffractée à 90 est faîte pendant 180 sec après 18() sec d'attente. La gamme utilisée va de 3 nm à 10 000 nm en utilisant 3lbins.
Pour être valable, I'échantillon doit donner entre 50 000 et I 000 ()()() counts/sec.
Caractéristiques phvsico-chimiqucs
Les trois méthodes de formulation "injection d'éthanol", "dialyse de détergent" et "sonication-extrusion " sont appliquées aux lipides cationiques selon l'invention avec ou sans des quantités équimolaires de DOPE à des rapports de charges d'environ 10 ou 5. Les formulations sont considérées comme appropriées lorsque l'ADN est complètement complexé (aucune migration dans le gel d'agarose) et que les complexes présentent des diamètres déterminés par diffusion quasi élastique de la lumière inférieurs a 500 nm. Le tableau 1 résume les résultats de ces analyses. 'l'ous les complexes
ADN/lipides indiqués dans le tableau complexent l'ADN complètement.
Les trois méthodes de formulation "injection d'éthanol", "dialyse de détergent" et "sonication-extrusion " sont appliquées aux lipides cationiques selon l'invention avec ou sans des quantités équimolaires de DOPE à des rapports de charges d'environ 10 ou 5. Les formulations sont considérées comme appropriées lorsque l'ADN est complètement complexé (aucune migration dans le gel d'agarose) et que les complexes présentent des diamètres déterminés par diffusion quasi élastique de la lumière inférieurs a 500 nm. Le tableau 1 résume les résultats de ces analyses. 'l'ous les complexes
ADN/lipides indiqués dans le tableau complexent l'ADN complètement.
TABLEAU 1
<tb> <SEP> lipide <SEP> Rapport <SEP> Taille <SEP> (nm) <SEP> Formulation
<tb> <SEP> pcTG37 <SEP> 10 <SEP> 77 <SEP> éthanol
<tb> <SEP> pcTG37 <SEP> 5 <SEP> 80 <SEP> éthanol
<tb> pcTG37/DOPE <SEP> 10 <SEP> 79 <SEP> éthanol
<tb> pcTG3 <SEP> 7/DOPE <SEP> 5 <SEP> 64 <SEP> <SEP> éthanol
<tb> <SEP> pcTG37 <SEP> 10 <SEP> 240 <SEP> détergent <SEP>
<tb> <SEP> pcTG37 <SEP> 5 <SEP> 5g <SEP> détergent
<tb> pcTG3 <SEP> 7/DOPE <SEP> 10 <SEP> 312 <SEP> détergent
<tb> pcTG39/DOPE <SEP> 10 <SEP> 312 <SEP> détergent
<tb> pcTG37/DOPE <SEP> 5 <SEP> 280 <SEP> sonication
<tb> 1: Rapport entre les charges positives du lipide cationique et les charges
négatives de I'ADN.
<tb> <SEP> pcTG37 <SEP> 10 <SEP> 77 <SEP> éthanol
<tb> <SEP> pcTG37 <SEP> 5 <SEP> 80 <SEP> éthanol
<tb> pcTG37/DOPE <SEP> 10 <SEP> 79 <SEP> éthanol
<tb> pcTG3 <SEP> 7/DOPE <SEP> 5 <SEP> 64 <SEP> <SEP> éthanol
<tb> <SEP> pcTG37 <SEP> 10 <SEP> 240 <SEP> détergent <SEP>
<tb> <SEP> pcTG37 <SEP> 5 <SEP> 5g <SEP> détergent
<tb> pcTG3 <SEP> 7/DOPE <SEP> 10 <SEP> 312 <SEP> détergent
<tb> pcTG39/DOPE <SEP> 10 <SEP> 312 <SEP> détergent
<tb> pcTG37/DOPE <SEP> 5 <SEP> 280 <SEP> sonication
<tb> 1: Rapport entre les charges positives du lipide cationique et les charges
négatives de I'ADN.
