CN103805586A

CN103805586A - 一种碱性果胶酸裂解酶PelA及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN103805586A
Application number: CN201410084597.2A
Authority: CN
Inventors: 丁少军; 史爱芹; 郑斐
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2014-03-10
Filing date: 2014-03-10
Publication date: 2014-05-21
Anticipated expiration: 2034-03-10
Also published as: CN103805586B

Abstract

本发明公开了一种碱性果胶酸裂解酶PelA及其编码基因和应用，所述碱性果胶酸裂解酶PelA的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明的碱性果胶酸裂解酶PelA是从食用菌草菇中克隆得到的新的果胶裂解酶酶，其最适温度为60℃，最适pH为10.0，具有良好的温度和pH稳定性，并且在无外源钙离子条件下仍具有高催化性能，因此其在工业化应用中具有良好的应用前景。另外其来源为食用菌因此安全性可靠，可广泛应用于食品，饲料以及医药等行业。

Description

一种碱性果胶酸裂解酶PelA及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种碱性果胶酸裂解酶PelA及其编码基因和应用。

背景技术

果胶（Pectin）分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键聚合而成的多糖链。果胶的结构因植物的种类、组织部位、生长条件等的不同而不同，主要分为三种类型，它们分别为聚半乳糖醛酸（Homogalacturonan，HGA）、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I（Rhamnogalacturonan I，RG-I）和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖II（Rhamnogalacturonan II，RG-II）。果胶质广泛存在高等植物中，是植物细胞间的胞间层和初生壁的重要组分。果胶质在植物的细胞组织中起着“粘合”作用，一旦植物组织中的果胶质分解便引起细胞的离散。果胶质主要是由D-半乳糖醛酸以α-1，4糖苷键连接形成的直链状的聚合物。棉花外面的保护层为细胞壁，其中含有以果胶质为主的各种杂质，对棉纤维起到一定的保护作用，但同时这也给棉织物的加工带来了一定的困难。在棉织物的进行精炼的工艺中，果胶质及其他一些杂质是主要的处理对象。

一般工业会采取碱处理去除果胶杂质，碱残液具有很高的pH，需要加入硫酸或二氧化碳进行中和，二者都会增加排除废水的盐浓度，使生产排出的废水具有较高COD/BOD。对于生产而言，还将耗费大量的时间及工艺用水，而且中和碱形成的盐类物质会对织物的色泽产生影响。更为重要的是，上述处理方式对环境产生的负面影响更应该引起我们的重视。利用酶法进行生物精炼是实现绿色纺织品生产的趋势之一。利用生物酶处理方法可大大改善棉纺织预处理工艺对产品质量及环境的影响。例如，可节约大量工艺用水、生产时间、能耗、原料及对废水的处理费用，减少对环境排放水中的盐含量及COD等。

果胶酸裂解酶（Pectate lyase，Pel）又叫聚半乳糖醛酸裂解酶（Polygalacturonase lyase，PGL），它是通过反式消去作用裂解果胶聚合体的一种果胶酶，在C-4位置上断开糖苷键，同时从C-5处消去一个H原子从而产生一个不饱和产物。

碱性果胶酸裂解酶对于亚麻纤维的前处理和棉纺织物的生物酶煮练有很大的应用前景。亚麻纤维具有许多其它纤维无法比拟的优点，是很有发展潜力的功能性环保纺织原料。但由于亚麻韧皮的单细胞间存在果胶物质，其主要成分是果胶酸的衍生物，且大部分以钙、镁盐和甲酯的形式存在，通过化学键的形式与亚麻纤维中的半纤维素和含氮的物质结合，在亚麻沤麻的过程中很难去除。并且果胶物质对亚麻纤维的润湿性、可渗透性都有影响，所以在亚麻纤维使用前必须去除果胶物质。果胶酸裂解酶能够裂解果胶物质变成半乳糖醛酸等小分子物质进而溶于水，将其去除。

碱性果胶酸裂解酶对棉花纤维进行生物精炼，发现果胶酸裂解酶的效果和传统碱处理一样好。果胶酸裂解酶还能够与纤维素酶协同煮练，果胶酶使初生壁层产生了较多的部位，可适用于纤维素酶的煮解；而纤维素酶的作用，在果胶物质层中产生了较多的部位，可适用于果胶酶的煮解。这种协同作用的结果，在对苎麻纤维的处理速度和均匀度方面较为有效。

