CN114774400A

CN114774400A - 一种高活性突变果胶裂解酶及应用

Info

Publication number: CN114774400A
Application number: CN202210389716.XA
Authority: CN
Inventors: 汪俊卿; 马俊; 李丕武; 王瑞明; 肖静; 刘开泉; 王婷; 吉兴香; 田中建
Original assignee: Qilu University of Technology
Current assignee: Qilu University of Technology
Priority date: 2022-04-13
Filing date: 2022-04-13
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2042-04-13
Also published as: CN116515871A; CN116286907A; CN114774400B

Abstract

一种高活性突变果胶裂解酶及应用，具体为突变果胶裂解酶PGLA‑rep4、突变果胶裂解酶PGLA‑rep1、突变果胶裂解酶PGLA‑rep2，本发明改造后的果胶裂解酶酶活力提高，在制浆、造纸、纺织、饲料等领域具有广泛的应用前景。

Description

一种高活性突变果胶裂解酶及应用

技术领域

本发明涉及一种高活性突变果胶裂解酶及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

果胶酶是一类能催化分解植物中果胶质(由D-半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键聚合而成)的酶的总称，主要包括果胶酯酶、聚甲基半乳醛酸酶、聚半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸裂解酶和聚甲基半乳糖醛酸裂解酶等。如果根据应用领域和最适pH值来分类，果胶酶通常可以分为酸性果胶酶和碱性果胶酶。酸性果胶酶一般指聚半乳糖醛酸酶，其最适pH值为3.5～5，主要应用于果胶的提取和酒类的澄清。碱性果胶酶一般指聚半乳糖醛酸裂解酶，其最适pH值为8～10，它能通过反式消去的作用方式断裂果胶质分子的α-l,4糖苷键，将聚合物果胶质分解成小分子半乳糖醛酸。

中国专利文献CN108588061A(申请号：201810396518.X)公开了一种比酶活及热稳定性提高的低温碱性果胶裂解酶突变体。该果胶裂解酶突变体是将野生型低温碱性果胶裂解酶的第184和第185位上的谷氨酸和赖氨酸突变为天冬氨酸和丝氨酸，显著提高了低温碱性果胶裂解酶的比酶活及热稳定性。该发明涉及的定点突变提高碱性果胶裂解酶比酶活的方法与本发明提高碱性果胶裂解酶酶活力的方法有所不同。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种高活性突变果胶裂解酶及应用。

本发明提供的突变果胶裂解酶PGLA-rep4、突变果胶裂解酶PGLA-rep1、突变果胶裂解酶PGLA-rep2酶活力明显提高。

本发明技术方案如下：

一种突变果胶裂解酶PGLA-rep4编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种突变果胶裂解酶PGLA-rep4的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组载体，包含上述突变果胶裂解酶PGLA-rep4编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。

一种重组菌，包含上述突变果胶裂解酶PGLA-rep4编码基因的核苷酸序列，如SEQID NO.1所示。

一种含突变果胶裂解酶PGLA-rep4基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)将合成的pET-28a(+)-PGLA质粒通过正向PCR扩增pET-28a(+)-PGLA-4基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

(2)通过正向PCR扩增rep4基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

(3)将步骤(1)中制得的pET-28a(+)-PGLA-4基因片段与步骤(2)制得的rep4基因片段进行无缝克隆连接，得到重组质粒pET-28a(+)-PGLA-rep4；

(4)制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将步骤(3)制得的重组质粒pET-28a(+)-PGLA-rep4转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，即得含突变果胶裂解酶PGLA-rep4的大肠杆菌工程菌。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，正向PCR扩增以pET-28a(+)-PGLA质粒为模板，扩增引物的核苷酸序列如下：

F1:ATCTATATCGATGGTACCATCACCC SEQ ID NO.5；

R1:ACCCCCCGCACCGCCTGT SEQ ID NO.6；

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：

PCR扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸3.2min，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，正向PCR扩增模板为Pel SWU基因片段，基因序列在NCBI数据库中的登录号为AB428424，扩增引物的核苷酸序列如下：

F2:ccacaggcggtgcggggggtCAGACGGTAACCGTAACAACGG SEQ ID NO.7；

R2:atggtaccatcgatatagatTTTTAAAGGCGTATTTGCATTCTT SEQ ID NO.8；

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸15sec，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，无缝克隆PCR扩增体系如下，总体系为20μl：

所述的无缝克隆程序如下：

37℃反应30min，4℃保存；

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，筛选阳性克隆的方法为：将转化细胞涂布在含有50μg/mL卡纳霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养，挑取单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37℃培养过夜，然后通过PCR验证，得到目的基因条带的阳性克隆子，然后测序，保留测序结果正确的菌株作为目的表达菌株。

一种突变果胶裂解酶PGLA-rep1编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

一种突变果胶裂解酶PGLA-rep1的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。

一种重组载体，包含上述突变果胶裂解酶PGLA-rep1编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.9所示。