2 : Les populations qui représentent moins de 10 % de l'intensité ne sont pas
indiquées. La taille est déterminée 24-48 heures après la préparation.
indiquées. La taille est déterminée 24-48 heures après la préparation.
Ces analyses montrent que les formulations remplissent les exigences requises. La méthode "injection d'éthanol" donne les meilleurs résultats, les différentes préparations testées présentant une taille inférieure à 100 nm. La méthode par dialyse de détergent ou de sonication/extrusion permet également d'obtenir certains complexes répondant aux buts dc la présente invention.
Transfection in vitro de cellules satellites
Des cultures de muscles de chien ct de muscles humains sont effectuées dans un milieu HamF 14 (Life Technologies) supplémenté avec 1() % de sérum foetal de veau (FCS, Hyclone, Logan, UT), 10 g/ml d'insulinc (Sigma), 10 ng/ml d'EGF (Sigma) et de FGF (Pepro Tech Inc., Rocky I-lill, NJ) 2mM de glutamine (bioMérieux), et 40 g/ml de gentamycine (Schering
Plough).
Des cultures de muscles de chien ct de muscles humains sont effectuées dans un milieu HamF 14 (Life Technologies) supplémenté avec 1() % de sérum foetal de veau (FCS, Hyclone, Logan, UT), 10 g/ml d'insulinc (Sigma), 10 ng/ml d'EGF (Sigma) et de FGF (Pepro Tech Inc., Rocky I-lill, NJ) 2mM de glutamine (bioMérieux), et 40 g/ml de gentamycine (Schering
Plough).
Les cellules sont ensemencées 24 h à 48 h avant la transfection dans une boite de culture à 9G puits à raison dc 5x10 à 104 cellules par puits, à environ 30 % de confluence, et maintenues à 37 C en atmosphère contenant 5 % CO2 et 95 % d'air.
Les transfections sont effectuées avec des mélanges de quantités variables de lipides et d'ADN plasmidique pour déterminer les rapports de charges et les concentrations d'ADN optimales par puits.
Les complexes utilisés sont préparés 24 h à 48 h avant la transfection et dilués dans le milieu HamF 14 contenant 40 g/ml de gentamycine et 2mM de glutamine.
Après élimination du milieu de culture, 100 cil de mélanges de transfection avec ou sans 10 % de FCS sont transférés dans chacun des puits et les plaques sont incubées pendant 4 h à 37 C.
Tous les milieux de transfection sont alors ajustés à 10 % de FCS, 1) g/ml d'insuline (Sigma), 10 ng/ml d'EGF (Sigma) et de FGF (Pepro Tech Inc., Rocky Hill, NJ), 2 mNl de glutamine (bioNlérieux), et 40 g/ml de gentamycine (Schering Plough) pour un volume final de 250 l. Les cultures sont incubées pendant 48 h puis les cellules sont récupérées et testées pour leur capacité à exprimer le gène de la luciférase. Les concentrations de protéines sont déterminées par le système de test de quantité de protéine (Promega).
Transfection de cellules A549 avec des complexes lipidiques
Les cellules A549 (cellules épithéliales dérivées de carcinome pulmonaire humain) sont mises en culture dans du milieu d'Eagle modifié par
Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum de veau foetal (Gibco HRL) 24 heures avant le début de la transfection dans des plaques de 9G puits (2 x cellules par puits) dans une atmosphère humide à 37"C et 5% CO2/95% air.
Les cellules A549 (cellules épithéliales dérivées de carcinome pulmonaire humain) sont mises en culture dans du milieu d'Eagle modifié par
Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum de veau foetal (Gibco HRL) 24 heures avant le début de la transfection dans des plaques de 9G puits (2 x cellules par puits) dans une atmosphère humide à 37"C et 5% CO2/95% air.