传统的碱性果胶酸裂解酶需要在钙离子存在下才具有催化活性，需要使用时添加钙离子，增加了工艺条件的复杂性和成本，因此，碱性果胶酸裂解酶如不需要钙离子,而且在苛性条件下，仍具有较高的活性和稳定性将是工业化应用的优良酶源。

草菇（Volvariella volvacea）是生长在热带和亚热带地区的大型真菌，与其它食用真菌相比，它具有独特的生物学特性，首先，它是一种高温型担子菌，酶稳定性好，对其天然生长底物——稻草的生物降解快速有效；其次，草菇虽为白腐菌，但它的木质素降解能力较弱，它可以在木质素未被充分降解的情况下有效的降解利用天然稻草中的纤维素和半纤维素，这些酶可能成为生物炼制工程中极具潜力的新酶源。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种碱性果胶酸裂解酶PelA，不需要外源性钙离子，在碱性条件下就具有高活性和稳定性，满足使用需求。本发明的另一目的是提供所述碱性果胶酸裂解酶的编码基因。本发明还有一目的是提供上述性果胶酸裂解酶PelA的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种碱性果胶酸裂解酶PelA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述碱性果胶酸裂解酶PelA的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有所述的碱性果胶酸裂解酶PelA的编码基因的表达体系。

所述的表达体系在表达碱性果胶酸裂解酶PelA中的应用。

所述的碱性果胶酸裂解酶PelA在酶解聚半乳糖醛酸中的应用。

本发明从草菇中克隆获得碱性果胶酸裂解酶PelA基因，并实现了其在毕赤酵母中的高效异源表达并研究了其酶学特性，发现其不需要添加外源钙离子就具有高活性，是一种工业化应用的优质酶源。

有益效果：与现有技术相比，本发明的碱性果胶酸裂解酶是一种从食用菌草菇中克隆得到的新的果胶酸裂解酶，其最适温度为60℃，最适pH为10.0，具有良好的温度和pH稳定性，并且无外源钙离子存在下就具有高活性，因此其在工业化应用中具有良好的应用前景。另外其来源为食用菌因此安全性可靠，可广泛应用于食品，纺织和造纸等行业。

附图说明

图1是纯化得到的碱性果胶酸裂解酶PelAI的12% SDS-PAGE电泳图；图中，M：Marker；1：PelA；2：PelA(+EndoH)

图2是碱性果胶酸裂解酶PelA最适pH测定结果图；

图3是碱性果胶酸裂解酶PelA pH耐受性测定结果图；

图4是碱性果胶酸裂解酶PelA最适温度测定结果图；

图5是碱性果胶酸裂解酶PelA温度耐受性测定结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

以下实施例所使用的材料和试剂如下：

菌株及载体：草菇菌种Volvariella volvacea V14由香港中文大学国际菌物服务中心提供，巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris KM71H）及表达载体pPiczαB购自Invitrogen公司，大肠杆菌DH5α及基因操作质粒pGEM-T购自Promega公司。

酶类及其它生化试剂：限制性内切酶、DNA 聚合酶、连接酶和dNTP 购自TaKaRa公司；燕麦木聚糖、桦木木聚糖和山毛榉木聚糖购自Sigma 公司；其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。

LB 培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000mL，pH 自然（约为7）。固体培养基在此基础上加2.0%（w/v）琼脂。

YPD培养基：10g Yeast Extract，20g peptone，溶于900mL水，高温高压灭菌，加入100mL灭过菌的10×D（20%的葡萄糖）。

BMGY培养基：10g Yeast Extract，20g peptone溶于700mL水，高温高压灭菌，冷却到室温后加入100mL pH=6的1M的磷酸钾缓冲液（温高压灭菌），100mL 10×YNB（滤膜灭菌），2mL 500×B（20mg biotin溶于100mL的水，滤膜灭菌），100mL 10×GY（100mL甘油溶于900mL水高温高压灭菌），混合均匀后4℃保存。

BMMY：10g Yeast Extract，20g peptone溶于700mL水，高温高压灭菌，冷却到室温后加入，100mL pH 6的1M的磷酸钾缓冲液（温高压灭菌），100mL 10×YNB（滤膜灭菌），2mL 500×B（20mg biotin溶于100mL的水，滤膜灭菌），100mL 10×M（5%的甲醇），混合均匀后4℃保存。

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J. 萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1 基因的克隆