一种重组菌，包含上述突变果胶裂解酶PGLA-rep1编码基因的核苷酸序列，如SEQID NO.9所示。

一种含突变果胶裂解酶PGLA-rep1基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：

①通过反向PCR直接扩增得到pET-28a(+)-PGLA-rep1质粒，其核苷酸序列如SEQID NO.11所示；

②制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将步骤①制得的重组质粒pET-28a(+)-PGLA-rep1转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，即得含突变果胶裂解酶PGLA-rep1的大肠杆菌工程菌。

根据本发明优选的，所述步骤①中，反向PCR扩增以pET-28a(+)-PGLA质粒为模板，扩增引物的核苷酸序列如下：

F1-1:CGGGCAAAGTAAATCCGCTTGCCGACTTCAGCTTACAAGGTTTTGCCACTCTCAATG SEQ IDNO.12；

R1-1:AAGCGGATTTACTTTGCCCGAGTTTAAGGCAGAAGCCATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC SEQ ID NO.13；

根据本发明优选的，所述步骤①中，PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：

PCR扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸3.5min，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

根据本发明优选的，所述步骤②中，筛选阳性克隆的方法为：将转化细胞涂布在含有50μg/mL卡纳霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养，挑取单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37℃培养过夜，然后通过PCR验证，得到目的基因条带的阳性克隆子，然后测序，保留测序结果正确的菌株作为目的表达菌株。

一种突变果胶裂解酶PGLA-rep2编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

一种突变果胶裂解酶PGLA-rep2的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。

一种重组载体，包含上述突变果胶裂解酶PGLA-rep2编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.14所示。

一种重组菌，包含上述突变果胶裂解酶PGLA-rep2编码基因的核苷酸序列，如SEQID NO.14所示。

一种含突变果胶裂解酶PGLA-rep2基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，包括如下步骤：

<1>将合成的pET-28a(+)-PGLA质粒通过正向PCR扩增pET-28a(+)-PGLA-2基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；

<2>通过正向PCR扩增rep2基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

<3>将步骤<1>中制得的pET-28a(+)-PGLA-2基因片段与步骤(2)制得的rep2基因片段进行无缝克隆连接，得到重组质粒pET-28a(+)-PGLA-rep2；

<4>制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将步骤<3>制得的重组质粒pET-28a(+)-PGLA-rep2转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，即得含突变果胶裂解酶PGLA-rep2的大肠杆菌工程菌。

根据本发明优选的，所述步骤<1>中，正向PCR扩增以pET-28a(+)-PGLA质粒为模板，扩增引物的核苷酸序列如下：

F1-1-1:GGGGGTGATGTGGTGACCG SEQ ID NO.18；

R1-1-1:CATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACA SEQ ID NO.19；

根据本发明优选的，所述步骤<1>中，PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：

PCR扩增程序如下：

根据本发明优选的，所述步骤<2>中，正向PCR扩增模板为Pel SWU基因片段，基因序列在NCBI数据库中的登录号为AB428424，扩增引物的核苷酸序列如下：

F1-1-2:taagaaggagatataccatgGCTTCTGCCTTAAACTCGGGC SEQ ID NO.20；

R1-1-2:acggtcaccacatcacccccTTCTCCGCCCGTTGTTCC SEQ ID NO.21；

根据本发明优选的，所述步骤<2>中，PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：

所述的PCR扩增程序如下：

根据本发明优选的，所述步骤<3>中，无缝克隆PCR扩增体系如下，总体系为20μl：

所述的无缝克隆程序如下：

37℃反应30min，4℃保存；

根据本发明优选的，所述步骤<4>中，筛选阳性克隆的方法为：将转化细胞涂布在含有50μg/mL卡纳霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养，挑取单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37℃培养过夜，然后通过PCR验证，得到目的基因条带的阳性克隆子，然后测序，保留测序结果正确的菌株作为目的表达菌株。

上述重组菌或上述构建方法制得的大肠杆菌工程菌在生产碱性果胶裂解酶中的应用。

有益效果

本发明提供的突变果胶裂解酶PGLA-rep4、突变果胶裂解酶PGLA-rep1、突变果胶裂解酶PGLA-rep2酶活力提高，在制浆、造纸、纺织、饲料等领域具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为实施例4中不同pH值条件下酶活检测结果图。

图2为实施例4中不同温度条件下酶活检测结果图。

图3为实施例5中不同pH值条件下酶活检测结果图。

图4为实施例5中不同温度条件下酶活检测结果图。

图5为实施例6中不同pH值条件下酶活检测结果图。

图6为实施例6中不同温度条件下酶活检测结果图。

图7为对比例1中不同pH值条件下酶活检测结果图。

图8为对比例1中不同温度条件下酶活检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中未详加说明的均按本领域现有技术。

果胶裂解酶Pel SWU基因序列在NCBI数据库中的登录号为AB428424。

实施例1

突变果胶裂解酶PGLA-rep4基因构建

(i)以pET-28a(+)-PGLA的DNA为模板，进行PCR扩增，得到替换基因载体片段pET-28a(+)-PGLA-4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述的PCR引物序列如下：

F1:ATCTATATCGATGGTACCATCACCC SEQ ID NO.5；

R1:ACCCCCCGCACCGCCTGT SEQ ID NO.6；

所述的PCR扩增体系见表1：

表1

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸3.2min，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存；

琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，长度为约6000bp，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用。

(ii)以果胶裂解酶Pel SWU基因的DNA为模板，进行PCR扩增，得到替换基因片段rep4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述的PCR引物序列如下：

F2:ccacaggcggtgcggggggtCAGACGGTAACCGTAACAACGG SEQ ID NO.7；

R2:atggtaccatcgatatagatTTTTAAAGGCGTATTTGCATTCTT SEQ ID NO.8；

所述的PCR扩增体系见表2：

表2

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸15sec，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存；

琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，长度为约100bp，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用。

(iii)将步骤(i)制得的pET-28a(+)-PGLA-4替换载体片段与步骤(ii)制得的rep4替换片段进行无缝克隆，制得pET-28a(+)-PGLA-rep4质粒，果胶裂解酶PGLA-rep4的基因序列如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的无缝克隆的扩增体系，见表3：

表3

所述的无缝克隆程序如下：

37℃反应30min，4℃保存；

琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，长度为6148bp，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用。

实施例2

制备大肠杆菌感受态

(i)挑取大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)单菌落接种至LB培养基中，220r/min、37℃培养过夜；

(ii)吸取0.1mL菌液至10mL的LB培养基中，300r/min、37℃培养至OD₆₀₀达0.6～0.8；

(iii)吸取1mLOD₆₀₀达0.6～0.8的菌液至1.5mL无菌离心管中，12000r/min离心2min，彻底去除上清；

(iv)加入100μL冰预冷的SSCS(一步法快速制备感受态细胞试剂盒，上海生工生物工程公司产品)，轻悬菌体即制成感受态细胞。

(v)将制备好的感受态细胞分装100μL每管，-80℃保存，备用。

实施例3

PGLA-rep4基因化学转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)

首先利用核酸超微量分光光度计测定pET-28a(+)-PGLA-rep4质粒浓度，达到300μg/mL浓度后，进行化学转化，得到的细胞使用复苏培养基37℃复苏培养1h后，取100μL涂布在含50μg/mL卡纳霉素的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，筛选具有卡那霉素抗性的阳性重组菌落。

液体复苏培养基，每升组分如下：

蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g、山梨醇91g、甘露醇69.4g，余量水。

阳性重组菌的培养及鉴定

挑取上述阳性重组菌落，接种到含50μg/mL卡纳霉素抗性的液体LB培养基中37℃培养过夜，培养完成后，使用上海生物工程有限公司提供的试剂盒提取重组菌DNA，并以获得的基因组为模板，F₁和R₂为引物进行PCR扩增，扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳进行验证；

所述的PCR引物序列如下:

F1:ATCTATATCGATGGTACCATCACCC SEQ ID NO.5；

R2:atggtaccatcgatatagatTTTTAAAGGCGTATTTGCATTCTT SEQ ID NO.8；

所述的PCR扩增体系为20μl，见表4：

表4

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸3.5min，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存；

琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，结果显示，使用引物F₁和R₂能够扩增出一条特异性基因条带，大小约为6100bp，与理论值6148bp接近，表明包含目的基因的载体已成功转入到大肠杆菌细胞内上，制得突变果胶裂解酶PGLA-rep4基因的大肠杆菌工程菌。

实施例4

实施例3制备含果胶裂解酶PGLA-rep4基因的大肠杆菌工程菌发酵测试

将制备的含有果胶裂解酶PGLA-rep4基因的大肠杆菌工程菌接种至100mL LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，余量水)中220rpm 37℃下培养至发酵液OD₆₀₀0.7，再加入IPTG(终浓度为0.5mM)诱导12h，取样。参考QB/T 4482-2013碱性果胶裂解酶酶活测定方法，样品处理后通过紫外分光光度(A235)法测定发酵液中果胶裂解酶的最高酶活力。在55℃，pH8.5-11.5的条件下分别处理10min后，加入3ml 0.03M磷酸终止反应，紫外分光光度计235nm处测定吸光度值，检测结果见图1。通过紫外分光光度法(A235法)测定发酵液中果胶裂解酶的最适温度，在最适pH11.0，温度55℃-85℃(梯度为5℃)的条件下分别处理10min后，加入3ml 0.03M磷酸终止反应，紫外分光光度计235nm处测定吸光度值，检测结果见图2。

与原始酶PGLA(最适温度为70℃，最适pH为11)相比，重组后的含PGLA-rep4基因大肠杆菌工程菌发酵液中果胶裂解酶的最适pH和最适温度保持不变。但是重组后的果胶裂解酶PGLA-rep4的发酵液中的最高酶活力为157.778U/ml，较原始的果胶裂解酶PGLA的发酵液中的最高酶活力104.348U/ml显著提高。

实施例5

果胶裂解酶PGLA-rep1基因的构建及发酵测试

(i)提取大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)的pET-28a(+)-PGLA质粒DNA，以该基因组DNA为模板，进行反向PCR直接扩增得到pET-28a(+)-PGLA-rep1质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11，果胶裂解酶PGLA-rep1的基因序列如SEQ ID NO.9所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；