Pour la transfection en l'absence de sérum, le milieu est enlevé et remplacé par du milieu sans sérum. On prépare dans une autre microplaque les suspensions de complexes lipides/ADN suivantes (complexes lipides/ADN à (),1 mg/ml d'ADN et au rapport de charges indiqué) : 44 sx1 (4,4 g ADN), 22 l (2,2 g ADN), 5,5 Ctl (0,55 g ADN) de solution stock dans les 3 premiers puits, et il cil (0,11 g ADN) de la solution stock diluée 10 fois dans le puits suivant. Le volume est complété à 110 cil avec du DMEM et 100 cil sont transférés sur les cellules A549. L'incubation se fait avec 4, 2, 0,5 ct (),1 g d'Al)N par puits pendant 4 heures. 50 crl de DMEM + 30% de sérum de veau foetal sont ajoutés 4 heures après le début de la transfection puis 100 l de DMEM + 10% de FCS 24 heures après le début de la transfection. Les translections en présence de 10% de sérum de veau foetal sont réalisées d'une façon identique sauf que la transfection se passe dans du milieu avec sérum.
Analyse de la transfection
48 h après la transfection, le milieu est éliminé et les cellules sont lavées avec 100 cil de solution phosphate PBS et lysées arec 50 l de tampon dc lyse (Promega). Les lysats sont congelés à - 8() "C jusqu'à la mesure de l'activité en luciférase. Celle-ci se fait sur 20 l de mélange pendant une minute en utilisant le système de détermination de la luciférase" (Promega) (luminomètre LB96P Berthold) dans des plaques à 96 puits en mode cinétique.
48 h après la transfection, le milieu est éliminé et les cellules sont lavées avec 100 cil de solution phosphate PBS et lysées arec 50 l de tampon dc lyse (Promega). Les lysats sont congelés à - 8() "C jusqu'à la mesure de l'activité en luciférase. Celle-ci se fait sur 20 l de mélange pendant une minute en utilisant le système de détermination de la luciférase" (Promega) (luminomètre LB96P Berthold) dans des plaques à 96 puits en mode cinétique.
Transfection in "itro
Les préparations de lipides cationiques pcTG37 ont été évaluées en tranfection in vitro en utilisant les cellules A549 et les myoblastes primaires de chien.
Les préparations de lipides cationiques pcTG37 ont été évaluées en tranfection in vitro en utilisant les cellules A549 et les myoblastes primaires de chien.
Les résultats sont résumés dans le tableau 2 ci-dessous et montrent les unités relatives de lumière (RLU) par puits. Les valeurs données sont obtenues avec 0,5 cig d'ADN par puits. Tous les complexes sont préparés en utilisant la méthode d'injection d'éthanol. La concentration totale de protéine par puits est déterminée par les techniques conventionnelles (test BCA,
Pierce). A titre indicatif, un puits contient environ 20 à 30 g de protéine.
Pierce). A titre indicatif, un puits contient environ 20 à 30 g de protéine.
TABLEAU 2
<tb> Lipide <SEP> rapport1 <SEP> A5492 <SEP> A549 <SEP> + <SEP> myoblastes <SEP> myoblastes <SEP>
<tb> <SEP> sérum <SEP> + <SEP> sérum
<tb> pcTG37 <SEP> 10 <SEP> 1,7 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 3,2 <SEP> x <SEP> 104 <SEP> 0 <SEP> 1.2 <SEP> N <SEP> 105 <SEP>
<tb> <SEP> (4,0 <SEP> x <SEP> 108
<tb> <SEP> RLU/mg/ <SEP> min)
<tb> pcTG37 <SEP> 5 <SEP> 9,9 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 3,9 <SEP> N <SEP> 103 <SEP> 8,5 <SEP> N <SEP> 10 <SEP> 8,6 <SEP> N <SEP> 10 <SEP>
<tb> <SEP> (1,4 <SEP> x <SEP> <SEP> 109
<tb> <SEP> RLU/mg/ <SEP> min)
<tb> pcTG37/ <SEP> 10 <SEP> 3,5 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 1,2 <SEP> N <SEP> 106 <SEP> 1,5 <SEP> N <SEP> 104 <SEP> 4,9 <SEP> x <SEP> 105 <SEP>
<tb> DOPE
<tb> pcTG37/ <SEP> S <SEP> 5,0 <SEP> N <SEP> 104 <SEP> G,7 <SEP> N <SEP> 106 <SEP> 1.9 <SEP> N <SEP> 106 <SEP> 4,9 <SEP> x <SEP> 104 <SEP>
<tb> DOPE
<tb> Rapport entre les charges positives du lipide cationique et les charges
négatives de l'ADN.
