FI126843B - Menetelmä glukuronoksylaanin hajottamiseksi - Google Patents

Description

Menetelmä glukuronoksylaanin hajottamiseksi

Keksinnön ala Tämä keksintö koskee yleisesti kasvibiomassan entsymaattista hajotusta. Spesifisemmin keksintö koskee eristettyä polypeptidiä, jolla on a-glukuronidaasiaktiivisuus, menetelmää polypeptidin eristämiseksi sekä sen olennaisesti rikastettua valmistetta.

Keksinnön tausta

Sellu-ja paperiteollisuus käsittelee suuria määriä kasvibiomassaa tai puuta. Tämä biomassa käsittää komplekseja hiilihydraatteja, kuten selluloosaa, hemiselluloosaa ja ligniiniä, jotka täytyy osittain hajottaa ja käsitellä paperituotteen tuottamiseksi. Puu sisältää noin 20 % hemiselluloosia, joista ksylaanit muodostavat olennaisen osan sekä lehtipuissa että havupuissa. Hemiselluloosien, joita esiintyy lehtipuissa, pääryhmä ovat glukuronoksylaanit. Nämä käsittävät β-1,4-kytketyn D-ksylopyranoosirungon, jossa on 4-O-metyyli-D-glukuronihapposubstituentteja kytkettynä a-1,2. Lisäksi ksyloosirungon 2,3-kohdat voivat olla osittain asetyloituja. Lehtipuun glukuronoksylaanipitoisuus on tyypillisesti välillä 15-30 painoprosenttia puusta.

Kuidutusprosessien aikana hemiselluloosat käyvät läpi erilaisia muutoksia. Hemiselluloosat kuten ksylaani eivät muodosta tiukasti pakattuja kiderakenteita kuten selluloosan rakenteet sivuketjujen läsnäolon takia ksylaanirakenteessa. Tämä hemiselluloosien ominaisuus tarkoittaa, että nämä polysakkaridit ovat helpommin hajotettavissa kuin selluloosa. Vaikka jotkut hemiselluloosat ja hemiselluloosan hajoamistuotteet liukenevat keittoliuoksiin, kuten helposti alkaliliukoiset hemiselluloosat, jotkut hajoavat pienempimolekyylipainoisiksi tuotteiksi, jotka voivat joko jäädä liukenemattomassa muodossa kuitumatriisiin tai liueta keittoliuoksiin.

Hemiselluloosien ja hemiselluloosan hajoamistuotteiden fraktio, joka liukenee keittoliuoksiin, häviää sitten prosessista, mikä johtaa puun saannon menetykseen. Hemiselluloosien uskotaan osallistuvan sellun turpoamiseen ja siksi märkäkuitujen yhdenmukaisuuteen levynmuodostuksen aikana niiden ei-kiteisen hydrofiilisen luonteen tuloksena. Ksylaanin hajotuksen aikana on siksi toivottavaa minimoida hemiselluloosan ja hemiselluloosan hajoamistuotteiden häviäminen keittoliuoksiin ja maksimoida hemiselluloosan retentio kuitumatriisiin.

Haluttujen hemiselluloosan hajoamistuotteiden tuottamiseksi suoritetaan hemiselluloosan valikoiva hajotus käyttämällä entsyymejä. Hemiselluloosan ksylaanin entsymaattinen hajotus on monimutkainen prosessi, joka edellyttää eri entsyymien toimintaa, jotka jaetaan yleensä kahteen luokkaan: i) entsyymit, jotka hajottavat polysakkaridin pääketjua, kuten endo-β-1,4-ksylanaasi (EC 3.2.18) ja β-ksylosidaasi (EC 3.2.1.37); ja ii) entsyymit, jotka vapauttavat sivuketjuja, pääketjun substituentteja, niin kutsutut ksylanolyyttiset lisäentsyymit, joihin sisältyvät a-glukuronidaasi (EC 3.2.1.139), a-L-arabino-furanosidaasi (EC 3.2.1.55), asetyyliksylaaniesteraasi (EC 3.1.1.72) ja feruloyyliesteraasi (EC 3.1.1.73). Kun endoksylanaasi hyökkää ksylaanien pääketjuihin ja β-ksylosidaasi hydrolysoi ksylo-oligosakkarideja ksyloosiksi, a-arabinofuranosidaasi ja a-glukuronidaasi poistavat arabinoosi- ja 4-O-metyyli-glukuronihapposubstituentteja, vastaavasti, ksylaanirungosta. Esteraasit hydrolysoivat esterisidoksia ksylaanin ksyloosiyksikköjen ja etikkahapon välillä (asetyyliksylaaniesteraasi) tai arabinoosin sivuketjutähteiden ja fenolihappojen, kuten ferulihapon (ferulihappoesteraasi) ja p-kumarihapon (p-kumarihappoeste-raasi), välillä.

MeGIcA- tai GIcA-sivuketjujen poiston ksylaanista ehdotetaan lisäävän ksylaanin retentiota kuitumatriisiin. Tällä hetkellä vain yhdellä GH-perheellä, GH67:Mä, on yksinomaan α-glukuronidaaseja. Näiden entsyymien aktiivisuus on kuitenkin rajoittunutta, sillä ne vapauttavat MeGlcA:ta tai GlcA:ta vain niistä glukuronoksylaanin fragmenteista (aldouronihapoista), joissa uronihappo on kytketty ksylopyranosyylitähteen ei-pelkistyvään päähän. Nämä a-glukuronidaasit eivät pilko glykosidisidoksia polymeerisissä substraateissa, kuten glukuronoksylaaneissa. Ainoa tähän mennessä kuvattu a-glukuronidaasi, joka kykenee vapauttamaan MeGIcA-sivuketjuja lehtipuun glukuronoksylaanista, on entsyymi, joka on läsnä puuta lahottavan sienen Schizophyllum commune (Tenkanen, M. et ai., Journal of Biotechnology, March 2000, Vol. 78, No. 2, pages 149-161) sellulolyyttisessä järjestelmässä. Kaavat 1-4 osoittavat glykosidisidoksia glukuronoksylaanin fragmenteissa, joihin GH67-a-glukuronidaasit hyökkäävät (<—) tai eivät hyökkää (χ).

Nämä entsyymit eivät myöskään hydrolysoi aryyli-a-glukuronideja, jotka toimivat ei-hemisellulolyyttisen perheen 4 a-glukuronidaasien substraatteina. Vaikka a-glukuronidaasi, joka hydrolysoi aryyli-a-D-glukuronosideja, tunnetaan GH4:ssä, tämä entsyymi ei tunnista glukuronoksylaania tai sen fragmentteja substraateiksi. Glykosidisidosten tyypit, joita a-glukuronidaasit leikkaavat, ovat siksi tähän asti olleet rajoittuneet.

On tarve parannetulle glukuronoksylaanin entsymaattiselle hydrolysointimenetelmälle glukuronoksylaanin retention lisäämiseksi kuitumatriisiin kasvibiomassan hajotuksen aikana, sekä siinä käytettäville entsyymeille.

Keksinnön kohde Tämän keksinnön kohde on aikaansaada vaihtoehtoinen glukuronoksylaanin entsymaattinen hydrolysointimenetelmä, joka voi, ainakin jossain määrin, helpottaa edellä mainittuja ongelmia.

Keksinnön yhteenveto

Keksinnön mukaisesti aikaansaadaan eristetty polypeptidi, jolla on a-glukuronidaasiaktiivisuus ja joka voi hajottaa glukuronoksylaanimolekyylin MeGIcA-tähteen ja ei-terminaalisen ksylopyranosyylitähteen välisen glykosidi-sidoksen hydrolyysillä.

Keksinnössä aikaansaadaan myös eristetty polypeptidi, jolla on aminohapposekvenssi, joka valitaan seuraavasta ryhmästä: i. sekvenssin nro 1 mukainen aminohapposekvenssi; ii. aminohapposekvenssi, joka on ainakin 95 % homologinen sekvenssin nro 1 tai sen osan kanssa; iii. aminohapposekvenssi, joka on ainakin 85 % homologinen sekvenssin nro 1 tai sen osan kanssa; iv. aminohapposekvenssi, joka on ainakin 75 % homologinen sekvenssin nro 1 tai sen osan kanssa; v. aminohapposekvenssi, joka on ainakin 65 % homologinen sekvenssin nro 1 tai sen osan kanssa; vi. aminohapposekvenssi, joka on ainakin 50 % homologinen sekvenssin nro 1 tai sen osan kanssa; ja vii. minkä tahansa kohdissa i-vi lueteltujen aminohapposekvenssien toiminnallinen variantti.

Keksinnön lisäominaisuuksissa aikaansaadaan, että polypeptidin molekyylipaino on noin 120 kDa, ja että polypeptidi on polypeptidin biologisesti aktiivinen fragmentti.

Keksintö ulottuu eristettyyn polynukleotidiin, joka koodaa keksinnön mukaista polypeptidiä, jolloin polynukleotidilla on nukleotidisekvenssi, joka valitaan seuraavasta ryhmästä: i. sekvenssin nro 2 mukainen nukleotidisekvenssi; ii. nukleotidisekvenssi, joka on ainakin 95 % homologinen sekvenssin nro 2 tai sen osan kanssa; iii. nukleotidisekvenssi, joka on ainakin 85 % homologinen sekvenssin nro 2 tai sen osan kanssa; ja iv. nukleotidisekvenssi, joka on ainakin 75 % homologinen sekvenssin nro 2 tai sen osan kanssa.

Keksinnössä aikaansaadaan myös menetelmä keksinnön mukaisen polypeptidin eristämiseksi, jolloin menetelmä sisältää vaiheet, joissa i. viljellään mikrobia, joka kykenee ilmentämään polypeptidiä indusointialustassa; ja ii. eristetään polypeptidi indusointialustasta.

Keksinnön lisäominaisuuksissa aikaansaadaan, että vaihe polypeptidin eristämiseksi indusointialustasta suoritetaan käyttämällä yhtä tai useampaa anioninvaihtokromatografiasta, hydrofobisesta kromatografiasta ja anioninvaihtokromatografiasta. Keksintö suoritetaan tyypillisesti seuraavissa vaiheissa i. viljellään mikrobia, joka kykenee ilmentämään polypeptidiä indusointialustassa ja tuottamaan mikrobibiomassaa; ii. erotetaan mikrobibiomassa indusointialustasta; iii. fraktioidaan indusointialusta anioninvaihtokromatografialla ensimmäisen eluentin saamiseksi; iv. fraktioidaan ensimmäinen eluentti hydrofobisella vuorovaikutuskromatografialla toisen eluentin saamiseksi; v. fraktioidaan toinen eluentti anioninvaihtokromatografialla kolmannen eluentin saamiseksi; ja vi. fraktioidaan kolmas eluentti anioninvaihtokromatografialla fraktion saamiseksi, joka käsittää eristetyn polypeptidin.

Keksinnön lisäominaisuuksissa aikaansaadaan, että mikrobi valitaan ryhmästä, johon sisältyvät Pichia stipitis, Schizophyllum commune, Aspergillus clavatus, Neosartorya fischeri, Aspergillus fumigatus, Aspergillus terreus, Aspergillus oryzae, Sclerotinia sclerotiorum, Botryotinia fuckeliana, Pyrenophora tritici-repentis, Neurospora crassa, Gibberella zeae, Podospora anserina, Coprinopsis cinerea okayama, Magnaporthe grisea, Fusarium sporotrichioides, Cryptococcus neoformans var. neoformans, Cellvibrio japonicus, Saccharo-phagus degradans, Opitutus terrae, Phaeosphaeria nodorum, Bacteroides ovatus ja Streptomyces pristinaespiralis; ja että mikrobi on edullisesti Pichia stipitis CBS 6054.

Vielä keksinnön lisäominaisuuksissa aikaansaadaan, että polypeptidin eristysmenetelmä sisältää lisäksi vaiheen, jossa konsentroidaan yksi tai useampia indusointialustasta; ensimmäisestä eluentista, toisesta eluentista, kolmannesta eluentista ja fraktiosta, joka käsittää eristetyn polypeptidin.

Keksinnössä aikaansaadaan lisäksi keksinnön mukaisen polypeptidin olennaisesti rikastettu valmiste.

Keksinnön lisäominaisuuksissa aikaansaadaan, että polypeptidi puhdistetaan mikrobin viljelmästä, joka mikrobi valitaan ryhmästä, johon sisältyvät Schizophyllum commune, Aspergillus clavatus, Neosartorya fischeri, Aspergillus fumigatus, Aspergillus terreus, Aspergillus oryzae, Sclerotinia sclerotiorum, Botryotinia fuckeliana, Pyrenophora tritici-repentis, Neurospora crassa, Gibberella zeae, Podospora anserina, Coprinopsis cinerea okayama, Magnaporthe grisea, Fusarium sporotrichioides, Cryptococcus neoformans var. neoformans, Cellvibrio japonicus, Saccharophagus degradans, Opitutus terrae, Phaeosphaeria nodorum, Bacteroides ovatus ja Streptomyces pristinaespiralis; ja että mikrobi on edullisesti Pichia stipitis CBS 6054.

Vielä keksinnön lisäominaisuuksissa aikaansaadaan, että indusointialusta on glukoosi-YNB-alusta, joka on täydennetty ksylo-oligosakkarideilla ja metyyli-p-ksylopyranosidilla; että ksylo-oligosakkaridit ovat pitoisuudessa 0,5 mg/ml; että metyyli-p-ksylopyranosidi on pitoisuudessa 0,33 mg/ml; että indusointialustan fraktiointi anioninvaihtokromatografialla ensimmäisen eluentin saamiseksi suoritetaan käyttäen HiTrap DEAE-FF -pylvästä; että ensimmäinen eluentti saadaan ensimmäisen eluointipuskurin lisäyksellä HiTrap DEAE-FF -pylvääseen, jolloin ensimmäinen eluointipuskuri käsittää NaCI-gradientin 0-1,0 M suunnilleen 50 mM natriumfosfaattipuskurissa suunnilleen pH:ssa 7,0; että ensimmäisen eluentin fraktiointi hydrofobisella vuorovaikutuskromatografialla toisen eluentin saamiseksi suoritetaan käyttäen

Butyl-FF-pylvästä; että toinen eluentti saadaan lisäämällä toista eluointipuskuria Butyl-FF-pylvääseen, jolloin toinen eluointipuskuri käsittää pienenevän (NH)4S04-gradientin 1,1-0,61 M suunnilleen 50 mM asetaattipuskurissa suunnilleen pH:ssa 4,0; että toisen eluentin fraktiointi anioninvaihtokromatografialla kolmannen eluentin saamiseksi suoritetaan käyttäen Tricorn MonoQ 5/50GL -pylvästä; että kolmas eluentti saadaan lisäämällä kolmatta eluointipuskuria Tricorn MonoQ 5/50GL -pylvääseen, jolloin kolmas eluointipuskuri käsittää kasvavan NaCI-gradientin 0-1,0 M suunnilleen 50 mM natriumasetaattipuskurissa suunnilleen pH:ssa 4,0; että kolmannen eluentin fraktiointi anioninvaihtokromatografialla olennaisesti puhtaan entsyymifraktion saamiseksi suoritetaan käyttäen Tricorn MonoQ 5/50GL -pylvästä; että olennaisesti puhdas entsyymifraktio saadaan lisäämällä neljättä eluointipuskuria Tricorn MonoQ 5/50GL -pylvääseen, jolloin neljäs eluointipuskuri käsittää kasvavan NaCI-gradientin 0-1,0 M suunnilleen 50 mM natriumfosfaattipuskurissa suunnilleen pH:ssa 7,0.

