BRPI0621874A2 - construção de composições de celulase altamente eficazes para a hidrólise enzimática de celulose - Google Patents

Abstract

CONSTRUçãO DE COMPOSIçõES DE CELULASE ALTAMENTE EFICAZES PARA A HIDRóLISE ENZIMáTICA DE CELULOSE. Esta invenção fornece novas composições enzimáticas usando enzimas de C. Iucknowense recém identificadas e isoladas, incluindo CBH Ib, CBH Ilb, EG II, EG VI, <225>- glicosidase, e xilanase II em combinação com as enzimas CBH Ia, CBH lla (previamente descrita como Endo 43), e EG V previamente identificadas. Estas composições enzimáticas demonstram uma capacidade extremamente alta para converter biomassa lignocelulósica (por exemplo, Avicel, algodão, madeira da espécie Douglas fir pré-tratada por organosolvente) em glicose. CBH la e IIb, as quais têm um módulo de ligação de celulose (CBM) exibiram um sinergismo considerável com três endoglicanases principais (EG II, EG V, EG VI) provenientes do mesmo fungo na hidrólise de algodão, assim como uma forte sinergia entre si. As composições enzimáticas são eficazes na hidrólise da biomassa lignocelulósica.

Description

"CONSTRUÇÃO DE COMPOSIÇÕES DE CELULASE ALTAMENTE EFICAZES PARA A HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE CELULOSE"

Este pedido é uma prorrogação parcial do Pedido de Patente U.S. 10/394.568, de- positado em 21 de Março de 2003, o qual reivindica o benefício do Pedido de Patente U.S.

09/548.938 (agora Patente US 6.573.086), depositado em 13 de Abril de 2000, o qual é uma prorrogação parcial do pedido internacional PCT/NL99/00618, depositado em 6 de Outubro de 1999, o qual é uma prorrogação parcial do pedido internacional PCT/EP98/06496, depo- sitado em 6 de Outubro de 1998. Este pedido também é um pedido de prorrogação parcial do Pedido de Patente U.S. 09/284.152, depositado em 8 de Abril de 1999 o qual é uma pror- rogação parcial de 08/731.170 depositado em 10 de Outubro de 1996. Todos os pedidos anteriores aos quais a prioridade é reivindicada são incorporados integralmente neste como referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se a composições e métodos para produzir bioenergia ou ou- tros produtos com valor agregado a partir de biomassa lignocelulósica ou materiais celulósi- cos. Em particular, a invenção fornece composições enzimáticas capazes de converter uma variedade de substratos celulósicos ou biomassa lignocelulósica em um açúcar fermentável. A invenção também fornece métodos para o uso de tais composições enzimáticas.

INTRODUÇÃO

A bioconversão de biomassa lignocelulósica renovável para um açúcar fermentável que é subseqüentemente fermentado para produzir álcool (por exemplo, etanol) como uma alternativa para combustíveis líquidos, tem atraído uma atenção intensiva de pesquisadores desde 1970, quando eclodiu a crise do petróleo por causa da diminuição da produção de petróleo pela OPEC (Bungay H.R., "Energy: the biomass options". NY: Wiley; 1981; Olsson L, Hahn-Hagerdal B. "Fermentation of Iignocellulosic hydrolysates for ethanol production", Enzyme Microb Technol 1996;18:312-31; Zaldivar J, Nielsen J, Olsson L. "Fuel ethanol pro- duction from lignocellulose: a challenge for metabolic engineering and process integration", Appl Microbiol Biotechnol 2001;56:17-34; Galbe M, Zacchi G., "A review of the production of ethanol from softwood", Appl Mierobiol Bioteehnol 2002; 59:618-28). O etanol foi amplamen- te usado como uma combinação de 10 % para a gasolina nos EUA ou como um combustível puro para veículos no Brasil nas últimas duas décadas. A importância do bioetanol combus- tível aumentará em paralelo com a alta de preços do petróleo e esgotamento gradual de suas fontes. Adicionalmente, açúcares fermentáveis estão sendo usados para produzir plás- ticos, polímeros e outros produtos com base biológica e, portanto, espera-se que sua indús- tria cresça substancialmente aumentando a demanda quanto a açúcares fermentáveis de baixo custo abundantes que possam ser usados como um estoque de abastecimento no lugar de matérias-primas com base no petróleo (por exemplo, vide artigo "The Rise Of In- dustrial Biotech" publicado na Forbes1 24 de Julho de 2006).

Os principais polissacarídeos compreendendo diferentes resíduos lignocelulósicos, que podem ser considerados como uma matéria-prima renovável potencial, são celulose e hemiceluloses (xilanas). A hidrólise enzimática destes polissacarídeos para açúcares solú- veis, por exemplo glicose, xilose, arabinose, galactose, manose, e outras hexoses e pento- ses ocorre sob a ação de diferentes enzimas que agem em conjunto. Endo-1,4-β-glicanases (EG) e exo-celobiohidrolases (CBH) catalisam a hidrólise de celulose insolúvel para celooli- gossacarídeos (celobiose como um produto principal), enquanto yS-glicosidases (BGL) con- vertem os oligossacarídeos para glicose. Xilanases junto com outras enzimas adicionais (exemplos não Iimitantes dos quais incluem σ-L-arabinofuranosidases, feruloil e acetilxilana esterases, glicuronidases, e (β-xilosidases) catalisam a hidrólise de hemiceluloses.

Não obstante o tipo de matéria-prima celulósica, o custo e eficiência hidrolítica de enzimas são fatores principais que restringem a comercialização dos processos de biocon- versão de biomassa. Os custos de produção de enzimas microbialmente produzidas estão intimamente associados com uma produtividade da cepa produtora de enzima e com a ativi- dade final produzida no caldo de fermentação. A eficiência hidrolítica de um complexo multi- enzimático no processo de sacarificação de Iignocelulose depende tanto das propriedades de enzimas individuais, das sinergias entre elas, quanto de sua razão no coquetel multien- zimático.

Chrysosporium Iucknowense é um fungo que é conhecido para produzir uma ampla variedade de celulases, hemicelulases, e possivelmente outras enzimas adicionais. C. Iuck- nowense também secreta pelo menos cinco endoglicanases diferentes, a EG Il (51 kDa, Cel5A) sendo a mais ativa. Além disso, cepas mutantes de C. Iucknowense (incluindo UV18- 25) foram desenvolvidas para produzir enzimas para tecido, polpa e papel, detergente e ou- tras aplicações, mas não para a sacarificação enzimática de celulose; estas cepas também podem ser usadas para uma produção de nível elevado de proteínas homólogas e heterólo- gas. As melhores cepas mutantes de C. Iucknowense secretam pelo menos 50 a 80 gl"1 de proteína extracelular em fermentações de baixa viscosidade. O genoma fúngico completo de C. lucknowense foi sequenciado em 2005 (vide http://WorldWideWeb.dyadic- group.com/wt/dyad/pr_1115654417), e presentemente a anotação do genoma está sendo realizada.

O complexo multienzimático de C. Iueknowense bruto demonstra resultados mode- rados na sacarificação da celulose, com apenas uma fração da celulose sendo convertida para glicose sob as condições testadas. Duas celobiohidrolases de C. lueknowense, perten- centes às famílias 7 e 6 de glicosídeo hidrolases: CBH Ia (Cel7A) e CBH Ila (Cel6A), foram previamente isoladas e estudadas. CBH Ia foi previamente referida como proteína CBH I, 70(60) kD na Patente US N- 6.573.086. CBH Ia vive no caldo de cultivo como uma enzima de tamanho natural (massa molecular observada de 65 kDa, dados SDS-PAGE), que con- siste de um domínio catalítico de núcleo e módulo de ligação de celulose (CBM) conectados por um Iigador de peptídeo flexível, e sua forma truncada (52 kDa), representando o domínio catalítico da enzima. CBH I (Cel7A) de C. Iucknowense parece ser levemente menos eficaz na hidrólise de celulose cristalina, porém mais termoestável do que a CBH I de T. reesei. CBH Ila foi previamente considerada ser uma endoglicanase e foi referida como Endo e EG6, 43 kD. Vide, por exemplo, Patente US Ne 6.573.086. CBH Ila (43 kDa) não tem CBM, isto é, sua molécula contém apenas o domínio catalítico.

Apesar da pesquisa constante nas últimas décadas para entender a degradação da biomassa lignocelulósica enzimática e produção de celulase, permanece desejável descobrir ou criar novas celulases e hemicelulases altamente ativas. Também seria altamente desejá- vel construir composições enzimáticas altamente eficazes capazes de realizar biodegrada- ção rápida e eficaz de materiais lignocelulósicos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção fornece várias enzimas recém identificadas e isoladas provenientes de C. lucknowense. As novas enzimas incluem duas novas celobiohidrolases (CBH Ib e llb, ou Cel7B e Cel6B), uma endoglicanase (EG VI), (não confundir com CBH lia, que foi previ- amente referida como EG 6) uma /?-glicosidase (BGL), e uma xilanase (Xyl II). A CBH Ilb tem uma alta atividade contra Avicel e algodão e exibiu um sinergismo considerável com outras celulases de C. lucknowense. Com o uso destas novas enzimas, esta invenção for- nece composições enzimáticas altamente eficazes para a hidrólise da celulose.

Um objetivo desta invenção é fornecer uma formulação enzimática que inclua pelo menos uma celobiohidrolase isolada obtida a partir de C. lucknowense. A celobiohidrolase isolada pode ser tanto CBH Ib quanto llb. A formulação enzimática pode opcionalmente con- ter uma endoglicanase e/ou uma β-glicosidase. Além disso, a formulação enzimática pode opcionalmente conter uma hemicelulase.

Um outro objetivo desta invenção é fornecer um método para produzir glicose a par- tir da celulose. O método inclui produzir uma formulação enzimática que contém pelo menos uma celobiohidrolase isolada obtida a partir de C. lucknowense, que pode ser CBH Ib ou llb. Opcionalmente, a formulação enzimática pode conter uma endoglicanase e/ou uma β- glicosidase. A formulação enzimática é aplicada à celulose para formar glicose.

Ainda um outro aspecto desta invenção é fornecer um método de produzir etanol. O método inclui fornecer uma formulação enzimática que contém pelo menos uma celobiohi- drolase isolada obtida a partir de C. lucknowense, que pode ser CBH Ib ou llb. A formulação enzimática opcionalmente pode conter uma endoglicanase e/ou uma β-glicosidase. Além disso, a formulação enzimática pode opcionalmente conter uma hemicelulase. O método ainda inclui aplicar a formulação enzimática à celulose para produzir glicose e subsequen- temente fermentar a glicose para produzir etanol.

Esta invenção também fornece um método de produzir energia a partir do etanol. O método inclui fornecer uma formulação enzimática que contém pelo menos uma celobiohi- drolase isolada obtida a partir de C. lucknowense, que pode ser CBH Ib ou Mb. A formulação enzimática opcionalmente pode conter uma endoglicanase e/ou uma B-glicosidase. Além disso, a formulação enzimática pode opcionalmente conter uma hemicelulase. O método ainda inclui aplicar a formulação enzimática à celulose para produzir glicose, fermentar a glicose para produzir etanol, e queimar o dito etanol para produzir energia.

Um outro aspecto desta invenção é fornecer uma cepa de Chrysosporium luckno- wense mutante capaz de expressar pelo menos uma celobiohidrolase e pelo menos uma endo-l,4-B-glicanase em níveis mais altos do que a cepa não mutante correspondente sob as mesmas condições. A celobiohidrolase é selecionada a partir do grupo que consiste de CBH Ia, CBH lla, CBH lb, e CBH llb; e a endo-1,4-B-glicanase é selecionada a partir do gru- po que consiste de EG II, EG V, e EG VI.

Ainda um outro aspecto desta invenção é fornecer proteínas que exibem pelo me- nos 65 % da identidade do aminoácido conforme determinado pelo algoritmo BLAST com as seqüências de aminoácido de CBH Ib, CBH Ilb, EG VI, BGL, e Xyl II de SEQ ID NOs. 2, 4, 16, 12, e 18, respectivamente, ou uma parte destas tendo pelo menos 20 aminoácidos con- tíguos. Esta invenção também considera as seqüências de ácido nucléico correspondentes que codificam uma tal proteína.

Um aspecto desta invenção fornece uma formulação enzimática compreendendo pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste de CBH lb, CBH Nb, EG II, EG VI, BGL, e Xyl II.

Um outro aspecto desta invenção fornece um método de produzir açúcares fermen- táveis a partir de material lignocelulósico. O método compreende (a) fornecer uma formula- ção enzimática compreendendo pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste de CBH lb, CBH llb, EG II, EG VI, BGL, e Xyl II; e (b) aplicar a formulação enzimá- tica ao material lignocelulósico para produzir açúcares fermentáveis.

A invenção também fornece um método de produzir um produto de fermentação ou um material de partida para um produto de fermentação a partir de um açúcar fermentável. Este método compreende (a) fornecer uma formulação enzimática, em que a formulação enzimática contém pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste de CBH lb, CBH llb, EG II, EG VI, BGL, e Xyl II; (b) aplicar a formulação enzimática ao material lignocelulósico para produzir um açúcar fermentável; e (c) fermentar o dito açúcar fermentá- vel para produzir um produto de fermentação.

Em um outro aspecto, a invenção fornece um método de produzir energia a partir de um açúcar fermentável. O método compreende (a) fornecer uma formulação enzimática, em que a formulação enzimática compreende pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste de CBH Ib1 CBH Ilb1 EG II, EG VI, BGL1 e Xyl II; (b) aplicar a formula- ção enzimática ao material lignocelulósico para produzir um açúcar fermentável; (c) fermen- tar o açúcar fermentável para produzir um produto de fermentação combustível; e (d) quei- mar o dito produto de fermentação combustível para produzir energia.

Um objetivo da invenção é fornecer uma cepa de Chrysosporium Iucknowense mu- tante capaz de expressar pelo menos uma celobiohidrolase e pelo menos uma endo-1,4-β- glicanase em níveis mais altos do que a cepa não mutante correspondente sob as mesmas condições. A celobiohidrolase é selecionada a partir do grupo que consiste de CBH Ia, CBH Ib1 CBH Ila e CBH llb; e a endo-1,4-β-glicanase é selecionada a partir do grupo que consiste de EG II, EG V, e EG VI.

A invenção também fornece uma proteína que exibe pelo menos 65 % da identida- de do aminoácido conforme determinado pelo algoritmo BLAST com as seqüências de ami- noácido de CBH lb, llb, EG VI, BGL, Xyl Il como definido neste relatório ou uma parte destas tendo pelo menos 20 aminoácidos contíguos.

Um outro aspecto desta invenção fornece uma seqüência de ácido nucléico tendo pelo menos 80 % de homologia com a seqüência de ácido nucléico que codifica CBH Ib, CBH llb, EG II, EG VI, BGL, ou Xyl II, como definido neste relatório.

A invenção também fornece um método para degradar um material lignocelulósico em açúcares fermentáveis. O método inclui contatar o material lignocelulósico com uma quantidade eficaz de um produto multienzimático derivado de um microorganismo, para pro- duzir pelo menos um açúcar fermentável. Pelo menos uma enzima no produto multienzimá- tico é selecionada a partir do grupo que consiste de CBH Ia, CBH lb, CBH lia, CBH llb, EG II, EG V, EG VI, BGL, e Xyl II.

Em um outro aspecto, a invenção fornece um microorganismo ou planta capaz de expressar uma ou mais de uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste de CBH Ia, CBH lb, CBH lia, CBH llb, EG II, EG V, EG VI, BGL, e Xyl II.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

FIG. 1: SDS/PAGE (A) e focalização isoelétrica (B) de celobiohidrolases purificadas provenientes de C. Iucknowense. Colunas: 1, marcadores com massas moleculares diferen- tes; 2 e 5, CBH Ib; 3 e 6, CBH llb; 4, marcadores com ρ/ diferente.

FIG. 2: Cinéticas de progresso da hidrólise de Avicel (5 mg ml-1) por celobiohidrola- ses purificadas (0,1 mg ml-1) na presença de BGL de A. japonicus purificada (0,5 U ml-1), 40 °C, pH 5,0.

FIG. 3: Sinergismo entre CBH Ilb e outras enzimas de C. Iucknowense purificadas durante a hidrólise da celulose de algodão (5 mg ml-1) na presença da BGL de A. japonicus purificada (0,5 U ml-1), 40 °C, pH 5,0. A concentração de CBH e EG foi de 0,15 e 0,05 mg ml- 1, respectivamente. Dados experimentais para os pares de enzimas são mostrados com símbolos vazios (curvas contínuas); as somas teóricas de concentrações de glicose obtidas sob a ação de enzimas individuais são mostradas com símbolos cheios (linhas pontilhadas). FIG. 4: Cinéticas de progresso da hidrólise do algodão (25 mg ml-1) por combinação #1 de enzimas de C. lucknowense purificadas e NCE L-600, uma preparação de celulase multienzimática de C. lucknowense comercial na proteína com carga de 0,5 mg ml-1, 50 °C, pH 5,0 (vide texto e Tabela 4 para detalhes).

FIG. 5: Cinéticas de progresso da hidrólise de Avicel (50 mg ml'1) por combinação #1 de enzimas de C. lucknowense purificadas e NCE-L1 uma preparação de celulase multi- enzimática de C. Iucknowense comercial na proteína com carga de 0,5 mg ml-1, 50 °C, pH 5,0 (vide texto e Tabela 4 para detalhes).

FIG. 6: Cinéticas de progresso da hidrólise de madeira da espécie Douglas fir pré tratada (50 mg ml"1) por combinação #1 de enzimas de C. lueknowense purificadas e NCE-L 600, um C. lueknowense comercial na proteína com carga de 0,5 mg ml"1, 50 °C, pH 5,0 (vi- de texto e Tabela 4 para detalhes).

FIG. 7: Cinéticas de progresso da hidrólise de madeira da espécie Douglas fir pré tratada (50 mg ml"1) por combinações diferentes de enzimas de C. lucknowense purificadas na proteína com carga de 0,5 mg ml"1, 50 °C, pH 5,0 (vide texto e Tabela 5 para detalhes).

FIG. 8: gene de cbh2 que codifica CBH IB.

FIG. 9: gene de cbh4 que codifica CBH.

FIG. 10: gene de cbhl que codifica CBH Ia

FIG. 11: gene de EG6 que codifica CBH lia

FIG. 12: gene de eg2 que codifica EG II

FIG. 13: gene de bgl 1 que codifica BGL

FIG. 14: gene de eg5 que codifica EGV

FIG. 15: gene de eg7 que codifica EG Vl

FIG. 16: gene de xyl2 que codifica Xyl II

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece métodos e composições para a conversão de biomas- sa da planta em açúcares fermentáveis que podem ser convertidos em produtos úteis. Os métodos incluem métodos para degradar material lignocelulósico usando misturas enzimáti- cas para liberar açúcares. As composições da invenção incluem combinações enzimáticas que decompõem lignocelulose. Como usado neste relatório, os termos "biomassa" ou "mate- rial lignocelulósico" incluem materiais contendo celulose e/ou hemicelulose. Geralmente, estes materiais também contêm xilana, lignina, proteína, e carboidratos, tais como amido e açúcar. Lignocelulose é geralmente encontrada, por exemplo, nos caules, folhas, cálices, cascas, e sabugos de plantas ou folhas, galhos, e madeira de árvores. O processo de con- verter um carboidrato complexo (tal como amido, celulose, ou hemicelulose) em açúcares fermentáveis também é referido neste relatório como "sacarificação." Açúcares fermentá- veis, como usado neste relatório, referem-se a açúcares simples, tais como glicose, xilose, arabinose, galactose, manose, ramnose, sacarose e frutose.

A biomassa pode incluir biomassa virgem e/ou biomassa não virgem tal como bio- massa agrícola, resíduos orgânicos comerciais, fragmentos de construção e demolição, re- síduos sólidos urbanos, papel usado e sobras orgânicas. Formas comuns de biomassa in- cluem árvores, arbustos e gramas, trigo, palha de trigo, bagaço de cana de açúcar, milho, palhas de milho, grão de milho incluindo fibra dos grãos, produtos e subprodutos provenien- tes da moagem dos grãos tais como milho, trigo e cevada (incluindo moagem úmida e moa- gem a seco) assim como resíduos sólidos urbanos, papel usado e sobras orgânicas. A bio- massa também pode ser, mas não é limitada a, material herbáceo, resíduos agrícolas, resí- duos florestais, resíduos sólidos urbanos, papel usado, e resíduos da fabricação de polpa e papel. "Biomassa agrícola" inclui galhos, matos, canas, milho e palhas de milho, safras e- nergéticas, florestas, frutos, flores, grãos, gramas, safras herbáceas, folhas, casca de árvo- re, acículas, lenhas, raízes, mudas, safras de madeira de curta rotação, arbustos, gramíneas do tipo switchgrass, árvores, vegetais, cascas de frutos, videiras, polpa de beterraba, trigui- lhos, cascas de aveia, e madeiras duras e moles (não incluindo madeiras com materiais de- letérios). Além disso, a biomassa agrícola inclui materiais de resíduos orgânicos gerados a partir de processos agrícolas incluindo atividades de agricultura e silvicultura, especifica- mente incluindo resíduos de madeira florestal. A biomassa agrícola pode ser qualquer um dos citados acima estabelecidos individualmente ou em qualquer combinação ou mistura dos mesmos.

Os açúcares fermentáveis podem ser convertidos em produtos de fermentação com valor agregado úteis, exemplos não limitantes dos quais incluem aminoácidos, vitaminas, produtos farmacêuticos, suplementos de ração animal, especialidades químicas, matérias- primas químicas, plásticos, solventes, combustíveis, ou outros polímeros orgânicos, ácido láctico, e etanol, incluindo etanol combustível. Produtos com valor agregado específicos que podem ser produzidos pelos métodos da invenção incluem, mas não são limitados a, bio- combustíveis (incluindo etanol e butanol); ácido láctico; plásticos; em especial produtos quí- micos; ácidos orgânicos, incluindo ácido cítrico, ácido succínico e ácido maléico; solventes; suplementos de ração animal; produtos farmacêuticos; vitaminas; aminoácidos, tais como lisina, metionina, triptofano, treonina, e ácido aspártico; enzimas industriais, tais como prote- ases, celulases, amilases, glicanases, lactases, lipases, liases, oxidoredutases, transferases e xilanases; e matérias-primas químicas.

Como usado neste relatório, um produto multienzimático pode ser obtido a partir de ou derivado de uma fonte microbiana, planta, ou outra fonte ou combinação das mesmas, e conterá enzimas capazes de degradar material lignocelulósico. Exemplos de enzimas com- preendendo os produtos multienzimáticos da invenção incluem celulases (tais como celobi- ohidrolases, endoglicanase, β-glicosidases, hemicelulases (tais como xilanases, incluindo endoxilanases, exoxilanase, e β-xilosidase), ligninases, amilases, σ-arabinofuranosidases, σ-glicuronidases, σ-glicuronidases, arabinases, glicuronidases, proteases, esterases (inclu- indo ácido ferúlico esterase e acetilxilana esterase), lipases, glicomananases, e xiloglicona- ses.