<tb> <SEP> sérum <SEP> + <SEP> sérum
<tb> pcTG37 <SEP> 10 <SEP> 1,7 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 3,2 <SEP> x <SEP> 104 <SEP> 0 <SEP> 1.2 <SEP> N <SEP> 105 <SEP>
<tb> <SEP> (4,0 <SEP> x <SEP> 108
<tb> <SEP> RLU/mg/ <SEP> min)
<tb> pcTG37 <SEP> 5 <SEP> 9,9 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 3,9 <SEP> N <SEP> 103 <SEP> 8,5 <SEP> N <SEP> 10 <SEP> 8,6 <SEP> N <SEP> 10 <SEP>
<tb> <SEP> (1,4 <SEP> x <SEP> <SEP> 109
<tb> <SEP> RLU/mg/ <SEP> min)
<tb> pcTG37/ <SEP> 10 <SEP> 3,5 <SEP> x <SEP> 106 <SEP> 1,2 <SEP> N <SEP> 106 <SEP> 1,5 <SEP> N <SEP> 104 <SEP> 4,9 <SEP> x <SEP> 105 <SEP>
<tb> DOPE
<tb> pcTG37/ <SEP> S <SEP> 5,0 <SEP> N <SEP> 104 <SEP> G,7 <SEP> N <SEP> 106 <SEP> 1.9 <SEP> N <SEP> 106 <SEP> 4,9 <SEP> x <SEP> 104 <SEP>
<tb> DOPE
<tb> Rapport entre les charges positives du lipide cationique et les charges
négatives de l'ADN.
: ADN libre entre 0 et 270 unités de lumière relative.
Claims (25)
1. Lipide de formule:
R-HN[-(CH2)m-NR]-(CH2)m-NH-R
n-l dans laquelle
R identique ou différent est un atome d'hydrogène ou un groupe de formule
dans laquelle
R1, R2, identiques ou différents sont des radicaux C6-C23 alkyle ou alcényle, linéaires ou ramifiés ou des radicaux -C(=O)-(C6-C23) alkyle ou -C(=O)-(C6-C23) alcényle, linéaires ou ramifiés,
p est un nombre entier positif de 1 à 4,
n est un nombre entier positif de 1 à G,
m est un nombre entier positif de 1 à 6 et pouvant être différent pour chaque motif -(CH2)m-NH- lorsque n > 1,
le nombre de groupes R présents différents de l'atome d'hydrogène étant compris entre 1 et 4, lesdits lipides étant éventuellement sous forme cationique associés avec un OU plusieurs anions biologiquements acceptables.
2. Lipide selon la revendication 1 formule
H2N-[(CH2)m-NH-]n-R; RNH[-(CH2)m-NH]-nH ; H2N[-(CH2)n-NR]-(CH2)m-NH2
n-l II lla llb dans laquelle
R a l'une des significations indiquée à la formule I ct un seul groupe 14 différent de l'atome d'hydrogène étant présent dans la polyamine de formule llb,
n est un nombre entier positif de 1 à 6,
m est un nombre entier positif de 1 à G ct pouvant être dilTércnt pour chaque motif -(CH2)m-NH- lorsque n > 1,
lesdits lipides étant éventuellement sous forme cationique associés avec un ou plusieurs anions biologiquement acceptables.
3. Lipide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que 1t1,
R2, identiques ou différents, sont des radicaux -C(=O)- alkyle linéaires ou
C(=0)- alcényle linéaires, comprenant notamment 12 à 20 atomes de carbonc lorsque ledit lipide comporte 1 ou 2 groupements R.
