CN109735524A

CN109735524A - 一种具有嗜冷特性的碱性果胶酶及其应用

Info

Publication number: CN109735524A
Application number: CN201910211067.2A
Authority: CN
Inventors: 陈豪; 陈鹏; 狄国虎; 郑洲
Original assignee: Qingdao University
Current assignee: Qingdao University
Priority date: 2019-03-20
Filing date: 2019-03-20
Publication date: 2019-05-10
Anticipated expiration: 2039-03-20
Also published as: CN109735524B

Abstract

本发明涉及一种具有嗜冷（Cold‑adapted）特性的内切型碱性果胶酶PelV307及其应用。所述果胶酶PelV307的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的果胶酶PelV307氨基酸序列与已知功能的果胶酶的相似度只有56%。本发明所述的果胶酶最适反应温度为30℃，在0℃和10℃下的酶活力分别能达到30℃活性下的33.4%和68.6%。本发明所述果胶酶为碱性果胶酶，最适反应pH为8.6，降解方式为内切，降解产物为二糖和三糖，具有良好的应用前景。

Description

一种具有嗜冷特性的碱性果胶酶及其应用

技术领域

本发明涉及一种具有嗜冷特性的碱性果胶酶及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

果胶是植物细胞壁和中胶层的重要组成部分，主要是直链α-1,4糖苷键连接的D-半乳糖醛酸残基组成的复合多糖，一般带有阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、海藻糖、乳糖等组成的侧链，游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子，特别是与硼化物结合在一起，含有20种不同的糖苷键。

果胶酶是一类分解果胶质的酶的总称，是含有多种组分的复合酶。果胶酶广泛分布在高等植物和微生物中。目前多种微生物来源果胶酶已经进入到商品化应用阶段，销售额可占到微生物酶制剂产值的25%。但是目前商品化的果胶酶多为酸性果胶酶，在碱性条件下活性较弱。碱性果胶酶研究较少，寻找具有特殊性质的碱性果胶酶，并研究其降解条件及最终产物具有重要意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种具有嗜冷（Cold-adapted）特性的碱性果胶酶PelV307及其应用。该酶与已有功能的果胶酶的氨基酸相似度仅为56%。最适反应温度为30℃，最适反应pH为8.6；具有嗜冷的特性，在0 ℃和10 ℃下的酶活力分别能达到最大反应温度下活性的33.4%和68.6%。该酶降解方式为内切，降解主产物为不饱和二糖和三糖。

一方面，本发明提供一种新型具有嗜冷特性的碱性果胶酶PelV307，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

SEQ ID NO.1：

MSQKYLSLSLVSLAVAGSMALNSAYAASLSTNQELTAADIGYATENGGTTGGADAVSDNIYLVSNKTDFKAALKEDKGEPRIIQISGTIDISGGEEYSDFDDQKSRSQIKIPADTTIIGVTSDAGFTNGSLVVSKVENVIIRNISIETPVDVEPHYEDGDGWNAEWDSMTITYSTNVWVDHVTFDDGSFTDADYEEVDGEEYVQHDGQLDIKHGSDYVTVSNSIFKNHNKTMLIGHSKSNSSEDDGHLRVTLANNIFSSIIQRTPRVRFGKIHVFNNLFEGDYKDDTYGYMYSFGLGYKGSIFSEKNIFTIDNLKDSKKCKLVSVKQSNSSLLDDDSVFNGSSLSLDDCDIPTDNLSWTVPYNYSLLSTDELEASLESNAGAGKLYL

另一方面，本发明还提供所述果胶酶PelV307对应的核酸序列，如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