RNA的提取及模板的制备：草菇菌种从平板接种于稻草培养基8天后收集菌丝，采用invitrogen的TRIZOL regent提取：液氮将收集的菌丝研磨成粉末，取适量粉末加入1mL TRIZOL regent，混合均匀后室温静置5min。加入氯仿，震荡混合均匀，室温静置2-3 min。12000g的转速离心15min。上清液转移至干净的离心管，加入异丙醇，混合均匀后室温静置10min，用12000g的转速离心弃上清，沉淀用75%乙醇清洗，7500g的速度离心。干燥RNA，注意RNA不能完全干燥，用TE buffer溶解RNA，55-60℃保温10min。参照SMART RACE cDNA Amplification Kit （Clontech）的方法制备5’ RACE及3’ RACE的模板。

取草菇cDNA文库的表达序列标签（EST）（序列见SEQ ID NO.3）与Genebank中相关序列进行blastx比对（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），发现其与果胶酸裂解酶具有较高的同源性，根据该EST序列设计特异性引物5’- GCGCTTGGCGAGGGCAACAATTTCGT -3’ ，参照SMART RACE cDNA Amplification Kit （Clontech）的说明书，以制备的5’ RACE的模板首先进行5’ RACE PCR。PCR 反应参数为：94 ℃变性30sec ，72℃延伸3min，5个循环；94 ℃变性30sec ，70℃退火30sec，72℃延伸3min，5个循环后94 ℃变性30sec，68℃退火30sec，72℃延伸3min，20个循环。获得基因片段，并将该片段回收后与载体pGEM-T相连，然后送南京思普金生物科技有限公司测序。根据测序得到的5’端序列，序列设计引物5’- ACATGGGGAACAGTCAACAGACATCTGT -3’，进行3’ RACE PCR扩增得到一约100bp片段，将该片段回收后与载体pGEM-T相连，测序，最后得到碱性果胶酸裂解酶PelA基因的全长。测序结果显示，该碱性果胶酸裂解酶PelA基因全长963bp，DNA序列见SEQ ID NO.2，表达的蛋白序列见SEQ ID NO.1，其阅读框包含 321个氨基酸，其中前18个氨基酸为信号肽。经蛋白同源性比对发现其属于多糖裂解酶家族1，理论分子量为34kDa，理论等电点（pI）为8.82。

实施例2 碱性果胶酸裂解酶PelA在毕赤酵母中的表达及纯化

碱性果胶酸裂解酶PelA的表达采用EasySelect Pichia Expression Kit （invitrogen）。分别设计了两条引物5’- TGCCGGAATTCCGATTCCGATCGAACCCTCTGAGCA -3’ 和 5’- GCTCTAGATTAATGATGATGATGATGATGAAATGTCAAGGTCTGGCCG -3’，利用PCR的方法在木聚糖酶的N端和C端分别引入两个限制性酶切位点EcoRI 和XbaI，将其双酶切后与同样双酶切的表达载体pPICZαB利用T4 DNA连接酶连接，将连接好的重组质粒pPICZαB--PelA经限制性内切酶SacI线性化后电击转入Pichia pastoris KM71H后，利用含有1M山梨醇和100 μg/mL Zeocin （Invitrogen）抗生素的YPD平板进行阳性克隆的筛选。将筛选到的阳性克隆接入装有3mL YPD和3μL抗生素Zeocin的试管中28℃-30℃，250rpm摇床培养，24h后将菌液分别转接到30mL BMGY培养液中28℃-30℃，250rpm摇床培养至其OD₆₀₀达到3-4后，离心收集菌体，再转接到15mL BMMY培养液中28℃，250rpm摇床培养，每隔24h补加甲醇，甲醇浓度为0.8%（v/v），连续培养4d后离心收集酶液。将粗酶液先装入透析袋中，4℃在pH 8.0的磷酸缓冲液中轻微搅拌透析24h。经透析的酶液的盐离子浓度得到调节，便于下面的亲和层析纯化过程。

酶液的纯化参照Ni-NTA Agarose（Qiagen）的方法。将纯化得到的蛋白利用SDS-PAGE进行检测。结果如图1所示，可见重组木聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达，经Ni-NTA Agarose 纯化后为二条带，分子量分别35 kDa and 37.5 kDa，实际分子量大小比理论分子量大，为糖基化引起。

实施例3 碱性果胶酸裂解酶PelA的活性分析

果胶酸裂解酶活的测定方法：将不加酶的反应体系（990μL的反应液，包含0.2%的聚半乳糖醛酸（PGA）、pH10.0的100mM Glycine-NaOH缓冲液）置于60℃恒温水浴锅中预热5 min，加入经过适当稀释的0.1mL的纯化的碱性果胶酸裂解酶PelA（约1μg，实施例2制备）于反应液中，反应10min后，加入500 mM盐酸终止液0.5mL终止反应，离心，取上清，于235 nm处测其吸光值A₂₃₅。一个酶活单位：每分钟产生1μmol不饱和产物所需的酶量。