4. Lipide selon la revendication 1 à 3, caractérisé en ce que n est un nombre entier choisi parmi les nombres 2, 3 ou 4.
5. Lipide selon la revendication 1 à 4, caractérisé en ce que m est un nombre entier choisi parmi les nombres 2, 3 ou 4.
6. Lipide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe constitué par les composés de formule suivante
dans laquelle
R1, R2 identiques sont choisis parmi les radicaux stéaryle ou oléoyle.
7. Lipide selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le lipide est conjugué à un ou plusieurs ligands d'intérêt par l'intermédiaire d'un des atomes d'azote secondaire ou primaire de la chaîne polyamine ou de l'acide diaminocarboxylique.
8. Lipide selon la revendication 7, caractérisé en ce que le ligand d'intérêt est choisi dans le groupe constitué par un sucre, un peptide, une hormone, une vitamine, un anticorps, un peptide fusogénique, un peptide dc localisation nucléaire.
9. Composition caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un lipide cationique selon l'une des revendications précédentes et au moins un colipide susceptible d'améliorer la formation d'agrégats lipidiques, entre lesdits lipides et les substances actives biologiquement acceptables.
10. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que le colipide est choisi dans le groupe constitué par la phosphatidyléthanolamine (PE) ou un dérivé de la phosphatidyléthanolamine tel que la DOll. ou dioléoyl-phosphatidyléthanolamine.
11. Composition selon la revendication 9 ou 10, caractérisée en ce que le rapport en poids lipide/colipide est compris entre 0,1 et 1().
12. Procédé de préparation d'un complexe lipide cationique/substance active, caractérisé en ce que l'on met en présence un ou plusieurs lipides selon l'une des revendications 1 à 8 sous forme cationique ou une composition selon l'une des revendications 9 à 11 dont le lipide est sous forme cationique avec une ou plusieurs substances actives et en ce que l'on récupère ledit complexe.
13. Procédé de préparation selon la revendication 12, caractérisé en ce que le rapport entre les charges positives du ou des lipides cationiques et les charges négatives de la substance active est compris entre (),()5 et 2(), de préférence entre 5 et 10.
14. Procédé de préparation selon l'une des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce que lesdits complexes sont obtenus par mise en solution dans un solvant miscible à l'eau, notamment I 'éthanol ou le diméthylsulfoxyde, des lipides ou des compositions selon l'une des revendications 1 à 11 ou par mise en suspension dans une solution de détergent des lipides ou des compositions selon l'une des revendications 1 à 11, puis mélange avec la substance active, éventuellement dals se dans le cas de la solution de détergent pour réduire le détergent, et récupération des complexes ou par sonication extrusion d'une suspension de lipide cationique ou composition selon l'une des revendications 1 à 11 et mélange avec une substance active et récupération des complexes.
15. Complexe de lipides cationiques selon l'une des revendications 1 à 8 ou d'une composition selon l'une des revendications 9 à 11 et d'une ou plusieurs substances actives comportant des charges négatives.
16. Complexe selon la revendication 15, caractérisé en ce que la substance active est choisie parmi les acides nucléiques, les protéines.
17. Complexe selon l'une des revendications 15 ou 1G, caractérisé en ce qu'il présente une taille inférieure à 500 nm, avantageusement inférieure à 200 nm.
18. Complexe selon l'une des revendications 15 à 17, caractérisé cn ce qu'il présente une taille inférieure à 100 nm.
19. Complexe selon l'une des revendications 15 à 18, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par le procédé selon la revendication 14.
20. Kit pour préparer des complexes selon l'une des revendications 15 à 19, comprenant un ou plusieurs lipides selon l'une des revendications 1 à 8 ou une ou plusieurs compositions selon l'une des revendications 9 à 11.