ATGTCTCAAAAATACCTATCTCTATCTCTAGTTTCTCTAGCTGTTGCTGGTTCTATGGCTCTAAACTCTGCTTACGCTGCTTCTCTATCTACTAACCAAGAACTAACTGCTGCTGACATCGGTTACGCTACTGAAAACGGTGGTACTACTGGTGGTGCTGACGCTGTTTCTGACAACATCTACCTAGTTTCTAACAAAACTGACTTCAAAGCTGCTCTAAAAGAAGACAAAGGTGAACCACGTATCATCCAAATCTCTGGTACTATCGACATCTCTGGTGGTGAAGAATACTCTGACTTCGACGACCAAAAATCTCGTTCTCAAATCAAAATCCCAGCTGACACTACTATCATCGGTGTTACTTCTGACGCTGGTTTCACTAACGGTTCTCTAGTTGTTTCTAAAGTTGAAAACGTTATCATCCGTAACATCTCTATCGAAACTCCAGTTGACGTTGAACCACACTACGAAGACGGTGACGGTTGGAACGCTGAATGGGACTCTATGACTATCACTTACTCTACTAACGTTTGGGTTGACCACGTTACTTTCGACGACGGTTCTTTCACTGACGCTGACTACGAAGAAGTTGACGGTGAAGAATACGTTCAACACGACGGTCAACTAGACATCAAACACGGTTCTGACTACGTTACTGTTTCTAACTCTATCTTCAAAAACCACAACAAAACTATGCTAATCGGTCACTCTAAATCTAACTCTTCTGAAGACGACGGTCACCTACGTGTTACTCTAGCTAACAACATCTTCTCTTCTATCATCCAACGTACTCCACGTGTTCGTTTCGGTAAAATCCACGTTTTCAACAACCTATTCGAAGGTGACTACAAAGACGACACTTACGGTTACATGTACTCTTTCGGTCTAGGTTACAAAGGTTCTATCTTCTCTGAAAAAAACATCTTCACTATCGACAACCTAAAAGACTCTAAAAAATGTAAACTAGTTTCTGTTAAACAATCTAACTCTTCTCTACTAGACGACGACTCTGTTTTCAACGGTTCTTCTCTATCTCTAGACGACTGTGACATCCCAACTGACAACCTATCTTGGACTGTTCCATACAACTACTCTCTACTATCTACTGACGAACTAGAAGCTTCTCTAGAATCTAACGCTGGTGCTGGTAAACTATACCTATAA

另一方面，本发明还提供一种所述果胶酶PelV307的制备方法。

另一方面，本发明还提供了所述果胶酶PelV307在裂解果胶中的应用。

另一方面，本发明还提供了所述果胶酶PelV307在制备果胶寡糖中的应用。

另一方面，一种裂解果胶的方法，所选用的果胶酶为所述果胶酶PelV307。

优选：所述裂解条件中反应温度为0~60℃。最适反应温度为30℃。

优选：所述裂解条件中反应pH为3.0~10.6。最适反应pH为8.6。

有益效果：

1.本发明的果胶酶PelV307为结构与功能新颖的酶，归属于多糖裂解酶第1家族（PL-1），其氨基酸序列与已知功能的果胶酶序列相似度最高仅为56%。

2.本发明提供了一种制备该新型果胶酶的方法，即利用基因工程的技术方法，将果胶酶PelV307的基因序列异源重组表达到大肠杆菌，经摇瓶发酵后，发酵液酶活力高达120.9 U/mL。并且该酶纯化方法简单，利用镍柱对其进行一步亲和纯化，回收率达到71.3%，蛋白质纯度高达95%。

3.本发明的果胶酶PelV307具有优良的理化性质，该酶最适反应pH为8.6。并且，其具有嗜冷特性，在0 ℃和10 ℃下的酶活力分别能达到最大反应温度下活性的33.4%和68.6%。该酶降解方式为内切，降解主产物为不饱和果胶二糖和三糖

综上所述，本发明所述的果胶酶PelV307具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明果胶酶PelV307与已知功能果胶酶序列之间的进化关系结果；

图2为本发明果胶酶PelV307蛋白质分离纯化图（M，蛋白质标准品；1，纯化所得果胶酶PelV307）；

图3为本发明果胶酶PelV307的温度和pH适应性分析（A，果胶酶PelV307的最适反应温度；B，果胶酶PelV307的温度稳定性；C，果胶酶PelV307的最适反应pH；D，果胶酶PelV307的pH稳定性）；