Vielä keksinnön lisäominaisuuksissa aikaansaadaan, että polypeptidi saadaan mikrobin viljelmästä, joka mikrobi valitaan ryhmästä, johon sisältyvät Schizophyllum commune, Aspergillus clavatus, Neosartorya fischeri, Aspergillus fumigatus, Aspergillus terreus, Aspergillus oryzae, Sclerotinia sclerotiorum, Botryotinia fuckeliana, Pyrenophora tritici-repentis, Neurospora orassa, Gibberella zeae, Podospora anserina, Coprinopsis cinerea okayama, Magnaporthe grisea, Fusarium sporotrichioides, Cryptococcus neoformans var. neoformans, Cellvibrio japonicus, Saccharophagus degradans, Opitutus terrae, Phaeosphaeria nodorum, Bacteroides ovatus ja Streptomyces pristinaespirali; ja että mikrobi on edullisesti Pichia stipitis CBS 6054.

Piirustusten lyhyt kuvaus

Keksinnön lisäominaisuudet tulevat nyt ilmeisiksi seuraavasta kuvauksesta vain esimerkinomaisesti viitaten oheisiin kuvioihin ja sekvenssinumeroihin.

Piirustusten kuvaus

Kuvio 1 on yhteenveto a-glukuronidaasin puhdistuksesta P. stipitis CBS 6054:n indusointialustasta;

Kuvio 2 on puhdistetun P. stipitiksen a-glukuronidaasin SDS-PAGE-geeli, kaista 1 - proteiinimarkkerit (Fermentas #SM 0431), kaista 2 - a-glukuroni-daasi, 10 pg proteiinia, kaista 3 - a-glukuronidaasi, 20 pg; kaista 4 -proteiinimarkkeri (SERVA #39216);

Kuvio 3 on kromatogrammi tuotteiden TLC-analyysistä, jotka tuotteet muodostuvat aldopentauronihaposta (Xyl-Xyl(MeGlcA)-Xyl-Xyl) (A) ja glukuronoksylaanista (B) puhdistetun P. stipitiksen a-glukuronidaasin toiminnalla, A: näytteet: kaista 1 ja kaista 8 - ksyloosi- ja ksylo-oligosakkaridistandardit, 2 - aldopentauronihappo (Xyl-Xyl(MeGlcA)-Xyl-Xyl), kaista 3 - entsyymiblankki, kaistat 4-7 - entsyymireaktion tuotteet 1, 10, 60 min ja 18 h jälkeen, vastaavasti, B: näytteet: kaista 1 ja kaista 5 - ksyloosi-ja ksylo-oligosakkaridistandardit, kaista 2 - glukuronoksylaanikontrolli, kaista 3 ja kaista 4 - entsyymireaktion tuotteet 4 h ja 18 h jälkeen, vastaavasti;

Kuvio 4 on yhteenveto BLAST-hausta, joka suoritettiin käyttäen P. stipitiksen sekvenssiä. Linjausta ja fylogeneettisen puun konstruointia varten käytettyjen mikroeliöiden sekvenssit on esitetty lihavoituna;

Kuvio 5 on kaavioesitys P. stipitis CBS 6054:n a-glukuronidaasin aminohapposekvenssin homologialinjauksesta yhdeksän proteiinisekvenssin kanssa kannoista Aspergillus fumigatus Af293, Pyrenophora tritici-repentis Pt-1C-BFP, Neurospora erässä OR74A, Gibberella zeae PH-1, Cellvibrio japonicus Ueda107, Coprinopsis cinerea okayama 7#130, Aspergillus oryzae RIB40, Bacteroides ovatus ATCC 8483, Streptomyces pristinaespiralis ATCC 25486, joilla oli suurempi kuin 50 % identtisyys;

Kuvio 6 esittää yhteenvetoa ksylaanisubstraateista, joita käytettiin entsymaattisen substraattispesifisyyden ja ksylaanin sivuketjujen poistoasteen arvioimiseksi;

Kuvio 7 esittää Box-Behnken-koeasetelmaa 4-O-metyyli-D-glukuro-nihapon poistamiseksi koivun ksylaanista a-glu:Ma;

Kuvio 8 esittää central composite design -koesuunnittelua kauran ksylaanipitoisuuden ja entsyymiannoksen vaikutusta varten arabinoosin poistoon;

Kuvio 9 esittää pylväskaaviota uuteaineiden sekä bagassin, männyn (Pinus patula) ja bambun (Bambusidae balcooa) tuhkan pitoisuudesta (OD biomassa-%);

Kuvio 10 esittää pylväskaaviota bagassin, männyn (Pinus patula) ja bambun (Bambusidae balcooa) Klason-ligniinin pitoisuudesta (OD biomassa-%);

Kuvio 11 esittää pylväskaaviota bagassin, männyn (Pinus patula) ja bambun (Bambusidae balcooa) selluloosa- ja pentosaanipitoisuudesta (OD biomassa-%);

Kuvio 12 esittää pylväskaaviota ksylaanisaannosta (pentosaani-%), joka on uutettu käyttäen ultrapuhdistus- ja etanolisaostusprotokollia, bagassista, männystä (Pinus patula) ja bambusta (Bambusidae balcooa)]

Kuvio 13 esittää kiinteän tilan 13C-CPMAS NMR -spektrejä, jotka osoittavat miedon alkalisen ksylaaniuuton vaikutusta selluloosakuitujen eheyteen lajeilla (A) Pinus patula, (B) bagassi, (C) Eucalyptus grandis ja (D) jättiläisbambu. Spektrit 1, 2 ja 3 tarkoittavat: raakamateriaali, uuttoainevapaa materiaali ja ksylaaniuuton jälkeinen materiaali ja ** tarkoittaa piikkejä hiilen resonansseille vähemmän järjestyneen selluloosan glukoosiyksiköissä;

Kuvio 14 esittää lignoselluloosamateriaalien neutraalin sokerikoostumuksen vertailua ennen (EF) ja jälkeen ksylaaniuuton (Pxyl) (A) Pinus patulaWa (mänty), (B) bagassilla (Bag), (C) Eucalyptus grandikseWa (EU) ja (D) bambulla (BM);

Kuvio 15 esittää yhteenvetoa uuttoa edeltävän ksylaanin neutraalien sokerien ja uronihapon profiilista;

Kuvio 16 esittää ksylaanin eluutioprofiileja HPAEC-PAD (Dionex) CarboPac P10 -pylväässä (A) monomeerisistä sokereista, (B) ksylitolista, (C) koivun ksylaanista (Roth) ja (D) kauran ksylaanista;

Kuvio 17 esittää ksylaanin eluutioprofiileja HPAEC-PAD (Dionex) CarboPac P10 -pylväässä (A) miedolla alkalilla uutetusta H202-valkaistusta bagassista (Bag B), (B) miedolla alkalilla uutetusta ultrapuhdistetusta bagassista (Bag H), ja (C) miedolla alkalilla uutetusta etanolilla saostetusta bagassista (Bag L);

Kuvio 18 esittää ksylaanin eluutioprofiileja HPAEC-PAD (Dionex) CarboPac P10 -pylväässä (A) Eucalyptus grandis H:sta [EU H] ja (B) Eucalyptus grandis L:stä [EU L], (C) bambusta ja (D) Pinus patulasta;

Kuvio 19 esittää pylväskaaviota liukenemattomasta fraktiosta, joka on saatu miedolla alkalilla uutetun ksylaanin H202-valkaistun bagassin (Bag B), ultrapuhdistetun bagassin (Bag H), etanolilla saostetun bagassin (Bag L), bambun, ultrapuhdistetun E. grandiksen [EU H], etanolilla saostetun E. grandiksen [EU L] ja P. patulan (mänty) 72 % happohydrolyysin jälkeen verrattuna koivun ksylaaniin (Roth);

Kuvio 20 esittää ksylaanin karakterisointia (A) koivun ksylaanin 1H-NMR-ja (B) 13C-NMR- analyyseillä, (C) hhCb-valkaistun bagassin (Bag B) 1H-NMR-ja (D) 13C-NMR- analyyseillä ja (E) kauran ksylaanin 1H-NMR-ja (F) 13C-NMR- analyyseillä. Me tarkoittaa metyyliryhmää glukuronihaposta ja Ac = asetyyliryhmä, Ar = arabinoosiryhmä;

Kuvio 21 esittää ksylaanin karakterisointia (A) bagassin 1H-NMR-ja (B) 13C-NMR- analyyseillä, (C) E. grandiksen ksylaanin 1H-NMR- ja (D) 13C-NMR- analyyseillä: spektreissä (1) = Lopez-uutettu ksylaani (Bag L tai EU L), ja (2) Hoije-ultrapuhdistettu ksylaani (Bag H tai EU H);

Kuvio 22 esittää ksylaanin karakterisointia (A) bambun 1H-NMR- ja (B) 13C-NMR- analyyseillä, (C) P. patulan ksylaanin 1H-NMR- ja (D) 13C-NMR-analyyseillä;

Kuvio 23 esittää FTIR-spektrejä ksylaanista, joka on uutettu erityyppisistä lignoselluloosamateriaaleista alhaalta (iv) koivu**, (F) etanolilla saostettu bagassi [Bag L] (2) (E) ultrapuhdistettu bagassi [Bag H] (1), (D) kauran ksylaani* (C) bambu, (B) etanolilla saostettu E. grandis [EU L] (2), (B) ultrapuhdistettu E. grandis [EU H] (1) ja (A) P. patula;

Kuvio 24 esittää 4-0-MelglcA:n poistoa AbfB:Mä ja a-glu:Ma kaurasta/koivusta, miedolla alkalilla esi-uutetun bagassin Höije (BH), H2O2-valkaistun bagassin (BB), bambun (BM) ja Pinus patulan (PP) ksylaanista ja a-glu:Ma miedolla alkalilla esi-uutetusta Eucalyptus grandista, (EH), Eucalyptus grandiksen sellusta uutetusta geelistä (ES);

Kuvio 25 esittää glukuronihapon poiston vastepintakuvaajia vastepintakuvaajia (A) ajan (h) ja lämpötilan (°C) funktiona annoksella 16500 nKat g-1 substraattia, (B) lämpötilan (°C) ja entsyymiannoksen (nKat g-1 substraattia) funktiona ajankohtana 9 h, ja (C) ajan (h) ja entsyymiannoksen (nKat g-1 substraattia) funktiona 33,5 °C:ssa;

Kuvio 26 esittää ajan, lämpötilan ja entsyymiannoksen välisen vuorovaikutuksen vaikutuksia glukuronihapon poistoon. Ensimmäiset sarakkeet ylhäältä esittävät lämpötilan (Temp) ja ajan, entsyymiannoksen (AbfB /a-glu) ja ajan, sekä entsyymiannoksen (a-glu) ja lämpötilan välistä vuorovaikutusta. Toisissa sarakkeissa ylhäällä oikealla, solu osoittaa käsittelyn ja vuorovaikutuksen vaikutusten kokoaja merkittävyyttä mitattuna pylväskuvaajan koolla. t(i, u)-arvot on merkitty kunkin pylväskuvaajan loppuun vastaavassa

Pareto-kuvaajassa. Pystysuora pisteviiva Pareto-kuvaajassa on tilastollisen merkitsevyyden mitta arvolla p=0,05.;

Kuvio 27 esittää yhteenvetoa regressiokertoimista glukuronihapon vapautumiselle hydrolyysiparametrien funktiona (koodattu muuttuja);

Sekvenssi nro 1 on P. stipitiksen a-glukuronidaasigeenin johdettu aminohapposekvenssi, kuten on saatavissa Genbank-talletusnumerossa XP 001385893; ja

Sekvenssi nro 2 on P. stipitiksen a-glukuronidaasigeenin DNA-sekvenssi, kuten on saatavissa Genbank-talletusnumerossa XM 001385893 ja julkaistussa P. stipitiksen genomisekvenssissä (Vrsanskä et ai. 2007).

Yksityiskohtainen kuvaus viitaten piirustuksiin

Keksintö koskee eristettyä polypeptidiä, jolla on a-glukuronidaasi-aktiivisuus ja joka kykenee hajottamaan glukuronoksylaanimolekyylejä, joita esiintyy kasvibiomassassa. Yllättäen, tällä polypeptidillä on entsymaattisen aktiivisuuden etuja glukuronoksylaanimolekyylien hajotuksessa, joita ei ole nähty muilla entsyymeillä, joilla on aiemmin raportoitu olevan a-glukuronidaasi-aktiivisuus. Tällaiset muut a-glukuronidaasit ovat rajoittuneita glukuronoksylaanimolekyylien glykosidisidosten hydrolyysissään, sillä ne kykenevät vain hydrolysoimaan glykosidisidoksen MeGIcA-tähteen ja terminaalisen ksylopyranosyylitähteen välillä. Sitävastoin keksinnön mukaisen eristetyn polypeptidin on havaittu yllättäen kykenevän hydrolysoimaan glykosidisidoksen MeGIcA-tähteen ja ei-terminaalisen ksylopyranosyylitähteen välillä. Lisäksi keksinnön mukaisen eristetyn polypeptidin a-glukuronidaasiaktiivisuus on sovellettavissa laajasti eri glukuronoksylaanimolekyyleille, joita saadaan eri kasvibiomassalähteistä.

Esillä olevassa keksinnössä aikaansaadaan eristetty polypeptidi, jolla on aminohapposekvenssi, joka on sekvenssin nro 1 mukainen aminohapposekvenssi; tai sellainen, joka on olennaisesti samanlainen sen kanssa, kuten sekvenssi, joka on ainakin 95 % homologinen sekvenssin nro 1 tai sen osan kanssa; ainakin 85 % homologinen sekvenssin nro 1 tai sen osan kanssa; ainakin 75 % homologinen sekvenssin nro 1 tai sen osan kanssa; ainakin 65 % homologinen sekvenssin nro 1 tai sen osan kanssa; ainakin 50 % homologinen sekvenssin nro 1 tai sen osan kanssa; minkä tahansa näiden aminohapposekvenssien toiminnallinen variantti. Täysipituisen eristetyn polypeptidin identtisyys voidaan varmistaa sen noin 120 kDa:n molekyylipainon suhteen käyttäen tekniikoita, kuten SDS-PAGE, tai a-glukuronidaasin aktiivisuusmäärityksiä polypeptidin biologisesti aktiivisten fragmenttien tunnistamiseksi.

Polypeptidi eristetään tyypillisesti Pichia stipitis CBS 6054 -viljelmän indusointialustasta, vaikka ymmärretään, että voidaan myös käyttää muita mikrobeja, jotka ilmentävät olennaisesti samanlaisia polypeptidejä. Tällaisiin mikrobeihin sisältyvät Schizophyllum commune, Aspergillus clavatus, Neosartorya fischeri, Aspergillus fumigatus, Aspergillus terreus, Aspergillus oryzae, Sclerotinia sclerotiorum, Botryotinia fuckeliana, Pyrenophora tritici-repentis, Neurospora erässä, Gibberella zeae, Podospora anserina, Coprinopsis cinerea okayama, Magnaporthe grisea, Fusarium sporotrichioides, Cryptococcus neoformans var. neoformans, Cellvibrio japonicus, Saccharophagus degradans, Opitutus terrae, Phaeosphaeria nodorum, Bacteroides ovatus ja Streptomyces pristinaespiralis.

Koska polypeptidi erittyy mikrobiviljelmän indusointialustaan, voidaan käyttää eri kromatografisia tekniikoita polypeptidin eristämiseksi indusointialustasta, kuten anioninvaihtokromatografia, hydrofobinen kromatografia ja anioninvaihtokromatografia. Polypeptidi eristetään tyypillisesti indusointialustasta erottamalla ensin mikrobibiomassa indusointialustasta, fraktioimalla indusointialusta anioninvaihtokromatografialla ensimmäisen eluentin saamiseksi; fraktioimalla ensimmäinen eluentti hydrofobisella vuorovaikutuskromatografialla toisen eluentin saamiseksi; fraktioimalla toinen eluentti anioninvaihtokromatografialla kolmannen eluentin saamiseksi; ja fraktioimalla kolmas eluentti anioninvaihtokromatografialla fraktion saamiseksi, joka käsittää eristetyn polypeptidin. Suoritetaan myös lisävaiheita yhden tai useamman indusointialustasta, ensimmäisestä eluentista, toisesta eluentista, kolmannesta eluentista ja fraktiosta, joka käsittää eristetyn polypeptidin, konsentroimiseksi.