所述的PCR引物序列如下：

F1-1:CGGGCAAAGTAAATCCGCTTGCCGACTTCAGCTTACAAGGTTTTGCCACTCTCAATG SEQ IDNO.12；

所述的PCR扩增体系，见表5：

表5

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸3.5sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；

琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，长度为约6100bp，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用。

参照实施例3的方法，制备含有耐碱果胶裂解酶PGLA-rep1基因的大肠杆菌工程菌，将制备的含有耐碱果胶裂解酶PGLA-rep1基因的大肠杆菌工程菌接种至100mL LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L)中220rpm 37℃下培养至发酵液OD₆₀₀为0.7，再加入IPTG(终浓度为0.5mM)诱导12h，取样。参考QB/T 4482-2013碱性果胶裂解酶酶活测定方法，样品处理后通过紫外分光光度(A235)法测定发酵液中果胶裂解酶的最高酶活力。在55℃，pH8.5-11.0的条件下分别处理10min后，加入3ml 0.03M磷酸终止反应，紫外分光光度计235nm处测定吸光度值，检测结果见图3。通过紫外分光光度法(A235法)测定发酵液中果胶裂解酶的最适温度，在最适pH10.5，温度55℃-85℃(梯度为5℃)的条件下分别处理10min后，加入3ml 0.03M磷酸终止反应，紫外分光光度计235nm处测定吸光度值，检测结果见图4。

与原始酶PGLA(最适温度为70℃，最适pH为11)相比，重组后的含PGLA-rep1基因大肠杆菌工程菌发酵液中果胶裂解酶的最适pH虽然降为10.5，但最适温度保持不变，且重组后的果胶裂解酶PGLA-rep1的发酵液中的最高酶活力为110.918U/ml，较原始的果胶裂解酶PGLA的发酵液中的最高酶活力104.348U/ml明显提高。

实施例6

果胶裂解酶PGLA-rep2基因的构建及发酵测试

(i)提取大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)的pET-28a(+)-PGLA质粒DNA，以该基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到替换基因载体片段pET-28a(+)-PGLA-2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16；

所述的PCR引物序列如下：

F1-1-1:GGGGGTGATGTGGTGACCG SEQ ID NO.18；

R1-1-1:CATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACA SEQ ID NO.19；

所述的PCR扩增体系，见表5：

表5

所述的PCR扩增程序如下：

95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸3.2min，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；

(ii)以Pel SWU基因片段为模板，进行PCR扩增，得到替换基因片段rep2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

所述的PCR引物序列如下：

F1-1-2:taagaaggagatataccatgGCTTCTGCCTTAAACTCGGGC SEQ ID NO.20；

R1-1-2:acggtcaccacatcacccccTTCTCCGCCCGTTGTTCC SEQ ID NO.21；

所述的PCR扩增体系，见表6：

表6

所述的PCR扩增程序如下：

(iii)将步骤(i)制得的pET-28a(+)-PGLA-2片段与步骤(ii)制得的rep2片段进行无缝克隆，制得pET-28a(+)-PGLA-rep2质粒；果胶裂解酶PGLA-rep2的核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示，果胶裂解酶PGLA-rep2的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。

所述的无缝克隆的扩增体系，见表7：

表7

所述的无缝克隆程序如下：

37℃反应30min，4℃保存；

琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，长度为6178bp，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用。

参照实施例3的方法，制备含有耐碱果胶裂解酶PGLA-rep2基因的大肠杆菌工程菌，将制备的含有耐碱果胶裂解酶PGLA-rep2基因的大肠杆菌工程菌接种至100mL LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L)中220rpm 37℃下培养至发酵液OD₆₀₀至0.7，再加入IPTG(终浓度为0.5mM)诱导12h，取样。参考QB/T 4482-2013碱性果胶裂解酶酶活测定方法，样品处理后通过紫外分光光度(A235)法测定发酵液中果胶裂解酶的最高酶活力。在55℃，pH8.5-11.0的条件下分别处理10min后，加入3ml 0.03M磷酸终止反应，紫外分光光度计235nm处测定吸光度值，检测结果见图5。通过紫外分光光度法(A235法)测定发酵液中果胶裂解酶的最适温度，在最适pH10.5，温度55℃-85℃(梯度为5℃)的条件下分别处理10min后，加入3ml 0.03M磷酸终止反应，紫外分光光度计235nm处测定吸光度值，检测结果见图6。

与原始酶PGLA(最适温度为70℃，最适pH为11)相比，重组后的含PGLA-rep2基因大肠杆菌工程菌发酵液中果胶裂解酶的最适pH虽然降为10.5，但最适温度保持不变，且重组后的果胶裂解酶PGLA-rep2的发酵液中的最高酶活力为130.048U/ml，较原始的果胶裂解酶PGLA的发酵液中的最高酶活力104.348U/ml显著提高。

对比例1

重组PGLA-rep3基因的构建及发酵测试

(i)提取大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)的pET-28a(+)-PGLA质粒DNA，以该基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到替换基因载体片段pET-28a(+)-PGLA-3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.22；