图4为本发明粘度法检测果胶酶PelV307的降解方式（实线为反应体系粘度变化，虚线为反应体系A235变化）；

图5为高效液相法（A）和阴离子一级质谱法（B）检测本发明果胶酶PelV307的降解产物（DP2，不饱和果胶二糖；DP3，不饱和果胶三糖）。

具体实施方式

实施例1 果胶酶PelV307序列分析

本发明所述果胶酶PelV307的产酶基因pelV307为人工合成序列。前期研究中，我们发现海洋细菌Vibrio sp. HY628具有较高的果胶酶活性，对其进行全基因测序时，发现其含有一个预测的果胶酶序列。我们将该基因序列根据宿主（大肠杆菌的）的密码子偏好性，进行了序列优化，并由华大基因公司进行全合成。本发明所述果胶酶PelV307包含有1164个碱基序列，编码387个氨基酸序列。利用National Center for Biotechnology Information(NCBI)中的保守结构域分析Conserved domain (CDD)和多重序列比对Basic LocalAlignment Search Tool (Blast)发现，该序列包含有一个多糖裂解酶第1家族（PL-1）的保守区。已经报道的果胶酶中，与PelV307氨基酸序列相似度最高的为来源于Dickeya chrysanthemi的多糖裂解酶第1家族（PL-1）的果胶酶PelD（Genbank AAA24854），两者之间的氨基酸序列相似度（Identity）为56%。本发明所述的果胶酶PelV307氨基酸序列进行Blast分析，将其与已报道的果胶酶，利用ClustalX软件进行多重序列比对，并利用Mega7.1软件进行进化树分析。如图1所示，果胶酶PelV307与其他已经报道的果胶酶具有较远的亲缘关系，为一个新颖的果胶酶。

实施例2 果胶酶PelV307的重组表达

将实施例1中所述的果胶酶PelV307的产酶基因序列以限制性内切酶Nde I和Xho I为酶切位点，设计重组引物如下（下划线为限制性内切酶位点）：

正向引物：SEQ ID NO.3：pelV307EF：

5’- CATATG TCTCAAAAATACCTATCTCT-3’ (Nde I)

反向引物：SEQ ID NO.4：pelV307ER：

5’- CTCGAGTAGGTATAGTTTACCAGCACC -3’ (Xho I)

PCR扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；72℃延伸5分钟；4℃稳定15分钟。PCR反应所用DNA聚合酶为Primerstar HS购自大连宝生物公司。

PCR产物用限制性内切酶Nde I和Xho I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物。pET24a (+)质粒DNA（美国Invitrogen公司），同样用限制性内切酶Nde I和Xho I进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。酶切所用酶和底物反应体系（温度、时间、DNA用量等）均参照大连宝生物提供的产品说明操作。

双酶切处理的PCR产物和pET-24a(+)质粒载体参照DNA连接酶（大连宝生物公司）说明书进行连接反应；连接产物转化至大肠杆菌DH5α菌株（美国Invitrogen公司），涂布在Luria-Bertani (LB)培养基固体平板上（含有50 μg/mL卡纳霉素的），37℃温箱中培养12-16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至LB液体培养基中（含有50 μg/mL卡纳霉素），转速为180 rpm的37℃摇床中培养过夜。将单克隆进行序列测定，选择阳性克隆，并将其命名为pET-24a(+)-pelV307。重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)（购自大连宝生物公司），将重组大肠菌株命名为BL21(DE3)/pET-24a(+)-pelV307，保存在-80℃备用。

实施例3 果胶酶PelV307的发酵及纯化制备方法

将实施例2中构建的大肠杆菌BL21(DE3)/pET-24a(+)-pelV307转接至LB液体培养基中（50 μg/mL卡纳霉素），在37℃摇床中180 rpm震荡培养至OD₆₀₀=0.6，加入终浓度为0.1 mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），在20℃诱导20 h。果胶酶活性测定方法为：100 μl酶液加入900 μl 0.3%果胶底物（20 mM Gly-NaOH缓冲液，pH=8.6），在30℃下反应10 min，用分光光度计测定A235数值。酶活力定义为1 ml酶液引起A235数值增加0.1为一个酶活力单位。发酵液酶活力可达120.9 U/mL。

发酵停止后，12000 rpm离心10 min，弃菌体，收集上清液，上样于5 mL镍离子亲和层析柱，上样流速为5 ml/min，利用10 mM咪唑洗脱，去除杂蛋白，再利用150 mM的咪唑洗脱，收集洗脱组分。将活性成分透析去除咪唑，分装储存在-20℃备用。通过镍离子一步亲和纯化，蛋白回收率达到71.3%。纯化所得果胶酶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），如图2所示，纯化所得PelV307的分子量大约为36.5 kDa，与序列分析中预测的蛋白大小一致。通过凝胶分析发现，纯化所得果胶酶PelV307的蛋白纯度达到95%以上。

实施例4 温度和pH对果胶酶PelV307的影响

将实施例3中纯化所得果胶酶PelV307 100 μl加入900 μl 0.3%果胶底物（20 mM Gly-NaOH缓冲液，pH=8.6），在不同温度（0-60℃）下反应10 min，用分光光度计测定A235数值，以最高酶活力为100%，计算不同温度下果胶酶PelV307的相对酶活力。如图3A所示，果胶酶PelV307的最适反应温度为30℃。具有嗜冷的特性，在0 ℃和10 ℃下的酶活力分别能达到最大反应温度下活性的33.4%和68.6%。