Keksinnön mukainen eristetty polypeptidi voidaan aikaansaada polypeptidin olennaisesti rikastetun valmisteen muodossa. Olennaisesti rikastettu valmiste tuotettuna keksinnön mukaisesti tarkoittaa yleisesti, että valmisteen vallitseva proteiinilaji tai komponentti on sekvenssin nro 1 mukainen polypeptidi tai sellainen, joka on olennaisesti samanlainen sen kanssa. Ymmärretään kuitenkin, että olennaisesti rikastetun valmisteen puhtaammat muodot sisältyvät keksinnön piiriin, niin että valmisteet, jotka käsittävät ainakin 75 % polypeptidiä; valmisteet, jotka käsittävät ainakin 80 % polypeptidiä; valmisteet, jotka käsittävät ainakin 90 % polypeptidiä; ja valmisteet, jotka käsittävät ainakin 90 % polypeptidiä. Olennaisesti rikastettu valmiste, joka on tuotettu keksinnön mukaisesti, viittaa yleisesti myös biologisesti aktiivisten entsyymien, jotka kykenevät hydrolysoimaan glukuronoksylaanimolekyylin pääketjun, olennaiseen poissaoloon.

Esimerkki 1

Materiaalit ja menetelmät P. stipitis -kanta ja sen viljely P. stipitis CBS 6054 kasvatettiin pulloissa elatusalustassa, joka sisälsi YNB (Difco, 6,7 g/l), L-asparagiinia (2 g/l), KH2PO4 (5 g/l) ja hiililähteen (glukoosi tai pyökkipuun glukuronoksylaani, 10 g/l) 30 °C:n lämpötilassa ja 180 rpm ravistelulla. Eksponentiaalisesti kasvatetut solut otettiin talteen solutiheydellä 0,15-0,20 mg/ml (kuivapaino). a-glukuronidaasin substraatit ja tuotteet

Deasetyloitu glukuronoksylaani uutettiin pyökin sahajauhosta [Ebringerovä et ai. 1967, Holzforschung 21:74-77], Aldotetrauronihappo Xyl(MeGlcA)Xyl-Xyl, glukuronoksylaanin hydrolyysin lyhin hapan tuote perheen 10 endoksylanaaseilla, ja aldopentauronihappo Xyl-Xyl(MeGlcA)Xyl-Xyl, glukuronoksylaanin hydrolyysin lyhin hapan tuote perheen 11 endoksylanaaseilla, valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [Biely et ai., 1997, J. Biotechnol. 57:151-166], 4-O-metyyli-D-glukuronihappo (MelGIcA) valmistettiin sen metyyliesterin de-esteröinnillä S. commune n glukuronoyyliesteraaseilla [Spänikoväja Biely, 2006, FEBS Lett. 580:4597-4601], P. stipitiksen a-glukuronidaasituotanto ksylaanin poissa ollessa

Entsyymi, josta tuli puhdistuksen kohde, tuotettiin indusointikokeissa, jotka suoritettiin seuraavasti: eksponentiaaliseen vaiheen soluja, joita oli kasvatettu 1 % glukoosi-YNB-alustassa, otettiin talteen sentrifugoinnilla, pestiin kahdesti YNB-perusalustalla (ilman hiililähdettä) ja suspendoitiin samaan alustaan, joka oli täydennetty 0,5 mg/ml ksylo-oligosakkaridien seoksella (XYLO-OLIGO 70, Suntory Limited, Japani) ja 0,33 mg/ml metyyli-β-ksylopyranosidilla. Solupitoisuus oli 0,6-0,8 mg/ml kuivapainoa (105 °C). 24 h inkuboinnin jälkeen ravistelijassa (180 rpm) 30 °C:ssa 24 h seos sentrifugoitiin ja kirkasta supernatanttia käytettiin solunulkoisen a-glukuronidaasin puhdistamiseksi, joka yhteisindusoitiin endo-β-1,4-ksylanaasilla. P. stipitiksen α-glukuronidaasin puhdistus

Kirkas indusointialusta (600 ml) konsentroitiin 300-kertaisesti 10 kDa:n raja-arvoisilla Amicon-membraaneilla. Eritetyt proteiinit fraktioitiin ensin anioninvaihtokromatografialla HiTrap DEAE-FF -pylväässä (GE Healthcare, Ruotsi) käyttäen eluointia NaCI-gradientilla (0-1,0 M) 50 mM natriumfosfaattipuskurissa (pH 7,0). Fraktiot, jotka sisälsivät a-glukuronidaasia, jotka eluoituivat piikkinä välillä 0,2-0,26 M NaCI, poolattiin, konsentroitiin ja poistettiin suola, sitten tasapainotettiin 50 mM asetaattipuskurissa (pH 4,0), joka sisälsi 2 M (NH^SCU. Saatu eluentti eroteltiin hydrofobisella vuorovaikutuskromatografialla Butyl-FF -pylväässä (5 ml) (GE Healthcare) eluoituna pienenevällä (NH^SCU-gradientilla samassa puskurissa, a-Glukuronidaasi eluoitui pitoisuudella välillä 1,1-0,61 M (NH^SCU. Fraktiot, joissa oli a-glukuronidaasiaktiivisuutta, poolattiin, poistettiin suola, konsentroitiin ja eroteltiin kahdella anioninvaihtokromatografialisävaiheella käyttäen Tricorn MonoQ 5/50GL -pylvästä (Amersham, Yhdistynyt kuningaskunta) (polystyreeni/divinyylibentseeni). Ensimmäisessä vaiheessa pylväs tasapainotettiin 50 mM natriumasetaattipuskurilla (pH 4,0) ja eluoitiin kasvavalla NaCI-gradientilla (0-1,0 M). Toisessa vaiheessa asetaattipuskuri korvattiin 50 mM natriumfosfaattipuskurilla (pH 7,0). Fraktioista, joissa oli a-glukuronidaasiaktiivisuutta, poistettiin suola ja konsentroitiin kalvosuodatuksella Microconilla (10 kDa:n raja-arvo, Millipore Co., Yhdysvallat).

Puhdistetun proteiinin sekvenssianalyysi

Puhdistettu a-glukuronidaasi eroteltiin SDS PAGE:lla 10 % akryyliamidigeeleillä ja elektroblotattiin polyvinylideenidifluoridikalvolle (Millipore Corp., Yhdysvallat). 15 N-terminaalisen aminohapon sekvenssi määritettiin käyttäen HP G105A -proteiinisekvensaattoria (Hewlett Packard, Palo Aito, Kalifornia, Yhdysvallat). a-glukuronidaasimääritys

Puhdistusfraktiot, joissa oli a-glukuronidaasiaktiivisuutta, tunnistettiin kvalitatiivisesti TLC-analyysillä käyttäen silikageeliä (Merck Silica gel 60 alumiinilevyillä) seoksessa etyyliasetaatti: etikkahappo: 1-propanoli: muurahaishappo: vesi (26:10:5:1:15, tilavuutta). Vapaan MeGlcA:n läsnäolo, joka oli peräisin aldouronihapoista (10 mg/ml) tai glukuronoksylaanista (2 %) liuotettuna 0,05 M natriumasetaattipuskuriin (pH 4,0), oli osoitus -glukuronidaasiaktiivisuudesta. Entsyymiä käytettiin tavallisesti pitoisuudella 50 pg proteiinia/ml.

Kvantitatiivista määritystä, joka perustui vapaan MeGlcA:n määritykseen, joka vapautui aldopentauronihaposta (Xyl-Xyl(MeGlcA)-Xyl-Xyl, 10 mg/ml) tai pyökkipuun glukuronoksylaanista (2 %), Milnerin ja Avigadin menetelmän mukaisesti [Milner ja Avigad, 1967, Carbohyd. Res. 4:359-361] käytettiin substraattien ja -glukuronidaasiaktiivisuuden tuotteiden havaitsemiseksi. Substraatti ja tuotteet havaittiin käyttäen N- (naftyylietyleenidiamiini)-divetykloridireagenssia [Buonias, 1980, Anal.

Biochem. 106:291-295], Reagenssi on ruskea väriltään MeGlcA:n läsnä ollessa ja sinipunainen väriltään ksyloosia sisältävien yhdisteiden läsnä ollessa. Proteiininäytteitä (1-10 pg, riippuen puhtaudesta) inkuboitiin 10-60 min 0,1 ml:n reaktioseoksessa, joka sisälsi substraatin 50 mM asetaattipuskurissa (pH 4,4). Reaktio lopetettiin lisäämällä 0,3 ml kuparireagenssia ja keittämällä 10 min 100 °C:ssa, mitä seurasi 0,2 ml:n lisäys Nelson-reagenssia ja 0,4 ml vettä. Absorbanssi mitattiin aallonpituudella 600 nm käyttäen kalibrointia GlcA:n kanssa. Yksi yksikkö a-glukuronidaasia määritettiin entsyymimääräksi, joka tuotti 1 pmol uronihappoa 1 min:ssa aldopentauronihaposta (Xyl-Xyl(MeGlcA)-Xyl-Xyl.

Proteiinin määritys

Proteiinipitoisuus määritettiin Bradfordin [Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72, 248-254] menetelmän mukaisesti käyttäen naudan seerumialbumiinia standardina. Proteiinin molekyylipaino arvioitiin käyttäen SDS-PAGE:a (Laemmli, 1970, Nature 227:680-685] ja vertailua samalla tavalla eroteltujen värjäämättömien molekyylipainomarkkerien (FERMENTAS, Kanada) ja värjättyjen proteiinimarkkerien (SERVA, GmbH) kanssa. IEF suoritettiin Multiphor II -järjestelmässä (GE Healthcare, Ruotsi) käyttäen SERVALYT PRECOTES 3-6 esivalettuja geelejä ja IEF-markkereita 3-10 (SERVA, GmbH).

Tulokset a-Glukuronidaasin eristys

Uusi a-glukuronidaasi havaittiin useiden P. stipitis -kantojen kasvatuksen aikana erityyppisillä ksylaaneilla. Hiivan suurin kasvu havaittiin glukuronoksylaanilla. Vaikka glukuronoksylaania käytettiin päähiililähteenä rajoittuneessa määrin verrattuna D-ksyloosin, D-glukoosin tai p-1,4-ksylo-oligosakkaridien käyttöön, elatusalustaan ei akkumuloitunut happamia oligosakkarideja. Kaikki glukuronoksylaanista vapautuneet fragmentit käytettiin täysin, mikä viittasi siihen, että hiiva eritti a-glukuronidaasia elatusalustaan. Hiivan kasvatusalustan analysointi glukuronoksylaanilla kasvatuksen jälkeen paljasti voimakkaan α-glukuronidaasiaktiivisuuden. Osittain puhdistetun entsyymin havaittiin kykenevän poistamaan glukuronoksylaanin haaroja ja vapauttamaan MeGlcA:ta aldouronihapoista, joissa MeGIcA oli sidottu sisäisiin ksylopyranosyylitähteisiin. Entsyymiä ei voitu puhdistaa osittain käytetystä glukuronoksylaanialustasta, sillä ksylaanitähteiden läsnäolo lisäsi konsentroidun kasvatusalustan viskositeettia ja häiritsi entsyymin puhdistusta.

Solunulkoinen a-glukuronidaasi kuitenkin puhdistettiin menestyksekkäästi kasvatusalustasta, kun pestyjä eksponentiaalisen vaiheen glukoosilla kasvatettuja soluja inkuboitiin synteettisessä alustassa, joka oli täydennetty seoksella ksylobioosia, ksylotrioosia ja metyyli-p-D-ksylopyranosidia, jotka ovat ksylanolyyttisten entsyymien indusoijia P. stipitikseWä. Näissä olosuhteissa indusoidun solunulkoisen a-glukuronidaasin taso oli 0,015 U/ml, joka edusti noin 20 % aktiivisuudesta, mikä havaittiin solujen inkuboinnin aikana 1 % glukuronoksylaanin kanssa. Tämä a-glukuronidaasitaso oli riittävä sen puhdistamiseksi indusointialustasta, joka sisälsi vain dialysoituvia ravinnekomponentteja. Entsyymi puhdistettiin menestyksekkäästi konsentroidusta indusointialustasta käyttäen ioninvaihto- ja hydrofobisen vuorovaikutuskromatografian yhdistelmää (kuvio 1). Entsyymi erottui yhdeksi juovaksi SDS PAGE -analyysillä, mikä vastasi suunnilleen 120 kDa:n proteiinia (kuvio 2), ja oli riittävän puhdas käytettäväksi N-terminaalista aminohapposekvenssianalyysiä varten. P. stipitiksen a-glukuronidaasin katalyyttiset ominaisuudet

Puhdistetun a-glukuronidaasin havaittiin olevan olennaisesti vapaa endoksylanaasi-tai β-ksylosidaasiaktiivisuudesta. Ainoa reaktio, jonka entsyymi osoitti aldopentauronihapon kanssa, jolla oli rakenne Xyl-Xyl(MeGlcA)-Xyl-Xyl* tai pyökin glukuronoksylaanin kanssa, oli MelGIcA-tähteiden vapauttaminen (kuvio 3). Entsyymi vapautti myös MeGclA:ta aldotetrauronihaposta Xyl(MeGlcA)-Xyl-Xyl* (ei esitetty), joka samalla tavalla toimii perheen 67 a-glukuronidaasien substraattina (Biely, 2003, Xylanolytic enzymes. Teoksessa: Handbook of food enzymology, ss. 879-916. Marcel Dekker, Inc. New York). Alun perin kirkkaalla glukuronoksylaaniliuoksella oli lisääntynyttä sameutta ja lisääntyvää viskositeettiä tehokkaan haarojen poiston takia. Entsyymin pyökkipuun glukuronoksylaanista vapauttama uronihapon määrä pitkäkestoisen käsittelyn jälkeen oli 0,35 pmol 1 mg glukuronoksylaania kohti, mikä edustaa 75 % MeGlcA:n kokonaispitoisuudesta polysakkaridissa.

Optimiolosuhteet entsyymiaktiivisuudelle

Entsyymiaktiivisuuden pH-optimin havaittiin olevan 4,4. pH:ssa 4,0 ja pH:ssa 5,5 aktiivisuus edusti 26,5 % ja 51,6 % optimi-pH:n aktiivisuudesta, vastaavasti. Lämpötilaoptimi entsyymiaktiivisuudelle oli 60 °C (18,43 U/mg polymeerisellä glukuronoksylaanilla), mutta proteiinin havaittiin olevan epävakaa tässä lämpötilassa, niin että aktiivisuudesta hävisi 50 % 30 min:ssa. Proteiinin havaittiin olevan vakaa ainakin 3 h 40 °C:ssa, kun spesifinen aktiivisuus glukuronoksylaanilla oli 3,01 U/mg. Sekvenssistä laskettu (ExPASy online ProtParam -työkalu) a-glukuronidaasin pl oli 4,64, mutta isoelektrofokusointidata osoitti proteiinin pl:n olevan lähempänä 4,0:aa. N-terminaalinen aminohapposekvenssi-ja homologia-analyysi

Puhdistetun a-glukuronidaasin Edman-analyysi paljasti aminohapposekvenssin, johon sisältyi N-terminaalinen LGGLQNIVFKNSKDD-sekvenssi, joka vastasi täsmälleen P. stipitiksen geeniä XP 0013855930 johdettuna saatavissa olevasta P. stipitiksen genom isekvenssistä alkaen aminohaposta numero 19, joka koodasi proteiinia, jonka toiminto oli tuntematon, mutta jolla oli samanlainen molekyylimassa kuin eristetyllä a-glukuronidaasilla (sekvenssi nro 1). Se osa geeniä, joka koodaa 18 ensimmäistä aminohappoa, vastaa ilmeisesti entsyymin eristyssignaalisekvenssiä, joka ei ole säilynyt valmiissa solunulkoisessa proteiinissa, joka käsittää 957 aminohappoa. BLAST-haku suoritettiin käyttäen P. stipitiksen a-glukuronidaasin sekvenssiä, mikä paljasti samanlaisia geenejä monien muiden mikroeliöiden, enimmäkseen sienten genomeissa. Luettelo mikroeliöistä, joilla on P. stipitiksen a-glukuronidaasigeenin ortologeja, joiden identtisyys on suurempi kuin 34 % ja samanlaisuus suurempi kuin 51 %, on esitetty kuviossa 4. Kaikki ortologit vastaavat noin 1000 aminohapon proteiineja, mikä vastaa noin 120 kDa:n molekyylimassaa, kaikissa tapauksissa proteiineja, joiden toiminta on tuntematon. Suuren identtisyys (54 %) ja suurin samanlaisuus (69 %) oli Aspergillus clavatuksen geenisekvenssillä.