Em algumas modalidades, o produto multienzimático compreende uma hemicelula- se. Hemicelulose é um polímero complexo, e sua composição freqüentemente varia ampla- mente de organismo para organismo, e de um tipo de tecido para um outro. No geral, um componente principal de hemicelulose é xilose ligada a beta-1,4, um açúcar de cinco carbo- nos. Entretanto, esta xilose é freqüentemente ramificada como ligações beta-1,3, e pode ser substituída com ligações para arabinose, galactose, manose, ácido glicurônico, ou por este- rificação para ácido acético. Hemicelulose também pode conter glicana, que é um termo geral para açúcares de seis carbonos ligados à beta. Essas hemiceluloses incluem xiloglica- na, glicomanana, e galactomanana.

A composição, natureza de substituição, e grau de ramificação da hemicelulose é muito diferente em plantas dicotiledonêas (dicotiledôneos, isto é, planta cujas sementes têm dois cotilédones ou folhas seminais tais como feijões-de-lima, amendoins, amêndoas, ervi- lhas, feijões) em comparação às plantas monocotiledôneas (monocotiledôneos; isto é, plan- tas tendo um cotilédone ou folha seminal único tal como milho, trigo, arroz, gramas, cevada). Em dicotiledôneos, a hemicelulose é compreendida principalmente de xiloglicanas que são cadeias de glicose ligadas a 1,4-beta com cadeias laterais de xilosil ligadas a 1,6-beta. Em monocotiledôneos, incluindo a maioria das safras de grão, os principais componentes de hemicelulose são heteroxilanas. Estas são principalmente compreendidas de polímeros de cadeia principal de xilose ligada a 1,4-beta com ligações 1,3-beta para arabinose, galactose e manose assim como xilose modificada por ácidos acéticos ligados ao éster. Também pre- sentes estão beta-glicanas ramificadas compreendidas de cadeias de glicosil ligadas a 1,3- e 1,4-beta. Em monocotiledôneos, celulose, heteroxilanas e beta-glicanas estão presentes em quantidades aproximadamente iguais, cada uma compreendendo cerca de 15 a 25 % da matéria seca de paredes celulares.

Enzimas hemicelulósicas, isto é hemicelulases, incluem tanto enzimas exohidrolíti- cas quanto endohidrolíticas, tais como xilanase, 0-xilosidase e esterases, que clivam ativa- mente o material hemicelulósico através da hidrólise. Estas enzimas xilanase e esterase clivam as cadeias laterais de xilana e acetil da xilana e os xilo-oligomêros remanescentes são não substituídos e podem, dessa forma, ser hidrolisados apenas com Pxilosidase. Além disso, várias atividades secundárias menos conhecidas foram descobertas nas preparações enzimáticas que hidrolisam a hemicelulose. Embora o produto multienzimático possa conter muitos tipos de enzimas, misturas compreendendo enzimas que aumentam ou realçam a liberação de açúcar da biomassa são preferidas, incluindo hemicelulases. Em uma modali- dade, a hemicelulase é uma xilanase, uma arabinofuranosidase, uma acetil xilana esterase, uma glicuronidase, uma endo-galactanase, uma mananase, uma endo arabinase, uma exo arabinase, uma exo-galactanase, uma ácido ferúlico esterase, uma galactomananase, uma xilogliconase, ou misturas de qualquer uma destas. Em particular, as enzimas podem incluir glicoamilase, β-xilosidase e/ou β-glicosidase. As enzimas do produto multienzimático podem ser fornecidas por uma variedade de fontes. Em uma modalidade, as enzimas podem ser produzidas pelo crescimento de microorganismos ou plantas que produzem as enzimas na- turalmente ou em virtude de serem geneticamente modificados para expressarem a enzima ou enzimas. Em uma outra modalidade, pelo menos uma enzima do produto multienzimático está comercialmente disponível.

Uma modalidade da presente invenção refere-se a uma enzima isolada para catali- sar a conversão de material lignocelulósico em açúcares fermentáveis como descrito neste relatório, um homólogo da mesma, e/ou um fragmento da mesma. Também incluídas na invenção estão moléculas de ácido nucléico isoladas que codificam qualquer uma de tais proteínas, homólogos ou fragmentos das mesmas. De acordo com a presente invenção, uma proteína ou polipeptídeo isolado é uma proteína que foi removida de seu ambiente na- tural (isto é, que foi submetida à manipulação humana) e pode incluir, por exemplo, proteí- nas purificadas, proteínas parcialmente purificadas, proteínas recombinantemente produzi- das, e proteínas sinteticamente produzidas. Como tal, "isolada" não reflete a extensão a que a proteína foi purificada. De preferência, uma proteína isolada da presente invenção é pro- duzida recombinantemente. Um peptídeo isolado pode ser produzido sinteticamente (por exemplo, quimicamente, tal como por síntese de peptídeo) ou recombinantemente. Uma proteína isolada também pode ser fornecida como um produto de fermentação bruto, ou uma preparação de proteína que foi parcialmente purificada ou purificada (por exemplo, a partir de um microorganismo) usando procedimentos de purificação de proteína conhecidos na técnica. Além disso, e somente por via de exemplo, uma proteína referenciada como sendo derivada de, ou proveniente de um organismo particular, tal como uma celulase e/ou hemicelulase de "Chrysosporium lucknowense" refere-se a uma celulase e/ou hemicelulase (geralmente incluindo um homólogo de uma celulose e/ou hemicelulase que ocorre natural- mente) proveniente de um microorganismo Chrysosporium lucknowense, ou a uma celulase e/ou hemicelulase que foi de outro modo produzida a partir do conhecimento da estrutura (por exemplo, seqüência), e possivelmente da função, de uma celulase e/ ou hemicelulase que ocorre naturalmente proveniente de Chrysosporium lucknowense. Em outras palavras, referência geral a uma celulase e/ou hemicelulase de Chrysosporium lucknowense ou uma celulase e/ou hemicelulase derivada de Chrysosporium Iucknowense inclui qualquer celula- se e/ou hemicelulase que tem estrutura e função substancialmente similares a uma celulase e/ou hemicelulase que ocorre naturalmente proveniente de Chrysosporium Iucknowense ou que é um homólogo biologicamente ativo (isto é, tem atividade biológica) de uma celulase e/ou hemicelulase que ocorre naturalmente proveniente de Chrysosporium Iucknowense como descrito em detalhe neste relatório. Como tal, uma celulase e/ou hemicelulase de C- hrysosporium Iucknowense pode incluir proteínas purificadas, parcialmente purificadas, re- combinantes, mutantes/modificadas e sintéticas. A mesma descrição aplica-se para fazer referência a outras proteínas ou peptídeos descritos neste relatório e a outras fontes micro- bianas para tais proteínas ou peptídeos.

Uma modalidade da presente invenção refere-se a moléculas de ácido nucléico iso- ladas compreendendo, que consistem essencialmente de, ou que consistem de seqüências de ácido nucléico que codificam qualquer uma das enzimas descritas neste relatório, inclu- indo um homólogo ou fragmento de qualquer uma de tais enzimas, assim como as sequên- cias de ácido nucléico que são completamente complementares a estas. De acordo com a presente invenção, uma molécula de ácido nucléico isolada é uma molécula de ácido nucléi- co que foi removida de seu ambiente natural (isto é, que foi submetida à manipulação hu- mana), seu ambiente natural sendo o genoma ou cromossomo em que a molécula de ácido nucléico é encontrada na natureza. Como tal, "isolada" não necessariamente reflete a ex- tensão a que a molécula de ácido nucléico foi purificada, mas indica que a molécula não inclui um genoma total ou um cromossomo total em que a molécula de ácido nucléico é en- contrada na natureza. Uma molécula de ácido nucléico isolada pode incluir um gene. Uma molécula de ácido nucléico isolada que inclui um gene não é um fragmento de um cromos- somo que inclui tal gene, mas particularmente inclui a região de codificação e regiões regu- Iadoras associadas com o gene, mas nenhum dos genes adicionais que são naturalmente encontrados no mesmo cromossomo. Uma molécula de ácido nucléico isolada também po- de incluir uma seqüência de ácido nucléico especificada flanqueada por ácidos nucléicos adicionais (isto é, na extrmidade 5' e/ou a 3' da seqüência) que normalmente não flanquei- am a seqüência de ácido nucléico especificada na natureza (isto é, seqüências heterólogas). Molécula de ácido nucléico isolada pode incluir DNA, RNA (por exemplo, mRNA), ou deriva- dos tanto de DNA quanto de RNA (por exemplo, cDNA). De preferência, uma molécula de ácido nucléico isolada da presente invenção é produzida usando tecnologia do DNA recom- binante (por exemplo, reação em cadeia da polimerase (PCR) amplificação, clonagem) ou síntese química. Um homólogo de molécula de ácido nucléico pode ser produzido usando vários métodos conhecidos àqueles habilitados na técnica (vide, por exemplo, Sambrook et ai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press (1989)). Por exemplo, moléculas de ácido nucléico podem ser modificadas usando uma variedade de técnicas incluindo, mas não limitadas a, técnicas de mutagênese e técnicas de DNA recom- binante clássicas, tais como mutagênese sítio-dirigida, tratamento químico de uma molécula de ácido nucléico para induzir mutações, clivagem por enzima de restrição de um fragmento de ácido nucléico, ligação de fragmentos de ácido nucléico, amplificação por PCR e/ou mu- tagênese de regiões selecionadas de uma seqüência de ácido nucléico, síntese de misturas de oligonucleotídeo e ligação de grupos de mistura para "construir" uma mistura de molécu- las de ácido nucléico e combinações das mesmas. Homólogos de molécula de ácido nucléi- co podem ser selecionados a partir de uma mistura de ácidos nucléicos modificados por triagem para a função da proteína codificada pelo ácido nucléico e/ou por hibridização com um gene do tipo selvagem.

Uma outra modalidade da presente invenção inclui uma molécula de ácido nucléico recombinante compreendendo um vetor recombinante e uma seqüência de ácido nucléico que codifica proteína ou peptídeo tendo pelo menos uma atividade enzimática útil para cata- lisar a conversão de material lignocelulósico em açúcares fermentáveis. De acordo com a presente invenção, um vetor recombinante é uma molécula de ácido nucléico projetada (isto é, artificialmente produzida) que é usada como uma ferramenta para manipular uma se- qüência de ácido nucléico de escolha e para introduzir uma tal seqüência de ácido nucléico em uma célula hospedeira. O vetor recombinante é, portanto, adequado para o uso em clo- nagem, sequenciação, e/ou de outro modo manipular a seqüência de ácido nucléico de es- colha, tal como pela expressão e/ou liberação da seqüência de ácido nucléico de escolha em um célula hospedeira para formar uma célula recombinante. Um tal vetor tipicamente contém seqüências heterólogas de ácido nucléico, isto é, seqüências de ácido nucléico que não são naturalmente encontradas adjacentes à seqüência de ácido nucléico a ser clonada ou liberada, embora o vetor também possa conter seqüências de ácido nucléico reguladoras (por exemplo, promotoras, não traduzidas) que são naturalmente encontradas adjacentes às moléculas de ácido nucléico da presente invenção ou que são úteis para a expressão das moléculas de ácido nucléico da presente invenção (debatido em detalhe abaixo). O vetor pode ser tanto RNA quanto DNA, tanto procariótico quanto eucariótico, e tipicamente é um plasmídeo. O vetor pode ser mantido como um elemento extracromossômico (por exemplo, um plasmídeo) ou ele pode ser integrado no cromossomo de um organismo recombinante (por exemplo, um micróbio ou uma planta). O vetor total pode permanecer dentro de uma célula hospedeira, ou sob certas condições, o DNA de plasmídeo pode ser suprimido, dei- xando para trás a molécula de ácido nucléico da presente invenção. A molécula de ácido nucléico integrada pode estar sob controle de promotor cromossômico, sob controle de pro- motor natural ou plasmídeo, ou sob uma combinação de vários controles de promotor. Có- pias únicas ou múltiplas da molécula de ácido nucléico podem ser integradas no cromosso- mo. Um vetor recombinante da presente invenção pode conter pelo menos um marcador selecionável.

Tipicamente, uma molécula de ácido nucléico recombinante inclui pelo menos uma molécula de ácido nucléico da presente invenção operativamente ligada a uma ou mais se- qüências de controle de expressão. De acordo com a presente invenção, a frase "operati- vãmente ligada" refere-se à ligação de uma molécula de ácido nucléico a uma seqüência de controle de expressão (por exemplo, uma seqüência de controle da transcrição e/ou uma seqüência de controle da tradução) de uma maneira tal que a molécula possa ser expressa- da quando transfectada (isto é, transformada, transferida, transfectada, conjugada ou con- duzida) em um célula hospedeira. Seqüências de controle da transcrição são seqüências que controlam a iniciação, prolongamento, ou terminação da transcrição. Seqüências de controle da transcrição particularmente importantes são aquelas que controlam a iniciação da transcrição, tal como seqüências promotoras, realçadoras, operadoras e repressoras.

Seqüências de controle da transcrição adequadas incluem qualquer seqüência de controle da transcrição que pode funcionar em uma célula hospedeira ou organismo em que a molécula de ácido nucléico recombinante seja introduzida.

Enzimas e Ácidos Nucléicos Que codificam as Enzimas

Como descrito nos exemplos, esta invenção fornece várias enzimas purificadas, in- cluindo duas celobiohidrolases, (CBH lb, SEQ ID NO. 2; CBH llb, SEQ ID NO. 4), uma en- doglicanase (EG VI, SEQ ID NO. 16), uma β-glicosidase (BGL, SEQ ID NO. 12), e uma xila- nase (Xyl SEQ ID NO. 18). Esta invenção também considera variantes de tais enzimas, in- cluindo variantes tendo seqüência de aminoácido com pelo menos 65 %, 70 %, ou 75 % da identidade do aminoácido com estas enzimas, conforme determinado pelo algoritmo BLAST convencionalmente usado.

Adicionalmente, a invenção fornece os ácidos nucléicos que codificam estas se- quências, incluindo o gene de cbh2 (SEQ ID NO. 1, que codifica CBH Ib), o gene de cbh4 (SEQ ID NO. 3, que codifica CBH llb); o gene de eg7 (SEQ ID NO. 15, que codifica EG VI), o gene bgll (SEQ ID NO. 11, que codifica BGL), e o gene dexyl2 (SEQ ID NO. 17, que codi- fica Xyl II). Esta invenção também considera variantes destes ácidos nucléicos, incluindo variantes que têm pelo menos 80 %, 85 % ou 90 % de homologia com estes ácidos nucléicos.

Como descrito neste relatório, as enzimas recém identificadas e isoladas de acordo com a invenção podem ser usadas em combinação com pelo menos uma outra enzima que promove sacarificação de materiais celulósicos. Em modalidades preferidas, esta enzima adicional é derivada de C. lucknowense. Por exemplo, a enzima pode ser CBH Ia (SEQ ID NO. 6), CBH Ila (SEQ ID NO. 8), EG II (SEQ ID NO. 10) ou EG V (SEQ ID NO. 14). Obser- va-se, entretanto, que em certas modalidades preferidas, CBH Ia, CBH Ila EG II, e EG V podem ser obtidas pela modificação genética de um microorganismo ou planta para expres- sar cbhl (SEQ ID NO. 5, que codifica CBH Ia), EG6 (SEQ ID NQ. 7, que codifica CBH lia), eg2 (SEQ ID NO. 9, que codifica EG II), e/ou EG5 (SEQ ID NO. 13, que codifica EG V). Uma combinação particularmente útil para a sacarificação é CBH Ia, CBH lb, CBH llb, EG II, EG V, BGL, e Xyl II.

Em certas modalidades, os polinucleotídeos e polipeptídeos da invenção são de- senvolvidos usando técnicas de evolução molecular para criar e identificar novas variantes com características estruturais, funcionais, e/ou físicas desejadas. Técnicas de evolução molecular podem ser "Rearranjo do DNA", ou "PCR sexual" (WPC, Stemmer, PNAS, 91:10747, (1994)), também referidas como "evolução molecular dirigida", "rearranjo de é- xon", "evolução enzimática dirigida", "evolução in vitro" e "evolução artificial". Tais termos de referência são conhecidos na técnica e são abrangidos pela invenção. Características tais como a atividade, a cinética enzimática da proteína, a K„ Kcai, Km, Vmax, Kd da proteína, ter- moestabilidade, pH ideal, e semelhantes podem ser modificadas. Em certas modalidades, os polinucleotídeos e/ou polipeptídeos da invenção podem ser desenvolvidos para conferir propriedades que são vantajosas para a sacarificação e fermentação enzimática in situ. Por exemplo, enzimas podem ser desenvolvidas para atuarem da melhor forma em um ambiente que é adequado para a fermentação de açúcares. Em um exemplo, as enzimas são desen- volvidas para ter atividade máxima em um ambiente com temperatura elevada e alto teor de álcool no ambiente, tal como um ambiente onde um organismo tal como levedura está fer- mentando os açúcares. Desta forma, a sacarificação de Iignocelulose e fermentação ocor- rem em uma etapa de processo único. Em um outro exemplo, as enzimas são desenvolvi- das para resistir a produtos químicos severos ou ambientes térmicos, tais como aqueles que podem ser experimentados durante pré tratamentos lignocelulósicos, como descrito neste relatório. Nestas modalidades, não é necessário pré tratar química ou termicamente a Iigno- celulose antes de adicionar as enzimas. Particularmente, o tratamento e a sacarificação en- zimática podem ser realizados simultaneamente. Certamente, esta invenção também consi- dera processos que envolvem etapas múltiplas para produzir açúcares a partir de Iignocelu- lose, tais como aqueles onde enzimas desenvolvidas primeiro sacarificam lignocelulose, que é subseqüentemente fermentada por um organismo, tal como levedura, por exemplo.

Em outras modalidades, a capacidade de realçar características específicas de uma proteína também pode ser aplicável para mudar a atividade caracterizada de uma enzima para uma atividade completamente não relacionada a sua atividade inicialmente caracteri- zada. Outros aperfeiçoamentos desejáveis da invenção seriam especificar cada proteína individual, e seriam assim bem conhecidos na técnica e considerados pela invenção.

Expressão de Enzimas

Os microorganismos úteis na presente invenção e/ou como uma fonte de enzimas úteis na presente invenção incluem qualquer microorganismo que produz uma enzima capaz de degradar material lignocelulósico, incluindo bactérias, levedura, e fungos filamentosos. Em virtude da simplicidade e conveniência, microorganismos fúngicos filamentosos serão debatidos neste relatório; entretanto, uma pessoa habilitada na técnica reconhecerá que outros microorganismos serão úteis na presente invenção. Fungos filamentosos foram am- piamente usados na indústria para a produção de proteínas. Estes fungos são, de maneira única, adaptados para a produção e secreção de proteínas devido ao seu nicho biológico como descontaminantes microbianos. Em ambientes ricos em polímeros biológicos, tais co- mo solos de floresta, os fungos competem por secretar enzimas que degradam esses polí- meros, produzindo monômeros que podem ser prontamente utilizados como nutrientes para cultivo. A capacidade natural dos fungos em produzir proteínas foi amplamente explorada, principalmente para a produção de enzimas industriais. Níveis de produção de proteína em isolatos naturais podem ser aumentados em cepas aperfeiçoadas por ordens de grandeza; rendimentos de produção de dezenas de gramas de proteína por litro de cultura de fermen- tação são comuns.

Cepas fúngicas, incluindo, mas não limitadas a, várias espécies de Talaromyces,

Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Penicillium, Fusarium, Humicola, Myceliophthora, Corynascus, Chaetomium, Tolypocladium, Thielavia, Acremonium, Sporotrichum, Thermo- ascus, e Chrysosporium, são consideradas na presente invenção. Estes são um pequeno número de muitos gêneros possíveis de fungos que serão fontes úteis de enzimas e/ou seri- am adequados como organismos hospedeiros para produzir tais misturas enzimáticas. Tais fungos podem ser obtidos, por exemplo a partir de vários depositários tais como a American Type Culture Collection (ATCC), a All Russian Collection of Microorganisms of the Russian Academy of Sciences (VKM), e Centraalbureau voor Schimmelcultures.

Cepas mutantes de C. Iucknowense

Cepas particulares de Chrysosporium expressam proteínas em quantidades extre- mamente grandes e seqüências que regulam expressão natural a partir destas cepas são de particular interesse. Estas cepas foram designadas como cepa de Chrysosporium Cl, cepa UV 13-6, cepa NG7C-19 e cepa UV18-25. Elas foram depositadas de acordo com o Buda- pest Treaty com o instituto depositário All Russian Collection (VKM) em Moscou. A cepa tipo Cl selvagem foi depositada de acordo com o Budapest Treaty com o número VKM F-3500 D, data do depósito em 29 de Agosto de 1996, Cl UV13-6 mutante foi depositada com número VKM F-3632 D, e a data do depósito em 9 de Fevereiro de 1998, Cl NG7c-19 mutante foi depositada com número VKM F-3633 Dea data do depósito em 9 de Fevereiro de 1998 e Cl UV18-25 mutante foi depositada com número VKM F-3631 D e data do depósito em 9 de Fevereiro de 1998.

De preferência, uma região reguladora de expressão permitindo alta expressão no hospedeiro selecionado é aplicada. Esta também pode ser uma região reguladora de alta expressão derivada de um hospedeiro heterólogo, tal como são bem conhecidos na técnica. Exemplos específicos de proteínas conhecidas a serem expressadas em grandes quantida- des e assim fornecendo seqüências reguladoras de expressão adequadas para a invenção apresentam-se sem ser limitados a estas: hidrofobina, protease, amilase, xilanase, pectina- se, esterase, beta-galactosidase, celulase (por exemplo, endo-glicanase, celobiohidrolase) e poligalacturonase. A alta produção foi confirmada tanto no estado sólido quanto nas condi- ções de fermentação submersas. Ensaios para avaliar a presença ou produção de tais pro- teínas são bem conhecidos na técnica.

Seqüências reguladoras de expressão heterólogas também trabalham eficazmente em Chrysosporium como seqüências de Chrysosporium naturais. Isto possibilita que cons- truções e vetores bem conhecidos sejam usados na transformação de Chrysosporium assim como oferecendo outras numerosas possibilidades para a construção de vetores que possi- bilitam boas taxas de expressão neste novo hospedeiro na expressão e secreção. Como taxas de expressão extremamente altas para celulase foram confirmadas para cepas de Chrysosporium, as regiões reguladoras de expressão de tais proteínas são particularmente preferidas.

Uma construção de ácido nucléico compreendendo uma região reguladora de ex- pressão de ácido nucléico proveniente de Chrysosporium Iucknowense ou um derivado des- ta, forma uma modalidade separada da invenção como faz a cepa de Chrysosporium mutan- te compreendendo tais regiões operativamente ligadas a um gene que codifica um polipep- tídeo a ser expressado. Em modalidades preferidas, uma tal construção de ácido nucléico será uma região reguladora de expressão proveniente de Chrysosporium associada com a expressão de celobiohidrolase, endoglicanase, /?-glicosidase, e/ou xilanase.