所述的PCR引物序列如下：

F2-1:ATCTATATCGATGGTACCATCACCC SEQ ID NO.23；

R1-1-1:CATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACA SEQ ID NO.19；

所述的PCR扩增体系，见表8：

表8

所述的PCR扩增程序如下：

(ii)以Pel SWU基因片段为模板，进行PCR扩增，得到替换基因片段rep3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；

所述的PCR引物序列如下：

F1-1-2:taagaaggagatataccatgGCTTCTGCCTTAAACTCGGGC SEQ ID NO.20；

R2-2:taagaaggagatataccatgGCTTCTGCCTTAAACTCGGGC SEQ ID NO.25；

所述的PCR扩增体系，见表9：

表9

所述的PCR扩增程序如下：

琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，长度为约200bp，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用。

(iii)将步骤(i)制得的pET-28a(+)-PGLA4-3片段与步骤(ii)制得的rep3片段进行无缝克隆，制得pET-28a(+)-PGLA-rep3质粒；

所述的无缝克隆的扩增体系，见表10：

表10

所述的无缝克隆程序如下：

37℃反应30min，4℃保存；

参照实施例3的方法，制备含有耐碱果胶裂解酶PGLA-rep3基因的大肠杆菌工程菌，将制备的含有耐碱果胶裂解酶PGLA-rep3基因的大肠杆菌工程菌接种至100mL LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L)中220rpm 37℃下培养至发酵液OD₆₀₀ 0.8，再加入IPTG(终浓度为0.5mM)诱导12h，取样，参考QB/T 4482-2013碱性果胶裂解酶酶活测定方法，样品处理后通过紫外分光光度(A235)法测定发酵液中果胶裂解酶的最高酶活力。在55℃，pH8.5-11.0的条件下分别处理10min后，加入3ml 0.03M磷酸终止反应，紫外分光光度计235nm处测定吸光度值，检测结果见图7。通过紫外分光光度法(A235法)测定发酵液中果胶裂解酶的最适温度，在最适pH11.0，温度55℃-85℃(梯度为5℃)的条件下分别处理10min后，加入3ml 0.03M磷酸终止反应，紫外分光光度计235nm处测定吸光度值，检测结果见图8。

与原始酶PGLA(最适温度为70℃，最适pH为11)相比，重组后的含PGLA-rep3基因大肠杆菌工程菌发酵液中果胶裂解酶的最适pH虽然仍为11.0，但最适温度降为65℃，且重组后的果胶裂解酶PGLA-rep3的发酵液中的最高酶活力为91.014U/ml，较原始的果胶裂解酶PGLA的发酵液中的最高酶活力104.348U/ml显著降低。

综上，实施例4中PGLA-rep4是将果胶裂解酶PGLA的第70至144号位共75个碱基替换为Pel SWU对应位置的75个碱基，即rep4。

实施例5中PGLA-rep1选取了果胶裂解酶PGLA的N端前21个碱基替换为Pel SWU的N端前51个碱基，即rep1。

实施例6中PGLA-rep2选取了果胶裂解酶PGLA的N端前63个碱基替换为Pel SWU的N端前93个碱基，即rep2。

对比例1中PGLA-rep3选取了果胶裂解酶PGLA4的N端前144个碱基替换为Pel SWU的N端前174个碱基，即rep3。

原始酶以及四种突变酶对应的酶学特性见表11：

表11

通过本发明涉及的突变酶与对比例1涉及的突变酶的比较，显示发酵液中酶活力的提升与替换片段的长度没有直接关系。本发明改造后的果胶裂解酶PGLA-rep4、果胶裂解酶PGLA-rep1、果胶裂解酶PGLA-rep2的发酵液中的酶活力提高，在制浆、造纸、纺织、饲料等领域具有广泛的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 齐鲁工业大学

<120> 一种高活性突变果胶裂解酶及应用

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 912

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcgaacgtga acttttccat gcaaggtttt gccactctca atggcggtac cacaggcggt 60

gcggggggtc agacggtaac cgtaacaacg ggagatcagc tgattgcggc attaaaaaat 120

aagaatgcaa atacgccttt aaaaatctat atcgatggta ccatcacccc agctaatacc 180

agcgcgtcga agatcgatat caaagatgtc aatgatgtta gcttgctggg cgttggtacg 240

aacggtgagt tgaacggtat tggcattaag gtgtggcgtg cgaacaacgt tatcatccgt 300

aatctgaaga ttcatcatgt aaacacgggt gataaagacg cgatctccat tgaaggtccg 360

tcgaagaaca tctgggttga tcacaacgag ctgtataatt cgctggacgt gcacaaagac 420

tactatgatg gcctgttcga cgtgaaaaga gatgcagact acatcacgtt cagctggaat 480

tacgtgcacg attcttggaa aagcatgctg atgggtagtt ccgacagcga tagctatggt 540

cgtaaaatca ctttccacaa taactatttc gagaacctga acagccgtgt tccgtctgtt 600

cgctttggtg aggcacatat tttcagcaat tattacgcag acatccgcga aaccggcatc 660

aactctcgta tgggtgcaca ggttcgcatt gaggagaact acttcgaacg cgcgaacaac 720

ccgattgtta gccgcgattc aaaagaaatt ggttactggc acctggttaa taaccgttac 780

gtttcctcca ccggtgagca accgaccgtt tccaccacca cgtataatcc gccgtacagc 840

taccaagcga ccccggtcaa tcaggttaag gacgttgtgc gtgctaatgc aggtgtaggc 900

gtcatctcgc cg 912

<210> 2

<211> 304

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Ala Asn Val Asn Phe Ser Met Gln Gly Phe Ala Thr Leu Asn Gly Gly