Kahdeksan valitun homologisen sekvenssin (jotka on esitetty lihavoituna kuviossa 4) linjaus P. stipitiksen a-glukuronidaasisekvenssin kanssa on esitetty kuviossa 5. Linjaus esittää 6 konservoitunutta glutamiinihappotähdettä ja 12 konservoitunutta asparagiinihappotähdettä, joista kaksi voivat olla aminohappoja, jotka liittyvät reaktion katalysointiin. Lisäksi 3 tyrosiinia ja 6 tryptofaania ovat myös konservoituneita. Siinä tapauksessa, että aromaattiset aminohapot ovat esillä pinnalla, niillä voisi olla tärkeä rooli ksylaanin pääketjun tunnistamisessa yhtenä entsyymin ehdoista toimia polymeerisellä substraatilla. P. stipitiksen entsyymi vapauttaa MeGIcA-tähteitä, jotka ovat sidottuja glukuronoksylaanin terminaalisiin tai sisäisiin ksylopyranosyylitähteisiin ja aldouronihappoihin, joita tuotetaan polysakkaridista endoksylanaasien toiminnalla. P. stipitis CBS 6054 -sekvenssi on fylogeneettisesti etäinen sekä GH-perheistä 67 että 4.

Ksyloosia fermentoiva hiiva Pichia stipitis on uniikki siinä, että sillä on myös rajoittunut kyky käyttää ksylaania hiililähteenä. Hiivan havaittiin edullisesti hydrolysoivan lehtipuun glukuronoksylaania, mahdollisesti koska sen ksylanolyyttisten entsyymien setti on rajoittunut vain kolmen entsyymin, endo-β-1,4-ksylanaasin, a-glukuronidaasin ja β-ksylosidaasin tuotantoon. Tämä hiivan ksylanolyyttisen järjestelmän ominaisuus vastaa sen luonnollista elinympäristöä, passalide-kuoriaisen, joka ruokailee kovan puun biomassalla, jossa on runsaasti asetyyliglukuronoksylaania, ruuansulatuskanavaa. Kasvatuksen aikana tällä deasetyloidulla glukuronoksylaanilla, hiiva eritti kahta ensimmäistä entsyymiä kasvatusalustaan, eikä happamien oligosakkaridien (aldouronihappojen) akkumulaatiota siksi tapahtunut tällä hiililähteellä kasvatuksen aikana. Tämän hiivan erittämän endoksylanaasin tason on aiemmin havaittu olevan niin alhainen, että se ei ole rohkaissut tämän hiivan ksylanolyyttisen järjestelmän lisätutkimuksia. On siksi yllättävää, että tämä heikko ksylanaasi erittää uuttaja käyttökelpoista a-glukuronidaasia. a-glukuronidaasin juuri kuvatulla tyypillä on kyky vapauttaa MeGIcA-tähteitä polymeerisestä substraatista. Sen toiminta aldotetrauronihapolla Xyl(MeGlcA)Xyl-Xyl, perheen 10 endoksylanaasien suorittaman glukuronoksylaanin hydrolyysin lyhimmällä happamalla tuotteella, vahvistaa, että uudella a-glukuronidaasien perheellä on GH67-entsyymien katalyyttinen aktiivisuus. S: commune n a-glukuronidaasin N-terminaalinen aminohapposekvenssi ei täsmännyt yhteenkään uuteen perheeseen ryhmiteltyjen entsyymien sekvensseistä. Tämän uuden a-glukuronidaasientsyymin kyvyn poistaa glukuronoksylaanin haaroja uskotaan vaikuttavan polysakkaridin fysikokemiallisiin ominaisuuksiin. Asetyyliglukuronoksylaanin deasetyloinnin tai α-L-arabinofuranosyylin sivuketjujen poiston arabinoksylaanissa on ehdotettu vähentävän polysakkaridien liukoisuutta ja lopulta johtavan polymeerin, jonka haarat on poistettu, saostumiseen. Kasvibiomassan käsittelyn käyttäen tässä kuvattua uutta a-glukuronidaasientsyymiä ehdotetaan vähentävän glukuronoksylaanin häviämistä keittoliuoksissa, joita tuotetaan paperinvalmistuksen aikana, ja maksimoivan glukuronoksylaanin retentiota kuitumatriisiin.

Metyyliglukuronihapon ja glukuronihapon poiston glukuronoksylaanista odotetaan tuottavan koostumuksia, joilla on käyttökelpoinen sovellutus paperi- ja selluteollisuudessa ja farmaseuttisella alalla. Lisääntyneet glukuronoksylaanimäärät paperintuotannossa eivät vain osallistu kasvibiomassan säilyttämiseen paperinvalmistusprosesseissa, vaan voisi tarjota uniikkeja ominaisuuksia paperin lujuudessa, paperin päällystyksessä ja painomusteen pysyvyydessä. Glukuroksylaanin uudelleen saostamista voidaan käyttää farmaseuttisella alalla lääkkeiden päällystämiseksi niiden varastoinnin pidentämiseksi ja lääkeyhdisteiden hitaan vapautumisen avustamiseksi. Glukuronoksylaanin hydrolyysin a-glukuronidaasin synergististen aktiivisuuksien avulla yhdessä β-ksylanaasien ja β-ksylosidaasien kanssa voi vapauttaa fermentoitavia sokereita glukuronoksylaanista hyödyketuotteiksi, kuten etanoliksi, laktaatiksi ja muiksi hienokemikaaleiksi konversiota varten.

Esimerkki 2 Tilastollinen analyysi

Jollei muutoin ole mainittu, näytteet suoritettiin kolmena kappaleena. Varianssianalyysi (ANOVA) sisältäen näytteiden keskiarvot ja standardipoikkeamat suoritettiin käyttäen ohjelmistoja Microsoft Excel ja Statistica 2007.

Ksylaaniuuton optimointi a-glukuronidaasiaktiivisuuden analysointia varten

Kahden miedon alkalisen ksylaaniuuttomenetelmän, jotka omaksuttiin julkaisuista Höije et ai. [2005, Carbohydr. Polym. 61: 266-275] ja De Lopez et ai. [1996, Biomass and Bioenergy, 10: (4): 201-211], valikoivuutta ja tehokkuutta arvioitiin mahdollista käyttöä varten olennaisesti puhtaiden ksylaanibiopolymeerien integroidussa tuotannossa ja selluntuotannossa raaka-aineesta, jota esiintyy yleisesti Etelä-Afrikassa. Arviointi perustui viiteen tekijään seuraavasti: (1) ksylaaniuuton tehokkuus, (2) polymerisaatio- ja substituutioaste, (3) uutetun ksylaanin kemiallinen koostumus, (4) uutetun ksylaanin puhtaus ja (5) raakamateriaalin rakenteellinen eheys ja kemiallinen koostumus ksylaaniuuton jälkeen. Entsymaattisen substraattispesifisyyden ja ksylaanin sivuketjujen poistoasteen arvioimiseksi käytettyjen ksylaanisubstraattien yhteenveto on esitetty kuviossa 6.

Raakamateriaalin karakterisointi Käytettyihin raaka-aineisiin sisältyivät eukalyptus (Eucalyptus grandis), mänty (Pinus patula), jättiläisbambu (Bambusa balcooa) ja sokeriruoko- (Saccharum officinarum L) -bagassi. E. grandis -lastut toimitti The Transvaal Wattle Cooperatives, Piet Retief, Mpumalanga-provinssi, kun taas P. patula -puut korjattiin Stellenbosch University -yliopiston metsäviljelmiltä Etelä-Afrikan Western Cape -provinssista. Jättiläisbambun varret (puolitoistavuotias kasvi) toimitettiin täysikasvuisilta viljelmiltä, jotka sijaitsivat Paarlissa Etelä-Afrikan Western Cape -provinssissa. Bagassi oli sokerinjalostusteollisuuden sivutuote, jonka lahjoitti TBS Company, joka sijaitsi Mpumalanga-provinssin Kaakkois-Lowveldin Nkomazi-alueella Etelä-Afrikassa. Kauran ksylaania (Sigma), koivun ksylaania (Roth) ja miedolla alkalilla uutettuja hhCb-valkaistuja bagassin ksylaaneja (jotka lahjoitti prof. A.M.F. Milagres, University of Säo Paolo, Brasilia), käytettiin vertailuksylaaneina.

Raaka-ainemateriaalit valmistettiin analyysiä varten TAPPI-testi-menetelmien (TAPPI, T264 cm-97 (2002-2003)) ja NREL Laboratory Analytical Procedures -toimintatapojen (NREL LAP) [Hammes et ai., 2005, Laboratory Analytical Procedure (LAP), versio 2005, NREL Biomass Program. National Bioenergy Center] mukaisesti. Eri raaka-aineista peräisin olevat lastut kuivattiin kosteuspitoisuuteen (mc) « 10 %, ja säädettiin sen jälkeen suhteelliseen kosteuteen 55 % 20 °C:ssa ainakin 24 h ennen koon lisäpienennystä. Lastujen kokoa pienennettiin peräkkäin Condux-vasaramyllyssä, Retch-laitteessa ja Wileyn laboratoriomyllyssä, ja fraktioitiin suodattamalla käyttäen pinottavia suodattimia (ASTM) 850 pm/20 -verkkokoko, 425 pm / 40 -verkkokoko ja 250 pm/60 -verkkokoko, joissa oli kansi ja vuoka. Hiukkaset, jotka läpäisivät 425 pm/40 -verkkokoon mutta retentoituivat 250 pm / 60 -verkkokoon siivilään, otettiin talteen kemiallisen koostumuksen analyysejä varten ja ne, jotka retentoituivat 425 pm/40 -verkkokokoon, käytettiin ksylaaniuuttoon. Raaka-aineen kosteuspitoisuus määritettiin käyttäen National Renewable Energy Laboratory Analytical Procedure -toimintatapaa (NREL LAP) kokonaiskuiva- aineen määrittämiseksi biomassasta [Hammes et ai., 2005, Laboratory Analytical Procedure (LAP), NREL Biomass Program. National Bioenergy Center], Kosteuspitoisuuden prosenttiosuus laskettiin biomassan uunikuivan (o.d) painon prosenttina.

Uuteaineet määritettiin kahdessa peräkkäisessä vaiheessa alkaen sykloheksaani/etanolilla (2:1), mitä seurasi kuuma vesiuutto käyttäen soxhlet-laitetta. Molemmat uutot tehtiin TAPPI-testimenetelmän T 264 om-88 ja NREL LAP -menetelmien mukaisesti [Sluiter et ai., 2005, Analytical Procedure (LAP), versio 2006. NREL Biomass Program. National Bioenergy Center], Uuteaineet kvantitoitiin kosteudettomalta pohjalta.

Raaka-aineen Klason-ligniinin (happoon liukenematon) pitoisuus määritettiin noudattaen NREL LAP -menetelmää rakennehiilihydraattien ja ligniinin määrittämiseksi biomassasta [Sluiter et ai., 2005, Analytical Procedure (LAP), versio 2006. NREL Biomass Program. National Bioenergy Center] ja TAPPI-testimenetelmiä (T249 cm-85). Klason-ligniini laskettiin o.d.-massasta.

Seifert-selluloosan pitoisuus määritettiin analyyttisten menetelmien mukaan, jotka oli hahmotellut Browning [1967, Methods of wood chemistry, vol II. Interscience publishers], sekä Fengel ja Wegner [1989, Wood chemistry, ultrastructure, reactions. Walter de Gruyter, Berliini, Saksa], Uuteaineista vapaa materiaali, joka painoi 1,1 g uunikuivana, käsiteltiin seoksella asetyyliasetonia (6 ml), dioksaania (2 ml) ja 32 % HCI (2 ml) pyöreäpohjaisissa pulloissa, mitä seurasi inkubointi kiehuvassa vesihauteessa 30 min. Käsitellyt näytteet siirrettiin kvantitatiivisesti ennalta punnittuihin sintterilasiupokkaisiin vakuumisuodatusta ja pesua varten. Jäännökset pestiin peräkkäin 100 ml:Ma kutakin metanolia, syklodioksaania, lämmintä vettä (80 °C), metanolia ja dietyylieetteriä, ja kuivattiin sen jälkeen 105 °C:ssa 2 h. Seifert-selluloosan pitoisuus määritettiin kuivatun jäännöksen painona esitettynä uuteaineista vapaan materiaalin prosenttiosuutena.

Happohydrolysaatin monomeerinen sokerikoostumus analysoitiin ainakin 24 h -20 °C:ssa varastoinnin jälkeen. Analyysi suoritettiin suuren erottelukyvyn anioninvaihtokromatografialla yhdistettynä pulssitettuun amperometriseen detektioon (HPAEC-PAD) (Dionex), joka oli varustettu gradienttipumpulla GP 50, Carbopac PA 10 (4 mm x 250 mm) -pylväällä ja sähkökemiallisella detektorilla (ED40). Datan hankinta ja analysointi suoritettiin käyttäen PEAKNET-ohjelmistopakkausta. Eluentit olivat 250 mM NaOH ja Milli-Q -vesi suhteessa 1,5:98,5 virtausnopeudella 1 ml min'1. Natriumasetaatti (1 M

NaOAc) -eluenttia käytettiin, kun analysoitiin happamia sokereita (glukuroni/metyyliglukuronihappo). Näytteet suodatettiin 0,22 pm huokoskoon suodattimilla ennen analysointia HPAEC-PAD:lla. Sokerien määrä määritettiin vastaavien analyyttisen laadun sokerien standardisuorasta (arabinoosi, ramnoosi, galaktoosi, glukoosi, mannoosi, ksyloosi ja glukuronihappo). Sokerin määrä esitettiin prosenttiosuutena suhteessa substraatin uunikuivaan (o.d) painoon. Pentosaanipitoisuus raaka-aineissa määritettiin TAPPI-standardimenetelmien mukaisesti pentosaanien mittaamiseksi puusta ja sellusta (T223 cm-84). Ksylaanipitoisuus laskettiin standardisuorasta, joka oli valmistettu ksyloosista (analyyttinen laatu) käyttäen kaavaa 3.1.1 o.d.-biomassan prosenttiosuutena [ Xyl = xyl χ cf, jossa: Xyl = ksylaanipitoisuus (mg), xyl = ksyloosipitoisuus (mg), cf = korjauskerroin (0,88)].

Tuhkapitoisuus määritettiin termogravimetrisella menetelmällä. Lignoselluloosanäytteitä (0,5 g) poltettiin muhveliuunissa 575 ± 25 °C:ssa 4 h tai kunnes saavutettiin vakiopaino. Tuhkapitoisuus laskettiin alun o.d.-biomassan prosenttiosuutena.