A invenção também abrange cepas de Chrysosporium geneticamente projetadas em que a seqüência que é introduzida pode ser de origem de Chrysosporium. Uma tal cepa pode, entretanto, ser distinguida de cepas que ocorrem naturalmente em virtude de, por e- xemplo, seqüências heterólogas estando presentes na seqüência de ácido nucléico usada para transformar ou transfectar o Chrysosporium, em virtude do fato de que cópias múltiplas da seqüência que codifica o polipeptídeo de interesse estão presentes, ou em virtude do fato de que estas são expressadas em uma quantidade que excede aquela cepa não projetada sob condições idênticas ou em virtude do fato de que a expressão ocorre sob condições normalmente de não expressão. A última pode ser o caso, se um promotor induzível regula a seqüência de interesse contrário à situação não recombinante ou se um outro fator induz a expressão no caso da cepa não projetada. A invenção, como definido nas modalidades pre- cedentes não é intencionada a abranger cepas de Chrysosporium que ocorrem naturalmen- te. A invenção é dirigida a cepas derivadas através da engenharia usando tecnologias gené- ticas clássicas ou metodologias de engenharia genética. Um método de produção de um microorganismo ou planta recombinante também é parte da invenção objeto. O método compreende introduzir de maneira estável uma seqüên- cia de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo heterólogo ou homólogo em uma cepa microbiana ou planta, a seqüência de ácido nucléico sendo operativamente ligada a uma região reguladora de expressão. Tais procedimentos para transformar fungos filamentosos foram previamente relatados. Em uma modalidade preferida, o Chrysosporium lucknowense mutante é derivado de UV18-25 (Acc. N- VKM F-3631 D) que foi projetada para superex- pressar o gene de Xyl II.

Organismos Geneticamente Modificados

Como usado neste relatório, um microorganismo geneticamente modificado pode incluir uma bactéria, levedura, fungo, ou outro micróbio geneticamente modificado. Um tal microorganismo geneticamente modificado tem um genoma que é modificado (isto é, mutan- te ou modificado) de sua forma normal (isto é, tipo selvagem ou que ocorre naturalmente) tal que um resultado desejado seja obtido (por exemplo, atividade e/ou produção aumentada ou modificada de pelo menos uma enzima ou um produto multienzimático para a conversão de material lignocelulósico em açúcares fermentáveis). A modificação genética de um microor- ganismo pode ser realizada usando-se desenvolvimento de cepa e/ou técnicas de genética molecular clássicos. Tais técnicas conhecidas no ramo são geralmente divulgadas para mi- croorganismos, por exemplo, em Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press. A referência Sambrook et al., ibid., é incorporada integralmente como referência neste relatório. Um microorganismo geneticamente modifica- do pode incluir um microorganismo em que moléculas de ácido nucléico foram inseridas, suprimidas ou modificadas (isto é, mutante; por exemplo, por inserção, supressão, substitui- ção, e/ou inversão de nucleotídeos), de uma tal maneira que tais modificações fornecem o efeito desejado dentro do microorganismo.

Em um aspecto da invenção, um microorganismo geneticamente modificado pode endogenamente conter e expressar uma enzima ou um produto multienzimático para a con- versão de material lignocelulósico em açúcares fermentáveis, e a modificação genética pode ser uma modificação genética de uma ou mais de tais enzimas endógenas, por meio das quais a modificação tem algum efeito na capacidade do microorganismo converter material lignocelulósico em açúcares fermentáveis.

Em um outro aspecto da invenção, um microorganismo geneticamente modificado pode endogenamente conter e expressar uma enzima ou um produto multienzimático para a conversão de material lignocelulósico em açúcares fermentáveis, e a modificação genética pode ser uma introdução de pelo menos uma seqüência de ácido nucléico exógena (por exemplo, uma molécula de ácido nucléico recombinante), em que a seqüência de ácido nu- cléico exógena codifica pelo menos uma enzima adicional útil para a conversão de material lignocelulósico em açúcares fermentáveis e/ou uma proteína que melhora a eficiência da enzima ou produto multienzimático para a conversão de material lignocelulósico em açúca- res fermentáveis. Neste aspecto da invenção, o microorganismo também pode ter pelo me- nos uma modificação para um gene ou genes compreendendo sua(s) enzima(s) endóge- na(s) para a conversão de material lignocelulósico em açúcares fermentáveis.

Ainda em um outro aspecto da invenção, o microorganismo geneticamente modifi- cado não necessariamente endógeno (naturalmente) contém uma enzima ou um produto multienzimático para a conversão de material lignocelulósico em açúcares fermentáveis, mas é geneticamente modificado para introduzir pelo menos uma molécula de ácido nucléi- co recombinante que codifica pelo menos uma enzima, uma multiplicidade de enzimas, ou um produto multienzimático para a conversão de material lignocelulósico em açúcares fer- mentáveis. Um tal microorganismo pode ser usado em um método da invenção, ou como um microorganismo de produção para produtos de fermentação brutos, enzimas recombi- nantes parcialmente purificadas, e/ou enzimas recombinantes purificadas, qualquer das quais depois podem ser usadas em um método da presente invenção.

Plantas Geneticamente Modificadas

A invenção também considera plantas geneticamente modificadas compreendendo tais genes. As plantas podem ser usadas para a produção das enzimas, ou como o material lignocelulósico usado como um substrato nos métodos da invenção. Métodos para gerar plantas recombinantes são conhecidos na técnica. Por exemplo, métodos numerosos para a transformação da planta foram desenvolvidos, incluindo protocolos de transformação bioló- gica e física. Vide, por exemplo, Miki et ai, "Procedures for Introducing Foreign DNA in Plants" em Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B.R. e Thompson, J.E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) páginas 67-88. Além disso, vetores e méto- dos de cultura in vitro para transformação e regeneração de célula ou tecido de planta de vegetais estão disponíveis. Vide, por exemplo, Gruber et ai, "Vectors for Plant Transforma- tion" em Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B.R. e Thompson, J.E. Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993) páginas 89-119.

Em certas modalidades da invenção, plantas geneticamente modificadas que ex- pressam as enzimas desta invenção são obtidas introduzindo-se um vetor de expressão em plantas com base no sistema de transformação natural de Agrobacterium. Vide, por exem- plo, Horsch et ai, Science, 227:1229 (1985). A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias do solo patogênicas da planta que geneticamente transformam as células da planta. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, carregam genes responsáveis pela transformação genética da planta. Vide, por exemplo, Kado, C.I., Crit. Rev. Plant. Sei. 10:1 (1991). Descrições de sistemas e métodos do vetor Agrobacterium pa- ra transferência genética mediada por Agrobacterium são fornecidas por numerosas refe- rências, incluindo Gruber et ai, supra, Miki et ai, supra, Moloney et al., Plant Cell Reports 8:238 (1989), e Patentes U.S. N- 4.940.838 e 5.464.763, incorporadas neste relatório inte- gralmente como referência.

Em outras modalidades, plantas geneticamente modificadas são obtidas por trans- formação mediada por microprojétil em que DNA é carregado na superfície de microprojé- teis. O vetor de expressão é introduzido nos tecidos da planta com um dispositivo biolístico que acelera os microprojéteis em velocidade suficiente para penetrar nas paredes celulares e membranas da planta. Sanford et ai, Part. Sei. Technol. 5:27 (1987), Sanford, J.C., Trends Biotech. 6:299 (1988), Sanford, J.C., Physiol. Plant 79:206 (1990), Klein et al., Biotechnology 10:268(1992).

Um outro método para liberação física de DNA para plantas considerado por esta invenção é sonicação de células alvo. Zhang et al., Bio Technology 9:996 (1991). Alternati- vamente, a fusão de Iipossomo ou esferoplasto foi usada para introduzir vetores de expres- são em plantas. Deshayes et al., EMBO J., 4:2731 (1985), Christou et ai, Proc Natl. Acad. Sei. USA 84:3962 (1987). A absorção direta de DNA em protoplastos usando precipitação de CaCh1 álcool polivinílico ou poli-L-ornitina também foi relatada. Hain et al., Mol. Gen. Ge- net. 199:161 (1985) e Draper et al., Plant Cell Physiol. 23:451 (1982). A eletroporação de protoplastos e células e tecidos totais também foram descritos. Donn et al., In Abstracts oi Vllth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, p. 53 (1990); D'Halluin et al., Plant Cell 4:1495-1505 (1992) e Spencer et al., Plant Moi Biol. 24:51-61 (1994).

Métodos de Usar as Enzimas e Cepas Mutantes de C. Iucknowense

Esta invenção também fornece métodos de sacarificação enzimática de materiais celulósicos. Qualquer material contendo celulose pode ser tratado pelas enzimas desta in- venção, exemplos não Iimitantes dos quais incluem podas de pomar, chaparral, resíduos de moagem, resíduos urbanos de madeira, sobras orgânicas, resíduos urbanos, resíduos de corte de madeira, desbastes florestais, safras de madeira de curta rotação, resíduos indus- triais, palha de trigo, palha de aveia, palha de arroz, palha de cevada, palha de centeio, pa- lha do linho, cana-de-açúcar, forragem de milho, hastes do milho, sabugos de milho, palhas de milho, pradarias, gamagrass, capim rabo-de-raposa; polpa de beterraba, polpa de frutas cítricas, cascas de semente, resíduos animais celulósicos, cortes de grama, algodão, e al- gas.

Em certas modalidades preferidas, os materiais lignocelulósicos são pré tratados antes de serem expostos às enzimas ou misturas enzimáticas da invenção. De modo geral, o pré tratamento pode ser qualquer procedimento que torna a sacarificação enzimática sub- sequente dos materiais lignocelulósicos mais eficaz (isto é, menos demorada ou menos ca- ra). Por exemplo, o material lignocelulósico pode ser pré tratado por métodos incluindo, mas não limitados a, exposição a ácidos, bases, solventes, calor, peróxidos, ozônio, ou alguma combinação dos mesmos, antes da sacarificação enzimática. Estes pré tratamentos também podem ser combinados com outras formas de processamento, tais como trituração mecâni- ca, trituração, moagem, ou depressurização rápida (por exemplo, explosão a vapor).

Geralmente, a sacarificação enzimática de acordo com a invenção envolve o uso de CBH Ia, CBH Ilb1 EG VI, BGL, Xyl II, ou misturas das mesmas. Uma ou mais destas enzimas podem ser ainda combinadas com outras enzimas capazes de promover a sacarificação enzimática, que pode ser derivada de C. lucknowense, uma cepa mutante, ou um outro or- ganismo. Por exemplo, em uma modalidade, a sacarificação enzimática envolve uma mistu- ra enzimática compreendendo CBH Ia, CBH lb, CBH llb, EG II, EG V, BGL, e Xyl II. Em ou- tras modalidades preferidas, a mistura enzimática contém uma celobiohidrolase, que pode ser CBH Ia, CBH lb, CBH lia, CBH llb, e misturas da mesma, com uma /?-glicosidase tal co- mo BGL.

Em certas modalidades, as composições enzimáticas são composições enzimáticas artificiais que contêm formas purificadas de CBH Ia1 CBH lb, CBH llb, EG II, EG VI, BGL, ou Xyl II. As formas purificadas destas enzimas podem ser usadas sozinhas ou misturadas en- tre si. Em certas modalidades preferidas, as enzimas purificadas selecionadas estão presen- tes em quantidades relativas mais altas do que seria o caso para as secreções enzimáticas do C. lucknowense do tipo selvagem.

Em certas modalidades, a invenção fornece uma cepa mutante de C. lucknowense que é capaz de expressar CBH Ia1 CBH lb, CBH lia, CBH llb, EG II, EG V, EG VI, BGL, ou Xyl II, ou misturas das mesmas em proporções mais altas do que encontradas nas secre- ções enzimáticas do organismo do tipo selvagem. As enzimas secretadas de uma tal cepa mutante de C. lucknowense podem servir como uma fonte bruta a partir da qual formas puri- ficadas de CBH Ia, CBH lb, CBH lia, CBH llb, EG II, EG V, EG VI, BGL, ou Xyl II, podem ser produzidas. Alternativamente, as enzimas secretadas de uma tal cepa mutante também po- dem ser aplicadas diretamente aos materiais celulósicos a serem sacarificados. Em modali- dades particularmente preferidas, os materiais celulósicos são expostos diretamente à cepa mutante de C. lucknowense em um ambiente conducente à proliferação da cepa mutante de C. lucknowense, tal como em um biorreator. As secreções in situ de CBIa, CBH lb, CBH lia, CBH llb, EG II, EG V, EG VI, BGL, ou Xyl II, ou misturas das mesmas, pela cepa mutante de C. lucknowense, em proporções mais altas do que encontradas nas secreções enzimáticas do organismo do tipo selvagem, levam à sacarificação in situ realçada do material celulósi- co.

A seguir do tratamento enzimático pelas composições enzimáticas inventivas da in- venção, o açúcar fermentável que é produzido, pode ser exposto a microorganismos, que ocorrem naturalmente ou geneticamente projetados, que são capazes de fermentar o açúcar para produzir etanol ou algum outro produto de fermentação com valor agregado. De prefe- rência, substancialmente toda a glicose é convertida em etanol, que pode ser subseqüente- mente usado como um combustível, solvente, ou reagente químico. Em modalidades prefe- ridas, o etanol é usado como um combustível para fornecer energia para veículos de trans- porte, exemplos não Iimitantes dos quais incluem carros, caminhões, ônibus, biciclos motori- zados e motocicletas. Outros produtos de fermentação potenciais provenientes da glicose incluem, mas não são limitados a, biocombustíveis (incluindo etanol); ácido láctico; plásticos; em especial produtos químicos; ácidos orgânicos, incluindo ácido cítrico, ácido succínico e ácido maléico; solventes; suplementos de ração animal; produtos farmacêuticos; vitaminas; aminoácidos, tais como lisina, metionina, triptofano, treonina, e ácido aspártico; enzimas industriais, tais como proteases, celulases, amilases, glicanases, lactases, lipases, liases, oxidoredutases, e transferases; e matérias-primas químicas.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Isolamento Enzimático

Os filtrados de cultura produzidos pelas cepas mutantes de C. Iucknowense foram usados para o isolamento de enzimas individuais. A preparação comercial NCE-L600 (C. lucknowense) proveniente da Dyadic International, Inc., USA.

BGL altamente purificada (celobiase) de Aspergillus japonicus foi obtida a partir de uma preparação comercial, tendo 50 U mg"1 de proteína de atividade de celobiase específica (pH 5,0, 40 °C), e foi usada nos experimentos em hidrólise de celulose insolúvel.

Exemplo 2: Purificação Enzimática

A purificação enzimática foi realizada por cromatografia em um sistema FPLC da Pharmacia (Suécia). Celobiohidrolases e endoglicanases BGL e Xyl Il foram isoladas de um filtrado de cultura de UV18-25 de C. lucknowense. BGL e Xyl Il (xilanase II) foram isoladas dos filtrados de cultura produzidos pelas cepas mutantes UV18ACbh1#10 e Xyl2-18 de C. lucknowense, respectivamente.

Em todos os casos, o primeiro estágio de purificação foi a cromatografia de troca aniônica em uma coluna Source 15Q (volume de 40 ml). A coluna foi equilibrada com tam- pão Bis-Tris-HCI 0,02 M, pH 6,8. O filtrado de cultura inicial foi preliminarmente dessaliniza- do e transferido no tampão primário por filtração em gel em Acrylex P4 (Reanal, Hungria). A amostra (400 mg de proteína) foi aplicada à coluna Source 15Q, e a eluição foi realizada com um gradiente de NaCI 0 a 1 M em uma taxa de fluxo de 10 ml min"1.

A primeira fração da proteína depois da Source 15Q, eluída em NaCI 0,05 M e ten- do alta atividade de Avicelase, foi submetida à cromatografia de interação hidrofóbica em uma coluna Isopropil Source 15 (Pharmacia, Suécia). A coluna foi equilibrada com sulfato de amônio 1,7 M em tampão Na-acetato 50 mM, pH 5,0. As proteínas foram eluídas com um gradiente linear reverso de sulfato de amônio 1,7 a 0 M em uma taxa de fluxo de 4 ml min"1. A fração da proteína com a atividade mais alta contra Avicel (eluindo em uma concentração de sal de 0,30 a 0,35 M) continha a proteína homogênea com uma massa molecular de 70 kDa (CBH llb, vide Fig. 1).

A fração da proteína depois da Source 15Q, eluída em NaCI 0,22 M e tendo a ativi- dade contra Avicel e p-NP-/?-D-celobiosídeo, foi ainda purificada por cromatofocalização em uma coluna Mono P HR 5/20 (Pharmacia, Suécia). A coluna foi equilibrada com tampão Na- formiato 0,025 M1 pH 4,0. As proteínas foram eluídas com um gradiente de pH 4,5 a 3,0 (u- sando Polybuffer 74) em uma taxa de fluxo de 0,5 ml min"1. CBH Ib 60 kDa homogênea foi obtida como um resultado da cromatofocalização (FIG. 1).

As duas celobiohidrolases recém isoladas são homogêneas de acordo com os da- dos de SDS-PAGE e isoeletrofocalização (FIG. 1), descobriu-se que suas massas molecula- res foram de 60 e 70 kDa, pl 3,8 e 5,6, respectivamente. O mapeamento genético da massa do peptídeo usando espectrometria de massa MALDI-TOF (dados não mostrados) indicou que estas proteínas foram diferentes das celobiohidrolases acima mencionadas (Cel6A e Cel7A) assim como de outras enzimas de C. Iucknowense previamente isoladas. A sequen- ciação de novo subsequente de peptídeos trípticos a partir de novas celobiohidrolases, u- sando espectrometria de massa TOF/TOF (MS/MS) em conjunto, seguido pela pesquisa BLAST no banco de dados SWISS-PROT (UniProtKB) mostrou que as proteínas de 60 kDa e 70 kDa exibem similaridade de seqüência para celobiohidrolases a partir de famílias 7 e 6 de GH (Tabela 1, vide classificação nas famílias em HyperTextTransferProtocol://afinb.cnrs- mrs.fr/CAZY/). Desse modo, elas foram classificadas como Cel7B (CBH Ib) e Cel6B (CBH IIB), respectivamente. Assim, o fungo C. Iucknowense secreta pelo menos quatro celobiohi- drolases codificadas por genes diferentes, dois deles pertencentes à família glicosil hidrola- se 6 (GH6) e duas outras enzimas à família GH7 (Tabela 2). As moléculas da CBH Ia (Cel7A) e CBH Ilb (Cel6B) representam celulases típicas que consistem de um domínio ca- talítico e CBM conectados por um Iigador de peptídeo flexível. As moléculas de CBH Ib (Cel7B) e CBH Ila (Cel6A) consistem apenas dos domínios catalíticos (elas não têm CBM). Deve ser observado que a maioria dos fungos T. reesei estudados tem apenas duas celobi- ohidrolases: I (Cel7A) e Il (Cel6A). Outros fungos, tais como Humicola insolens, também segregam duas celobiohidrolases (Cel7A e Cel6A), enquanto que Phanerochaete cluysospo- rium produz pelo menos sete celobiohidrolases diferentes, das quais seis enzimas perten- cem à família GH7. Todas as enzimas mencionadas, exceto a CBH 1-1 de P. chrysosporlum (Cel7A), possuem CBM.

A BGL foi isolada a partir da fração da proteína depois da Source 15Q (eluída em NaCI 0,10 M) contendo a atividade mais alta contra p-NP-/?-D-glicopiranosídeo e celobiose. A fração foi submetida à cromatografia de interação hidrofóbica como descrito acima, a BGL homogênea com uma massa molecular de 106 kDa e pl 4,8 foi eluída a 1,3 M de sulfato de amônio. Descobriu-se que a atividade específica da BGL para p-NP-β-glicopiranosídeo e celobiose foi de 11 e 26 U mg"1 de proteína, respectivamente (40 °C, pH 5,0). A BGL purifi- cada teve atividade ideal ao pH 4,0 e reteve >50 % de atividade na faixa do pH 2,5 a 6,5. A temperatura ideal foi de 40 °C. Depois do aquecimento durante três horas, a enzima reteve 10 % de atividade a 60 °C, 64 % a 50 °C, e 100 % a 40 °C. A enzima foi altamente ativa con- tra celobiose, gentiobiose, e Iaminarobiose como substratos. A atividade fraca também foi observada usando soforose, celotriose, celotetraose, celopentaose, e celohexaose como substratos. Nenhuma atividade foi observada com Iactose ou tregalose como substratos.

A Xyl II homogênea (24 kDa, ρ/ 7,9) foi obtida depois da cromatografia de troca ani- ônica seguido por cromatografia de interação hidrofóbica como descrito acima e filtração em gel em uma coluna Superose 12 HR 10/30 (Pharmacia, Suécia). A eluição no último estágio cromatográfico foi realizada com tampão Na-acetato 0,1 M, pH 5,0, em uma taxa de fluxo de 0,3 ml min-1. A Xyl Il teve atividade de xilanase específica de 395 U mg"1 de proteína (50 °C, pH 5,0, xilana birchwood como um substrato). A enzima teve um pH ideal de 6,0 e uma tem- peratura ideal de 70 °C. A Xyl II foi altamente específica para xilana como substrato, sem nenhuma atividade contra carboximetilcelulose (CMC) ou β-glicana de cevada.

As CBH Ia (65 kDa), CBH Ila (43 kDa), EG II (51 kDa), EG V (25 kDa), EG Vl (47 kDa) de C. Iucknowense foram purificadas como descrito em outra parte deste relatório (vi- de, Gusakov AV, Sinitsyn AP1 Salanovich TN, Bukhtojarov FE1 Markov AV, Ustinov BB, van Zeijl C, Punt P, Burlingame R. "Purification, cloning and characterisation of two forms of thermostable and highly active cellobiohydrolase I (Cel7A) produced by the industrial strain of Chrysosporium lucknowense" Enzime Microb Technol 2005;36:57-69; Bukhtojarov FE, Ustinov BB, Salanovich TN, Antonov Al, Gusakov AV, Okunev ON, Sinitsyn AP. "Cellulase complex of the fungus Chrysosporium lucknowense: isolation and characterization of en- doglucanases and cellobiohydrolases", Biochemistry (Moscou) 2004;69:542-51.

A pureza da enzima foi caracterizada por SDS-PAGE e isoeletrofocalização. SDS- PAGE foi realizado em 12 % de gel usando um equipamento Mini Protean II (Bio-Rad Labo- ratories, USA). Isoeletrofocalização foi realizada em um Modelo 111 Mini IEF Cell (Bio-Rad Laboratories, USA). A marcação da proteína foi realizada com Coomassie Blue.

Exemplo 3: MALDI-TOF e espectrometria de massa TOF/TOF em conjunto de pep- tídeos

A digestão tríptica em gel das tiras de proteína depois do SDS-PAGE foi realizada essencialmente como descrito por Smith (Smith BE. Protein sequencing protocols. Totowa: Humana Press; 1997). Tripsina (Promega, modificada, 5 Mg/mL) em NH4HCO3 50 mM foi usada para uma digestão de proteína. Os peptídeos resultantes foram extraídos de um gel com 20 % de acetonitrila aquosa contendo 0,1 % de ácido trifluoroacético e submetida à MS MALDI-TOF (vide, James P. (Ed.) Proteome research: mass spectrometry. Berlin: Springer- Verlag; 2001.) Os peptídeos selecionados a partir de espectros de massa dos digestos tríp- ticos da CBH Ib e IIb foram analisados por espectrometria de massa em conjunto de modo a determinar suas sequencias de novo. O espectrômetro de massa TOF/TOF Ultraflex (Bruker Daltonik Gmbh, Alemanha) foi usado nos experimentos da MS.