1 5 10 15

Thr Thr Gly Gly Ala Gly Gly Gln Thr Val Thr Val Thr Thr Gly Asp

20 25 30

Gln Leu Ile Ala Ala Leu Lys Asn Lys Asn Ala Asn Thr Pro Leu Lys

35 40 45

Ile Tyr Ile Asp Gly Thr Ile Thr Pro Ala Asn Thr Ser Ala Ser Lys

50 55 60

Ile Asp Ile Lys Asp Val Asn Asp Val Ser Leu Leu Gly Val Gly Thr

65 70 75 80

Asn Gly Glu Leu Asn Gly Ile Gly Ile Lys Val Trp Arg Ala Asn Asn

85 90 95

Val Ile Ile Arg Asn Leu Lys Ile His His Val Asn Thr Gly Asp Lys

100 105 110

Asp Ala Ile Ser Ile Glu Gly Pro Ser Lys Asn Ile Trp Val Asp His

115 120 125

Asn Glu Leu Tyr Asn Ser Leu Asp Val His Lys Asp Tyr Tyr Asp Gly

130 135 140

Leu Phe Asp Val Lys Arg Asp Ala Asp Tyr Ile Thr Phe Ser Trp Asn

145 150 155 160

Tyr Val His Asp Ser Trp Lys Ser Met Leu Met Gly Ser Ser Asp Ser

165 170 175

Asp Ser Tyr Gly Arg Lys Ile Thr Phe His Asn Asn Tyr Phe Glu Asn

180 185 190

Leu Asn Ser Arg Val Pro Ser Val Arg Phe Gly Glu Ala His Ile Phe

195 200 205

Ser Asn Tyr Tyr Ala Asp Ile Arg Glu Thr Gly Ile Asn Ser Arg Met

210 215 220

Gly Ala Gln Val Arg Ile Glu Glu Asn Tyr Phe Glu Arg Ala Asn Asn

225 230 235 240

Pro Ile Val Ser Arg Asp Ser Lys Glu Ile Gly Tyr Trp His Leu Val

245 250 255

Asn Asn Arg Tyr Val Ser Ser Thr Gly Glu Gln Pro Thr Val Ser Thr

260 265 270

Thr Thr Tyr Asn Pro Pro Tyr Ser Tyr Gln Ala Thr Pro Val Asn Gln

275 280 285

Val Lys Asp Val Val Arg Ala Asn Ala Gly Val Gly Val Ile Ser Pro

290 295 300

<210> 3

<211> 6073

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atctatatcg atggtaccat caccccagct aataccagcg cgtcgaagat cgatatcaaa 60

gatgtcaatg atgttagctt gctgggcgtt ggtacgaacg gtgagttgaa cggtattggc 120

attaaggtgt ggcgtgcgaa caacgttatc atccgtaatc tgaagattca tcatgtaaac 180

acgggtgata aagacgcgat ctccattgaa ggtccgtcga agaacatctg ggttgatcac 240

aacgagctgt ataattcgct ggacgtgcac aaagactact atgatggcct gttcgacgtg 300

aaaagagatg cagactacat cacgttcagc tggaattacg tgcacgattc ttggaaaagc 360

atgctgatgg gtagttccga cagcgatagc tatggtcgta aaatcacttt ccacaataac 420

tatttcgaga acctgaacag ccgtgttccg tctgttcgct ttggtgaggc acatattttc 480

agcaattatt acgcagacat ccgcgaaacc ggcatcaact ctcgtatggg tgcacaggtt 540

cgcattgagg agaactactt cgaacgcgcg aacaacccga ttgttagccg cgattcaaaa 600

gaaattggtt actggcacct ggttaataac cgttacgttt cctccaccgg tgagcaaccg 660

accgtttcca ccaccacgta taatccgccg tacagctacc aagcgacccc ggtcaatcag 720

gttaaggacg ttgtgcgtgc taatgcaggt gtaggcgtca tctcgccgct cgagcaccac 780

caccaccacc actgagatcc ggctgctaac aaagcccgaa aggaagctga gttggctgct 840

gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt cttgaggggt 900

tttttgctga aaggaggaac tatatccgga ttggcgaatg ggacgcgccc tgtagcggcg 960

cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc 1020

tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc 1080

gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg 1140

accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg 1200

tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg 1260

gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt 1320

cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa 1380

tattaacgtt tacaatttca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt 1440

gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gaattaattc ttagaaaaac 1500

tcatcgagca tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag gattatcaat accatatttt 1560