将实施例3中纯化所得果胶酶PelV307（1 ml）在不同温度（0-60 ℃）下孵育1 h，取出后，立即在其最适反应温度（30℃）下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100%，如图3B所示，果胶酶PelV307温度稳定性较差，在30 ℃下孵育1 h，酶即失去大部分活性，利于在反应过程中定向灭活，终止反应。

将实施例3中纯化所得果胶酶PelV307 100 μl加入900 μl 0.3%褐藻胶底物（Gly-NaOH缓冲液，pH=8.6），在4种不同缓冲液中反应10 min，用分光光度计测定A235数值，以最高酶活力为100%，计算不同pH条件下果胶酶PelV307的相对酶活力。使用的4种缓冲液分别为50 mM 磷酸盐缓冲液，甘氨酸-NaOH缓冲液，Na₂HPO₄ ^-柠檬酸缓冲液，Tris-HCl缓冲液。如图3C所示，果胶酶PelV307的最适反应pH为8.6。

将实施例3中纯化所得果胶酶PelV307在不同pH条件（3-10.6）下孵育12 h，取出后，立即在其最适反应pH（8.6）下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100%，如图3D所示，果胶酶PelV307只在比较狭窄的pH范围内保持稳定。

实施例5 果胶酶PelV307降解方式的粘度法检测

使用乌氏粘度计进行降解方式的确定，0.1 ml果胶酶PelV307酶液（30 U）加入9.9 ml0.3%果胶底物，30℃反应不同时间（1、5、10、30、60 min），煮沸10 min终止反应。在室温条件下，利用乌氏粘度计计算不同酶解时间的产物粘度。同时，利用A235法测定不同酶解时间的产物的吸光度变化，测定对应的酶活力。通过测定结果（图4）可知，酶解反应初期（1-5分钟），产物粘度急剧下降，而此时A235法检测的酶解产物形成的不饱和双键没有急剧增加，说明果胶酶PelV307的酶解方式为内切。

实施例6 果胶酶PelV307降解产物的高效液相检测

将实施例3中纯化所得果胶酶PelV307（10 U）与0.1%的果胶底物共孵育过夜，降解产物12,000 g离心10分钟，弃沉淀，将上清20 μl上样至预平衡（0.2 M的碳酸氢铵）的凝胶过滤柱（Superdex peptide 10/300）。流速为0.6 ml/min，流动相为0.2 M的碳酸氢铵，检测时间为40分钟，在235 nm下检测吸光度。如图5A所示，与标准寡糖出峰时间进行比对发现，果胶酶PelV307的降解产物主要为不饱和果胶二糖和三糖。

实施例7 果胶酶PelV307酶解产物质谱（ESI-MS）分析

将实施例6中孵育所得样品进行脱盐处理，并与乙腈进行等体积混合，进行阴离子一级质谱检测，确定酶解产物的分子量。阴离子模式一级质谱结果表明（图5B），降解主产物为不饱和果胶二糖和三糖，与HPLC检测结果一致。

序列表

<110> 青岛大学

<120> 一种具有嗜冷特性的碱性果胶酶及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 387

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Gln Lys Tyr Leu Ser Leu Ser Leu Val Ser Leu Ala Val Ala