Exemplo 4: Ensaios de atividade enzimática

A atividade de CMCase foi medida pelo ensaio de açúcares redutores liberados de- pois de 5 mM de reação enzimática com 0,5 % de carboximetilcelulose (CMC, viscosidade do meio, Sigma, USA) ao pH 5,0 e 50°C (Sinitsyn AP, Chemoglazov VM, Gusakov AV. "Me- thods of investigation and properties of cellulolytic enzymes" (in Russian), Biotechnology Series, v. 25. Moscou: VINITI Press; 1990). As atividades enzimáticas contra B-glicana de cevada (Megazyme, Austrália) e xilana birchwood (Sigma, USA) foram determinadas do mesmo modo como a atividade de CMCase, exceto o tempo de incubação que foi de 10 mM. A atividade de avicelase foi determinada analisando-se açúcares redutores liberados depois de 60 mM de reação enzimática com 5 mg ml"1 de Avicel PH 105 (Serva, Alemanha) ao pH 5,0 e 40°C. Os açúcares redutores foram analisados pelo método de Somogyi- Nelson (Sinitsyn AP, Chemoglazov VM, Gusakov AV, "Methods of investigation and proper- ties of cellulolytic enzymes" (in Russian); Biotechnology Series, v. 25. Moscou: VINITI Press; 1990; Somogyi M., "Notes on sugar determination" J Biol Chem 1952;195:19-23. A atividade sobre papel de filtro (FPA) foi determinada conforme recomendado por Ghose (Ghose TK. "Measurement of celullase activities", Pure Appl Chem 1987;59:257-68).

As atividades contra p-NP-B-D-glicopiranosídeo, p-NP-B-D-celobiosídeo e p-NP-B- D-lactosídeo (Sigma, USA) foram determinadas ao pH 5,0 e 40 °C como descrito em outra parte deste relatório (Gusakov AV, Sinitsyn AP, Salanovich TN, Bukhtojarov FE, Markov AV, Ustinov BB, van Zeijl C, Punt P, Burlingame R. "Purification, cloning and characterisation of two forms of thermostable and highly active cellobiohydrolase I (Cel7A) produced by the in- dustrial strain of Chrysosporium lucknowense", Enzyme Microb Technol 2005;36:57-69).

A atividade de celobiase foi avaliada ao pH 5,0 e 40 0C medindo-se a taxa inicial de liberação de glicose a partir de celobiose 2 mM pelo método da glicose oxidase-peroxidase (Sinitsyn AP, Chemoglazov VM, Gusakov AV, "Methods of investigation and properties of cellulolytic enzymes" (in Russian), Biotechnology Series, v. 25. Moscow: VINlTl Press; 1990).

Todas as atividades foram expressadas em Unidades Internacionais, isto é, uma unidade de atividade correspondeu à quantidade de enzima hidrolisando um Mmol de subs- trato ou liberando um μιτιοΙ de açúcares redutores (em equivalentes de glicose) por um minuto.

Exemplo 5: Hidrólise enzimática de substratos celulósicos

A hidrólise enzimática de substratos celulósicos foi realizada ao pH 5,0 sob agita- ção magnética. Avicel PH 105 (Serva, Alemanha), pré tratado de algodão com mistura de acetona-etanol (1:1) durante dois dias de modo a remover a cera da superfície de fibras de celulose, e madeira da espécie Douglas fir pré tratada por organosolv foram usadas como substratos.

Os experimentos em cinéticas de progresso da hidrólise de Avicel por celobiohidro- lases individuais purificadas e experimentos em interação sinérgica entre celulases de C. lucknowense (com algodão como um substrato) foram realizados a 40 °C. A concentração de substrato nesses experimentos foi de 5 mg ml"1. De modo a eliminar o efeito da inibição do produto (celobiose) nas cinéticas e converter todos os celooligossacarídeos em glicose, a hidrólise foi realizada na presença de BGL purificada (celobiase) de A. japonicus, que foi extra adicionada ao sistema de reação em quantidade excessiva (0,5 U ml"1).

Os experimentos em sacarificação enzimática de Avicel, algodão, e madeira da es- pécie Douglas fir pré tratada por combinações de enzimas de C. Iucknowense purificadas e preparações multienzimáticas brutas foram realizadas a 50 °C. A concentração de Avicel e madeira pré tratada nesses experimentos foi de 50 mg ml"1, enquanto que a concentração de algodão foi de 25 mg ml"1.

Um experimento típico foi realizado da seguinte maneira. Uma quantidade pesada de substrato celulósico seco foi colocada em um tubo de ensaio plástico 2 ml, depois 0,5 a 1 ml de tampão Na-acetato 0,05 M1 contendo NaN3 1 mM para prevenir contaminação micro- biana, foi adicionado, e o substrato foi embebido no tampão durante 1 h. Depois, o tubo foi colocado em um banho de água termo-estabelecido, localizado em um agitador magnético, e solução enzimática adequadamente diluída no mesmo tampão foi adicionada à suspensão de substrato de modo a ajustar o volume total do sistema de reação a 2 ml e iniciar a hidróli- se. O tubo foi hermeticamente fechado com uma tampa, e a hidrólise foi realizada com agi- tação magnética. Em tempos definidos na reação, uma alíquota da suspensão (0,05 a 0,1 ml) foi tomada, diluída, centrifugada durante 3 min a 15000 rpm, e as concentrações de gli- cose e açúcares redutoras no sobrenadante foram determinadas pelos métodos da glicose oxidase-peroxidase e de Somogyi-Nelson. Nesses casos, quando a glicose foi um produto único da reação, o grau de conversão de substrato (para Avicel e algodão, que representou substratos celulósicos puros) foi calculado usando a seguinte equação:

Conversão (%) = Concentração de glicose (mg ml"1) χ 100 %/Concentração de substrato inicial (mg ml"1) χ 1,11

Os experimentos cinéticos foram realizados em duplicatas. A concentração de pro- teína foi a medição de carga de enzima no sistema de reação. No caso de enzimas purifica- das, a concentração de proteína foi calculada a partir da absorção de UV a 280 nm usando coeficientes de extinção de enzima prognosticados pela ferramenta ProtParam (http://WorldWideWeb.expasy.ch/tools/protparam.HyperTextMarkupLanguage). Para as pre- parações multienzimáticas brutas, a concentração de proteína foi determinada pelo método de Lowry usando albumina de soro bovino como um padrão.

A CBH Ib e Ilb exibiram atividade máxima ao pH 4,7 e 5,0. Ambas enzimas foram estáveis durante a incubação de 24 h ao pH 5,0 e 50 °C. O estudo da adsorção da enzima em Avicel, realizado ao pH 5,0 e 6 °C, revelou que apenas a CBH Ilb tem CBM. Depois da incubação da CBH Ib e Ilb (1 mg ml-1) com Avicel (25 mg ml-1) durante 30 min em agitação, o grau de adsorção de proteína foi de 65 e 99 %, respectivamente. Deve ser observado que o grau de adsorção do domínio catalítico da CBH Ia de C. Iucknowense foi de 59 % sob as mesmas condições, enquanto que para a CBH Ia de C. Iucknowense de tamanho natural (uma enzima com CBM) foi de 89 %.

A CBH Ilb teve uma alta atividade contra Avicel e atividade de CMCase muito baixa, enquanto que a atividade para derivados de p-nitrofenil sintéticos de dissacarídeos foi com- pletamente ausente (Tabela 2). A CBH Ib exibiu atividade de Avicelase mais baixa, mas p- NP-β-D-celobiosídeo e p-NP-β-D-lactosídeo hidrolisados, que é típica para celulases da fa- mília 7. Para uma comparação, atividades específicas de celobiohidrolases de C. Iuckno- wense previamente isoladas (agora chamadas como CBH Ia e CBH lia) também são forne- cidas na Tabela 2.

A FIG. 2 mostra as cinéticas de progresso da hidrólise de Avicel para todas as ce- lobiohidrolases de C. Iucknowense purificadas, onde as enzimas foram equalizadas por con- centração de proteína (0,1 mg ml"1). De modo a eliminar o efeito da inibição do produto (ce- lobiose) nas cinéticas, a hidrólise foi realizada na presença de BGL purificada (celobiase) de A. japonicus, adicionada ao sistema de reação em quantidade excessiva (0,5 U ml"1).

A taxa da hidrólise mais alta entre um número reduzido de celobiohidrolases testa- das, incluindo três outras enzimas de C. Iucknowense (CBH Ia, Ib, lia) foi observada no caso de CBH Ilb de C. Iueknowense: 3,2 mg ml-1 de glicose, isto é, 58 % de conversão de celulo- se foi obtida depois de 5 dias da hidrólise (vide FIG. 2). A CBH Ia de C. Iueknowense (que tem um CBM) foi notavelmente menos eficaz (o rendimento de glicose depois de 5 dias foi de 2,5 mg ml-1, que correspondeu ao grau de conversão de celulose de 46 %, respectiva- mente). Como esperado, as celobiohidrolases de C. Iueknowense sem CBM (CBH Ib e lia) tiveram a capacidade mais baixa para hidrolisar Avicel: apenas 23 e 21 % de conversão de celulose foi obtida depois do mesmo tempo de reação.

Ambas celobiohidrolases de C. Iueknowense tendo um CBM (Ia e Mb) exibiram um sinergismo considerável com três endoglicanases principais a partir do mesmo fungo (EG II, EG V, EG VI) na hidrólise de algodão assim como uma sinergia forte entre si (Tabela 3). Nestes estudos, a concentração de algodão foi de 5 mg ml-1, a concentração de CBH foi de 0,15 mg ml"1 em todos casos, enquanto que a concentração de EG foi sempre de 0,05 mg ml"1. De modo a eliminar o efeito da inibição do produto nas cinéticas e converter os oligos- sacarídeos intermediários em glicose, a hidrólise foi realizada na presença de BGL purifica- da de A. japonicus, adicionada ao sistema de reação em quantidade excessiva (0,5 U ml"1). Os experimentos foram realizados ao pH 5,0 e 40 0C durante 140 h.

Como observado na Tabela 3, celobiohidrolases individuais, CBH Ia e CBH llb, e as endoglicanases individuais, não hidrolisam completamente o algodão sob as condições tes- tadas. A CBH Ilb forneceu o rendimento de glicose mais alto depois de 140 h da hidrólise: 1,18 mg ml"1, que correspondeu ao grau de conversão de substrato de 21 %. Entretanto, quando qualquer celobiohidrolase foi incubada com endogluacanase, um sinergismo consi- derável foi observado. Os rendimentos de glicose mais altos (4,1 a 4,7 mg ml"1) foram obti- dos com combinações de CBH Ia ou CBH Ilb com EG II, o coeficiente de sinergismo sendo variado na faixa de 2,6 a 2,8. Um sinergismo forte (Ksyn= 2,75) também foi observado entre CBH Ia e CBH Nb. De fato, a combinação de duas celobiohidrolases (1:1 em peso) com BGL forneceu conversão praticamente completa (98,6 %) de celulose de algodão em glicose de- pois de 140 h da hidrólise.

Como um exemplo, as cinéticas de progresso da hidrólise de algodão por combina- ções de CBH Ilb com outras enzimas de C. Iucknowense são mostradas na FIG. 3, onde os dados experimentais reais são mostrados com símbolos vazios (curvas contínuas) enquanto que as somas teóricas de concentrações de glicose obtidas sob a ação de enzimas indivi- duais são mostradas com símbolos cheios (linhas pontilhadas). Os rendimentos de glicose obtidos depois de 140 h da hidrólise de algodão sob a ação de celobiohidrolases e endogli- canases individuais e suas combinações são resumidos na Tabela 3. O coeficiente de siner- gismo (Ksym) foi calculado como uma razão de concentração de glicose experimental (coluna 2 da Tabela 3) para a soma teórica de concentrações de glicose (coluna 3).

Usando quatro enzimas de C. Iucknowense purificadas (CBH Ia e llb, EG II, BGL), um complexo de celulase artificial foi construído (combinação #1 de C.I.), o qual demonstrou uma capacidade extremamente alta para converter substratos celulósicos diferentes em gli- cose (FIGS. 4 a 6). Esta composição multienzimática foi notavelmente mais eficaz na hidró- lise de celulose cristalina pura (algodão e Avicel) do que a preparação multienzimática de C. Iucknowense bruta NCE-L600. Em 72 h da hidrólise de um substrato lignocelulósico (madei- ra da espécie Douglas fir pré tratada por organosolv), a combinação #1 de C.l. também foi muito eficaz na hidrólise da celulose.

Na combinação #1 de C. lucknowense, a enzima consistiu das duas celobiohidrola- ses CBH Ia e CBH Ib, e da endoglicanase EG II, as enzimas com capacidade de adsorção forte em celulose cristalina (as moléculas destas enzimas têm CBM). A atividade de celula- ses severamente adsorvidas é gradualmente diminuída durante o curso da hidrólise de celu- lose insolúvel como um resultado da mobilidade limitada da enzima ao longo da superfície do substrato ou da ligação improdutiva (desse modo chamada pseudoinativação). Sem de- sejar estar ligado por teoria, acredita-se que possa existir um sinergismo entre celulases severamente e livremente adsorvidas em que celulases de ligação livre (enzimas sem CBM) podem destruir obstáculos impedindo a ação processiva das celobiohidrolases severamente adsorvidas, assim auxiliando para que elas se movam para os próximos sítios reativos de celulose. A concentração de proteína total no sistema de reação foi de 0,5 mg ml"1. A com- posição da composição multienzimática (combinação #1 de C.l.) foi a seguinte: 0,2 mg ml"1 de CBH Ia + 0,2 mg ml"1 de CBH Ilb + 0,08 mg ml"1 de EG Il + 0,02 mg ml"1 de BGL. Avicel (50 mg ml"1) e algodão (25 mg ml"1) foram usados como substratos representando celulose cristalina pura nestes experimentos. A amostra de madeira da espécie Douglas fir pré trata- da por organosolv (50 mg ml"1) foi tomada como um exemplo de matéria-prima lignocelulósi- ca real que pode ser usada para bioconversão em etanol. Uma preparação de celulase mul- tienzimática de C. Iucknowense bruta NCE L-600 (diluída de modo que a concentração de proteína no sistema de reação também seria de 0,5 mg ml"1) foi tomada para uma compara- ção nestes estudos. Os experimentos da hidrólise com esta, também foram realizados na presença de BGL de A. japonicus extra adicionada (0,5 U ml"1).

As cinéticas de progresso da hidrólise de algodão, Avicel e Douglas fir por prepara- ções multienzimáticas de celulase diferentes são mostradas nas FIGS. 4 a 6. Deve ser ob- servado que em todos os casos, as concentrações de glicose e açúcares redutores depois de 24 a 72 h da hidrólise em um experimento concreto foram praticamente as mesmas, isto é, glicose composta de >96 % dos açúcares solúveis totais. Desse modo, o rendimento da glicose pode ser tomado como critério confiável em comparação à eficiência hidrolítica de amostras multienzimáticas diferentes.

Na hidrólise do algodão (FIG. 4), a combinação #1 de enzimas de C. Iucknowense purificadas forneceu rendimento de glicose muito maior depois de 72 h da reação (23,4 mg ml"1, isto é, 84 % de grau de conversão de substrato) doque o de 4,2 mg ml"1 exibido por (NCE-L600). Na hidrólise de Avicel (FIG. 5), a combinação #1 de C.l. também foi superior (45,0 mg ml"1 de glicose, ou 81 % de conversão de substrato depois de 72 h da hidrólise). No caso de Douglas fir pré tratada (FIG. 6), a combinação #1 de C.l. também foi eficaz (gli- cose 28,8 mg ml"1, 63 % de conversão depois de 72 horas).

Diferente de Avicel e algodão, a amostra de madeira pré tratada continha não ape- nas celulose (~85 %) mas também Iignina (13 %) e hemicelulose (2%). A combinação #1 de quatro enzimas de C. Iucknowense artificiais foi composta de apenas celulases; todas elas, exceto para a BGL, tendo CBM. Todas as outras amostras multienzimáticas possuíam não apenas celulase mas também xilanase e outros tipos de atividade de carbohidrase, isto é, elas continham enzimas não-celulase adicionais. Isto pode esclarecer a eficiência relativa- mente menor da combinação #1 de C.l. em Douglas fir pré tratada comparada à preparação de P. verruculosum #151 (FIG. 6). Em um conjunto de experimentos (FIG. 7), a amostra de madeira pré tratada foi hi- drolisada por composições diferentes de enzimas de C. Iucknowense purificadas, para que celulases carentes de um CBM fossem incluídas (EG V ou EG V em combinação com CBH lb). A concentração de proteína total no sistema de reação foi mantida no mesmo nível de 0,5 mg ml-1 (Tabela 5). De fato, duas combinações (#3 e #4) de C.I., contendo enzimas fra- camente adsorvidas, forneceram um aperfeiçoamento notável do rendimento de glicose de- pois de 72 h da reação enzimática em comparação com a combinação #1 de C.I..

Em dois experimentos, a Xyl II de C. Iucknowense altamente ativa (Xynl 1A) foi adi- cionada às quatro enzimas acima mencionadas (combinações #2 e #4 de C.I.). Visto que um sinergismo entre celulases severamente e livremente adsorvidas foi descrito [38], EG V ou EG V junto com CBH Ib (ambas as enzimas têm carência de CBM) foram usadas nas com- binações #3 e #4 de C.I..

Como pode ser observado na FIG. 7, a taxa inicial de formação de glicose diminuiu seqüencialmente a partir da combinação #1 para combinação #4 de C.I., entretanto, o redi- mento de glicose depois de 2 a 3 dias da hidrólise aumentou na mesma seqüência. A Xyl II demonstrou apenas leve efeito positivo no rendimento de glicose, enquanto que a EG V ou EG V junto com CBH Ib forneceu um aumento notável na concentração do produto depois de 72 h da hidrólise da madeira (37 e 41 mg ml-1, respectivamente) comparado à combina- ção #1 de C.l. (29 mg ml"1), isto é, as combinações #3 e #4 tiveram melhor desempenho do que todas as amostras multienzimáticas brutas (FIG. 6).

O baixo desempenho da preparação de C. Iucknowense bruta (NCE-L600) na hidró- lise de substratos celulósicos diferentes (FIGS. 4 a 6) merece uma atenção especial. Sem desejar estar ligado pela teoria, pode ser esclarecido o teor total baixo de celobiohidrolases diferentes na NCE-L600 (35 a 40 % do teor de proteína total). Além disso, duas das quatro celobiohidrolases de C. Iucknowense (lb e lia) carecem de CBM, enquanto que duas outras enzimas (CBH Ia e llb) também parcialmente perdem a CBM durante o curso de fermenta- ção. A ausência de CBM na maior parte de celobiohidrolases a partir da NCE-L600 pode levar à atividade mais baixa da preparação bruta para celulose cristalina. Tabela 1

<table>table see original document page 30</column></row><table> tabela 2

<table>table see original document page 31</column></row><table> Tabela 3

Sinergismo entre celulases de C. Iucknowense na hidrólise de celulose de algodão (5 mg ml"1) ao pH 5,0 e 40 0C na presença de 0,5 U ml"1 de BGL de A. japonicus. Em todos os casos, a concentração de CBH foi de 0,15 mg ml"1, a concentração de EG foi de 0,05 mg ml'1.

<table>table see original document page 32</column></row><table>

a Calculado como uma soma de concentrações de glicose obtidas sob a ação de enzimas individuais.

Tabela 4

Atividades específicas (U mg"1 de proteína) de preparações multienzimáticas para substratos diferentes ao pH 5,0 e 50°C

<table>table see original document page 32</column></row><table>

a Atividade foi determinada a 40 °C.

Tabela 5

Composição de combinações multienzimáticas artificiais com base em enzimas de C. lucknowense purificadas e rendimentos de glicose depois de 72 h da hidrólise de madeira da espécie Douglas fir pré tratada (50 mg ml-1), pH 5,0, 50 0C . A concentração de proteína total no sistema de reação foi de 0,5 mg ml-1, a concentração de cada componente e rendi- mentos de glicose são fornecidos em mg ml-1.

<table>table see original document page 33</column></row><table> Listagem de Seqüência

<110> Dyadic International, Inc.

GUSAKOV, Alexander V. SALANOVICH, Tatyana N. antonov, Alexey I. USTINOV, BOri S B. OKUNEV, Oleg N. BURLINGAME, Richard P. EMALFARB, Mark A. BAEZ, Marco sinitsyn, Arkady p.