Ksylaaniuutto ja karakterisointi

Ksylaanin uutto raaka-aineesta suoritettiin käyttäen kahta mietoa alkalista uuttomenetelmää, jotka on kuvattu luvussa 2.9 edellä. Hoije-menetel-mään liittyi ksylaaniuuton jälkeinen ultrapuhdistus käyttäen kalvodialyysiä (MWCO 12-14 kDa), kun taas Lopez-menetelmään liittyi hydrolysaattien fraktiointi etanolisaostuksella. Molemmissa menetelmissä ksylaaniuutto suoritettiin ilman aiempaa liuottimen ja kuumavesiuuteaineiden poistoa. Uutteet konsentroitiin ennen ultrapuhdistusta tai fraktiointia kolmannekseen alkutilavuudesta käyttäen pyöröhaihdutinta (Rotavapor BCichi R-124, Sveitsi) vakuumissa 40 °C:ssa. Uuttotehokkuus määritettiin ksylaanisaannoksi teoreettista pentosaanien pitoisuutta kohti materiaalissa. Lopez-menetelmä rajoittui ksylaanin uuttoon vain E. grandiksesta ja bagassista.

Raaka-aineiden ksylaaniuuttoa varten rakenne ja kemiallinen koostumus analysoitiin ennen ja jälkeen ksylaaniuuton kiinteän tilan 13C-ydinmagneettiresonanssi ristipolarisaatio/magic angle spinning (13C-NMR CP/MAS) -menetelmällä Vahan VNMRS 500 leveän halkaisijan kiinteän tilan NMR-spektrometrillä toimintafrekvenssillä 125 MHz 13C:Ile, käyttäen 6 mm T3-koetinta koetinlämpötilan 25 °C kanssa. Kuivat näytteet ladattiin 6 mm:n zirkoniumoksidiroottoreille analyysiä varten. Spektrit tallennettiin käyttäen ristipolarisaatiota ja magic angle spinning (CP/MAS). Pyörimisnopeus oli 5 kHz, 90° protonipulssi oli 5 ps, kosketuspulssi 1500 ps ja viive toistojen välillä 5 s. Kemialliset siirtymät määritettiin suhteessa TMS:ään asettamalla ulkoisen adamantaanivertailuaineen alakentän huipuksi 38,3 ppm. Hiilen resonanssit kiinteän tilan NMR-spektreissä nimettiin Larssonin et ai. [1999, Solid State Nuclear Magnetic Resonance 15: 31-40]; Renardin ja Järvisin [1999, Plant Physiology 119:1315-1322], Maunun [2002, Progress in Nuclear Magnetic Response Spectroscopy 40: 151-174], Lahayen et al. [2003, Carbohydrate Research 338: 1559-1569]; Atallan ja Isogain [2005, Recent developments in spectroscopic and chemical characterisation of cellulose. Teoksessa Dumitriu, S. (toim.) Marcel Dekker. New York. ss. 123-157], Virkin et al. [2005, Carbohydrate Polymers 59: 357-366], Gengin etal. [2006, International Journal of Polymer Characterization 11: 209-226], sekä Oliveiran et al. mukaisesti [2008, Chemical composition and lignin structural features of banana plant leaf sheath and rachis. Teoksessa Hu, T.Q. (toim.) luku 10: 171-188],

Uutetut ksylaaninäytteet analysoitiin käyttäen kiinteän tilan 13C-ydinmagneettiresonanssi-ristipolarisaatio/ Magic Angle Spinning (13C-NMR CP/MAS) ja nestemäistä 13C- ja 1H-NMR:ää ja Fourier-muunnos infrapuna-(FTIR) -spektroskopiaa. Ksylaaninäytteet altistettiin 13C- ja 1H-NMR -ajolle joko Varian Inova 400- tai 600- NMR-spektrometrillä. 13C-NMR -spektrit otettiin talteen 1,3 s:n tallennusajalla ja 1 s pulssin viiveellä 25 °C:ssa. 13C-spektrit otettiin talteen yön yli (minimi 19000 skannausta). 1H-NMR -spektrit otettiin talteen näytteen suodatuksen jälkeen 4,8 s:n tallennusajalla 50 °C:ssa. 1H-spektrit otettiin talteen 64 skannauksella HDO-piikin esikyllästyksellä. 13C- ja 1H-NMR-spektrit tulkittiin sukulaisraaka-aineiden ominaisten signaalien nimeämisen mukaan, joita ovat esittäneet Ebringerovä et al. [1998, Carbohydrate Polymers 37: 231-239], Vignon ja Gey [1998, Carbohydrate Research 307: 107-111 ], Renard ja Jarvis [1999, Plant Physiology 119:1315-1322], Teleman et al. [2002, Carbohydrate Research 337: 373-377], Gröndahl et al. [2003, Carbohydr. Polym. 53: 359-366], Lahaye etal. [2003, Carbohydrate Research 338: 1559-1569], Sun et al. [2004, Carbohydrate Research 339: 291-300; Polym. Degrad, and Stability 84: 331-337; Carbohydrate Polymers 56: 195-204], Simsja Newman [2006, Carbohydrate Polymers 63: 379-384]; Habibi ja Vignon [2005, Carbohydrate Research 340: 1431-1436], Pinto et al. [2005, Carbohydrate Polymers 60: 489-497], Geng et al. [2006, International Journal of Polymer Characterization 11: 209-226], Maunu [2008. 13C CPMAS NMR

Studies of wood, cellulose fibers, and derivatives. Teoksessa Hu, T.Q. (toim.)], Shao et al. [2008, Wood Science Technology 42: 439-451], FTIR-spektroskopiassa ksylaanin kuivat kiinteät näytteet tallennettiin Nexus 670 -spektrometrilla yrityksestä Thermo Nicolet, jossa oli asennettuna Smart Golden Gate ATR -lisävaruste. Tässä yhden heijastuksen lisälaitteessa on timantti ATR-kide sidottuna tungsten-karbidialustaan, joka on varustettu ZnSe-fokusointilinsseillä. Spektrit otettiin talteen spektrialueella 4000-650 cm'1 käyttäen 16 skannausta 6 cm'1 resoluutiolla ja kalibroitiin aiemmin tallennettua taustaa vastaan. Thermo Nicoletin OMNIC®-ohjelmistoa käytettiin infrapunaspektrien tallentamiseksi ja käsittelemiseksi. Spektrisignaalit FTIR:lle tulkittiin ominaisten juovien mukaan, joita on esitetty julkaisuissa Fengel ja Wegener (1989); Sun et ai. (2004); Xu et ai. (2000), Sims ja Newman (2006).

Uutettujen ksylaanifraktioiden polymerisaatioaste arvioitiin HPAEC:lla (Dionex) käyttäen Carbopac™ PA100 -pylvästä (4 x 250 mm) ja esikolonnia sekä sähkökemiallista detektoria (ED40) pulssitettua amperometristä detektiota (PAD) varten. PA 100 -pylväs erottelee monomeerit ja oligomeerit polymerisaatioasteeseen (PD) 10 saakka, joka tavallisesti eluoituu retentioajalla 25 min. HPAEC PA 100 -pylväs perustaa erottelunsa DP:hen ja substituutioasteeseen, siten mitä pitempi retentioaika, sitä suurempi DP tai substituutioaste (Combined Carbopac -ohjekirja s. 53-56). Näytteet (10 pl) injektoitiin pylvääseen ja eluoitiin heliumilla kaasunpoistetulla 0,25 M NaOH:lla, Milli-Q H2O:Ma ja 1 M NaOAc:llä virtausnopeudella 1 ml min'1. Näytteiden eluutioprofiileja verrattiin monomeeristen sokerien (arabinoosi, ramnoosi, galaktoosi, glukoosi, ksyloosi ja mannoosi) ja polymeerisen ksylaanin (koivun ja kauran ksylaani) ja H202-valkaistun bagassin eluutioprofiileihin. Näytteitä, joilla oli vähemmän intensiiviset piikit < 20 nC tai piikkejä ei eluoitunut 25 min retentioajan sisällä, pidettiin polymeerisinä, joiden DP>10 sokeriyksikköä.

Neutraalien sokerien koostumus uutetuissa ksylaaninäytteissä määritettiin HPAEC-PAD:llä (Dionex) Carbopac PA 10 -pylväässä miedon happohydrolyysin jälkeen, jonka ovat kuvanneet Yang et ai. [2005, LWT 38: 677-682], Näytteet (0,1 g) pantiin Schott-pulloihin (50 ml), joihin lisättiin 1 ml 72 % H2SO4. Seosta inkuboitiin 30 °C:ssa vesihauteessa 1 h. Lisättiin deionisoitua vettä (30 ml), mitä seurasi autoklavointi 121 °C:ssa 1 h. Näytteet jäähdytettiin huoneenlämpötilaan ennen suodatusta. Suodatinkakku kuivattiin 105 °C:ssa Klason-ligniinijäännöksen määrittämiseksi. Nestemäinen fraktio suodatettiin 0,22 pm huokoskoon suodattimen läpi ennen sen altistusta HPAEC-PAD:lle (Dionex) Carbopac PA 10 -pylväässä. Monomeeriset sokerit kvantitoitiin analyyttisen laadun arabinoosin, ramnoosin, galaktoosin, glukoosin, ksyloosin ja mannoosin) standardisuorista. Näytteiden neutraalien sokerien kokonaispitoisuus esitettiin suhteessa alun ksylaanin o.d-massaan.

Uronihappokoostumuksen määritys

Ksylaaninäytteiden ja raaka-aineiden uronihappopitoisuus kvantitoitiin käyttäen kromatografisia ja kolorimetrisiä menetelmiä. Kromatografisessa menetelmässä käytettiin kaksivaiheista happohydrolyysimenetelmää, joka oli omaksuttu prof. A.M.F. Milagresilta, University of Säo Paulo, Brasilia. Ksylaaninäytteet (150 mg o.d-massa) hydrolysoitiin 0,75 ml:ssa 72 % (paino/paino) H2SO4 McCartney-pulloissa. Seosta inkuboitiin 45 °C:ssa 7 min vesihauteessa, minkä jälkeen lisättiin 22,5 ml tislattua vettä. Pullot peitettiin löyhästi ja autoklavoitiin 121 °C:ssa 30 min. Huoneenlämpötilaan jäähdytyksen jälkeen nestemäinen fraktio eroteltiin vakuumisuodatuksella lasimikrokuitusuodattimien (GF/A- Whatman) läpi. Nestemäinen fraktio suodatettiin lisäksi 0,22 pm suodattimen läpi ja pidettiin jäädytettynä yön yli -20 °C:ssa ennen glukuronihappopitoisuuden suhteen analysointia käyttäen HPAEC-PAD (Dionex) Carbopac PA 10 -pylväässä. Uronihapon kvantitointi perustui standardisuoriin glukuronihapolle (Sigma). Uronihappohävikit autoklavoinnin aikana selitettiin autoklavoidulla glukuronihapolla 121 °C:ssa 1 h 4 % HaSCkssä. Kolorimetrisessä menetelmässä käytettiin karbatsoli-rikkimääritystä, joka oli omaksuttu julkaisusta Li et ai. [2007, Carbohydr. Res. 342 (11): 1442-1449], Kokonais-uronihappopitoisuus määritettiin standardisuorakuvaajasta D-galakturonihapol-le (Merck) ja molemmissa menetelmissä uronihappopitoisuus esitettiin alun ksylaanimäärän prosenttiosuutena.

Ksylaanin sivuketjujen poisto 4-O-metyyliglukuronihapon (4-O-MeglCA) sivuryhmien valikoiva poistoaste Schizophyllum commune n a-D-glukuronidaasilla (a-glu) määritettiin käyttäen ksylaania, joka oli peräisin Eucalyptus grandiksesta, Pinus patulasta, Bambusa balcooasta ja bagassista, jota esiintyy Etelä-Afrikassa. a-glu S. communesta arvioitiin 4-O-MeglcA -sivuryhmien valikoivan poiston suhteen ksylaanista, joka oli peräisin lehtipuu-, havupuu-ja ruohokasvi-sisältäen viljat) -lähteistä tavoitteena kehittää säädelty entsymaattinen teknologia ksylaanin toiminnallisten ominaisuuksien diversifiointia varten. Siksi tutkittiin hydrolyysiajan, -lämpötilan ja entsyymin ksylaanispesifisen annoksen vaikutusta 4-O-MeglcA -sivuketjujen poistoon, sen jälkeistä ksylaanin viskositeetin, liukoisuuden, saostuksen ja aggregaation muokkausta. Ksylaaninäytteet substituoitiin arabinoosilla ja/tai 4-O-metyyliglukuronihapon (4-O-MeglcA) sivuketjuilla (kuvio 7). Kauran ksylaania (Sigma) ja koivun ksylaania (Roth) käytettiin malliksylaaneina. Ksylaaniliuos (1 % paino/tilavuus) kullekin materiaalille valmistettiin deionisoituun veteen (dhhO). Ksylaani, jolla oli rajoittunut liukoisuus veteen, valmistettiin liuottamalla ensin etanoliin ja kuumentamalla sen jälkeen de Wetin et ai. mukaisesti [2008, Appi. Microbiol. Biotechnol. 77: 975-983], Ksylaaniliuokset valmistettiin suurena määränä ja varastoitiin astioissa -20 °C:ssa. Samalla tavalla valmistettua kauran ksylaania (Sigma), jonka sokerikoostumus oli 10:15:75 (arabinoosi:glukoosi:ksyloosi), ja koivun ksylaania (Roth), jonka sokerikoostumus oli 8,3:1,4:89,3 (4-0-MeglcA:glukoosi ja ksyloosi) [Kormelinkja Voragen, 1993, Carbohydr. Res. 249: 345-353], käytettiin malliksylaanina. Käytetty entsyymi oli a-D-glukuronidaasi (a-glu), jonka spesifinen aktiivisuus = 300 nKat mg-1, joka oli puhdistettu Schizophyllum commune sta (VTT-D-88362- ATCC 38548 (jonka lahjoitti prof. Matti Siika-aho VTT Bioteknologian instituutista Suomessa), 4-O-metyyli-D-glukuronihapon/glukuronihapon sivuryhmien valikoivaa poistoa varten. Entsyymiosanäytteet varastoitiin 4 °C:ssa.

Ksylaaniliuos (1 % paino/tilavuus), joka oli valmistettu 4-O-MeglcA-substituoiduista substraateista, käsiteltiin a-glu:Ma (9000 nKat g-1) 5 ml:n reaktiotilavuuksissa, jotka koostuivat 2,5 ml:sta substraattia ja tehtiin 5 ml:ksi 0,05 M asetaattipuskurilla, pH 4,8. Reaktioiden annettiin edetä 16 h 40 °C:ssa. 4-O-MeglcA-sivuketjusokerin vapautuminen analysoitiin käyttäen (HPAEC-PAD) Carbopac PA 10 -pylväässä eluoituna heliumilla kaasunpoistetulla Mill-Q H2O:Ma, 250 mM NaOH:lla ja 1 M NaOAc:llä (vain happamille sokereille). D-glukuronihappoa käytettiin standardisokerina. Ksylaanihydrogeelien liukenemattomaksi tekeminen, saostus ja aggregaatio varmistettiin visuaalisella tarkastelulla (otettiin valokuvia) ja kvantitoitiin mittaamalla viskositeetti käyttäen reometria (MCR501). Ksylaanin saostumisaste kvantitoitiin määrittämällä jäännösksyloosi liuoksessa käyttäen fenoli-rikkimääritystä kokonaissokerille [Dubois et ai., 1956, Annal. Chem. 28 (3):350-356].