1 5 10 15

Gly Ser Met Ala Leu Asn Ser Ala Tyr Ala Ala Ser Leu Ser Thr Asn

20 25 30

Gln Glu Leu Thr Ala Ala Asp Ile Gly Tyr Ala Thr Glu Asn Gly Gly

35 40 45

Thr Thr Gly Gly Ala Asp Ala Val Ser Asp Asn Ile Tyr Leu Val Ser

50 55 60

Asn Lys Thr Asp Phe Lys Ala Ala Leu Lys Glu Asp Lys Gly Glu Pro

65 70 75 80

Arg Ile Ile Gln Ile Ser Gly Thr Ile Asp Ile Ser Gly Gly Glu Glu

85 90 95

Tyr Ser Asp Phe Asp Asp Gln Lys Ser Arg Ser Gln Ile Lys Ile Pro

100 105 110

Ala Asp Thr Thr Ile Ile Gly Val Thr Ser Asp Ala Gly Phe Thr Asn

115 120 125

Gly Ser Leu Val Val Ser Lys Val Glu Asn Val Ile Ile Arg Asn Ile

130 135 140

Ser Ile Glu Thr Pro Val Asp Val Glu Pro His Tyr Glu Asp Gly Asp

145 150 155 160

Gly Trp Asn Ala Glu Trp Asp Ser Met Thr Ile Thr Tyr Ser Thr Asn

165 170 175

Val Trp Val Asp His Val Thr Phe Asp Asp Gly Ser Phe Thr Asp Ala

180 185 190

Asp Tyr Glu Glu Val Asp Gly Glu Glu Tyr Val Gln His Asp Gly Gln

195 200 205

Leu Asp Ile Lys His Gly Ser Asp Tyr Val Thr Val Ser Asn Ser Ile

210 215 220

Phe Lys Asn His Asn Lys Thr Met Leu Ile Gly His Ser Lys Ser Asn

225 230 235 240

Ser Ser Glu Asp Asp Gly His Leu Arg Val Thr Leu Ala Asn Asn Ile

245 250 255

Phe Ser Ser Ile Ile Gln Arg Thr Pro Arg Val Arg Phe Gly Lys Ile

260 265 270

His Val Phe Asn Asn Leu Phe Glu Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Thr Tyr

275 280 285

Gly Tyr Met Tyr Ser Phe Gly Leu Gly Tyr Lys Gly Ser Ile Phe Ser

290 295 300

Glu Lys Asn Ile Phe Thr Ile Asp Asn Leu Lys Asp Ser Lys Lys Cys

305 310 315 320

Lys Leu Val Ser Val Lys Gln Ser Asn Ser Ser Leu Leu Asp Asp Asp

325 330 335

Ser Val Phe Asn Gly Ser Ser Leu Ser Leu Asp Asp Cys Asp Ile Pro

340 345 350

Thr Asp Asn Leu Ser Trp Thr Val Pro Tyr Asn Tyr Ser Leu Leu Ser

355 360 365

Thr Asp Glu Leu Glu Ala Ser Leu Glu Ser Asn Ala Gly Ala Gly Lys

370 375 380

Leu Tyr Leu

385

<210> 2

<211> 1164

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtctcaaa aatacctatc tctatctcta gtttctctag ctgttgctgg ttctatggct 60

ctaaactctg cttacgctgc ttctctatct actaaccaag aactaactgc tgctgacatc 120

ggttacgcta ctgaaaacgg tggtactact ggtggtgctg acgctgtttc tgacaacatc 180

tacctagttt ctaacaaaac tgacttcaaa gctgctctaa aagaagacaa aggtgaacca 240

cgtatcatcc aaatctctgg tactatcgac atctctggtg gtgaagaata ctctgacttc 300

gacgaccaaa aatctcgttc tcaaatcaaa atcccagctg acactactat catcggtgtt 360

acttctgacg ctggtttcac taacggttct ctagttgttt ctaaagttga aaacgttatc 420

atccgtaaca tctctatcga aactccagtt gacgttgaac cacactacga agacggtgac 480

ggttggaacg ctgaatggga ctctatgact atcacttact ctactaacgt ttgggttgac 540

cacgttactt tcgacgacgg ttctttcact gacgctgact acgaagaagt tgacggtgaa 600

gaatacgttc aacacgacgg tcaactagac atcaaacacg gttctgacta cgttactgtt 660

tctaactcta tcttcaaaaa ccacaacaaa actatgctaa tcggtcactc taaatctaac 720

tcttctgaag acgacggtca cctacgtgtt actctagcta acaacatctt ctcttctatc 780

atccaacgta ctccacgtgt tcgtttcggt aaaatccacg ttttcaacaa cctattcgaa 840

ggtgactaca aagacgacac ttacggttac atgtactctt tcggtctagg ttacaaaggt 900

tctatcttct ctgaaaaaaa catcttcact atcgacaacc taaaagactc taaaaaatgt 960

aaactagttt ctgttaaaca atctaactct tctctactag acgacgactc tgttttcaac 1020

ggttcttctc tatctctaga cgactgtgac atcccaactg acaacctatc ttggactgtt 1080

ccatacaact actctctact atctactgac gaactagaag cttctctaga atctaacgct 1140

ggtgctggta aactatacct ataa 1164

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catatgtctc aaaaatacct atctct 26

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcgagtagg tatagtttac cagcacc 27

Claims

1.一种具有嗜冷特性的碱性果胶酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的果胶酶所对应的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的果胶酶的制备与纯化方法。

4.如权利要求1所述的果胶酶在裂解大分子果胶中的应用。

5.如权利要求1所述的果胶酶在制备不饱和果胶寡糖中的应用。

6.一种果胶寡糖的制备方法，其特征是，所选用的果胶酶为权利要求1所述的具有嗜冷特性的碱性果胶酶。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征是，裂解条件中反应温度为0~60℃。

8.如权利要求6所述的制备方法，其特征是，裂解条件中反应pH为3.0~10.6。