<120> "CONSTRUÇÃO DE COMPOSIÇÕES DE CELULASE ALTAMENTE EFICAZES PARA A HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE CELULOSE"

<130> 3123-4008PC

<140> TBD <141> 2006-07-13

<160> 18

<170> Patentln versão 3.3

<210> 1

<211> 6360

<212> DNA

<213> Chrysosporium lucknowense

<400> 1

ctcagattct aggggtaggg cgggagcaga ggcgaaaatt gggttgtaga atatgaggag 60 ctagggttgt taaactcaaa gaacttcttg ctcttgttct tagtcttctc tcctgggaaa 120 agggggtttt tccgaaagcg gcgctatacg aagccagagg ctactttcct tgctttggat 180 ggcccttgtc caccgttctt gtttcccgtt tgtcaattgc gacgttgccg gcaacctagg 240 tcctaataat taggtagata tttcggtaga ggtagtttaa ttatgcttca gtagagaaat 300 cgttgtctcc acgtctcgca accttgcgaa acttcgccac attgaagata gcattgtctg 360 agttgatttt aaccctttcc agagacgata taatagtgca agtttctttg atcggaatca 420 tcgacattcg gattttccct taattatatg aagtattcgg cccacggaac cgggccccga 480 gcaggttgaa ccgcgcaaaa cctcaaccga gtcacctcgc gtccatgttt gtcatggaat 540 caggctccga atcccgtcag atcagtcagt tctggtggct atggacgcgg gagttacggc 600 cagtcgtccc gttgttctgg ggggttgatc aacaggagga agagatctga gatcgaacta 660 cacccattga tttatcgacg cataatcaag tttaataaaa accaaacagc gtgtttggtg 720 ctaccaccga atgcgagatc cgggctagcc cgcggaagga tgatggccac agatctagcg 780 tcatgtatga ttattaccta tgcatctatc ttcgtatctg cctcgggttg gcaacacctg 840 accgagagac gactcgacaa cctgacactt ggcaaaagac atttcggttg acagcgggag 900 aactccagcg aggaagtcgc ccagagatgc ggatgagaag acaacgccga gacgtgccgg 960 cgttggctct ccacgaatcg gagccgactc ttccgtttgg ccaatctccg ggataaatcc 1020 cagcggcggg tcacgtcacg tttcatgggg aggcgcggac agccatccca gccaggccat 1080 ggaagagaac aattcttggg ggtagcgacc gagccaaaag gggggggggg gaagcgggag 1140 gggaagaagt ggtattagag cacgcaccgg aaaacgcatt tgggcccttg ccaacaaaca 1200 ccacaccccg cgtcctggga gcaagacatc caggatgcaa cccagtaggg gatgccaaga 1260 agcatctacg gcaccatctg ccggcgcctc gcctgttaga gtcccggcac ccgccaatgg 1320 ggccgtgctg ggccctgccc ggcaatgctg gcgcagcggc atcaacaaca ttgctcgggg 1380 aggggcccga ttttattgat tagcaaaaaa acaattaaat tacccttcca ttccagcaga 1440 gcttctcctc cacgcggcgg cgggaccgct tgtggacggc ggtacactac aaccgcgggg 1500 ctccagtctc cgtgctgggc gtgcagatca cgacccggaa gagaaatgat cgcggtctga 1560 cgccgggtac ggagtactga gccgccaacc acagccgatg gaccgtgata tctcaatgcg 1620 ttcaagcaac acagcaacac cctggacgag tctctcctcc cctaccaccc cctccccccc 1680 tgccctggcc gcgaacgggg cgcgtacccc agatttctac tccgtactga caccccaatc 1740 tattcccgct ggcgtcgccc agtctggggc ggtccggcca agactctcgg tgcacgatac 1800 cgcgacgaaa tcggattaac cgttggctga tcaattccaa gtcaagggag aagtggtatg 1860 gaaagtcggc tcagttttcc actgcccccg acaggcaggt tccggatctg gacagcagtc 1920 ttccgaatct ttggcagaga ctcatgataa tataaaaagg caaatgaggc ggcgccttgg 1980 acaggtccat tctcccaccg ctcaaccagc ctccaattcc tcagaagtct gttgctctct 2040 cgcagtcgca gtcaagatga agcagtacct ccagtacctc gcggcgaccc tgcccctggt 2100 gggcctggcc acggcccagc aggcgggtaa cctgcagacc gagactcacc ccaagctcac 2160 ttggtcgaag tgcacggccc cgggatcctg ccaacaggtc aacggcgagg tcgtcatcga 2220 ctccaactgg cgctgggtgc acgacgagaa cgcgcagaac tgctacgacg gcaaccagtg 2280 gaccaacgct tgcagctctg ccaccgactg cgccgagaat tgcgcgctcg agggtgccga 2340 ctaccagggc acctatggcg cctcgaccag cggcaatgcc ctgacgctca ccttcgtcac 2400 taagcacgag tacggcacca acattggttc gcgcctctac ctcatgaacg gcgcgaacaa 2460 gtaccagatg ttcaccctca agggcaacga gctggccttc gacgtcgacc tctcggccgt 2520 cgagtgcggc ctcaacagcg ccctctactt cgtggccatg gaggaggatg gcggtgtgtc 2580 gagctacccg accaacacgg ccggtgctaa gttcggcact ggggtaagtt caacgacccg 2640 agacgggtgc ccttattatc tgctgcgaaa acggacggtc cccttttgct aactaccctc 2700 ctccaaacag tactgcgacg cccaatgcgc acgcgacctc aagttcgtcg gcggcaaggg 2760 caacatcgag ggctggaagc cgtccaccaa cgatgccaat gccggtgtcg gtccttatgg 2820 cgggtgctgc gctgagatcg acgtctggta agttttgttg cctgggcagc aatggtatat 2880 tagctcgagt ggttcccgtc gttgctgacc ctctcttacc agggagtcga acaagtatgc 2940 tttcgctttc accccgcacg gttgcgagaa ccctaaatac cacgtctgcg agaccaccaa 3000 ctgcggtggc acctactccg aggaccgctt cgctggtgac tgcgatgcca acggctgcga 3060 ctacaacccc taccgcatgg gcaaccagga cttctacggt cccggcttga cggtcgatac 3120 cagcaagaag ttcacgtgag tacaccgtgc ttgaagcccc ctcccccccc ccccccaaaa 3180 aaaaaaagaa aaaagaagtc aaatgattga tgctaaccaa atcaaataac agcgtcgtca 3240 gccagttcga ggagaacaag ctcacccagt tcttcgtcca ggacggcaag aagattgaga 3300 tccccggccc caaggtcgag ggcatcgatg cggacagcgc cgctatcacc cctgagctgt 3360 gcagtgccct gttcaaggcc ttcgatgacc gtgaccgctt ctcggaggtt ggcggcttcg 3420 atgccatcaa cacggccctc agcactccca tggtcctcgt catgtccatc tgggatgatg 3480 tacgttacct aacccccccc cccttttttt ttcccgcttc tctccccgaa actgccacta 3540 cttatatacg tcccgcgtcc atgatgctta ccttttctcc ttccagcact acgccaatat 3600 gctctggctc gactcgagct acccccctga gaaggctggc cagcctggcg gtgaccgtgg 3660 cccgtgtcct caggactctg gcgtcccggc cgacgttgag gctcagtacc ctaatgcgtg 3720 agtcgaaacc gtaaaatgtc gggcaaaaaa aagatcgctc aagctaacga aataatatga 3780 ttagcaaggt catctggtcc aacatccgct tcggccccat cggctcgact gtcaacgtct 3840 aaactgcaac ctgaccgggc cctttctctc cacccccacc cctctcaagt tctctctggt 3900 ggagccctcg tgtccttctt ttcctaggtt cgcgaacctt tgagcttgtg tatcgtaggg 3960 tcattgtgta catacacaaa aacttaacat ctgctaccaa gatcttggcg ctttgccagg 4020 tcttctcaaa cctcgaagca ctgagccttt gtcctccgag tgaagtagga tgactattta 4080 cgttgcaaga ctacgcggta aaggggacgg agcagacctg ccacagatat tcgtttggtt 4140 gcttgattta tagcagagtc cgaacgtaga catggcccct gaaggtgcca accctagata 4200 gccagaagcc ttgttttacg aaagggtggt caaccaacgg tgctcctcgc tcagcgaatc 4260 tacccgcacg caatgtatcg taagaatgtg aactaaaggg aacgacgagg catagggaaa 4320 cgtcaatgtg gcttgaataa cagagttaaa tacctaatag aagaaattag catgccaaga 4380 ttgagccagc aacacatggt agaatagcca gcaaaggacg cttgttcgct tgatctcgaa 4440 ccgtccaacc tgattcgaag gaggagggaa aagttgaaga ataccggcaa taattactcg 4500 aggttcctat gccctgcaga gtctaattaa tattaaaggc accacccgca tgattccgca 4560 attataagca taataagctc gcgggcccca cacgtgcctt caccctccca tgtgtataca 4620 atctgtacct cgttattgtc gaatcgctat tccgatagcg aaggtctggc actcatcaga 4680 taccgtgaca tcgattgaga tttggccggg ccaccggtag taagcgatga gttggtcatc 4740 aattatcaac aatgcgctca atcagcgata atcagcctat caaccgcgaa atcatacgcg 4800 catcaacgaa ttgtccatca tgcacgtagc ttgtcggcag tgccgcatac cctccagagc 4860 atcatagccg ggatagaaag ctcgctttca gccgtcccag agtccgagat gcaggtagca 4920 agccttcaag accagttata tgtgacccgg gtaaaatact tggtgagatg caatgggcgt 4980 agcttcgggc acttataagc tttactagat attatctcaa ggtttctttt tgaactcctc 5040 ctagacattt actataaact accgagcttc aatgctagac gccctccttc tgttaaatag 5100 tcttttcctt ctaagagcat ctgccttttt tcccttaggc ttagaggata gggcccctcc 5160 atcttgctgc gacggcctta gccttgggga gtaattattg gtatccgcgt acctgtttcc 5220 cagacagccg aagtttcgac gacaaagtaa ttattgcgac aataccaccg ccatatgcta 5280 ttccgagtgg gtgagccccg aaaacatcgc ttaccgcatc gccatcccag acgacagagg 5340 gcgactttga tgtcttgctc cagatcgccg cacctaacac ggtgggatgg gctggtatcg 5400 tatgggacgg catcatggtc aacaaccccc tgacggggtg ttgggccaat ggaaacacca 5460 ccgttgtctc gagccggatc gcaaggtaag ccgaagagga caaatgacga tgagactttc 5520 tttctttttt attttatttt tttttaaatt tcttttttaa gcgtaatgaa aagagctaca 5580 tatctgtggt tcgttcctca atttcagcga cctctccacc gaagcatcgt caaataagaa 5640 gttgtcggaa acaaagggtg tcagaagcta tagagcttct aaggatatta gccacataca 5700 tgccatagct gtataaggct atttaacgct ttggccagct cctttgtcta taaatattag 5760 tcgttttgtc tcctttgtag ataattttaa caaggcactc ttttccttta tatagccacc 5820 tactatagac tgctttcaac gctcccggaa gcttattact acgttcggca gttataagcc 5880 tggcgccttg actactcctc tgccgacgta tctttaatat tagtagtagc ttcttctatt 5940 acgaactctc ttaccctgct ttaatacgct ttcgacgacg tgtctattat atctaagatc 6000 ctagtcgaga cttctatatg ccttactagg cctagttctt agaacttgta gtatattaaa 6060 ctatagttat aggctaaatt tgctagtata tagagatttg ttaaccttaa tagtaattat 6120 aaactagatc tagaagtttt atagtgccta acctataaat aagctagaga taaccttatt 6180 ttagcttcct aggagtaatt cctagaagga gtattacctt taatatctat agatttgata 6240 ccttctaata tagctatcat agctaaattt atataattat aagattcctt ttataaaaat 6300 attatatata ctatagatat tagtaagtag ataggatagc tataatacta gctagtatat 6360

<210> 2 <211> 450 <212> PRT

<21Β> Chrysosporium Iucknowense <400> 2

Met Lys Gln Tyr Leu Gln Tyr Leu Ala Ala Thr Leu Pro Leu Val Gly Leu Ala Thr Ala Gln Gln Ala Gly Asn Leu Gln Thr Glu Thr His Pro 20 25 30

Lys Leu Thr Trp Ser Lys cys Thr Ala Pro Gly ser Cys Gln Gln vai 35 40 45

Asn Gly Glu Val Val Ile Asp Ser Asn Trp Arg Trp Val His Asp Glu 50 55 60

Asn Ala Gln Asn Cys Tyr Asp Gly Asn Gln Trp Thr Asn Ala Cys Ser 65 70 75 80

Ser Ala Thr Asp Cys Ala Glu Asn Cys Ala Leu Glu Gly Ala Asp Tyr

85 90 95

Gln Gly Thr Tyr Gly Ala ser Thr Ser Gly Asn Ala Leu Thr Leu Thr 100 105 110

Phe Val Thr Lys His Glu Tyr Gly Thr Asn Ile Gly Ser Arg Leu Tyr 115 120 125

Leu Met Asn Gly Ala Asn Lys Tyr Gln Met Phe Thr Leu Lys Gly Asn 130 135 140

Glu Leu Ala Phe Asp vai Asp Leu Ser Ala vai Glu Cys Gly Leu Asn 145 150 155 160

ser Ala Leu Tyr Phe Val Ala Met Glu Glu Asp Gly Gly Val Ser Ser

165 170 175

Tyr Pro Thr Asn Thr Ala Gly Ala Lys Phe Gly Thr Gly Tyr Cys Asp 180 185 190

Ala Gln Cys Ala Arg Asp Leu Lys Phe Val Gly Gly Lys Gly Asn Ile 195 200 205

Glu Gly Trp Lys Pro ser Thr Asn Asp Ala Asn Ala Gly Val Gly Pro 210 215 220

Tyr Gly Gly Cys cys Ala Glu Ile Asp Val Trp Glu Ser Asn Lys Tyr 225 230 235 240

Ala Phe Ala Phe Thr Pro His Gly Cys Glu Asn Pro Lys Tyr His Val

245 250 255 Cys Glu Thr Thr Asn Cys Gly Gly Thr Tyr ser Glu Asp Arg Phe Ala 260 265 270

Gly Asp Cys Asp Ala Asn Gly Cys Asp Tyr Asn Pro Tyr Arg Met Gly 275 280 285

Asn Gln Asp Phe Tyr Gly Pro Gly Leu Thr Val Asp Thr Ser Lys Lys 290 295 300

Phe Thr vai Val ser Gln Phe Glu Glu Asn Lys Leu Thr Gln Phe Phe 305 310 315 320

Val Gln Asp Gly Lys Lys Il e Glu Ile Pro Gly Pro Lys Val Glu Gly 325 330 335

lie Asp Ala Asp ser Ala Ala Ile Thr Pro Glu Leu Cys Ser Ala Leu 340 345 350

Phe Lys Ala Phe Asp Asp Arg Asp Arg Phe Ser Glu Val Gly Gly Phe 355 360 365

Asp Ala Ile Asn Thr Ala Leu Ser Thr Pro Met Val Leu Val Met Ser 370 375 380

lie Trp Asp Asp His Tyr Ala Asn Met Leu Trp Leu Asp ser Ser Tyr 385 390 395 400

Pro Pro Glu Lys Ala Gly Gln Pro Gly Gly Asp Arg Gly Pro Cys Pro 405 410 415

Gln Asp Ser Gly Val Pro Ala Asp Val Glu Ala Gln Tyr Pro Asn Ala 420 425 430

Lys Val Ile Trp Ser Asn Ile Arg Phe Gly Pro Ile Gly Ser Thr Val 435 440 445

Asn Val 450

<210> 3 <211> 3900 <212> DNA

<213> chrysosporium lucknowense <400> 3

ccgcaagtga atatgtaatt actcaatgga agttctcgaa acggagtcca gaaatgatgt ggttctgtgg gaatgcggca agaggcgacg ttgccgtgaa tgcgtgaaca ttcccgcctc ttcttcttct cqtcttcttc cttcttcttc tttcgggtcg cggatggttg acggccagcg tgcgcacggc tgcgtgttat cgagcgtcgg tacgtctagc caacatcccg tagacacgac 240 gaccaagcgt cttgagaatg caacaacgtc tcggaacctg gcacgcatct tccgccgcag 300 gtcggcagac gccgcctggg caataccacc cctgtccagg ccctttcccc gcaggcagag 360 ccgcgctctt cctttcatgg ttattcagga acgtggcttc cgagattctc gcctgttctc 420 ccccagtcaa cctgccgacc gtaacccggt tccaccaccg cggactgtcc gcaaaacctg 480 gttcgcccga gattaatatg ctatttccgg actaagtgca caacacacaa gcaccccttc 540 cgcctcgcgc tctagaatct gctttctaac ccggttctcg ggcccttccc tttcgcgacg 600 cctccgctct ccttaccagg caccatccgc aataggtaag gtagccaacc gttttggagc 660 gtgattctgc caaggaccgc atccttgcat tcgccatctg gtcaaggacc cctctttccc 720 gctccattct ggtggctcta tcgggacggc gttccccatg gctctccagg agagtgatgt 780 gcgagtctgg agagccgggg ttggcgtcac gatgctgccc acctagggcc ggccagcccg 840 gcactgcgct cccgttgatc cgtctatccc cgtcaagagc accagccccg gcgctcgtga 900 attttcgact tgttcgactt gctacaggtg ataaagagga tgcacgccgc cctcgatcgg 960 cctgtgtggt ttctctccct cgtgccaaac cactcccacc tcccgccccg agatagttgc 1020 ttgtttcgct ccgtgagagg gacacacacc aatggccaag aagcttttca tcaccgccgc 1080 gcttgcggct gccgtgttgg cggcccccgt cattgaggag cgccagaact gcggcgctgt 1140 gtggtaagaa agcccggtcc gagtctccca tgattttctc gtcgagtaat ggcataaggg 1200 ccaccccttc gactgaccgt gagaatcgat caaatccagg actcaatgcg gcggtaacgg 1260 gtggcaaggt cccacatgct gcgcctcggg ctcgacctgc gttgcgcaga acgagtggta 1320 ctctcagtgc ctgcccaaca gccaggtgac gagttccacc actccgtcgt cgacttccac 1380 ctcgcagcgc agcaccagca cctccagcag caccaccagg agcggcagct cctcctcctc 1440 ctccaccacg cccccgcccg tctccagccc cgtgaccagc attcccggcg gtgcgacctc 1500 cacggcgagc tactctggca accccttctc gggcgtccgg ctcttcgcca acgactacta 1560 caggtccgag gtccacaatc tcgccattcc tagcatgact ggtactctgg cggccaaggc 1620 ttccgccgtc gccgaagtcc ctagcttcca gtggctcgac cggaacgtca ccatcgacac 1680 cctgatggtc cagactctgt cccaggtccg ggctctcaat aaggccggtg ccaatcctcc 1740 ctatgctggt gagttacatg gcgacttgcc ttctcgtccc ctacctttct tgacgggatc 1800 ggttacctga cctggaggca aaacaacaac agcccaactc gtcgtctacg acctccccga 1860 ccgtgactgt gccgccgctg cgtccaacgg cgagttttcg attgcaaacg gcggcgccgc 1920 caactacagg agctacatcg acgctatccg caagcacatc attgagtact cggacatccg 1980 gatcatcctg gttatcgagc ccgactcgat ggccaacatg gtgaccaaca tgaacgtggc 2040 caagtgcagc aacgccgcgt cgacgtacca cgagttgacc gtgtacgcgc tcaagcagct 2100 gaacctgccc aacgtcgcca tgtatctcga cgccggccac gccggctggc tcggctggcc 2160 cgccaacatc cagcccgccg ccgagctgtt tgccggcatc tacaatgatg ccggcaagcc 2220 ggctgccgtc cgcggcctgg ccactaacgt cgccaactac aacgcctgga gcatcgcttc 2280 ggccccgtcg tacacgtcgc ctaaccctaa ctacgacgag aagcactaca tcgaggcctt 2340 cagcccgctc ttgaactcgg ccggcttccc cgcacgcttc attgtcgaca ctggccgcaa 2400 cggcaaacaa cctaccggta tgtttttttt tcttttgtct ctgtcccccc cttttctccc 2460 ccttcagttg gcgtccacaa ggtctcttag tcctgcttca tctgtgacca acctcccccc 2520 ccccggcacc gcccacaacc gtttgactct atactcttgg gaatgggcgc cgaaactgac 2580 cgttccacag gccaacaaca gtggggtgac tggtgcaatg tcaagggcac cggctttggc 2640 gtgcgcccga cggccaacac gggccacgag ctggtcgatg cctttgtctg ggtcaagccc 2700 ggcggcgagt ccgacggcac aagcgacacc agcgccgccc gctacgacta ccactgcggc 2760 ctgtccgatg ccctgcagcc tgcccccgag gctggacagt ggttccaggc ctacttcgag 2820 cagctgctca ccaacgccaa cccgcccttc taaacctcgt cataaagaga gagagatggc 2880 gggcatgggc ctgattgggt tcattgacca tgcggctctt ctgggggtac atattttacc 2940 tacctaccta taaataaggc ggcctatcgg gctctcgctt cgtttattag gtacttgttc 3000 ttgtacatac tttgtttata catacagcag ttagcatcca ctattcgttt cgacaaagcg 3060 gaactttcca gaaaaaaaaa ggttgtacat aattagtctt taggcttcga ttctttgtgc 3120 CtttCttttt ggtaaaaaaa aaattttttt tgaggcatga ttaccttagg tacgttcgtc 3180 gttgtattgg tccccctgca ttttggcgcg agagcagctc agccccttgc aaatccctca 3240 acgggcgttc aattccctcc actcgggtct tcagcgagac cagccgtcca gagtatccca 3300 gcgtgtagtt gccccacgaa ccagtcgtcc tcgtaagcct cgtcaaagtg tccaagagca 3360 gtatagaagc aacgacctcc gtcaaaagtc tggcaccatg cgatcgggtg gtcctccccg 3420 tgcgccccgc cctcgtagga cttctcatcc acgccaagga gcacgtgcag gccgtcggac 3480 gtcgcccgcg ggtgcgcctt gaagttgtac cattcgtcct tccagacgcg ctccagctgc 3540 gcctgcttgg gttcctgcgg ttcctgcggt tcctgcgctg gccggtcggc gccgccgtct 3600 tggtcacacg cccgcagcga catgactggg tgtttcgggt cgagcagctt gacgagcccg 3660 acctggggtt ccgggtggtt gtcgaacacg gcgccaatga ggtggccgta ccattcggat 3720 gactgcatgg cgaagctggc gcagtgtacc gccacgatcc cgccgcccgc ctggacgaaa 3780 ccccgcaggg cgcccagctg cgcgccgtcc aggaactcgc ccgagcactg caggaggacg 3840 atgacgcgat acgccgagag ggagccgggg ctgaacacgg cgggatcctc gctgtcgtcc 3900 <210> 4 <211> 481 <212> PRT

<213> Chrysosporiutn Iucknowense <400> 4

Met Ala Lys Lys Leu Phe Ile Thr Ala Ala Leu Ala Ala Ala Val Leu 1 5 10 15

Ala Ala Pro Val Ile Glu Glu Arg Gln Asn Cys Gly Ala Val Thr Gln 20 25 30

Cys Gly Gly Asn Gly Trp Gln Gly Pro Thr Cys Cys Ala Ser Gly Ser 35 40 45

Thr Cys Val Ala Gln Asn Glu Trp Tyr Ser Gln Cys Leu Pro Asn Ser 50 55 60

Gln Val Thr Ser Ser Thr Thr Pro Ser Ser Thr Ser Thr ser Gln Arg 65 70 75 80

Ser Thr Ser Thr ser ser Ser Thr Thr Arg Ser Gly ser ser Ser Ser

85 90 95

Ser ser Thr Thr Pro Pro Pro Val Ser Ser Pro Val Thr Ser Ile Pro 100 105 110

Gly Gly Ala Thr Ser Thr Ala ser Tyr Ser Gly Asn Pro Phe ser Gly 115 120 125

Val Arg Leu Phe Ala Asn Asp Tyr Tyr Arg Ser Glu Val His Asn Leu 130 135 140

Ala Ile Pro Ser Met Thr Gly Thr Leu Ala Ala Lys Ala Ser Ala Val 145 150 155 160

Ala Glu vai Pro ser Phe Gln Trp Leu Asp Arg Asn Val Thr Ile Asp

165 170 175

Thr Leu Met vai Gln Thr Leu Ser Gln Val Arg Ala Leu Asn Lys Ala 180 185 190

Gly Ala Asn Pro Pro Tyr Ala Ala Gln Leu Val Val Tyr Asp Leu Pro 195 200 205

Asp Arg Asp Cys Ala Ala Ala Ala Ser Asn Gly Glu Phe Ser Ile Ala 210 215 220 Asn Gly Gly Ala Ala Asn Tyr Arg Ser Tyr Ile Asp Ala Ile Arg Lys 225 230 235 240