21. Procédé pour introduire une substance active dans une cellule, caractérisé en ce que l'on met en contact un ou plusieurs complexes selon l'une des revendications 15 à 19 avec les cellules cibles.
22. Procédé pour transfecter une cellule, caractérisé en ce que l'on met en contact avec les cellules cibles un ou plusieurs complexes selon l'une des revendications 16 à 19 comprenant des acides nucléiques.
23. Complexes selon l'une des revendications 15 à 19, pour leur application en tant que produit thérapeutiquement actif, notamment pour transférer un acide nucléique à l'intérieur d'une cellule.
24. Complexes selon la revendication 23, caractérisés en ce que le lipide répond à la formule III où R1, R2 correspondent au radical oléoyle.
25. Complexes selon l'une des revendications 23 ou 24, caractérisés en ce que les cellules sont des cellules musculaires ou pulmonaires.
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9702420A FR2760193B1 (fr) | 1997-02-28 | 1997-02-28 | Lipides et complexes de lipides cationiques et de substances actives, notamment pour la transfection de cellules |
| EP98912565A EP0948360A1 (fr) | 1997-02-28 | 1998-02-27 | Nouveaux composes lipidiques et compositions les contenant utilisables pour le transfert d'au moins une substance active, notamment un polynucleotide, dans une cellule cible et utilisation en therapie genique |
| CA002252942A CA2252942A1 (fr) | 1997-02-28 | 1998-02-27 | Nouveaux composes lipidiques et compositions les contenant utilisables pour le transfert d'au moins une substance active, notamment un polynucleotide, dans une cellule cible et utilisation en therapie genique |
| JP10537387A JP2000510871A (ja) | 1997-02-28 | 1998-02-27 | 少なくとも一種の活性物質特にポリヌクレオチドを標的細胞中へ移送するのに使用できる新規脂質化合物およびこれを含む組成物、ならびに遺伝子治療における使用 |
| US09/171,845 US6335199B1 (en) | 1997-02-28 | 1998-02-27 | Lipid compounds and compositions containing same used for the transfer of at least an active substance, in particular a polynucleotide, in a target cell and therapeutic use |
| PCT/FR1998/000389 WO1998037916A1 (fr) | 1997-02-28 | 1998-02-27 | Nouveaux composes lipidiques et compositions les contenant utilisables pour le transfert d'au moins une substance active, notamment un polynucleotide, dans une cellule cible et utilisation en therapie genique |
| AU67352/98A AU727040B2 (en) | 1997-02-28 | 1998-02-27 | New lipid compounds and compositions containing them which can be used for the transfer of at least one active substance, in particular a polynucleotide, into a target cell and use in gene therapy |
| US10/021,421 US20020151070A1 (en) | 1997-02-28 | 2001-12-19 | Lipid compounds and compositions containing them which can be used for the transfer of at least one active substance, in particular a polynucleotide, into a target cell and use in gene therapy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9702420A FR2760193B1 (fr) | 1997-02-28 | 1997-02-28 | Lipides et complexes de lipides cationiques et de substances actives, notamment pour la transfection de cellules |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2760193A1 true FR2760193A1 (fr) | 1998-09-04 |
| FR2760193B1 FR2760193B1 (fr) | 1999-05-28 |
Family
ID=9504295
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9702420A Expired - Fee Related FR2760193B1 (fr) | 1997-02-28 | 1997-02-28 | Lipides et complexes de lipides cationiques et de substances actives, notamment pour la transfection de cellules |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6335199B1 (fr) |
| EP (1) | EP0948360A1 (fr) |
| JP (1) | JP2000510871A (fr) |
| AU (1) | AU727040B2 (fr) |
| CA (1) | CA2252942A1 (fr) |
| FR (1) | FR2760193B1 (fr) |
| WO (1) | WO1998037916A1 (fr) |
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|---|---|---|---|---|
| WO2001042200A1 (fr) * | 1999-12-10 | 2001-06-14 | Genzyme Corporation | Amphiphiles cationiques pour administration intracellulaire de molecules therapeutiques |
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