tgaaaaagcc gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga ggcagttcca taggatggca 1620

agatcctggt atcggtctgc gattccgact cgtccaacat caatacaacc tattaatttc 1680

ccctcgtcaa aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat gagtgacgac tgaatccggt 1740

gagaatggca aaagtttatg catttctttc cagacttgtt caacaggcca gccattacgc 1800

tcgtcatcaa aatcactcgc atcaaccaaa ccgttattca ttcgtgattg cgcctgagcg 1860

agacgaaata cgcgatcgct gttaaaagga caattacaaa caggaatcga atgcaaccgg 1920

cgcaggaaca ctgccagcgc atcaacaata ttttcacctg aatcaggata ttcttctaat 1980

acctggaatg ctgttttccc ggggatcgca gtggtgagta accatgcatc atcaggagta 2040

cggataaaat gcttgatggt cggaagaggc ataaattccg tcagccagtt tagtctgacc 2100

atctcatctg taacatcatt ggcaacgcta cctttgccat gtttcagaaa caactctggc 2160

gcatcgggct tcccatacaa tcgatagatt gtcgcacctg attgcccgac attatcgcga 2220

gcccatttat acccatataa atcagcatcc atgttggaat ttaatcgcgg cctagagcaa 2280

gacgtttccc gttgaatatg gctcataaca ccccttgtat tactgtttat gtaagcagac 2340

agttttattg ttcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga 2400

ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg 2460

cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc 2520

aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct 2580

agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc 2640

tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt 2700

ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg 2760

cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct 2820

atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag 2880

ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag 2940

tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg 3000

gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg 3060

gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac 3120

cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt 3180

gagcgaggaa gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat 3240

ttcacaccgc atatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc 3300

cagtatacac tccgctatcg ctacgtgact gggtcatggc tgcgccccga cacccgccaa 3360

cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg 3420

tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga 3480

ggcagctgcg gtaaagctca tcagcgtggt cgtgaagcga ttcacagatg tctgcctgtt 3540

catccgcgtc cagctcgttg agtttctcca gaagcgttaa tgtctggctt ctgataaagc 3600

gggccatgtt aagggcggtt ttttcctgtt tggtcactga tgcctccgtg taagggggat 3660

ttctgttcat gggggtaatg ataccgatga aacgagagag gatgctcacg atacgggtta 3720

ctgatgatga acatgcccgg ttactggaac gttgtgaggg taaacaactg gcggtatgga 3780

tgcggcggga ccagagaaaa atcactcagg gtcaatgcca gcgcttcgtt aatacagatg 3840

taggtgttcc acagggtagc cagcagcatc ctgcgatgca gatccggaac ataatggtgc 3900

agggcgctga cttccgcgtt tccagacttt acgaaacacg gaaaccgaag accattcatg 3960

ttgttgctca ggtcgcagac gttttgcagc agcagtcgct tcacgttcgc tcgcgtatcg 4020

gtgattcatt ctgctaacca gtaaggcaac cccgccagcc tagccgggtc ctcaacgaca 4080

ggagcacgat catgcgcacc cgtggggccg ccatgccggc gataatggcc tgcttctcgc 4140

cgaaacgttt ggtggcggga ccagtgacga aggcttgagc gagggcgtgc aagattccga 4200

ataccgcaag cgacaggccg atcatcgtcg cgctccagcg aaagcggtcc tcgccgaaaa 4260

tgacccagag cgctgccggc acctgtccta cgagttgcat gataaagaag acagtcataa 4320

gtgcggcgac gatagtcatg ccccgcgccc accggaagga gctgactggg ttgaaggctc 4380

tcaagggcat cggtcgagat cccggtgcct aatgagtgag ctaacttaca ttaattgcgt 4440

tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg 4500

gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgcca gggtggtttt tcttttcacc 4560