His Ile Ile Glu Tyr Ser Asp Ile Arg Ile lie Leu Val Ile Glu Pro

245 250 255

Asp Ser Met Ala Asn Met Val Thr Asn Met Asn Val Ala Lys Cys ser 260 265 270

Asn Ala Ala ser Thr Tyr His Glu Leu Thr Val Tyr Ala Leu Lys Gln 275 280 285

Leu Asn Leu Pro Asn Val Ala Met Tyr Leu Asp Ala G1Iy His Ala Gly 290 295 300

Trp Leu Gly Trp Pro Ala Asn Ile Gln Pro Ala Ala Glu Leu Phe Ala 305 310 315 320

Gly Ile Tyr Asn Asp Ala Gly Lys Pro Ala Ala Val Arg Gly Leu Ala

325 330 335

Thr Asn vai Ala Asn Tyr Asn Ala Trp Ser lie Ala ser Ala Pro ser 340 345 350

Tyr Thr ser Pro Asn Pro Asn Tyr Asp Glu Lys His Tyr Ile Glu Ala 355 360 365

Phe Ser Pro Leu Leu Asn Ser Ala Gly Phe Pro Ala Arg Phe Ile Val 370 375 380

Asp Thr Gly Arg Asn Gly Lys Gln Pro Thr Gly Gln Gln Gln Trp Gly 385 390 395 400

Asp Trp Cys Asn Val Lys Gly Thr Gly Phe Gly Val Arg Pro Thr Ala

405 410 415

Asn Thr Gly His Glu Leu Val Asp Ala Phe Val Trp Val Lys Pro Gly 420 425 430

Gly Glu Ser Asp Gly Thr Ser Asp Thr Ser Ala Ala Arg Tyr Asp Tyr 435 440 445

His Cys Gly Leu ser Asp Ala Leu Gln Pro Ala Pro Glu Ala Gly Gln 450 455 460

Trp Phe Gln Ala Tyr Phe Glu Gln Leu Leu Thr Asn Ala Asn Pro Pro 465 470 475 480 Phe

<210> 5

<211> 1648

<212> DNA

<213> Chyrsosporium Iucknowense

<220>

<221> misc_feature

<222> (812)..(812)

<223> η is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1162)..(1162)

<223> η is a, c, g, or t

<400> 5

atgtacgcca agttcgcgac cctcgccgcc cttgtggctg gcgccgctgc tcagaacgcc 60 tgcactctga ccgctgagaa ccacccctcg ctgacgtggt ccaagtgcac gtctggcggc 120 agctgcacca gcgtccaggg ttccatcacc atcgacgcca actggcggtg gactcaccgg 180 accgatagcg ccaccaactg ctacgagggc aacaagtggg atacttcgta ctgcagcgat 240 ggtccttctt gcgcctccaa gtgctgcatc gacggcgctg actactcgag cacctatggc 300 atcaccacga gcggtaactc cctgaacctc aagttcgtca ccaagggcca gtactcgacc 360 aacatcggct cgcgtaccta cctgatggag agcgacacca agtaccagag taagttcctc 420 tcgcacccgg ccgccgggag atgatggcgc ccagcccgct gacgcgaatg acacagtgtt 480 ccagctcctc ggcaacgagt tcaccttcga tgtcgacgtc tccaacctcg gctgcggcct 540 caatggcgcc ctctacttcg tgtccatgga tgccgatggt ggcatgtcca agtactcggg 600 caacaaggca ggtgccaagt acggtaccgg ctactgtgat tctcagtgcc cccgcgacct 660 caagttcatc aacggcgagg ccaacgtaga gaactggcag agctcgacca acgatgccaa 720 cgccggcacg ggcaagtacg gcagctgctg ctccgagatg gacgtctggg aggccaacaa 780 catggccgcc gccttcactc cccacccttg cnccgtgatc ggccagtcgc gctgcgaggg 840 cgactcgtgc ggcggtacct acagcaccga ccgctatgcc ggcatctgcg accccgacgg 900 atgcgacttc aactcgtacc gccagggcaa caagaccttc tacggcaagg gcatgacggt 960 cgacacgacc aagaagatca cggtcgtcac ccagttcctc aagaactcgg ccggcgagct 1020 ctccgagatc aagcggttct acgtccagaa cggcaaggtc atccccaact ccgagtccac 1080 catcccgggc gtcgagggca actccatcac ccaggactgg tgcgaccgcc agaaggccgc 1140 cttcggcgac gtgaccgact tncaggacaa gggcggcatg gtccagatgg gcaaggccct 1200 cgcggggccc atggtcctcg tcatgtccat ctgggacgac cacgccgtca acatgctctg 1260 gctcgactcc acctggccca tcgacggcgc cggcaagccg ggcgccgagc gcggtgcctg 1320 ccccaccacc tcgggcgtcc ccgctgaggt cgaggccgag gcccccaact ccaacgtcat 1380 cttctccaac atccgcttcg gccccatcgg ctccaccgtc tccggcctgc ccgacggcgg 1440 cagcggcaac cccaacccgc ccgtcagctc gtccaccccg gtcccctcct cgtccaccac 1500 atcctccggt tcctccggcc cgactggcgg cacgggtgtc gctaagcact atgagcaatg 1560 cggaggaatc gggttcactg gccctaccca gtgcgagagc ccctacactt gcaccaagct 1620 gaatgactgg tactcgcagt gcctgtaa 1648

<210> 6

<211> 526

<212> PRT

<213> Chrysosporium Iucknowense <220>

<221> misc_feature

<222> (249)..(249)

<223> xaa poc|e ser qua|quer aminoácido que ocorre naturalmente <220>

<221> misc_feature

<222> (365)..(365)

<223> Xaa pode ser qualquer aminoácido que ocorre naturalmente

<400> 6

Met Tyr Ala Lys Phe Ala Thr Leu Ala Ala Leu Val Ala Gly Ala Ala 15 10 15

Ala Gln Asn Ala Cys Thr Leu Thr Ala Glu Asn His Pro Ser Leu Thr 20 25 30

Trp Ser Lys Cys Thr Ser Gly Gly Ser Cys Thr ser Val Gln Gly Ser 35 40 45

Ile Thr Ile Asp Ala Asn Trp Arg Trp Thr His Arg Thr Asp ser Ala 50 55 60

Thr Asn cys Tyr Glu Gly Asn Lys Trp Asp Thr Ser Tyr Cys Ser Asp 65 70 75 80

Gly Pro Ser Cys Ala Ser Lys Cys Cys Ile Asp Gly Ala Asp Tyr Ser 85 90 95

Ser Thr Tyr Gly Ile Thr Thr Ser Gly Asn Ser Leu Asn Leu Lys Phe 100 105 110

Val Thr Lys Gly Gln Tyr ser Thr Asn Ile Gly Ser Arg Thr Tyr Leu 115

120

125

Met Glu Ser Asp Thr Lys Tyr Gln Met Phe Gln Leu Leu Gly Asn Glu 130 135 140

Phe Thr Phe Asp Val Asp Val ser Asn Leu Gly Cys Gly Leu Asn Gly 145 150 155 160

Ala Leu Tyr Phe Val ser Met Asp Ala Asp Gly Gly Met Ser Lys Tyr

165 170 175

ser Gly Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser 180 185 190

Gln Cys Pro Arg Asp Leu Lys Phe Ile Asn Gly Glu Ala Asn Val Glu 195 200 205

Asn Trp Gln Ser ser Thr Asn Asp Ala Asn Ala Gly Thr Gly Lys Tyr 210 215 220

Gly Ser Cys Cys ser Glu Met Asp vai Trp Glu Ala Asn Asn Met Ala 225 230 235 240

Ala Ala Phe Thr Pro His Pro Cys Xaa Val Ile Gly Gln Ser Arg Cys

245 250 255

Glu Gly Asp Ser Cys Gly Gly Thr Tyr Ser Thr Asp Arg Tyr Ala Gly 260 265 270

Ile Cys Asp Pro Asp Gly Cys Asp Phe Asn ser Tyr Arg Gln Gly Asn 275 280 285

Lys Thr Phe Tyr Gly Lys Gly Met Thr Val Asp Thr Thr Lys Lys Ile 290 295 300

Thr Val Val Thr Gln Phe Leu Lys Asn ser Ala Gly Glu Leu ser Glu 305 310 315 320

lie Lys Arg Phe Tyr Val Gln Asn Gly Lys Val Ile Pro Asn Ser Glu

325 330 335

Ser Thr Ile Pro Gly Val Glu Gly Asn Ser Ile Thr Gln Asp Trp Cys 340 345 350

Asp Arg Gln Lys Ala Ala Phe Gly Asp Val Thr Asp Xaa Gln Asp Lys 355 360 365 Gly Gly Met Val Gln Met Gly Lys Ala Leu Ala Gly Pro Met Val Leu 370 375 380

Val Met ser Ile Trp Asp Asp His Ala Val Asn Met Leu Trp Leu Asp 385 390 395 400

ser Thr Trp Pro Ile Asp Gly Ala Gly Lys Pro Gly Ala Glu Arg Gly 405 410 415

Ala Cys Pro Thr Thr Ser Gly Val Pro Ala Glu Val Glu Ala Glu Ala 420 425 430

Pro Asn Ser Asn Val Ile Phe ser Asn Ile Arg Phe Gly Pro Ile Gly 435 440 445

Ser Thr Val ser Gly Leu Pro Asp Gly Gly ser Gly Asn Pro Asn Pro 450 455 460

Pro Val Ser ser Ser Thr Pro Val Pro Ser Ser Ser Thr Thr Ser Ser 465 470 475 480

Gly Ser ser Gly Pro Thr Gly Gly Thr Gly Val Ala Lys His Tyr Glu 485 490 495

Gln Cys Gly Gly Ile Gly Phe Thr Gly Pro Thr Gln Cys Glu Ser Pro 500 505 510

Tyr Thr Cys Thr Lys Leu Asn Asp Trp Tyr ser Gln Cys Leu 515 520 525

<210> 7 <211> 4376 <212> DNA <213> Chrysosporium lucknowense <400> 7 ggatccacac ctaccatacc ggatagtatg ctacccaagt gacatagggt tggtaaagta 60 atacgagaac tcagagagca ctgcccatat ggctcgccaa tgacctcaag tgccaggtca 120 gctttgcgag acagacctga gcgcgtcgga tgtgtgacat ggaacgcgcc ggatcgcctt 180 gttgattaat tatagggaag tagcgaggaa ggtttcagca attgacgtga gcgtacatta 240 aaagctgtat gatttcagga agacgagcca tggaccaggt ttcaaggctg aatggcttga 300 cgacttaagc accgaacgag gaatgaaaga atgaaaagtg ggggatcatt ctggcccctc 360 ctcgtatgtc gagtgttaaa gaaggcggtt ctacggagga cctaaagagc tccaatttgc 420 tctgttgagc ttaagccaca tatctcaaga tgaatacatg tcaggcatag tcaccctgat 480 cttgttcatc agtccacaca cttttcagtt cagcatgttg attcctcatc catatcactt 540 tccattacta tctctttatg tccttggtca agactccaag gaaccgatag gtgagcatcg 600 gtgaggctcc ctcaaggtac caaagtagcc atcatcaccg aggtctggga atggcgccgt 660 gcccgatctg agtcctccaa ctccacggta cgacgacagc acgtcacatt gacgcaccac 720 ggttgaacaa gcagagaggg acacgtcttg ctacgcgaat cctggcactg gatggagacg 780 cgtgtgagca ggtttccgga accatgacgg cctggtccgg cttctcgaac aaagaagtgg 840 aacacaaaaa gaaccgaaac ggaaacgcag gcacggcatc gacgaccgga ttgtcccacg 900 gggacctcgg ccagtcaagc gttgccctgg ccgtcagctc cctggcgacg gggattcagc 960 acatctcacg ttataggcga cctcatcccc cttccgtctt gtgcggtcgt tgctccgtgc 1020 cgagtaccca ggcgtgccgg ggcctttagc cggggcggaa tcagagtcaa gatgcggccg 1080 aattggacgg cagacgaagt ttcgtagagg gtcatgatcg gcactgacga cacccacccc 1140 tgcgtgatcc cgtggccctg ggctgggaat tgccggctaa taatctacgg cttaatagat 1200 atgcactttg cacgcggtgc agataaataa gctgtggttt caaacactgg cctccgtact 1260 ttacccacca actgccgctt agcgccggga cctgagtctt gggagtgcgc ggagcggcag 1B20 ccacctcggg ttagcgtaca cacgacggct gcatgcgggg atgccgcgtg catggcttca 1380 tagtgtacga cagaccgtca agtccaaatc tgggtgatgc ttgatgagat gacagcgagc 1440 cccgtcggcg gcaccccggc tatgcatcgc gaattgacaa cactctcagc tctattgcga 1500 cccatcggat aaaagaagaa gaaaaaaatg gaccttgagt acgggcgtca gaaaccaaaa 1560 aaaaactccg gaaccaaata tgtcgggcat ggccggggtg aacgaccgct actccccgtt 1620 cccttcttcg caaacagaac gctacagagg gttttctggt ttgtcaaaga gttcggaggt 1680 cctctgctcc gcgaatgcgt ggtgaaccca ccagcagcca ttgttcttgc atgcgtggcg 1740 gaccgttagc cgctgatcga catggcgagc ttcccacctc agacctggag cagacggttg 1800 cgaggagcaa ggggctgccc tccccctgac ggtcggaccc caatgacttc cccaaacggg 1860 gacatcgagg gtcgtgcatg atggtggaaa gtagttgcag tatgggaagt accccgggtt 1920 gccaggaacc gttgttcggc cccccacatt ttctctctgc catgtcaact gtgtgtcgtt 1980 cgagagttcc tggctccggc cccccgtcca attccctaac gggaccgcgg ggcatcgcct 2040 gtaactaact tccaaatgaa gccggatatg agggagggag attggatctg gcaagccagc 2100 cattcgctgc gatcggcact cgtccgtcag ccccgcagtc catatcccca aaggcaactg 2160 ctcggcgcgg ctcaagtctt cttcggaacg tccagcccga aggcgcgcgc cagcaccggc 2220 cctatgttcc tgattgcgat cctcgatctc cagagacggg tcacctcgcc tcgaggacgg 2280 tgcaggggca tcggcttcgc ttcctagagc tccgggctgt gtgtggtcaa ggggagaagg 2340 cggcggcgcc aaggtgcgtc tcggcgcact cacccatcgc ctttaccccc ctccccccca 2400 gtatataaaa gatggccatc gtctcctcgt ctgcttggga agaaaggatc tctcgaccat 2460 gcaccacagc ctagctctaa cccagcttgt cgtgtgttgt tgcccagcat gaagttcgtg 2520 cagtccgcca ccctggcgtt cgccgccacg gccctcgctg cgccctcgcg cacgactccc 2580 cagaagcccc gccaggcctc ggcgggctgc gcgtcggccg tgacgctcga tgccagcacc 2640 aacgtgttcc agcagtacac gctgcacccc aacaacttct accgtgccga ggtcgaggct 2700 gccgccgagg ccatctccga ctcggcgctg gccgagaagg cccgcaaggt cgccgacgtc 2760 ggtaccttcc tgtggctcga caccatcgag aacattggcc ggctggagcc cgcgctcgag 2820 gacgtgccct gcgagaacat cgtgggtctc gtcatctacg acctcccggg ccgtgactgc 2880 gcggccaagg cctccaacgg cgagctcaag gtcggcgagc tcgacaggta caagaccgag 2940 tacatcgaca gtgagttaac cctttgtggc cccttctttt cccccgagag agcgtctggt 3000 tgagtggggt tgtgagagag aaaatggggc gagcttaaag actgacgtgt tggctcgcag 3060 agatcgccga gatcctcaag gcccactcca acacggcctt cgccctcgtc atcgagcccg 3120 actcgctccc caacctggtc accaatagcg acctgcagac gtgccagcag agcgcttccg 3180 gctaccgcga gggtgtcgcc tatgccctca agcagctcaa cctccccaac gtggtcatgt 3240 acatcgatgc cggccacggt ggctggctcg gctgggacgc caacctcaag cccggcgccc 3300 aggagctcgc cagcgtctac aagtctgctg gttcgccctc gcaagtccgc ggtatctcca 3360 ccaacgtggc tggttggaac gcctggtaag acactctatg tccccctcgt cggtcaatgg 3420 cgagcggaat ggcgtgaaat gcatggtgct gacctttgat cttttccccc tcctataggg 3480 accaggagcc cggtgagttc tcggacgcct cggatgccca gtacaacaag tgccagaacg 3540 agaagatcta catcaacacc tttggcgctg agctcaagtc tgccggcatg cccaaccacg 3600 ccatcatcga cactggccgc aacggtgtca ccggtctccg cgacgagtgg ggtgactggt 3660 gcaacgtcaa cggcgccggc ttcggtgtgc gcccgactgc caacactggc gacgagctcg 3720 ccgacgcctt cgtgtgggtc aagcccggtg gcgagtccga cggcaccagc gactcgtcgg 3780 cggcgcgcta cgacagcttc tgcggcaagc ccgacgcctt caagcccagc cccgaggccg 3840 gtacctggaa ccaggcctac ttcgagatgc tcctcaagaa cgccaacccg tccttctaag 3900 ctcctcgacg gcttcttgct gtcagtcgct ctgacggtgg tgtgctggtg gtgcccctgc 3960 tcctgctgct gctgctccgc ggggagggga ggcaacgaaa atgaagtcct gcttcaaaac 4020 aaaacagaaa caagcgaggc gcggtgcaat ggtcgtgcgt tcgtcttttt tcatgttccc 4080 ttctagtgta gtagtttgat agtcgtacat aaggggtttc agaaccgtct ctctgtctcg 4140 gtctttttgc gagttgttgc gactcgtgat tatggccttt gttgctcgtt gcggcagagt 4200 agaaccacag cgtgttgggg tagcagcttg ctccgtagga cgtagggaaa caacctgaga 4260 ctctqgaatt gcagtcagcc tgcgtcgccc ctctaggaaa cgaaggggag aaccagtagt 4320 ggctgcagct tacaaacgcg agcatggtga acatctccga gaaaagggag ggatcc 4376

<210> 8 <211> 395 <212> PRT

<213> Chrysosporium Iucknowense <400> 8

Met Lys Phe Val Gln ser Ala Thr Leu Ala Phe Ala Ala Thr Ala Leu 15 10 15

Ala Ala Pro ser Arg Thr Thr Pro Gln Lys Pro Arg Gln Ala Ser Ala 20 25 30

Gly Cys Ala Ser Ala vai Thr Leu Asp Ala ser Thr Asn Val Phe Gln 35 40 45

Gln Tyr Thr Leu His Pro Asn Asn Phe Tyr Arg Ala Glu Val Glu Ala 50 55 60

Ala Ala Glu Ala Ile ser Asp Ser Ala Leu Ala Glu Lys Ala Arg Lys 65 70 75 80

vai Ala Asp Val Gly Thr Phe Leu Trp Leu Asp Thr Ile Glu Asn Ile 85 90 95

Gly Arg Leu Glu Pro Ala Leu Glu Asp Val Pro Cys Glu Asn Ile Val 100 105 110

Gly Leu Val Ile Tyr Asp Leu Pro Gly Arg Asp Cys Ala Ala Lys Ala 115 120 125

Ser Asn Gly Glu Leu Lys Val Gly Glu Leu Asp Arg Tyr Lys Thr Glu 130 135 140

Tyr lie Asp Lys Ile Ala Glu Ile Leu Lys Ala His ser Asn Thr Ala 145 150 155 160

Phe Ala Leu Val Ile Glu Pro Asp ser Leu Pro Asn Leu Val Thr Asn 165 170 175

Ser Asp Leu Gln Thr Cys Gln Gln ser Ala ser Gly Tyr Arg Glu Gly 180 185 190

Val Ala Tyr Ala Leu Lys Gln Leu Asn Leu Pro Asn Val Val Met Tyr 195 200 205 Ile Asp Ala Gly His Gly Gly Trp Leu Gly Trp Asp Ala Asn Leu Lys 210 215 220

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Lys cys Gln Asn Glu Lys Ile Tyr Ile Asn Thr Phe Gly Ala Glu Leu 275 280 285

Lys ser Ala Gly Met Pro Asn His Ala Ile Ile Asp Thr Gly Arg Asn 290 295 300

Gly vai Thr Gly Leu Arg Asp Glu Trp Gly Asp Trp Cys Asn Val Asn 305 310 315 320

Gly Ala Gly Phe Gly Val Arg Pro Thr Ala Asn Thr Gly Asp Glu Leu 325 330 335

Ala Asp Ala Phe Val Trp Val Lys Pro Gly Gly Glu Ser Asp Gly Thr 340 345 350

ser Asp ser Ser Ala Ala Arg Tyr Asp ser Phe Cys Gly Lys Pro Asp 355 360 365

Ala Phe Lys Pro Ser Pro Glu Ala Gly Thr Trp Asn Gln Ala Tyr Phe 370 375 380

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<210> 9 <211> 5777 <212> DNA

<213> Chrysosporium lucknowense <400> 9

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Ile Phe Pro Ser Thr Ser Ala Ile Gln Thr Leu Ile Asn Asp Gly Tyr 115 120 125

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Val Asn Phe Val Thr Asn Ala Gly Lys Tyr Ala Val Leu Asp Pro His

165 170 175

Asn Tyr Gly Arg Tyr Tyr Gly Asn Val Ile Thr Asp Thr Asn Ala Phe 180 185 190

Arg Thr Phe Trp Thr Asn Leu Ala Lys Gln Phe Ala Ser Asn ser Leu 195 200 205

Val Ile Phe Asp Thr Asn Asn Glu Tyr Asn Thr Met Asp Gln Thr Leu 210 215 220

Val Leu Asn Leu Asn Gln Ala Ala Ile Asp Gly Ile Arg Ala Ala Gly 225 230 235 240 Ala Thr ser Gln Tyr lie Phe Val Glu Gly Asn Ala Trp ser Gly Ala 245 250 255

Trp Ser Trp Asn Thr Thr Asn Thr Asn Met Ala Ala Leu Thr Asp Pro 260 265 270

Gln Asn Lys Ile Val Tyr Glu Met His Gln Tyr Leu Asp ser Asp Ser 275 280 285

Ser Gly Thr His Ala Glu Cys Val Ser ser Asn Ile Gly Ala Gln Arg 290 295 300

Val Val Gly Ala Thr Gln Trp Leu Arg Ala Asn Gly Lys Leu Gly Val 305 310 315 320

Leu Gly Glu Phe Ala Gly Gly Ala Asn Ala Val Cys Gln Gln Ala Val 325 330 335

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165 170 175

Leu Thr Gly Ile Gly Met Ser Glu Thr Ile Lys Gly Ile Gln Asp Ala 180 185 190

Gly Val Ile Ala cys Ala Lys His Phe Ile Gly Asn Glu Gln Glu His 195 200 205

Phe Arg Gln Val Pro Glu Ala Gln Gly Tyr Gly Tyr Asn Ile Ser Glu 210 215 220

Thr Leu ser Ser Asn Ile Asp Asp Lys Thr Met His Glu Leu Tyr Leu 225 230 235 240 Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val Arg Ala Gly Val Gly Ser Val Met Cys