Kolmen tekijän Box-Behnken tilastollista suunnittelukoetta, jossa oli 3 keskipistettä, suorittaen yhteensä 15 ajoa, ajettiin kahtena kappaleena:

Statistica 7.0 -ohjelmistoa (StatSoft, Inc., 1984-2005) käytettiin suunnitteluun ja analysointiin käyttäen vastepintamenetelmää (RSM), kuten on esitetty kuviossa 8. Regressio-ja ANOVA-analyysit suoritettiin hydrolyysiparametrien yksittäisten ja vuorovaikutuksen vaikutusten koon ja merkitsevyyden määrittämiseksi viskositeettiin. Optimiolosuhteet määritettiin käyttäen haluttavuusfunktiota. Pintavastekuvaajat sovitettiin toisen asteen polynomin kanssa seuraavasti: Z = β o + βιχι + βηχι1 + βιχι + βηχι1 + /3 3X3 + /3 33x32 + ε jossa: Ζ = viskositeetti (mPa.s.), βο+ βι.........βη = lineaarinen regressiokerroin, βι 1.... βηη= kvadraattinen regressiokerroin, ε= virhe, ja Χι, Χ2, Χ3= hydrolyysiaika, lämpötila ja entsyymin ksylaanispesifinen annos.

Optimiolosuhteet sivuketjun poistoa varten

Hydrolyysiparametrien optimaalisen yhdistelmät tasot määritettiin: aika, lämpötila ja a-D-glukuronidaasin annos 4-O-metyyliglukuronihapon sivuketjun poistamiseksi.

Ksylaanin latauksen, entsyymin latauksen, hydrolyysiajan ja lämpötilan sekä niiden vuorovaikutuksen vaikutus 4-O-MeglcA -sivuketjujen a-glu:Ma poistoon kauran ja koivun ksylaanista määritettiin käyttämällä pintavastemetodologiaa (RSM). Aika, lämpötila ja entsyymin ksylaanispesifinen annos muodostivat riippumattoman muuttujan, kun taas sivuketjun poistoaste ja viskositeettimuutos muodostivat riippuvaiset muuttujat. Statistica 7.0 -ohjelmistoa (StatSoft, Inc., 1984-2005) käytettiin kokeiden suunnitteluun ja analysointiin. Tilastollinen analyysi sisälsi regressio- ja ANOVA-analyysit. Pareto-kuvaajia käytettiin vaikutusten koon ja merkitsevyyden esittämiseksi, kun taas haluttavuus- ja profilointifunktiota käytettiin optimaalisen asetusarvon määrittämiseksi hydrolyysiparametreille. Kauran ksylaani (1 % paino/tilavuus) valmistettiin de Wetin et ai. mukaisesti [2008, Appi. Microbiol. Biotechnol. 77: 975-983], Liuokset valmistettiin suurena määränä ja varastoitiin astioissa -20 °C:ssa. a-D-glukuronidaasia (a-glu), joka oli puhdistettu villityypin Schizophyllum commune sta (VTT-D-88362- ATCC 38548), jonka spesifinen aktiivisuus oli 300 nKat mg-1,(jonka lahjoitti prof. Matti Siika-aho VTT Bioteknologian instituutista Suomessa), käytettiin 4-O-metyyli-D-glukuronihapon/glukuronihapon sivuryhmien valikoivaa poistoa varten. Entsyymiosanäytteet varastoitiin 4 °C:ssa. D-glukuronihappoa (Sigma) käytettiin standardisokerina.

Hydrolyysiparametrien optimointi

Optimaaliset asetusarvot ajalle, lämpötilalle ja entsyymiannokselle 4-0-MeglcA:n a-glu:Ma poistoa varten koivun ksylaanista määritettiin kolmen tekijän Box-Behnken tilastollisessa mallissa, jossa oli 3 keskipistettä, suorittaen yhteensä 15 ajoa kahtena kappaleena. Hydrolyysiparametrit testattiin kukin kahdessa tasossa ja keskikohdassa, niin että suurin, keskimmäinen ja matalin taso merkittiin 1,0 ja -1 vastaavasti. Lämpötilaa testattiin 30 °C:ssa ja 50 °C:ssa, aika 1 h ja 16 h, ja a-glu:n entsyymiannos oli 2 000 nKat g_1 ja 18 000 nKat g-1. Keskipisteet lämpötilalle ja ajalle olivat 40 °C ja 8,5 h, kun taas a-glu:n ksylaanispesifiset annokset olivat 360000 nKat g-1 ja 11000 nKat g-1, vastaavasti. Muuttujat koodattiin kaavan mukaisesti:

jossa: x,= koodattu arvo muuttujalle, X, = luonnollinen arvo, ΔΧ,= skaalaustekijä (puolet riippumattomien muuttujien alueesta, jotka koostuivat ajasta, lämpötilasta, ja entsyymin ksylaanispesifisestä annoksesta)] 4-O-MeglcA -sivuketjut analysoitiin käyttäen (HPAEC-PAD) Carbopac PA 10 -pylväässä eluoituna heliumilla kaasunpoistetulla Mill-Q H2O:Ma, 250 mM NaOH:lla ja 1 M NaOAc:llä (vain happamille sokereille). D-glukuronihappoa käytettiin standardisokerina.

Pintavastekuvaaja sovitettiin toisen asteen polynomin kanssa, joka sisälsi sekä lineaariset että kvadraattiset vuorovaikutukset seuraavasti: ^ — β()+ β\Χ\ + β Λ + βΧ2 + ΑΛ βΧ2 β?Λ Ί" β12*1 Χ2 + β13*1 *1 + β\22Χ\Χ2 + A 3 3*1 *3 + βΐ23Χ2Χ3 + /^233*2*3 A 122*1 *2 + A 133*1 *3 + β223?Ρί2Χ1 + 8 jossa: Ζ = vaste (sivuketjun poistoaste), βο + βι......... βη = lineaarinen regressiokerroin, βι 1.... βηη= kvadraattinen regressiokerroin, Χι, Χ2, Χ3= hydrolyysiaika, lämpötila ja entsyymin ksylaanispesifinen annos tai ksylaani ja entsyymin lataus, ε= virhe.

Tulokset

Ksylaanin uutto ja karakterisointi lignoselluloosamateriaaleista

Bagassin, männyn (Pinus patula) ja bambun (Bambusidae balcooa) kemiallinen koostumus on esitetty (kuvioissa 9-11). Bagassilla oli suurin tuhka (8,6 %) ja liuotinuuteaineet (6,2 %) (kuvio 9), ligniini (30,0 %) (kuvio 10), selluloosa (53,80 %) ja pentosaanit (22,00 %) (kuvio 11). Sekä E. grandikseWa että P. patulaWa olivat tuhka-ja uuteainepitoisuudet pienemmät kuin 3 % (kuvio 9). Kuitenkin P. patulaWa oli alhaisin pentosaanitaso (8,49 %). Selluloosataso E. grandiksessa ja bambussa oli välillä 40-43 % (kuvio 11), kun taas ligniinipitoisuus oli noin 23 % (kuvio 10). Ksylaanin uutto P. patulasta, bagassista, E. grandiksesia ja bambusta Hoije-menetelmällä tuotti uuttotehokkuudet 71,20, 65,50, 35,20 ja 20,20 % vastaavasti (kuvio 12), kun taas ksylaanin uutto bagassista ja E. grandiksesta käyttäen Lopez-menetelmää tuotti uuttotehokkuudet 28,00 ja 12,00 % vastaavasti (kuvio 12).

Kiinteän tilan 13C-CP/MAS NMR -spektreissä käsittelemättömälle, uuteaineettomalle ja ksylaaniuutetulle P. patula-, bagassi-, E. grandis- ja bambumateriaalien jäännökselle oli ominaiset signaalit, jotka olivat peräisin anhydrisen glukoosirenkaan kuudesta hiiliresonanssista selluloosassa, jotka nimettiin Atallan ja Isogain mukaisesti [2005, Recent developments in spectroscopic and chemical characterisation of cellulose. Teoksessa Dumitriu,

S. (toim.) Marcel Dekker. New York. s. 123-157] (Kuviot 13A-D spektrit 1. Alkaen spektrien yläkentästä, primaarisen alkoholiryhmän C6 ilmaantui kemiallisessa siirtymässä (6) 60-70 ppm ja resonanssit renkaan hiilien C2, C3 ja C5 ryppäälle muille kuin niille, jotka ankkuroivat glykosidisidosta, ilmaantuivat siirtymässä δ 70-81 ppm, C4-resonanssit siirtymässä δ 81-93 ppm, ja C1 siirtymässä δ 102-108 ppm. Lisäksi tyypillisiä pareja oli C4- ja C6-resonansseissa (ylempi kenttä), jotka edustavat vähemmän järjestynyttä (amorfista) selluloosaa ja järjestyneessä (kide) selluloosassa (alakenttä) (Atalla ja Isogai, 2005) kaikkien lignoselluloosaraaka-ainemateriaalien spektreissä (kuviot 13A-D). Kuitenkin parit C6:lle P. patulan spektreissä (kuvio 13A spektri 1) olivat erottuneemmat kuin bagassilla (kuvio 13B), E. grandikseWa (kuvio 13C) ja bambulla (kuvio 13D). Lisäksi ominaiset signaalit asetyyliryhmille (siirtymässä δ 20-22 ppm, alifaattiset ryhmät siirtymässä δ 30-40 ppm, metyyli (CH3) syntyen ligniinitähteistä siirtymässä δ 50-60 ppm, arabinoositähteiden C1 siirtymässä δ 110 -120 ppm, aromaattiset yhdisteet ligniinitähteistä siirtymässä δ 140-160 ppm, ja uronihappotähteiden tai karbonyyliryhmien C6 siirtymässä δ 170-190 ppm olivat yhdenmukaiset Liitian et ai. [2001, Holzforschung 55: 503-510]; Maunun [2002, Progress in Nuclear Magnetic Response Spectroscopy 40: 151 — 174]; Lahayen et al. [2003, Carbohydrate Research 338: 1559-1569] kanssa; Oliveira et al. [2008, Chemical composition and lignin structural features of banana plant leaf sheath and rachis. Teoksessa Hu, T.Q. (toim.). Luku 10: 171 — 188] tunnistivat käsittelemättömien raakamateriaalien spektreissä (kuviot 13A-D spektrit 1). Raaka-aineen, josta uuteaineet oli poistettu, 13C-CP/MAS NMR -spektreissä oli muutoksia signaalien linja- ja jakautumismallissa C4:n ja C6:n yläkentässä ja resonansseissa välillä δ 81-93; 60-70 ja 20-22 ppm, vastaavasti (kuviot 13A-D) spektrit 2). Kun taas 13C-CP/MAS NMR -spektreissä raaka-aineelle, josta ksylaani oli poistettu, oli signaalien häviämistä tai intensiteetin vähenemistä, mikä ilmeni asetyyli-, alifaattisista, metyyli-, aromaattisista, uroni/karbonyyliryhmien C6:sta siirtymissä δ 20-22, 30-40, 50-60, 140-160 ja 170-190 ppm, vastaavasti (kuviot 13A-D spektrit 3). 13C-CP/MAS NMR -spektreissä bagassille, josta ksylaani oli poistettu, oli terävöityneet signaalit erityisesti resonansseissa välillä δ 30-40 ppm, jotka ovat peräisin alifaattisista ryhmistä (Oliveira, 2008), ja resonanssien täydellinen häviäminen aiheutuen metyyliryhmistä siirtymässä δ 40-50 ppm (kuvio 13B spektri 3). Kun taas P. patulan, E. grandiksen ja bambun 13C-CP/MAS NMR -spektreissä oli huomattava signaalin vähentynyt intensiteetti metyyliryhmälle (kuvio 13A, C, D spektrit 3, vastaavasti).

Glukoosin alkutasot uuteaineettomassa bagassissa, bambussa, P. patulassa ja E. grandiksessa olivat 68,0, 66,0, 61,0, ja 59,0 %, vastaavasti. Ksylaaniuutossa käyttäen Hoije-menetelmää glukoosin osuus raaka-aineissa lisääntyi 75,0, 76,0, 65,0 ja 79,0 %:iin vastaavasti, kun taas ksyloosipitoisuus pieneni 14,0:sta 10,0 %:iin, 27,0:sta 25 %:iin, 35:stä 19 %:iin, 30,0:sta 22,0 %:iin P. patulassa, bagassissa, E. grandiksessa ja bambussa, vastaavasti (kuviot 14A-D). Lisäksi ksylaaniuutto vastasi vähenemistä arabinoosi- ja galaktoosipitoisuudessa kaikissa raaka-aineissa (kuviot 14A-D). Mannoosin pitoisuus (16 %), joka oli havaittavissa vain P. patula -raaka-aineessa, lisääntyi 18 %:iin ksylaaniuutetussa jäännöksessä (kuvio 14A). Uronihappojen läsnäolo oli havaittavissa kaikissa neljässä lignoselluloosaraaka-ainemateriaaleissa (kuvio 15). Suurin ja pienin uronihappojen pitoisuus havaittiin E. grandis- ja bagassi-raaka-aineissa, vastaavasti (kuvio 15).

Uutettujen ksylaanifraktioiden eluutioprofiileja verrattiin monomeeristen sokerien (arabinoosi, ramnoosi, galaktoosi, glukoosi, ksyloosi ja mannoosi), ksylitolisokerin, koivun ksylaanin, kauran ksylaanin ja H2O2-valkaistun bagassin (Bag B) eluutioprofiileihin. HPAEC-PAD (Dionex) -kromatogrammi osoitti, että monomeeriset sokerit sisältäen ksylitolin eluoituivat CarboPac PA 100 -pylväässä retentioajalla 5 min (kuviot 16Aja B). Välillä 0-3 min kauran ksylaanin eluutioprofiilissa oli suuri intensiteettipiikki detektorivasteella > 300 nC, mikä vastasi retentioaikaa ksylitolille (kuvio 16D). Muutoin välillä 3-6 min kromatogrammissa sekä koivun ksylaanille että kauran ksylaanille oli vain pienet intensiteettipiikit (detektorivaste < 20 nC) (kuviot 16C ja D vastaavasti). Kun taas kromatogrammissa hbCb-valkaistun bagassin (Bag B) ksylaanille oli monia suuren intensiteetin piikkejä, joiden detektorivaste oli yli 100 nC ilmestyen retentioajalla välillä 2-30 min (kuvio 17A). Kromatogrammeissa sekä Hoije- että Lopez-uutetulle ksylaanille oli pienet intensiteettipiikit (< 20 nC) 25 min retentioajan sisällä (kuvio 17B ja C). Uutettujen ksylaaninäytteiden joukossa piikki, joka vastasi ksylitolia, oli läsnä ksylaanin kromatogrammissa E. grandiksesta (kuvio 18A), bambusta (18C) ja P. patulasta (kuvio 18D), joka oli uutettu Hoije-menetelmällä.

Ksylaanin ksyloosipitoisuus E. grandiksesta, joka oli uutettu Hoije-menetelmällä (EU H), bambusta, bagassista, joka oli uutettu Hoije-menetelmällä (Bag H) jaP. patulasta oli 92,00, 79,50, 71,00 ja 61,30 % vastaavasti (kuvio 15). Kun taas ksyloosipitoisuus koivun ja kauran ksylaanissa oli 80,00 ja 87,20 % vastaavasti (kuvio 15). Arabinoosin osuus Bag H:n, P. patulan ja bambun ksylaanifraktioissa oli 17,45, 15,50 ja 10,50 % vastaavasti (kuvio 15). Vaikka kaupallisessa kauran ksylaanissa on raportoitu olevan 10 % arabinoosia (Sigma), tämä tutkimus osoitti arabinoosipitoisuutta 7,4 % (kuvio 15). Noin 2,30 % glukoosia oli läsnä EU H:n ksylaanifraktiossa, kun taas 13,20 % glukoosia oli läsnä P. patulan ksylaanifraktioissa (kuvio 15). Lisäksi EU-H sisälsi 4,45 % galaktoosia ja vähäisiä määriä ramnoosia ja arabinoosia (kuvio 15). EU H:n, bambun ja P. patulan ksylaanin uronihappopitoisuuden kokonaisuronihappopitoisuus oli 12,38, 11,20 ja 11,54 %, kun taas bagassin ksylaani sisälsi 8,5 % (kuvio 15).