1）碱性果胶酸裂解酶PelA的最适pH 和pH 稳定性的测定

酶的最适pH 测定：将实施例2纯化得到的酶液在60℃下，以PGA为底物，在60℃下分别测量酶在Glycine-NaOH缓冲液pH9-12和Tris-HCl缓冲液pH7-9中反应的活力。结果如图2所示，表明PelA的最适pH为10.0。

pH的耐受性测定：将纯化好的酶液（实施例2制备）在不同的pH条件下（广泛缓冲液pH3.0-12.0）4℃保存24小时，然后在60℃及pH 10.0下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以PGA为底物，反应10min测定碱性果胶酸裂解酶PelA的酶活。经pH4.0–11.0 的缓冲液处理24h，酶活剩余80% 以上，如图3所示。

2）碱性果胶酸裂解酶PelA的最适温度和热稳定性的测定

酶的最适温度测定：以聚半乳糖醛酸（PGA）为底物，pH10.0的Glycine-NaOH为缓冲液，分别在30-70℃的条件下测活力。酶的热稳定性测定：将同样酶量的酶液置于设定的温度中（30℃、40℃、50℃下）保温0-60 min，然后放置在冰上。以PGA为底物，在最适温度和pH下测它们的剩余活力，以未处理的酶液作为对照。结果表明：PelA的最适最适温度为60℃（图4），在40 ℃和放置60 min还能保持60%以上的活性（图5）。

3）碱性果胶酸裂解酶PelA的动力学常数的测定

重组碱性果胶酸裂解酶PelA动力学常数测定：动力学常数（V _max 和 K _m）的测定在 60 ℃，pH7.0的条件下，添加不同浓度的聚半乳糖醛酸（PGA）（0.1 -1.5 mg/mL）为底物，不添加或添加外源钙离子条件下，反应5min，测定其活性。数据利用Graphpad Prism 5.0软件进行非线性回归分析计算该酶的动力学常数。结果表明：在60 ℃，pH10.0，无外源钙离子的条件下，PelA对聚半乳糖醛酸的V _max 、K _m分别为50.71 U mg^-1、0.681 mg mL^-1，而在有外源钙离子的条件下，二者分别为89.96 U mg^-1和0.514 mg mL^-1。

本发明的碱性果胶酸裂解酶PelA是一种从食用菌草菇中克隆得到的新的果胶裂解酶，其最适温度为60℃，最适pH为11.0，具有良好的温度和pH稳定性，并且在无外源钙离子存在下具有高催化活性，因此其在工业化应用中具有良好的应用前景。另外其来源为食用菌因此安全性可靠，可广泛应用于食品，纺织以及造纸等行业。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 一种碱性果胶酸裂解酶PelA及其编码基因和应用