245 250 255

ser Tyr Gln Gln Val Asn Asn Ser Tyr Ala Cys Gln Asn Ser Lys Leu 260 265 270

Leu Asn Asp Leu Leu Lys Asn Glu Leu Gly Phe Gln Gly Phe Val Met 275 280 285

ser Asp Trp Gln Ala Gln His Thr Gly Ala Ala ser Ala Val Ala Gly 290 295 300

Leu Asp Met ser Met Pro Gly Asp Thr Gln Phe Asn Thr Gly Val Ser 305 310 315 320

Phe Trp Gly Ala Asn Leu Thr Leu Ala Val Leu Asn Gly Thr Val Pro

325 330 335

Ala Tyr Arg Leu Asp Asp Met Ala Met Arg Ile Met Ala Ala Leu Phe 340 345 350

Lys Val Thr Lys Thr Thr His Leu Glu Pro Ile Asn Phe Ser Phe Trp 355 360 365

Thr Asp Asp Thr Tyr Gly Pro Ile His Trp Ala Ala Lys His Gly Tyr 370 375 380

Gln Lys Ile Asn Ser His Val Asp Val Arg Ala Asp His Gly Asn Leu 385 390 395 400

Ile Arg Glu Ile Ala Ala Lys Gly Thr vai Leu Leu Lys Asn Thr Gly

405 410 415

Ser Leu Pro Leu Asn Lys Pro Lys Phe Val Ala Val Ile Gly Glu Asp 420 425 430

Ala Gly Ser Ser Pro Asn Gly Pro Asn Gly Cys Ser Asp Arg Gly Cys 435 440 445

Asn Glu Gly Thr Leu Ala Met Gly Trp Gly Ser Gly Thr Ala Asn Tyr 450 455 460

Pro Tyr Leu Val Ser Pro Asp Ala Ala Leu Gln Ala Arg Ala Ile Gln 465 470 475 480

Asp Gly Thr Arg Tyr Glu ser Val Leu Ser Asn Tyr Ala Glu Glu Lys 485 490 495

Thr Lys Ala Leu vai ser Gln Ala Asn Ala Thr Ala Ile Val Phe Val 500 505 510

Asn Ala Asp ser Gly Glu Gly Tyr Ile Asn Val Asp Gly Asn Glu Gly 515 520 525

Asp Arg Lys Asn Leu Thr Leu Trp Asn Asn Gly Asp Thr Leu Val Lys 530 535 540

Asn Val ser ser Trp Cys Ser Asn Thr Ile Val Val Ile His Ser Val 545 550 555 560

Gly Pro Val Leu Leu Thr Asp Trp Tyr Asp Asn Pro Asn Ile Thr Ala

565 570 575

lie Leu Trp Ala Gly Leu Pro Gly Gln Glu Ser Gly Asn Ser Ile Thr 580 585 590

Asp Val Leu Tyr Gly Lys Val Asn Pro Ala Ala Arg Ser Pro Phe Thr 595 600 605

Trp Gly Lys Thr Arg Glu ser Tyr Gly Ala Asp Val Leu Tyr Lys Pro 610 615 620

Asn Asn Gly Asn Gly Ala Pro Gln Gln Asp Phe Thr Glu Gly Val Phe 625 630 635 640

Ile Asp Tyr Arg Tyr Phe Asp Lys Val Asp Asp Asp ser Val Ile Tyr

645 650 655

Glu Phe Gly His Gly Leu ser Tyr Thr Thr Phe Glu Tyr Ser Asn Ile 660 665 670

Arg Val vai Lys Ser Asn Val Ser Glu Tyr Arg Pro Thr Thr Gly Thr 675 680 685

Thr Ala Gln Ala Pro Thr Phe Gly Asn Phe Ser Thr Asp Leu Glu Asp 690 695 700

Tyr Leu Phe Pro Lys Asp Glu Phe Pro Tyr Ile Tyr Gln Tyr Ile Tyr 705 710 715 720

Pro Tyr Leu Asn Thr Thr Asp Pro Arg Arg Ala Ser Ala Asp Pro His

725 730 735 Asp Pro Gln Pro Leu Leu Arg ser ser Gly Gly Asn Ser Pro Gly Gly

755 760 765

Asn Arg Gln Leu Tyr Asp Ile Val Tyr Thr Ile Thr Ala Asp Ile Thr

770 775 780

Asn Thr Gly Ser vai Val Gly Glu Glu vai Pro Gln Leu Tyr Val Ser

785 790 795 800

Leu Gly Gly Pro Glu Asp Pro Lys Val Gln Leu Arg Asp Phe Asp Arg

805 810 815

Met Arg Ile Glu Pro Gly Glu Thr Arg Gln Phe Thr Gly Arg Leu Thr

820 825 830

Arg Arg Asp Leu Ser Asn Trp Asp Val Thr Val Gln Asp Trp Val Ile

835 840 845

Ser Arg Tyr Pro Lys Thr Ala Tyr Val Gly Arg Ser Ser Arg Lys Leu

Asp Leu Lys Ile Glu Leu Pro 865 870

<210> 13 <211> 998 <212> DNA

<213> Chrysosporium lucknowense <400> 13

atggcccatc tctccgccac caccgggttc ctcgccctcc cggccctggc cctggcccag 60

ctctcgggca gcggccagac gacccggtac tgggactgct gcaagccgag ctgcgcctgg 120

cccggcaagg gcccctcgtc tccggtgcag gcctgcgaca agaacgacaa cccgctcaac 180

gacggcggct ccacccggtc cggctgcgac gcgggcggca gcgcctacat gtgctcctcc 240

cagagcccct gggccgtcag cgacgagctg tcgtacggct gggcggccgt caagctcgcc 300

ggcagctccg agtcgcagtg gtgctgcgcc tgctacgagc tgaccttcac cagcgggccg 360

gtcgcgggca agaagatgat tgtgcaggcg accaacaccg gtggcgacct gggcgacaac 420

cactttgacc tggccgtgag ttgcctcccc ttctccccgg accgctcaga ttagatgaga 480

ttagactttg ctcgtaaatc ggtccaagat tcccttgact gaccaacaaa catcatacgg 540

gcagatcccc ggtggcggtg tcggtatttt caacggtaag ctggtgcccc cggacccctc 600

cccggacccc tccccctttt cctccagcga gccgagttgg gatcgccgag atcgagaact 660 cacacaactt ctctctcgac agcctgcacc gaccagtacg gcgctccccc gaacggctgg 720 ggcgaccgct acggcggcat ccattccaag gaagagtgcg aatccttccc ggaggccctc 780 aagcccggct gcaactggcg cttcgactgg tacgttgctt tgacataccg gaacccaatt 840 cctccaaccc CCCCCCtttt ctcccccaac tccgggggta gtcggaatgt cgcgactgac 900 cctatttcag gttccaaaac gccgacaacc cgtcggtcac cttccaggag gtggcctgcc 960 cgtcggagct cacgtccaag agcggctgct cccgttaa 998

<210> 14 <211> 225 <212> PRT

<213> Chrysosporium Iucknowense <400> 14

Met His Leu ser Ala Thr Thr Gly Phe Leu Ala Leu Pro Ala Leu Ala 15 10 15

Leu Ala Gln Leu ser Gly ser Gly Gln Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys 20 25 BO

Cys Lys Pro ser Cys Ala Trp Pro Gly Lys Gly Pro Ser Ser Pro Val 35 40 45

Gln Ala Cys Asp Lys Asn Asp Asn Pro Leu Asn Asp Gly Gly Ser Thr 50 55 60

Arg Ser Gly Cys Asp Ala Gly Gly Ser Ala Tyr Met Cys Ser Ser Gln 65 70 75 80

Ser Pro Trp Ala Val Ser Asp Glu Leu Ser Tyr Gly Trp Ala Ala Val 85 90 95

Lys Leu Ala Gly Ser Ser Glu Ser Gln Trp cys Cys Ala Cys Tyr Glu 100 105 110

Leu Thr Phe Thr ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Lys Met Ile Val Gln 115 120 125

Ala Thr Asn Thr Gly Gly Asp Leu Gly Asp Asn His Phe Asp Leu Ala 130 135 140

Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asn Ala cys Thr Asp Gln Tyr 145 150 155 160

Gly Ala Pro Pro Asn Gly Trp Gly Asp Arg Tyr Gly Gly Ile His Ser 165 170 175 Lys Glu Glu Cys Glu Ser Phe Pro Glu Ala Leu Lys Pro Gly Cys Asn 180 185 190

Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Asn Ala Asp Asn Pro ser Val Thr Phe 195 200 205

Gln Glu Val Ala Cys Pro Ser Glu Leu Thr ser Lys Ser Gly Cys ser 210 215 220

Arg 225

<210> 15 <211> 4190 <212> DNA

<213> Chrysosporium lucknowense <400> 15

gcgcttccgg cctgggcgag taaaatgacg gaagccgggc cccgtccgac tgcgtttgtc 60 ccaactcgga agcaggcatc gttttttggg cgggaggaag cgttgcaaca cgcactatcg 120 ccaaggtgga ctcggcgcaa tctggaggtt cggcccgcgg aggacggaat ccgggctgaa 180 tctgcgcaaa ggctgaccct gcgatggtgg gaaaatgtaa atatgtgaag ttataggcat 240 ataggactca gcgatgacat ggaaattgca gaggcatgtg ggatttcagc gtttggcatg 300 cattggtcgg atctctcgcc ttgtctgatg tgatcccgcc ggaggtgttt cggtctctgg 360 ggaagggacc ccccctggcc ccccacctgc cccgcatcat gcctcgccac gactcccgcg 420 cgccgaggaa gaacttcggg tctttgtgac gggagattcc actgagtgag cattggccaa 480 ccaagcacac aattactccg tacatacaca gtacttctga ctccgtaaag taaaccgtgt 540 gtttcaaaga tcggtaatcc gtaacaggta ctccgtatct aaggtaaatt taccctgtgc 600 acggagcaga acctgaactt cttcccccct cttactcgag tagtcaccct actccaacca 660 gcggcttttc aactcgcaaa gtcttgttta taacagtgca tatacctgca tttcgtatct 720 cgctagtgta aagacgacca cacgcggaca aagaaagaaa aatccaattg cccgatggct 780 cttagtttga ggacagcagc gaaggactac actgcgccgt agtgaccagg ccaagaaacg 840 cgaatcgtat attaacggca aatcaaaatg gattatatgc catttcgctt ccgggttgcg 900 tgctcgtccg aagtctggtg ccgatcgatt gcgaaccccc ggaatcgcgg gatgattcct 960 acagccgccg aaaggggggg ggggggaggg gggtctggac gggacgtgca taacttcgaa 1020 tttctagaat attgcggatt gggttccctt cagccctgcg agcgcgcccc cttctggaac 1080 cgcacccttc accggttcca cacacagagg acatgggtgg aaatgtgtac ctgacggttg 1140 cccctttqqg acagtggaga ggcggatgtt cggataacca tccggagccg cagtgtcgac 1200 caagatcttg gcttaccatc gacaccaaca tgcggactcg tccctcagtc atggagcctt 1260 ggctcgcgga gcctccgttc gaagcggcta tcccgtcctg ccagcggagg atctcgtacc 1320 gcttccgcga actgtgaatg tcctgggtat aagagcatgg cgcgaccttg tctcgtcagg 1380 aacggggagg aggagggctt ggttagggtc gcgttcgttt ggagattgct gagctctgag 1440 ccttcggtcc ttggatccct gcggtccccg gtctcctctc tctctctctc tctctctctc 1500 tctCtCtCtt cttcccacgc tcgttcgaca gacgcctccc cttcttcgct ctcctttccc 1560 tcgcacgtag cacactaata gtgcaccatg cgcgtctcta gtttggtcgc ggcccttgct 1620 accggtggtc ttgtcgccgc cacgcctaag cccaaggggt cgtcgccccc tggggccgtg 1680 gacgcgaacc ctttcaaggg caagacgcag ttcgtcaacc cggcatgggc ggccaagctg 1740 gaacagacca aaaaggcgtt cctggccagg aacgacaccg tcaatgccgc caagacggag 1800 aaggtccagc agaccagctc gttcgtctgg gtctcgagga tcgccgagct ctccaacatc 1860 gacgacgcca tcgcggctgc ccgcaaggcg cagaagaaga cgggcaggag gcagatcgtc 1920 ggcctggtgc tctacaacct tccggaccgc gactgcagcg cgggcgagag cgcgggcgag 1980 ctcagcagcg acaagaacgg gctcgagatc tacaagactg agttcgtcaa gcccttcgcc 2040 gacaaggtgg cggccgcaaa ggacctcgac ttcgccatcg tcctggagcc cgactcgctg 2100 gccaacctgg tcaccaacct gggcatcgag ttctgcgcca acgccgcccc cgtctaccgc 2160 gagggcatcg cctatgccat ctccagcctt cagcagccaa acgtgcactt gtacatcgat 2220 gctgcccacg gcggctggct cggctgggac gacaacctgc cgctggccgc caaggagttt 2280 gccgaggtgg tcaagcttgc cggcgagggc aagaagatcc gcggcttcgt caccaacgtg 2340 tccaactaca accccttcca cgccgtcgtg cgcgagaact ttaccgagtg gagcaactcg 2400 tgggacgagt ctcactacgc ctcctcgctc acaccgttcc tcgagaaaga ggggctgccg 2460 gcacgcttca tcgtcgacca gggtcgcgtt gccctcccgg gagcccgcaa ggagtggtga 2520 gtttcgacca gattgaccct cgacccatgc gaccgagatt gctgacgatt gaattgcgtg 2580 tcccgtcccc caggggtgaa tggtgcaacg tggcacccgc cggatttggc cccgcgccca 2640 cgaccagggt caacaacacc gtcgtcgatg ctctcgtctg ggtcaagcct ggcggcgaga 2700 gcgacggcga gtgtggcttg gctggcgccc ccaaggccgg ccagtggttc gacgagtacg 2760 cccagatgct ggtcgagaat gcccacccgt ctgtcgtcca caagtggtag ataaattttg 2820 gagtccgaga agggtcccag atagactttt gttttaaaac aaaatgcaag gtgtcgacag 2880 atactggctt aacattaacc aagcaccatg aacatgactt gtcaacatat tgatacattc 2940 cgctgctttc ccatacgtgc tctcaggtct cagggatcaa atggataggt cggtaatgca 3000 aaacgatcca ttggatatcc agaagagaga aaaaaaaaag gacatgcatg ccttgtctgt 3060 catcatgagg aaacaaagga aaaacaaacg atcgtcgtgt tccaacaagc tttccaagac 3120 cacaagaccc atccaccaac acaaccaaac gacaagcaat acgatggacc gccgttgttc 3180 catctctcaa gagctgacta aacgaacagt cgttgaaatc atcctacatg agtacgccgc 3240 accacctgtt atcgtgtaaa ccaaatcgcc tgttaaagtg catcatctct taggtatgat 3300 cgtaagttcc ggtcacggtc acggatcagg gatggttctc aattcgtgtg tcgcgtagcc 3360 gccgccgtat ctggacaaga cttcttgtat tgctccgaaa ccgcttttgc cgccctaata 3420 atctgtagcc ttcttacctg gtggtgcctt gaaagacgcg gcaggcaaca cttcgcaggt 3480 ctgtggcgca ccagcaccag gctgtggtga tgccccggaa ccggtcgtcg acttgctcgc 3540 ggtgtcctcg gctggtgggg atgggggtga tgagggcttg gagggtgttg ttgcgcccgc 3600 aacatccggc tccggctccg gaccgtccac agacattgga cctgcgagca tgactcgtgc 3660 cttcagccag accaaagcca tgccatcatc gcctctgccg acgctgttga gcgggaggct 3720 gatgttctca gccagaactg cgggctgtac ggccatgacc atgggctgtt cggtctggcc 3780 gtcttgcggc ggtttctccc tgccagcttg ttgtgcgcgg tgcctgcgag attcgacttc 3840 gacctgggcg tggcagaggg tgacgaggga cgttgacgcc ttgatctcct tgctccccat 3900 gtccttccac ccgtacaggc ggacgggtgc catacgcgtc cacagcctgc acgagaacct 3960 cagggcgtcg tcaatgagtt ctgtcaactt gctctccagc ctctctatgc cgcgagcatc 4020 ctgatcctgg agcagaaacc gtgccgagcc tccgaggaaa cgctccttca gcttccgcgc 4080 gtagtttagg cgtgattcaa caaacgtccg gcgggactcg ttgttgcccg cagcagcgac 4140 gtccttgatg ctgaagccgc cgtcggcgaa caggcgcatc atctgggccc 4190

<210> 16 <211> 381 <212> PRT

<213> chrysosporium Iucknowense <400> 16

Met Arg Val Ser Ser Leu Val Ala Ala Leu Ala Thr Gly Gly Leu Val 1-5 10 15

Ala Ala Thr Pro Lys Pro Lys Gly Ser Ser Pro Pro Gly Ala Val Asp 20 25 30

Ala Asn Pro Phe Lys Gly Lys Thr Gln Phe Val Asn Pro Ala Trp Ala 35 40 45

Ala Lys Leu Glu Gln Thr Lys Lys Ala Phe Leu Ala Arg Asn Asp Thr 50 55 60

Val Asn Ala Ala Lys Thr Glu Lys Val Gln Gln Thr ser Ser Phe Val Trp Val Ser Arg Ile Ala Glu Leu Ser Asn Ile Asp Asp Ala Ile Ala

85 90 95

Ala Ala Arg Lys Ala Gln Lys Lys Thr Gly Arg Arg Gln Ile Val Gly 100 105 110

Leu Val Leu Tyr Asn Leu Pro Asp Arg Asp Cys Ser Ala Gly Glu Ser 115 120 125

Ala Gly Glu Leu Ser ser Asp Lys Asn Gly Leu Glu Ile Tyr Lys Thr 130 135 140

Glu Phe Val Lys Pro Phe Ala Asp Lys Val Ala Ala Ala Lys Asp Leu 145 150 155 160

Asp Phe Ala Ile Val Leu Glu Pro Asp Ser Leu Ala Asn Leu Val Thr

165 170 175

Asn Leu Gly Ile Glu Phe Cys Ala Asn Ala Ala Pro Val Tyr Arg Glu 180 185 190

Gly Ile Ala Tyr Ala Ile ser Ser Leu Gln Gln Pro Asn Val His Leu 195 200 205

Tyr Ile Asp Ala Ala His Gly Gly Trp Leu Gly Trp Asp Asp Asn Leu 210 215 220

Pro Leu Ala Ala Lys Glu Phe Ala Glu Val Val Lys Leu Ala Gly Glu 225 230 235 240

Gly Lys Lys Ile Arg Gly Phe Val Thr Asn Val Ser Asn Tyr Asn Pro

245 250 255

Phe His Ala Val Val Arg Glu Asn Phe Thr Glu Trp Ser Asn ser Trp 260 265 270

Asp Glu Ser His Tyr Ala Ser Ser Leu Thr Pro Phe Leu Glu Lys Glu 275 280 285

Gly Leu Pro Ala Arg Phe Ile Val Asp Gln Gly Arg Val Ala Leu Pro 290 295 300

Gly Ala Arg Lys Glu Trp Gly Glu Trp cys Asn Val Ala Pro Ala Gly 305 310 315 320 Phe Gly Pro Ala Pro Thr Thr Arg Val Asn Asn Thr Val vai Asp Ala

325

330

335

Leu Val Trp Val Lys Pro Gly Gly Glu Ser Asp Gly Glu Cys Gly Leu

340

345

350

Ala Gly Ala Pro Lys Ala Gly Gln Trp Phe Asp Glu Tyr Ala Gln Met

355

360

365

Leu Val Glu Asn Ala His Pro ser Val vai His Lys Trp

370

375

380

<210> 17 <211> 3000 <212> DNA

<213> Chrysosporium lucknowense <400> 17

cgcggccccg tctttgaacg cttgagaagc gcacggtgaa gaaccatcaa ctccgattcc 60

gctcctcatc ctcccacgaa gccgattgaa atagccacag cggctatgta cggattactc 120

tgctccgttt gcacatccat acacagcgct atttttaaaa gttcaggacg gccaagcccg 180

gttcttggaa cggacgaccc ggattccgaa agctccagcg ctcaatgcgg tcagtcgtgg 240

cgctgatcct gctgatctgc tgatctcata aacccgcaac ttcaactttt cactttgaag 300

cgtatacacg cagcgcctct ttcaccggcg cattcatact cgcaaattaa ccgctaatat 360

cctcgcactt ggataatgtg tagccgacac ggaggagggg ggttgggggg gggttggggg 420

gagacatgat ggtctgccca acggatatta ttattttgtt gttttgtata attactgcgg 480

caacattctc aaaggggccg tgcctcgcgg cgggaaagcc catgacagag aattggacag 540

ctccaagctc gcgatatact ctaacaacgg cgtgactcgg caatgaaggc ctgccgctcg 600

agtgataggg cgaagtaaaa cggacgttac atgcggcact tagccggctg atgccggaga 660

atacgggatt caacgataca atcacacgat gcgacacacc tcggcgactt ggcgctctat 720

ggaagaaggc tgggttaaag ctggcgtaga ttttgcgcgt cttggtttct taaccgggtt 780

atttctattt ctcatatgcc gcgagcgaat gcggggtgca gagcgcccgg gagtcgatgg 840

tcctatcaga caagagcctg gccccggaac ctgggataat agaagccaaa ttaagccatg 900

ggagtatcgt ccgggggtag gaaccgcacg ggcaactaga ggaggaagaa tttggtataa 960

agggaggacg gcggaacagg cttgatggac atgaatcaga agacgacact gggcaactaa 1020

acagcttgca gcagagtttt gtgccttgca taggccctcg atatcatggt ctcgttcact 1080

ctcctcctca cggtcatcgc cgctgcggtg acgacggcca gccctctcga ggtggtcaag 1140

cgcggcatcc agccgggcac gggcacccac gaggggtact tctactcgtt ctggaccgac 1200

qgccgtggct cggtcgactt caaccccggg ccccgcggct cgtacagcgt cacctggaac 1260 aacgtcaaca actgggttgg cggcaagggc tggaacccgg gcccgccgcg caagattgcg 1320 tacaacggca cctggaacaa ctacaacgtg aacagctgtg cgttgtcctc ctctttctcc 1380 ctttcgcttg ttttccttga tgattgggat ccattttaaa agagaaggaa aaaaaaaaca 1440 aaggaaaata gaagataact aacgccaagc tctggcagac ctcgccctgt acggctggac 1500 tcgcaacccg ctggtcgagt attacatcgt ggaggcatac ggcacgtaca acccctcgtc 1560 gggcacggcg cggctgggca ccatcgagga cgacggcggc gtgtacgaca tctacaagac 1620 gacgcggtac aaccagccgt ccatcgaggg gacctccacc ttcgaccagt actggtccgt 1680 ccgccgccag aagcgcgtcg gcggcactat cgacacgggc aagcactttg acgagtggaa 1740 gcgccagggc aacctccagc tcggcacctg gaactacatg atcatggcca ccgagggcta 1800 ccagagctct ggttcggcca ctatcgaggt ccgggaggcc taaagaagcc aggcgccttt 1860 cttttgtttt gcaggagggg gtagaggggg ggggggaggg aaaacgaaaa gtagcagggt 1920 ggttttatgc cggcagccgt gggccattcg agtgcaacct gtatctctct ctctcccaag 1980 tctccgggct ccttctcaga gaacttcaat atgtctgggg acaaaccacc ttgtgaaata 2040 caacggtaat tatctaagtt tgagtgccct atcgtatgct tctgaaaatt tcctgctcct 2100 tgatacaagt cggtttgagc cgagccaatg agactgtgtc gattgataga ggccctgaag 2160 gatcaagcgc gatgcaacaa ttaagcatga ctacgtgcct agctgcagat aaatggaagc 2220 cactcaccaa ggtcaacccc gcatactggc acgtaagaac cttccgtgta caaggcccaa 2280 ccgactcaca tatctatctg cttgggtttt gggatgcggt tttttaccca caaaacaaat 2340 ttgatacaat gctctgctgt gcccgggttg ctgagaccaa gccgtaatca gcgggcaggg 2400 aatcgagtag gtcacgcctg ttgcttggtc tagaacaaac taatattaaa aagccttgtg 2460 ctcggcacac atacagaact cgacctgagg catgttcttg gaaggcggct agccagtcaa 2520 gtctggcacc aggccttggt ctcgtcgagg ataccgaggg cgaggaggat gaggaagacc 2580 tctttctcgc ctcagatctc ttaggggacg aagaagacaa cgccggagcc acacaataat 2640 taggtctcat atcagacgtt tcggcctggc cgagctaata tgtctaatta tgcccatcag 2700 ccgtatgtcg aggcaggttg caccgatacg ctcgccgcgc cgcctcattc atctccgact 2760 gggcacaatg tcgccatctc ggccgtcaag gtggtgcaag atacctatta tgcaagcaga 2820 ggatcagatg gcgggccgat acgagcggct gctccggctt gcgagaaagc cgcttcgcag 2880 caaggtatcg tggcaggccg ccattttcgg ttgggtattc tttgtcttgt ttgcttcgta 2940 attatgtcct ggctggcatt gtgggaaggg gcgaacctct tgatttccga tgggggtcga 3000