Hoije-menetelmällä uutetut ksylaanifraktiot, kun ne altistettiin miedolle happo- (72 % H2SO4) -hydrolyysille, tuottivat väliltä 16-55 % liukenemattomia jäännöksiä (kuvio 19). Suurimmat happoon liukenemattomat jäännökset 55 % saatiin ksylaanista, joka oli uutettu P. patulasta käyttäen Hoije-menetelmää. Happoon liukenemattomat jäännökset bagassin ksylaanista, jotka oli uutettu Lopez-menetelmällä (Bag L), oli 16 % kun taas vertailumateriaalilla, koivun ksylaanilla oli 3,5 % (kuvio 19).

Uutetun ksylaanin rakenneominaisuudet

Vertailuksylaanin 1H NMR- ja 13C NMR -spektreissä koivun, H2O2-valkaistun bagassin ja kauran ksylaanista oli ominaisia signaaleja protoni- ja hiiliresonansseille (kuvio 20A-D). Uutetun ksylaanin 1H NMR -spektreissä oli ominaiset protonisignaalit ksyloosi-, 4-O-metyyliglukuronihappo- ja arabinoosiyksiköistä kemiallisissa siirtymissä (5) välillä 3,3-5,7 ppm (kuviot 20- 22). 1H NMR:ssä protonisignaalit ksyloosille ksylaanifraktioissa bagassista, joka oli uutettu Hoije- (Bag H) ja Lopez- (Bag L) -menetelmillä, olivat siirtymissä δ 4,44/4,45, 3,50, 3,67 ja 4,01 ppm (kuvio 21 A). Vignonin ja Geyn mukaan [1998, Carbohydrate Research 307: 107-111] tällaiset signaalit vastaavat ksyloosiyksikön, joka on substituoitu 4-O-metyyliglukuronihapolla sidottuna kohtaan 0-2, H1 :tä, H3:a, H4:ääja H5:tä vastaavasti. Lisäksi protonispektrissä Lopez-uutetulle bagassille (Bag L) ja Hoije-uutetulle bagassille (Bag H) oli protoniresonanssit D-ksylopyranosyyliyksikköjen tähteistä, jotka oli substituoitu 4-O-metyyliglukuronihapolla kohdassa 0-2 ja asetyyliryhmällä kohdassa 0-3 siirtymissä δ 4,72, 3,76/3,75, 3,97/3,96 ppm, jotka vastaavat β-D-ksylopyrano-syyliyksikköjen H1 :tä, H2:ta ja H4:ää vastaavasti (kuvio 21 A).

Ksylaanin, joka oli uutettu E. grandiksesia Lopez-menetelmällä (EU-L) ja Hoije-menetelmällä (EU-H), protonispektreissä oli signaalit siirtymissä 4,48, 3,96/3,99, 3,63/3,68, ja 3,50/3,52 ppm, jotka syntyivät ksyloosiyksiköistä, jotka oli substituoitu 4-O-metyyliglukuronihapolla (kuvio 21C). Simsin ja Newmanin (2006) mukaan tällaiset kemialliset siirtymät voisivat olla peräisin D-ksylopyranosyyliyksikköjen tähteistä, jotka on substituoitu 4-O-metyyli-glukuronihapolla kohdassa 0-2 ja asetyyliryhmällä kohdassa 0-3. Samoissa spektreissä protonisignaalit, jotka ovat peräisin 4-O-metyyliglukuronihappo-tähteiden H1:stä ja H3:sta, olivat ilmeisiä siirtymissä δ 5,48/5,49/5,46 ppm, ja välillä 1,06 ja 1,54 ppm δ 5,16 ja 3,63 ppm (kuvio 21C). Bambun ja P. patulan protonispektreissä signaalit 4-O-metyyliglukuronihappotähteille olivat kohdassa 5,47/5,48 ppm (kuvio 21Aja C). Tällaiset signaalit voisivat ilmaantua siirtymissä δ 5,16 ja 3,63 ppm [Sun et ai., 2004, Carbohydrate Research 339: 291-300, Polym. Degrad, and Stability 84: 331-337, Carbohydrate Polymers 56: 195-204; Ebringerovå et al., 1998, Carbohydrate Polymers 37: 231-239], Uutetun ksylaanin protonispektreissä oli lisäksi ominaisia signaaleja, jotka olivat peräisin C-2-kytketystä arabinoosista ksyloosiyksikköihin [Höije et ai., 2005, Carbohydr. Polym. 61: 266-275; Ebringerovå et ai., 1998, Carbohydrate Polymers 37: 231 — 239], Protonispektreissä Bag H:Ile ja Bag L:Ile C2-kytketty arabinoosi tunnistettiin siirtymissä δ 5,58, 5,60, 4,29/4,30 ppm (kuvio 21 Aja C). Arabinoosin läsnäolo bambun ja P. patulan ksylaanin protonispektreissä oli yhdenmukaista Ebringerovän et ai. (1998) ja Vignonin ja Geyn, (1998) kanssa tunnistettuna muun muassa siirtymissä δ 5,58/5,59 ppm ja 5,47/5,48 ppm, vastaavasti (kuviot 22A ja C). Arabinoosisignaalit olivat läsnä EU-L:n ja EU-H:n spektreissä siirtymässä δ välillä 3,83 ja 3,85 ppm (kuvio 21C), kun taas 0-2 -kytkettyjen asetyyliryhmien läsnäolo, joka perustui julkaisuihin Shao et ai. [2008, Wood Science Technology 42: 439-451]; Höije et ai.(2005) Sun et ai. (2004); Ebringerovä et ai. (1998); Vignon ja Gey (1998), edellä, tunnistettiin siirtymässä δ 4-2,4 ppm (kuviot 20-22). Lisäksi leveät signaalit, jotka liittyivät aromaattisiin tai fenolisiin yhdisteisiin, jotka olivat peräisin ligniinijäännöksistä (Höije et ai., 2005 edellä; Xu et ai., 2006, Carbohydrate Research ja Oliveira et ai., 2008, Chemical composition and lignin structural features of banana plant leaf sheath and rachis. Teoksessa Hu, T.Q. (toim.). Luku 10: 171-188] olivat välissä δ 6,5 ja 7,9 ppm uutetun ksylaanin protonispektreissä (kuviot 21 ja 22).

Ominaiset hiiliresonanssit (1—>4) -sidottujen β-D-ksylopyranosyyli-tähteiden viidestä hiilestä välillä δ 103 ja 62 ppm heijastuivat uutettujen ksylaanifraktioiden 13C NMR -spektreissä (kuviot 21 ja 22). E. grandiksen ksylaanifraktioiden hiilispektreissä resonanssi, joka oli peräisin ksyloosiyksikköjen C1:stä, joissa oli C2-kytketyt arabinoosiryhmät, ilmaantui siirtymässä δ * 102,33 ppm, kun taas vastaavat arabinofuranosyylitähteiden C1:stä, C2:sta, C3:sta, C4:stäja C5:stä olivat siirtymissä δ «108, 81,7, 78, 85,5 ja 62 ppm (kuvio 21D). Spektreissä arabinoosiin liittyvät hiilisignaalit EU H:ssa ja EU L:ssä nähtiin siirtymässä δ 61,81/61,59 ppm (kuvio 21D). Bag L:ssä ja Bag H:ssa arabinoosisignaalit, jotka tunnistettiin Vignonin ja Geyn perusteella (1998) edellä, olivat siirtymässä δ 112,50/ 111,56 ja 89,31 ppm, jotka vastaavat C-2 -kytkettyjen arabinoositähteiden C1:tä ja C2:ta vastaavasti (kuvio 21B). C1-, C2, C4-resonanssit, jotka kuuluvat arabinofuranosyylitähteille monosubstituoiduille ksyloosiyksiköille kohdassa 0-3 ((Ebringerovä et ai., 1998, edellä), olivat läsnä sekä bambun että P. patulan 13C NMR -spektreissä siirtymissä δ 108,60/108,33 ppm, 81,71/81,42 ppm, 85,72/85,43 ppm vastaavasti (kuvio 22B ja D). 4-0-metyyliglukuronihappotähteiden läsnäolo uutetuissa ksylaanifraktiossa oli ilmeistä ominaisista hiilisignaaleista, jotka olivat peräisin C1:stä, C4:stä, C6:sta ja C5:stä siirtymässä δ välillä 97 ja 100 ppm, 83 ja 84 ppm, 179-172 ppm, sekä 59 ja 61 ppm, vastaavasti (Habibi ja Vignon, 2005, Carbohydrate Research 340: 1431-1436; Xu et ai., 2000, edellä; Ebringerovä et ai., 1998, edellä) (kuviot 21 ja 22). Asetyyli-, fenolisten ja aromaattisten ryhmien, jotka syntyivät ligniiniyhdisteistä, ja heksoosisokerien läsnäolo tunnistettiin uutettujen ksylaanifraktioiden 13C NMR -spektreissä. Lisäksi asetyyliryhmät kaikissa ksylaanifraktioissa tunnistettiin välillä δ 21-24 ppm (kuviot 21 ja 22). Kuitenkin asetyylisignaalien puuttuminen oli ilmeistä koivun ksylaanin (kuvio 20 B) ja H202-valkaistun bagassin (Bag B) (kuvio 20D) 13C NMR -spektreissä.

Metoksyyliryhmät, jotka merkitsevät ligniiniyhdisteiden läsnäoloa [Ebringerovä et ai., 1998 edellä, Sun et ai., 2004, edellä, Xu et ai., 2006 edellä; Maunu, 2008, 13C CPMAS NMR Studies of wood, cellulose fibers, and derivatives. Teoksessa Hu, T.Q. (toim)]; tunnistettiin 13C NMR -spektreissä siirtymässä δ 56,62/56,58 ppm (kuviot 21 ja 22). Ligniiniyhdisteitä, erityisesti niitä, jotka olivat kytkettyjä arabinosyylisivuketjuihin ferulihapposilloilla, heijastivat hiilisignaalit siirtymissä δ 140-160 ppm ja 116,6-117,08 ppm (kuviot 21 ja 22). Muita ligniiniyhdisteitä, jotka liittyivät feruli- tai p-kumarihapporyhmiin ja -CH3-:een Ar-COCH3:ssa (Maunu, 2002, Progress in Nuclear Magnetic Response Spectroscopy 40: 151 — 174; Sun et al. 2004, edellä) nähtiin siirtymässä δ 26-49 ppm siirtymässä δ 115,38 ja δ 17,55/17,69 ppm Bag L- (kuvio 21B spektri 1) bambu- ja P. patula -ksylaanifraktioissa (kuviot 22B ja D). Heksoosisokerien, kuten galaktoosin tai glukoosin läsnäolo [Sun et ai., 2004, edellä] oli ilmeistä 13C NMR -spektreissä, erityisesti EU H:n ja EU L:n spektrissä siirtymässä δ välillä 69 ja 71 ppm (kuvio 21B).

Uutettujen ksylaanifraktioiden FTIR-spektreissä oli ominaisia juovia ksylaanitähteille, jotka sisälsivät β-glykosidisidoksia heijastuen kohdassa « 897 cm-1 (kuvio 23). Kuitenkin tällainen signaali puuttui uutetun ksylaanin FTIR-spektreistä P. patulasta. Lisäksi uutetun ksylaanin spektreissä oli signaaleja juova-alueella välillä 1600-1200 cm'1 (kuvio 23), mikä Fengelin ja Wegenerin mukaan [1989, Wood Chemistry, ultrastucture, reactions. Walter de Gruyter, Berliini, Saksa] on alue, joka liittyy aromaattisiin yhdisteisiin, jotka ovat peräisin ligniinifraktioista. Juovat, jotka syntyivät syringyylirenkaan hengityksestä Cai--OCH3-, ja metoksyyliryhmien kanssa ligniinissä heijastuivat kohdissa 1329 cm'1 ja 1591-1595, sekä 1460-1461 cm'1 E. grandiksen ja bambun spektreissä (kuvio 23). Bagassin ksylaanifraktiot, Bag H ja Bag L sisälsivät signaaleja, joilla oli vaihtelevat intensiteetit aallonpituusalueella 1600 -1200 cm'1 ja spektri Bag L:Ile heijasti suhteellisen voimakasintensiteettistä juovaa C-H-venymisvibraa-tioille kohdassa 2919 cm'1 (kuvio 23). FTIR-spektrissä EU L:Ile oli kaksi intensiivistä signaalia, jotka liittyivät ligniiniyhdisteisiin, kohdissa 1591 ja 1379 cm'1, kun taas EU H -spektrissä nähtiin monia juovia, jotka olivat vähemmän intensiivisiä, alueella 1600-1200 cm'1, erityisesti 1595, 1461 ja 1329 (kuvio 23). Säädelty sivuketjujen entsymaattinen poisto lignoselluloosaraaka-aineis-ta

Puhdistettu a -glucuronidaasi (a-glu) Schizophyllum commune sta poisti 1,2 mg g-1 4-0-MeglCA:ta (1,3 % käytettävästä uronihaposta) koivun ksylaanista, kun taas noin 1,6 mg g-1 4-O-MeglCA (2 % käytettävistä uronihapoista) vapautui BH-ksylaanifraktioista (kuvio 24). 4-0-MeglCA:n osuus, joka poistui Eucalyptus grandiksen ksylaanista, joka oli uutettu Hoije-menetelmällä (EH), ja Eucalyptus grandiksen ksylaanigeelistä (ES), oli noin 1,3 mg g substraattia-1 (kuvio 24). Pienin 4-0-MeglCA:n poisto a-glu:Ma oli < 0,6 mg g substraattia-1 H202-valkaistusta bagassista (BB) (kuvio 24).

Optimiolosuhteiden määritys sivuketjujen poistamiseksi

Samalla tavalla vastepintakuvaajat glukuronihapon (4-O-MeglcA) poistamiseksi koivun ksylaanista a-glu:Ma heijastivat sekä lineaarisia että kvadraattisia suhteita hydrolyysiajan, lämpötilan ja a-glu:n ksylaanispesifisen annoksen kanssa. Maksimissaan 350 ug g-1 4-0-MeglcA:n substraattia poistui koivusta a-glu:Ma ksylaanispesifisellä annoksella välillä 16500-18000 nkat g substraattia-1, kun hydrolyysi suoritettiin kestoina välillä 9-10,2 h lämpötiloissa välillä 33,5-42 °C (kuvio 25 A-C).

Hydrolyysiparametreilla oli merkittäviä vaikutuksia 4-0-MeglcA:n poistoon koivun ksylaanista a-glu:Ma ja ne olivat koon alenemisessa, lineaarista vaikutuksista a-glu:n ksylaanispesifisestä annoksesta [a-glu, nKat/g (L)], lämpötilasta [Temp (L)], ja lämpötilan kvadraattisesta vaikutuksesta [Temp (Q)] (kuvio 26, Pareto-kuvaaja). Ainoa merkittävä vuorovaikutuksen vaikutus 4-0-MeglcA:n poistoon koivun ksylaanista a-glu:Ma oli hydrolyysiajan lineaarisesta vaikutuksesta ja lämpötilan kvadraattisesta vaikutuksesta [lämpötila (Q) ajan (L) suhteen] (kuvio 26, Pareto-kuvaaja). Optimaaliset asetusarvot 4-0-MeglcA:n a-glu: Ma poistolle olivat välillä 9 h ja 10,2 h, 33,5 ja 42 °C, sekä 16500-18000 nKat g substraattia-1. Toisen asteen polynomimallissa olevan muuttujan regressiokertoimet sovitettuna vastepintakuvaajiin 4-0-MeglcA:n poistolle ajan, lämpötilan ja entsyymiannoksen funktiona tuotti regressiokertoimen R2 0,90 (R2 sovitettu = 0,81) (kuvio 27).