<130> 100

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 321

<212> PRT

<213> Volvariella volvacea

<400> 1

Met Lys Trp Leu Ile Ser Phe Ile Ala Phe Ala Ala Leu Gln Leu Val

1 5 10 15

Ser Ala Ile Pro Ile Glu Pro Ser Glu His Gln Leu Ala Lys Arg Ala

20 25 30

Ala Tyr Gly Asp Thr Ala Asn Ile Gly Tyr Ala Thr Leu Asn Gly Gly

35 40 45

Thr Thr Gly Gly Ser Gly Gly Ser Val Thr Thr Val Ser Ser Leu Ser

50 55 60

Ala Leu Thr Ser Ala Val Ser Gly Thr Ala Arg Lys Ile Val Val Ile

65 70 75 80

Ser Gly Thr Ile Thr Gly Asn Thr Val Ile Arg Val Gly Ser Asn Thr

85 90 95

Ser Val Ile Gly Leu Arg Gly Ser Ser Leu Val Gly Val Gly Leu Arg

100 105 110

Val Tyr Arg Glu Ser Asn Val Ile Ile Arg Asn Val Lys Ile Ser Lys

115 120 125

Val Leu Ala Asn Val Gly Asp Ala Ile Gly Val Gln Glu Ala Ser Lys

130 135 140

Val Trp Ile Asp His Ala Asp Leu Ser Ser Asp Met Asp His Asp Lys

145 150 155 160

Asp Tyr Tyr Asp Gly Leu Leu Asp Ile Thr His Gly Cys Thr Glu Val

165 170 175

Thr Val Ser Tyr Thr Arg Phe Tyr Asn His Trp Lys Gly Ser Leu Val

180 185 190

Gly His Ser Asp Ser Asn Ala Ser Glu Asp Thr Lys Met Thr Val Thr

195 200 205

Tyr Ala Tyr Asn Tyr Phe Ser Asn Ile Asn Ser Arg Thr Pro Ser Phe

210 215 220

Arg Phe Gly Arg Gly His Ile Tyr Asn Asn Val Phe Asp Asn Val Gly

225 230 235 240

Asp Gly Ile Asn Thr Arg Val Gly Ala Gln Leu Leu Val Glu Asn Asn

245 250 255

Val Phe Ser Asn Thr Lys Lys Pro Leu Tyr Ser Thr Ser Ser Gly Tyr

260 265 270

Ala Val Ala Arg Gly Asn Asp Phe Gly Gly Val Ala Asn Thr Ala Pro

275 280 285

Thr Gly Thr Phe Thr Ser Ala Pro Tyr Gly Tyr Asn Leu Ile Ala Thr

290 295 300

Gly Ser Val Arg Ser Gln Val Val Gly Gln Thr Gly Gln Thr Leu Thr

305 310 315 320

Phe

<210> 2

<211> 966

<212> DNA

<213> Volvariella volvacea

<400> 2

atgaagtggc tcatctcctt catcgcattt gctgctctcc agctcgtttc ggctattccg 60

atcgaaccct ctgagcacca gcttgccaaa cgggctgcct atggtgacac cgccaacatt 120

ggctacgcaa ccttgaatgg aggtacaact ggaggctctg gagggtcggt taccaccgtc 180

tcttccctct ccgcccttac ttctgcggtc tccggcactg ccaggaagat tgttgtcatc 240

tctggcacca tcactggaaa cactgttatc cgtgttggat ccaacacctc cgtgattgga 300

ttaagaggct cctcccttgt cggcgtcggc cttcgagtct acagggagag caacgtcatc 360

atccgaaacg tcaagatctc caaggttctc gccaatgttg gtgacgcaat tggtgtccaa 420

gaagccagca aagtttggat cgatcatgct gacctctcca gcgatatgga tcatgacaag 480

gactactatg atggattgct cgatatcacc cacggttgca ctgaggttac tgtctcttac 540

accaggttct acaaccactg gaagggatct ctcgttggcc actccgacag caacgcctcc 600

gaggacacca agatgactgt tacctatgct tacaactact tcagcaacat caactctcgt 660

acaccttcat tccgcttcgg tcgtggccac atctacaaca acgtctttga caatgttggt 720

gacggtatta acactcgcgt cggtgctcaa ctcctcgtcg agaacaacgt cttcagcaac 780

accaagaagc ctctctactc caccagctcc ggttatgcag tcgctcgcgg caacgacttt 840

ggtggtgttg ccaataccgc ccccactggc acattcacat ctgctcctta tggctacaac 900

cttattgcta ccggtagtgt taggtcccag gtcgtcggcc aaaccggcca gaccttgaca 960

ttttaa 966

<210> 3

<211> 191

<212> DNA

<213> Volvariella volvacea

<400> 3

tatgtcaaga ttttgagcaa taacaatgag ttcggtcaaa taacaccttc caacaccatg 60

aaatgggaga ctattgaacc cgtccgtgga acgttcaact ttacgggtgg agacgaaatt 120

gttgccctcg ccaagcgcaa tcgtcaattg gttcgcggtc atacatgcgt ttggcacagc 180

caactcgctc c 191

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 特异性引物

<400> 4

gcgcttggcg agggcaacaa tttcgt 26

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 3' RACE引物

<400> 5

acatggggaa cagtcaacag acatctgt 28

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 表达引物1

<400> 6

tgccggaatt ccgattccga tcgaaccctc tgagca 36

<210> 7

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 表达引物2

<400> 7

gctctagatt aatgatgatg atgatgatga aatgtcaagg tctggccg 48

Claims

1.一种碱性果胶酸裂解酶PelA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述碱性果胶酸裂解酶PelA的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述的碱性果胶酸裂解酶PelA的编码基因的表达体系。

4.权利要求3所述的表达体系在表达碱性果胶酸裂解酶PelA中的应用。

5.权利要求1所述的碱性果胶酸裂解酶PelA在酶解聚半乳糖醛酸中的应用。