<210> 18 <211> 218 <212> PRT <213> chrysosporium Tucknowense <400> 18

Met Val Ser Phe Thr Leu Leu Leu Thr Val Ile Ala Ala Ala Val Thr 1 5 10 15

Thr Ala ser Pro Leu Glu Val Val Lys Arg Gly Ile Gln Pro Gly Thr 20 25 30

Gly Thr His Glu Gly Tyr Phe Tyr Ser Phe Trp Thr Asp Gly Arg Gly 35 40 45

Ser Val Asp Phe Asn Pro Gly Pro Arg Gly Ser Tyr Ser Val Thr Trp 50 55 60

Asn Asn Val Asn Asn Trp Val Gly Gly Lys Gly Trp Asn Pro Gly Pro 65 70 75 80

Pro Arg Lys Ile Ala Tyr Asn Gly Thr Trp Asn Asn Tyr Asn Val Asn

85 90 95

ser Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Asn Pro Leu Val Glu Tyr 100 105 110

Tyr Ile Val Glu Ala Tyr Gly Thr Tyr Asn Pro ser Ser Gly Thr Ala 115 120 125

Arg Leu Gly Thr Ile Glu Asp Asp Gly Gly Val Tyr Asp Ile Tyr Lys 130 135 140

Thr Thr Arg Tyr Asn Gln Pro Ser Ile Glu Gly Thr Ser Thr Phe Asp 145 150 155 160

Gln Tyr Trp Ser Val Arg Arg Gln Lys Arg vai Gly Gly Thr Ile Asp

165 170 175

Thr Gly Lys His Phe Asp Glu Trp Lys Arg Gln Gly Asn Leu Gln Leu 180 185 190

Gly Thr Trp Asn Tyr Met Ile Met Ala Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ser 195 200 205

Gly ser Ala Thr Ile Glu Val Arg Glu Ala 210 215

Claims (62)

1. Formulação enzimática, a dita formulação CARACTERIZADA pelo fato de que compreende pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste de CBH Ib (SEQ ID NO. 2), CBH Ilb (SEQ ID NO. 4), EG Il (SEQ ID NO. 10), EG Vl (SEQ ID NO. 16), BGL (SEQ ID NO 12) e Xyl Il (SEQ ID NO. 18).

2. Método de produzir açúcares fermentáveis a partir de material lignocelulósico, o dito método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) fornecer uma formulação enzimática, em que a dita formulação enzimática com- preende pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste de CBH Ib (SEQ ID NO. 2), CBH Ilb (SEQ ID NO. 4), EG Il (SEQ ID NO. 10), EG Vl (SEQ ID NO. 16), BGL (SEQ ID NO 12) e Xyl Il (SEQ ID NO. 18); (b) aplicar a dita formulação enzimática ao material lignocelulósico para produzir açúcares fermentáveis.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que os açúcares fermentáveis compreendem pelo menos um açúcar do grupo que consiste de glicose, xilose, arabinose, galactose, manose, ramnose, sacarose e frutose.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o material lignocelulósico é selecionado a partir do grupo que consiste de podas de pomar, chaparral, resíduos de moagem, resíduos urbanos de madeira, resíduos urbanos, resíduos de corte de madeira, desbastes florestais, safras de madeira de curta rotação, resíduos in- dustriais, palha de trigo, palha de aveia, palha de arroz, palha de cevada, palha de centeio, palha do linho, cascas de soja, cascas de arroz, palha de arroz, alimentação de glúten de milho, cascas de aveia, cana-de-açúcar, forragem de milho, hastes do milho, sabugos de milho, palhas de milho, pradarias, gamagrass, capim rabo-de-raposa; polpa de beterraba, polpa de frutas cítricas, cascas de semente, resíduos animais celulósicos, cortes de grama, algodão, algas, árvores, arbustos, gramas, trigo, palha de trigo, bagaço de cana de açúcar, milho, palhas de milho, grão de milho, fibra dos grãos, produtos e subprodutos da moagem úmida ou moagem a seco de grãos, resíduos sólidos urbanos, papel usado, sobras orgâni- cas, material herbáceo, resíduos agrícolas, resíduos florestais, resíduos sólidos urbanos, papel usado, resíduos da fabricação de polpa e papel, galhos, matos, canas, milho, palhas de milho, safras energéticas, florestas, frutos, flores, grãos, gramas, safras herbáceas, fo- lhas, casca de árvore, acículas, lenhas, raízes, mudas, arbustos, gramíneas do tipo switch- grass, árvores, vegetais, cascas de frutos, videiras, polpa de beterraba, triguilhos, cascas de aveia, madeiras duras e moles, materiais de resíduos orgânicos gerados a partir de proces- sos agrícolas, resíduos da madeira florestal, ou combinações dos mesmos.

5. Método de produzir um produto de fermentação ou um material de partida para um produto de fermentação a partir de um açúcar fermentável, o dito método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) fornecer uma formulação enzimática, em que a dita formulação enzimática com- preende pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste de CBH Ib (SEQ ID NO. 2), CBH Ilb (SEQ ID NO. 4), EG Il (SEQ ID NO. 10), EG Vl (SEQ ID NO. 16), BGL (SEQ ID NO 12), e Xyl Il (SEQ ID NO. 18); (b) aplicar a dita formulação enzimática ao material lignocelulósico para produzir um açúcar fermentável; e (c) fermentar o dito açúcar fermentável para produzir um produto de fermentação.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o açúcar fermentável é selecionado a partir do grupo que consiste de glicose, xilose, arabino- se, galactose, manose, ramnose, sacarose e frutose.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o material lignocelulósico é selecionado a partir do grupo que consiste de podas de pomar, chaparral, resíduos de moagem, resíduos urbanos de madeira, resíduos urbanos, resíduos de corte de madeira, desbastes florestais, safras de madeira de curta rotação, resíduos in- dustriais, palha de trigo, palha de aveia, palha de arroz, palha de cevada, palha de centeio, palha do linho, cascas de soja, cascas de arroz, palha de arroz, alimentação de glúten de milho, cascas de aveia, cana-de-açúcar, forragem de milho, hastes do milho, sabugos de milho, palhas de milho, pradarias, gamagrass, capim rabo-de-raposa; polpa de beterraba, polpa de frutas cítricas, cascas de semente, resíduos animais celulósicos, cortes de grama, algodão, algas, árvores, arbustos, gramas, trigo, palha de trigo, bagaço de cana de açúcar, milho, palhas de milho, grão de milho, fibra dos grãos, produtos e subprodutos da moagem úmida ou moagem a seco de grãos, resíduos sólidos urbanos, papel usado, sobras orgâni- cas, material herbáceo, resíduos agrícolas, resíduos florestais, resíduos sólidos urbanos, papel usado, resíduos da fabricação de polpa e papel, galhos, matos, canas, milho, palhas de milho, safras energéticas, florestas, frutos, flores, grãos, gramas, safras herbáceas, fo- lhas, casca de árvore, acículas, lenhas, raízes, mudas, arbustos, gramíneas do tipo switch- grass, árvores, vegetais, cascas de frutos, videiras, polpa de beterraba, triguilhos, cascas de aveia, madeiras duras e moles, materiais de resíduos orgânicos gerados a partir de proces- sos agrícolas, resíduos da madeira florestal, ou combinações dos mesmos.

8. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito produto de fermentação é um biocombustível.

9. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito produto de fermentação é selecionado a partir do grupo que consiste de ácido láctico; plásticos; especialidades químicas, ácidos orgânicos, solventes, suplementos de ração ani- mal, produtos farmacêuticos, vitaminas; aminoácidos, enzimas industriais, e matérias-primas químicas.

10. Método de produzir energia a partir de um açúcar fermentável, o dito método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) fornecer uma formulação enzimática, em que a dita formulação enzimática com- preende pelo menos uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste de CBH Ib (SEQ ID NO. 2), CBH Ilb (SEQ ID NO. 4), EG Il (SEQ ID NO. 10), EG Vl (SEQ ID NO. 16), BGL (SEQ ID NO 12), e Xyl Il (SEQ ID NO. 18); (b) aplicar a dita formulação enzimática ao material lignocelulósico para produzir um açúcar fermentável; (c) fermentar o dito açúcar fermentável para produzir um produto de fermentação combustível; (d) queimar o dito produto de fermentação combustível para produzir energia.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o açúcar fermentável é selecionado a partir do grupo que consiste de glicose, xilose, arabi- nose, galactose, manose, ramnose, sacarose e frutose.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o material lignocelulósico é selecionado a partir do grupo que consiste de podas de pomar, chaparral, resíduos de moagem, resíduos urbanos de madeira, resíduos urbanos, resíduos de corte de madeira, desbastes florestais, safras de madeira de curta rotação, resíduos in- dustriais, palha de trigo, palha de aveia, palha de arroz, palha de cevada, palha de centeio, palha do linho, cascas de soja, cascas de arroz, palha de arroz, alimentação de glúten de milho, cascas de aveia, cana-de-açúcar, ferragem de milho, hastes do milho, sabugos de milho, palhas de milho, pradarias, gamagrass, capim rabo-de-raposa; polpa de beterraba, polpa de frutas cítricas, cascas de semente, resíduos animais celulósicos, cortes de grama, algodão, algas, árvores, arbustos, gramas, trigo, palha de trigo, bagaço de cana de açúcar, milho, palhas de milho, grão de milho, fibra dos grãos, produtos e subprodutos da moagem úmida ou moagem a seco de grãos, resíduos sólidos urbanos, papel usado, sobras orgâni- cas, material herbáceo, resíduos agrícolas, resíduos florestais, resíduos sólidos urbanos, papel usado, resíduos da fabricação de polpa e papel, galhos, matos, canas, milho, palhas de milho, safras energéticas, florestas, frutos, flores, grãos, gramas, safras herbáceas, fo- lhas, casca de árvore, acículas, lenhas, raízes, mudas, arbustos, gramíneas do tipo switch- grass, árvores, vegetais, cascas de frutos, videiras, polpa de beterraba, triguilhos, cascas de aveia, madeiras duras e moles, materiais de resíduos orgânicos gerados a partir de proces- sos agrícolas, resíduos da madeira florestal, ou combinações dos mesmos.

13. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito produto de fermentação combustível é um álcool.

14. Método, de acordo com as reivindicações 2, 5, ou 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o material lignocelulósico é submetido a um pré-tratamento antes de ser exposto às enzimas.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o pré-tratamento compreende expor a biomassa lignocelulósica a um ácido, base, solvente, calor, peróxido, ozônio, trituração mecânica, trituração, moagem, despressurização rápida, ou um combinação dos mesmos.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito solvente é uma mistura de acetona/etanol ou organosolvente.

17. Cepa de Chrysosporium Iucknowense mutante, CARACTERIZADA pelo fato de que é capaz de expressar pelo menos uma celobiohidrolase e pelo menos uma endo-1,4-B- glicanase em níveis mais altos do que a cepa não mutante correspondente sob as mesmas condições; em que pelo menos a dita uma celobiohidrolase é selecionada a partir do grupo que consiste de CBH Ia, CBH lb, CBH Ha e CBH Nb; e em que pelo menos a dita uma endo-1,4-B-glicanase é selecionada a partir do gru- po que consiste de EG II, EG V, e EG VI.

18. Cepa de Chrysosporium lucknowense mutante, de acordo com a reivindicação 17, a dita cepa CARACTERIZADA pelo fato de que é capaz de expressar uma B-glicosidase e/ou uma xilanase em níveis mais altos do que a cepa não mutante correspondente sob as mesmas condições.

19. Cepa de Chrysosporium Iucknowense mutante, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita xilanase é Xyl II.

20. Cepa de Chrysosporium Iucknowense mutante, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita mutante é derivada de uma cepa mutante de Chrysosporium Iueknowense selecionada a partir do grupo que consiste de cepa de C. luek- nowense C1 (VKM F-3500 D), UV13-6 (VKM F-3632 D), NG7C-19 (VKM F-3633 D), e UV18-25 (VKM F-3631 D).

21. Proteína, CARACTERIZADA pelo fato de que exibe pelo menos 65 % da iden- tidade de aminoácido conforme determinado pelo algoritmo BLAST com a seqüência de a- minoácido de CBH Ib da SEQ ID NO. 2 ou uma parte desta tendo pelo menos 20 aminoáci- dos contíguos.

22. Proteína, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína exibe pelo menos 70 % da identidade de aminoácido conforme determinado pelo algoritmo BLAST com a seqüência de aminoácido de CBH Ib da SEQ ID NO. 2 ou uma parte desta tendo pelo menos 20 aminoácidos contíguos.

23. Proteína, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita proteína exibe pelo menos 75 % da identidade de aminoácido conforme determi- nado pelo algoritmo BLAST com a seqüência de aminoácido de CBH Ib da SEQ ID NO. 2 ou uma parte desta tendo pelo menos 20 aminoácidos contíguos.

24. Seqüência de ácido nucléico, CARACTERIZADA pelo fato de que codifica uma proteína conforme definida na reivindicação 21.

25. Seqüência de ácido nucléico, CARACTERIZADA pelo fato de que codifica uma proteína conforme definida na reivindicação 22.

26. Seqüência de ácido nucléico, CARACTERIZADA pelo fato de que codifica uma proteína conforme definida na reivindicação 23.

27. Proteína, CARACTERIZADA pelo fato de que exibe pelo menos 65 % da iden- tidade do aminoácido conforme determinado pelo algoritmo BLAST com a seqüência de a- minoácido de CBH IIb da SEQ ID NO. 4 ou uma parte desta tendo pelo menos 20 aminoáci- dos contíguos.

28. Proteína, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína exibe pelo menos 70 % da identidade de aminoácido conforme determinado pelo algoritmo BLAST com a seqüência de aminoácido de CBH Ilb da SEQ ID NO. 4 ou uma parte desta tendo pelo menos 20 aminoácidos contíguos.

29. Proteína, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita proteína exibe pelo menos 75 % da identidade de aminoácido conforme determi- nado pelo algoritmo BLAST com a seqüência de aminoácido de CBH Ilb da SEQ ID NO. 4 ou uma parte desta tendo pelo menos 20 aminoácidos contíguos.

30. Seqüência de ácido nucléico, CARACTERIZADA pelo fato de que codifica uma proteína conforme definida na reivindicação 27.

31. Seqüência de ácido nucléico, CARACTERIZADA pelo fato de que codifica uma proteína conforme definida na reivindicação 28.

32. Seqüência de ácido nucléico, CARACTERIZADA pelo fato de que codifica uma proteína conforme definida na reivindicação 29.

33. Proteína, CARACTERIZADA pelo fato de que exibe pelo menos 65 % da iden- tidade do aminoácido conforme determinado pelo algoritmo BLAST com a seqüência de a- minoácido de EG VI da SEQ ID NO. 16 ou uma parte desta tendo pelo menos 20 aminoáci- dos contíguos.

34. Proteína, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína exibe pelo menos 70 % da identidade de aminoácido conforme determinado pelo algoritmo BLAST com a seqüência de aminoácido de EG VI da SEQ ID NO. 16 ou uma parte desta tendo pelo menos 20 aminoácidos contíguos.

35. Proteína, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita proteína exibe pelo menos 75% da identidade de aminoácido conforme determi- nado pelo algoritmo BLAST com a seqüência de aminoácido de EG VI da SEQ ID NO. 16 ou uma parte desta tendo pelo menos 20 aminoácidos contíguos.

36. Seqüência de ácido nucléico, CARACTERIZADA pelo fato de que codifica uma proteína conforme definida na reivindicação 33.

37. Seqüência de ácido nucléico, CARACTERIZADA pelo fato de que codifica uma proteína conforme definida na reivindicação 34.

38. Seqüência de ácido nucléico, CARACTERIZADA pelo fato de que codifica uma proteína conforme definida na reivindicação 35.

39. Proteína, CARACTERIZADA pelo fato de que exibe pelo menos 65 % da iden- tidade de aminoácido conforme determinado pelo algoritmo BLAST com a seqüência de a- minoácido de BGL da SEQ ID NO. 12 ou uma parte desta tendo pelo menos 20 aminoácidos contíguos.

40. Proteína, de acordo com a reivindicação 39, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína exibe pelo menos 70 % da identidade de aminoácido conforme determinado pelo algoritmo BLAST com a seqüência de aminoácido de BGL da SEQ ID NO. 12 ou uma parte desta tendo pelo menos 20 aminoácidos contíguos.

41. Proteína, de acordo com a reivindicação 42, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita proteína exibe pelo menos 75 % da identidade de aminoácido conforme determi- nado pelo algoritmo BLAST com a seqüência de aminoácido de BGL da SEQ ID NO. 12 ou uma parte desta tendo pelo menos 20 aminoácidos contíguos.

42. Seqüência de ácido nucléico, CARACTERIZADA pelo fato de que codifica uma proteína conforme definida na reivindicação 39.

43. Seqüência de ácido nucléico, CARACTERIZADA pelo fato de que codifica uma proteína conforme definida na reivindicação 40.

44. Seqüência de ácido nucléico, CARACTERIZADA pelo fato de que codifica uma proteína conforme definida na reivindicação 41.

45. Proteína, CARACTERIZADA pelo fato de que exibe pelo menos 65 % da iden- tidade de aminoácido conforme determinado pelo algoritmo BLAST com a seqüência de a- minoácido de Xyl Il da SEQ ID NO. 18 ou uma parte desta tendo pelo menos 20 aminoáci- dos contíguos.

46. Proteína, de acordo com a reivindicação 45, CARACTERIZADA pelo fato de ue a proteína exibe pelo menos 70 % da identidade de aminoácido conforme determinado pelo algoritmo BLAST com a seqüência de aminoácido de Xyl Il da SEQ ID NO. 18 ou uma parte desta tendo pelo menos 20 aminoácidos contíguos.

47. Proteína, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita proteína exibe pelo menos 75 % da identidade de aminoácido conforme determi- nado pelo algoritmo BLAST com a seqüência de aminoácido de Xyl Il da SEQ ID NO. 18 ou uma parte desta tendo pelo menos 20 aminoácidos contíguos.

48. Seqüência de ácido nucléico, CARACTERIZADA pelo fato de que codifica uma proteína conforme definida na reivindicação 45.

49. Seqüência de ácido nucléico, CARACTERIZADA pelo fato de que codifica uma proteína conforme definida na reivindicação 46.

50. Seqüência de ácido nucléico, CARACTERIZADA pelo fato de que codifica uma proteína conforme definida na reivindicação 47.

51. Seqüência de ácido nucléico, CARACTERIZADA pelo fato de que tem pelo menos 80 % de homologia com a seqüência de ácido nucléico que codifica CBH Ib como mostrado na SEQ ID NO. 1.

52. Seqüência de ácido nucléico, CARACTERIZADA pelo fato de que tem pelo menos 80 % de homologia com a seqüência de ácido nucléico que codifica CBH Ilb como mostrado na SEQ ID NO. 3.

53. Seqüência de ácido nucléico, CARACTERIZADA pelo fato de que tem pelo menos 80 % de homologia com a seqüência de ácido nucléico que codifica EG Vl como mostrado na SEQ ID NO. 15.

54. Seqüência de ácido nucléico, CARACTERIZADA pelo fato de que tem pelo menos 80 % de homologia com a seqüência de ácido nucléico que codifica BGL como mos- trado na SEQ ID NO. 11.

55. Seqüência de ácido nucléico, CARACTERIZADA pelo fato de que tem pelo menos 80 % de homologia com o ácido nucléico que codifica Xyl Il como mostrado na SEQ ID NO. 17.

56. Método para degradar um material lignocelulósico em açúcares fermentáveis, o dito método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende contatar o material lignocelulósico com uma quantidade eficaz de um produto multi- enzimático derivado de um microorganismo, para produzir pelo menos um açúcar fermentá- vel em que pelo menos uma enzima no produto multienzimático é selecionada a partir do grupo que consiste de CBH Ia (SEQ ID NO. 6), CBH Ib (SEQ ID NO. 2), CBH Ila (SEQ ID NO 8), CBH Ilb (SEQ ID NO. 4), EG Il (SEQ ID NO. 10), EG V (SEQ ID NO. 14), EG Vl (SEQ ID NO. 16), BGL (SEQ ID NO. 12), e Xyl Il (SEQ ID NO. 18).

57. Microorganismo ou planta, CARACTERIZADO pelo fato de que é capaz de ex- pressar uma ou mais de uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste de CBH Ia (SEQ ID NO. 6), CBH Ib (SEQ ID NO. 2), CBH Ila (SEQ ID1NO 8), CBH Ilb (SEQ ID NO. 4), EG Il (SEQ ID NO. 10), EG V (SEQ ID NO. 14), EG Vl (SEQ ID NO. 16), BGL (SEQ ID NO. -12), e Xyl Il (SEQ ID NO. 18).

58. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 57, CARACTERIZADO pelo fa- to de que o dito microorganismo é um fungo.

59. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 58, CARACTERIZADO pelo fa- to de que o dito fungo é selecionado a partir do grupo que consiste de Talaromyces, Asper- gillus, Trichoderma, Neurospora, Penicillium, Fusarium, Humicola, Myceliophthora, Corynas- cus, Chaetomium, Tolypocladium, Thielavia, Acremonium, Sporotrichum, Thermoascus, e Chrysosporium.

60. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito fungo é Chrysosporium lucknowense.

61. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 60, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito Chrysosporium é uma cepa selecionada a partir do grupo que consiste da cepa do tipo selvagem, Acc. N2 VKM F-3500 D; Cl UV13-6, Acc. Na VKM F-3632 D; cepa C1 NG7C-19, Acc. N2 VKM F-3633 D; e Cl UV18-25, Acc. Ne VKM F-3631 D.

62. Seqüência de ácido nucléico, CARACTERIZADA pelo fato de que tem pelo menos 80 % de homologia com a seqüência de ácido nucléico que codifica EG II como mostrado na SEQ ID NO. 9.