Sekvenssilistaus

<110> STELLENBOSCH UNIVERSITY <120> AN ENZYME WITH ALPHA-GLUCURONIDASE ACTIVITY <13 0> P1928PC00 <160> 2 <170> Patentin version 3.3 <210> 1 <211> 997

<212> PRT <213> Pichia stipitis <4 0 0> 1

Met Leu Phe Ser Tyr Phe Pro Ala Leu Val Ala Leu Cys Ser Thr Val 15 10 15

Ser Ala Leu Gly Gly Leu Gin Asn lie Val Phe Lys Asn Ser Lys Asp 20 25 30

Asp Leu Gin Leu Ala Ala His Lys Lys Ser Ala Thr Leu Phe Leu Asp 35 40 45

Thr Glu Asp Trp Pro Gly Val Val Arg Ala Gly Leu Asp Leu Ser Asp 50 " 55 60

Asp Phe Lys Lys Val Thr Gly Glu Ala Leu Pro Val Val Asn Phe Thr 65 70 75 80

Gly Ser Gly lie Cys Thr Lys Val His Gly Lys Val Glu Ser Ala lie 85 90 95 lie lie Gly Thr Val Gly Asn Ser Ser lie lie Asp Thr Leu Val Ser 100 105 110

Ala Lys Lys Leu Asp Val Ser Glu lie Glu Gly Lys Trp Glu Ser Tyr 115 120 125

Val Met Lys Val lie Glu Asn Pro Ala Pro Cys lie Ser Ser Ala Leu 130 135 140

Val lie Ala Gly Ser Asp Lys Arg Gly Ser lie Phe Gly Ala Tyr Asp 145 150 155 160 lie Ser Glu Gin lie Gly Val Ser Pro Trp Tyr Trp Phe Ala Asp Val 165 170 175

Val Pro Ala Thr His Ser Glu lie Tyr Val Ser Lys Ser lie Val Lys 180 185 190

Val Gin Gly Glu Pro Ser Val Lys Tyr Arg Gly lie Phe Leu Asn Asp 195 200 205

Glu Gin Pro Ala Leu Ala Ala Trp Val Ala Glu Phe Phe Pro Glu Gly 210 215 220

Lys Tyr Asn Ser Tyr Phe Val His Gin Phe Tyr Val Lys Leu Phe Glu 225 230 235 240

Leu Leu Leu Arg Met Arg Ala Asn Phe Leu Trp Pro Ala Met Trp Ala 245 250 255

Ser Met Phe Gly Glu Asp Asp Pro Glu Asn Gin Tyr Trp Ala Asp Tyr 260 265 270

Tyr Gly lie Val Met Ser Thr Ser His Thr Glu Pro Leu Met Arg Ala 275 280 285

Thr Asn Glu Trp Thr Thr Phe Gly Asn Gly Ser Trp Asp Tyr Ser Thr 290 295 300

Asn Lys Asp Asn lie Val Glu Phe Trp Lys Glu Gly lie Ala Arg Ser 305 " 310 315 320

Lys Pro Tyr Glu Asn Met Trp Thr Thr Gly Met Arg Gly Phe Gly Asp 325 330 335

Thr Pro lie Thr Gly Gly Val Glu lie Ser Leu Leu Glu Asp Val lie 340 345 350

Lys Thr Gin Arg Glu Leu Leu Thr Glu Tyr Phe Asn Asn Thr Asp lie 355 360 365

Thr Asp lie Pro Gin Val Trp Cys Leu Tyr Lys Glu Val Gin Ala Tyr 370 375 380

Phe Gin Glu Gly Met Gin Val Pro Glu Asp lie Thr Leu Leu Trp Val 385 390 395 400

Asp Asp Asn Trp Gly Asn Asn Arg Arg Leu Pro Leu Ala Asn Glu Thr 405 410 415

Asp Arg Ala Gly Gly Ala Gly Val Tyr Tyr His Phe Asp Tyr Val Gly 420 425 430

Ser Pro Val Asp Phe Lys Trp lie Asn Thr Val Ser Leu Glu Lys Thr 435 440 445

Trp Glu Gin Met His Leu Ala Lys Gin Lys Gin Ala Asp Gin lie Trp 450 455 460

Val Val Asn Val Gly Asp Met Lys Pro Leu Glu lie Pro lie Glu Tyr 465 470 475 480

Phe lie Ser Leu Gly Tyr Asp Phe Asp Thr Trp Gly Pro lie Asn Lys 485 490 495

Val Met Thr Trp Ala Thr Ala Trp Ala Gin Arg Glu Phe Gly Ala Tyr 500 505 510

Leu Lys Glu Asp Asp Val Lys Glu Val Ala Asp Ile Ile Asp Leu Tyr 515 520 525

Gly Phe Tyr Ala Asn Arg Lys Lys Tyr Glu Ala Leu Asn Thr Thr Thr 530 535 540

Phe His Leu Tyr Asn Tyr Asn Glu Ala Glu Thr Val Leu Ser Glu Trp 545 550 555 560

Ala Asp Leu Ala Asp Arg Ala Trp Ala Val Tyr Lys Lys Leu Pro Lys 565 570 575

Asn Val Gin Pro Ser Phe Phe Gin Leu Val Leu His Pro Ala Val Ala 580 585 590

Gly Tyr Thr Val Tyr Asp Ile Leu Ile Ser Ala Gly Lys Asn Asn Leu 595 600 605

Tyr Ala Glu Gin Arg Arg Asn Gin Ala Asn Ala Leu Ser Thr His Val 610 615 620

Leu Asp Arg Phe Gin Tyr Asp Asn Thr Trp Lys Gly Glu Tyr Asp Ser 625 630 635 640

Leu Leu Gly Gly Lys Trp Lys His Met Met Asp Gin Thr His Leu Gly 645 650 655

Tyr Phe Tyr Trp Gin Gin Pro Met Arg Asn Vai Ala Pro Pro Leu Ala 660 665 670

Tyr Vai Gin Leu Glu Glu Asn Ser Leu Ala Gly Ser Leu Gly Vai Thr 675 680 685

Vai Glu Gin Ser Arg Gly Ser Vai Pro Gly Asp Asp Ala Tyr Asn Ala 690 695 700

Vai Ala Tyr Ser Asn Asn Thr Leu Vai Leu Pro Thr Leu Asp Pro Tyr 705 710 715 720

Thr Asp Ser Arg His Ile Thr Ile Phe Asn Lys Gly Ile Glu Asp Phe 725 730 735

Tyr Phe Glu Vai Ser Pro Tyr Ala Asp Tyr Vai Lys Vai Asn Pro Ser 740 745 750

Ser Gly Ser Val Ser Ala Thr Asn Asn Ser Ile Trp Asn Ser Val Asp 755 760 765

Val Glu Val Thr Val Asp Trp Asp Gin Ala Pro Glu Gly Tyr Asn Ile 770 775 780

Val Phe Met Asn Ile Thr Ser Asn Thr Thr Tyr Glu Phe Phe Gly Met 785 790 795 800

Pro Thr Val Asn Leu Pro Ile Asn Lys Thr Gin Ala Pro Asp Asp Phe 805 810 815

Lys Gly Phe Val Glu Thr Asn Gin His Ile Ser Ile Glu Ala Glu His 820 825 830

Phe Ser Asn Asn Gin Ser Thr Asn Asp Thr Tyr Tyr Val Thr Ile Asp 835 840 845

Arg Tyr Gly Arg Thr Leu Ser Gly Val Thr Leu Phe Pro Val Thr Ala 850 855 860

Asp Ser Gin Glu Ala Thr Glu Asp Tyr Ser Tyr Leu Glu Tyr Asn Leu 865 870 875 880

Tyr Ser Phe Ser Ala Pro Gin Tyr Gly Ser Asn Ile Thr Val Tyr Thr 885 890 895

Gly Ser Ser Leu Asn Ile Asp Pro Ser Arg Pro Leu Lys Tyr Ala Ile 900 905 910

Ala Ile Asp Asp Gin Glu Pro Gin Vai Vai Gin Ile Vai Vai Asp Pro 915 920 925

Thr Asp Pro Thr Ala Met Pro Ala His Trp Glu Asp Ala Ala Ser Asp 930 935 940

Gly Vai Trp Ile His Asn Thr Thr His Thr Phe Asp Ala Gly Glu His 945 950 955 960

Thr Leu Lys Leu Trp Ala Leu Glu Pro Ala Vai Vai Phe Glu Lys Vai 965 970 975

Vai Vai Asp Phe Gly Gly Vai Vai Pro Ser Phe Leu Gly Pro Pro Glu 980 985 990

Thr Tyr Ile Lys Lys 995 <210> 2 <211> 2994

<212> DNA <213> Pichia stipitis <4 0 0> 2 atgttgtttt catacttccc agcgttggtt gctctttgca gcaccgttag cgcattgggt 60 gggttgcaaa atattgtgtt caaaaatctg aaagacgatt tgcaattggc tgcacacaaa 120 aagtcggcta cgttattctt ggatactgaa gactggccag gtgttgtcag agctggtttg 180 gacttaagtg atgatttcaa gaaagtcact ggtgaagcct tgccagttgt caattttact 240 ggtagtggaa tttgtactaa agtacatggt aaggttgaat ctgcaattat tattggtact 300 gttggcaact cttcaattat cgatacatta gtttctgcaa agaagttaga tgtcagtgaa 360 attgaaggca agtgggaatc ttatgtcatg aaggttattg agaatccagc accatgtatc 420 agtagtgctt tggtaattgc tggaagtgac aagagaggtt caatttttgg tgcctatgat 480 atttctgaac aaatcggtgt ctctccatgg tactggttcg ccgacgtcgt gccagctact 540 catagtgaaa tctatgtttc caagtcaatc gtaaaggtcc aaggagagcc cagtgttaaa 600 tacagaggta ttttccttaa cgatgaacaa ccagctttgg cagcttgggt tgccgaattc 660 ttcccagaag gaaaatacaa ctcttacttc gtccaccaat tctacgtgaa gttattcgaa 720 ttgttgctca gaatgagagc caacttcttg tggcccgcta tgtgggccag tatgtttgga 780 gaggatgatc ccgaaaacca gtactgggct gactactatg gtattgtcat gtccacatcc 840 cacactgagc cacttatgag agccactaat gagtggacta ctttcggtaa tggttcttgg 900 gattacagta ctaacaaaga taacatcgtt gaattctgga aagaaggtat cgccagaagc 960 aagccatatg aaaacatgtg gacaactggt atgagaggat tcggagacac tcctatcact 1020 ggtggtgttg aaatcagttt acttgaagac gtcatcaaga ctcaaagaga acttttaact 1080 gagtacttta acaataccga tatcactgat atcccacaag tttggtgttt gtataaggaa 1140 gttcaagcct acttccaaga aggtatgcaa gttcctgaag acattacttt gttatgggtg 1200 gatgataact ggggaaacaa cagaagattg ccccttgcta acgaaacaga cagagctggt 1260 ggtgctggtg tttactatca ttttgactac gttggtagtc cagttgattt caagtggatt 1320 aacactgttt ctttggaaaa gacttgggaa cagatgcatt tggcaaaaca aaaacaagct 1380 gaccagatct gggttgttaa cgttggtgac atgaagcctt tagaaattcc aattgaatac 1440 ttcatttctt taggttatga ctttgataca tggggaccaa ttaacaaggt catgacttgg 1500 gctaccgcat gggctcaaag agaattcgga gcatacctta aggaagacga tgtcaaggaa 1560 gttgctgaca ttattgatct ttacggtttc tatgcaaaca gaaagaagta cgaagcatta 1620 aacaccacca catttcattt atacaactac aacgaagccg aaaccgtgct tagtgaatgg 1680 gcagacttgg ctgacagagc atgggctgtt tacaaaaaat tgccaaagaa tgttcagcca 1740 tcatttttcc aattggttct ccatcctgct gttgctggtt acaccgttta cgacattttg 1800 atttctgctg gtaagaacaa cttgtatgct gaacaaagaa gaaatcaagc taatgcatta 1860 tccactcatg tacttgacag attccaatat gacaacacct ggaaaggtga atatgactcc 1920 ttgcttggtg gaaaatggaa gcatatgatg gatcaaactc acttgggcta cttctactgg 1980 caacagccaa tgagaaatgt tgctcctcca cttgcatatg ttcaacttga agaaaactca 2040 ttagctggtt ctttgggtgt cactgtagaa caatccagag gatctgttcc aggtgatgat 2100 gcttataatg ctgttgcata cagtaacaat actttggtat tgccaacttt agatccttac 2160 actgacagta gacacattac tattttcaac aaaggtattg aagatttcta ctttgaggtt 2220 tctccttatg ctgattacgt taaggttaat ccctcgtcag gatctgtttc tgcaacaaac 2280 aacagtatct ggaactcggt tgatgttgaa gtcacggtag actgggacca ggccccagaa 2340 ggatacaata tcgtgttcat gaatatcact tccaatacca cttacgaatt ctttggtatg 2400 ccaactgtca atttgccaat caacaagact caagcaccag atgatttcaa gggttttgtg 2460 gagactaacc aacacatctc catcgaagca gaacatttct ctaacaacca atctacaaat 2520 gacacatact atgttacaat tgacagatat ggaagaacct tgtctggtgt cactttgttc 2580 cccgtcactg ctgactccca agaagcaacc gaagactatt cgtacttgga atacaacttg 2640 tacagtttta gtgcaccaca atatggatct aacattactg tttacactgg ttcatccttg 2700 aacattgatc catctcgtcc tttgaagtat gccattgcca tcgacgatca agaacctcaa 2760 gtagttcaaa ttgttgttga tccaactgac cctactgcca tgcctgccca ttgggaagac 2820 gctgcaagtg acggtgtatg gattcataac actacccata cttttgatgc tggtgaacat 2880 accttgaaat tatgggcatt ggaaccagca gttgtttttg aaaaagttgt tgtcgacttt 2940 ggtggtgttg ttccttcgtt cttgggacca ccagaaactt acatcaaaaa gtag 2994

Claims (6)

1. Menetelmä glukuronoksylaanin hajottamiseksi, jolloin menetelmä käsittää glukuronoksylaanin saattamisen yhteen eristetyn polypeptidin kanssa, jolla on aminohapposekvenssi, joka on vähintään 75 % identtinen sekvenssin nro 1 kanssa, jolloin polypeptidillä on a-glukuronidaasiaktiivisuus ja se voi hajottaa glukuronoksylaanimolekyylin hydrolysoimalla glykosidisidoksen MeGIcA-tähteen ja terminaalisen ksylopyranosyylitähteen välissä ja MeGIcA-tähteen ja ei-terminaalisen ksylopyranosyylitähteen välissä.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jolloin polypeptidillä on aminohapposekvenssi, joka on vähintään 85 % vähintään 95 % tai 100 % identtinen sekvenssille nro 1.

3. Jommankumman patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, jolloin polypeptidiä koodaa polynukleotidi, jolla on nukleotidisekvenssi, joka on vähintään 75 %, vähintään 85 %, vähintään 95 % tai 100 % identtinen nukleotidisekvenssille nro 2.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, jolloin polypeptidi tai polynukleotidi on eristetty mikrobista, joka valitaan ryhmästä, johon sisältyvät Pichia stipitis, Schizophyllum commune, Aspergillus clavatus, Neosartorya fischeri, Aspergillus fumigatus, Aspergillus terreus, Aspergillus oryzae, Sclerotinia sclerotiorum, Botryotinia fuckeliana, Pyrenophora tritici-repentis, Neurospora orassa, Gibberella zeae, Podospora anserina, Coprinopsis cinerea okayama, Magnaporthe grisea, Fusarium sporotrichioides, Cryptococcus neoformans var. neoformans, Cellvibrio japonicus, Saccharophagus degradans, Opitutus terrae, Phaeosphaeria nodorum, Bacteroides ovatus ja Streptomyces pristinaespiralis.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, jolloin polypeptidi tai polynukleotidi on eristetty Pichia stipitis CBS 6054:sta.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, jolloin glukuronoksylaani sisältää 4-O-metyyliglukuronihappon (MeGIcA) sivuketjuja. Patentkrav