agtgagacgg gcaacagctg attgcccttc accgcctggc cctgagagag ttgcagcaag 4620

cggtccacgc tggtttgccc cagcaggcga aaatcctgtt tgatggtggt taacggcggg 4680

atataacatg agctgtcttc ggtatcgtcg tatcccacta ccgagatatc cgcaccaacg 4740

cgcagcccgg actcggtaat ggcgcgcatt gcgcccagcg ccatctgatc gttggcaacc 4800

agcatcgcag tgggaacgat gccctcattc agcatttgca tggtttgttg aaaaccggac 4860

atggcactcc agtcgccttc ccgttccgct atcggctgaa tttgattgcg agtgagatat 4920

ttatgccagc cagccagacg cagacgcgcc gagacagaac ttaatgggcc cgctaacagc 4980

gcgatttgct ggtgacccaa tgcgaccaga tgctccacgc ccagtcgcgt accgtcttca 5040

tgggagaaaa taatactgtt gatgggtgtc tggtcagaga catcaagaaa taacgccgga 5100

acattagtgc aggcagcttc cacagcaatg gcatcctggt catccagcgg atagttaatg 5160

atcagcccac tgacgcgttg cgcgagaaga ttgtgcaccg ccgctttaca ggcttcgacg 5220

ccgcttcgtt ctaccatcga caccaccacg ctggcaccca gttgatcggc gcgagattta 5280

atcgccgcga caatttgcga cggcgcgtgc agggccagac tggaggtggc aacgccaatc 5340

agcaacgact gtttgcccgc cagttgttgt gccacgcggt tgggaatgta attcagctcc 5400

gccatcgccg cttccacttt ttcccgcgtt ttcgcagaaa cgtggctggc ctggttcacc 5460

acgcgggaaa cggtctgata agagacaccg gcatactctg cgacatcgta taacgttact 5520

ggtttcacat tcaccaccct gaattgactc tcttccgggc gctatcatgc cataccgcga 5580

aaggttttgc gccattcgat ggtgtccggg atctcgacgc tctcccttat gcgactcctg 5640

cattaggaag cagcccagta gtaggttgag gccgttgagc accgccgccg caaggaatgg 5700

tgcatgcaag gagatggcgc ccaacagtcc cccggccacg gggcctgcca ccatacccac 5760

gccgaaacaa gcgctcatga gcccgaagtg gcgagcccga tcttccccat cggtgatgtc 5820

ggcgatatag gcgccagcaa ccgcacctgt ggcgccggtg atgccggcca cgatgcgtcc 5880

ggcgtagagg atcgagatct cgatcccgcg aaattaatac gactcactat aggggaattg 5940

tgagcggata acaattcccc tctagaaata attttgttta actttaagaa ggagatatac 6000

catggcgaac gtgaactttt ccatgcaagg ttttgccact ctcaatggcg gtaccacagg 6060

cggtgcgggg ggt 6073

<210> 4

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cagacggtaa ccgtaacaac gggagatcag ctgattgcgg cattaaaaaa taagaatgca 60

aatacgcctt taaaa 75

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atctatatcg atggtaccat caccc 25

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

accccccgca ccgcctgt 18

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccacaggcgg tgcggggggt cagacggtaa ccgtaacaac gg 42

<210> 8

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atggtaccat cgatatagat ttttaaaggc gtatttgcat tctt 44

<210> 9

<211> 942

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcttctgcct taaactcggg caaagtaaat ccgcttgccg acttcagctt acaaggtttt 60

gccactctca atggcggtac cacaggcggt gcggggggtg atgtggtgac cgttagcacc 120

ggcgaccagc tgatcgcagc gctgaagaac aagaaagcta acacccccct gaccatctat 180

atcgatggta ccatcacccc agctaatacc agcgcgtcga agatcgatat caaagatgtc 240

aatgatgtta gcttgctggg cgttggtacg aacggtgagt tgaacggtat tggcattaag 300

gtgtggcgtg cgaacaacgt tatcatccgt aatctgaaga ttcatcatgt aaacacgggt 360

gataaagacg cgatctccat tgaaggtccg tcgaagaaca tctgggttga tcacaacgag 420

ctgtataatt cgctggacgt gcacaaagac tactatgatg gcctgttcga cgtgaaaaga 480

gatgcagact acatcacgtt cagctggaat tacgtgcacg attcttggaa aagcatgctg 540

atgggtagtt ccgacagcga tagctatggt cgtaaaatca ctttccacaa taactatttc 600

gagaacctga acagccgtgt tccgtctgtt cgctttggtg aggcacatat tttcagcaat 660

tattacgcag acatccgcga aaccggcatc aactctcgta tgggtgcaca ggttcgcatt 720

gaggagaact acttcgaacg cgcgaacaac ccgattgtta gccgcgattc aaaagaaatt 780

ggttactggc acctggttaa taaccgttac gtttcctcca ccggtgagca accgaccgtt 840

tccaccacca cgtataatcc gccgtacagc taccaagcga ccccggtcaa tcaggttaag 900

gacgttgtgc gtgctaatgc aggtgtaggc gtcatctcgc cg 942

<210> 10

<211> 314

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Ala Ser Ala Leu Asn Ser Gly Lys Val Asn Pro Leu Ala Asp Phe Ser

1 5 10 15

Leu Gln Gly Phe Ala Thr Leu Asn Gly Gly Thr Thr Gly Gly Ala Gly

20 25 30

Gly Asp Val Val Thr Val Ser Thr Gly Asp Gln Leu Ile Ala Ala Leu

35 40 45

Lys Asn Lys Lys Ala Asn Thr Pro Leu Thr Ile Tyr Ile Asp Gly Thr

50 55 60

Ile Thr Pro Ala Asn Thr Ser Ala Ser Lys Ile Asp Ile Lys Asp Val

65 70 75 80

Asn Asp Val Ser Leu Leu Gly Val Gly Thr Asn Gly Glu Leu Asn Gly

85 90 95

Ile Gly Ile Lys Val Trp Arg Ala Asn Asn Val Ile Ile Arg Asn Leu

100 105 110

Lys Ile His His Val Asn Thr Gly Asp Lys Asp Ala Ile Ser Ile Glu

115 120 125

Gly Pro Ser Lys Asn Ile Trp Val Asp His Asn Glu Leu Tyr Asn Ser

130 135 140

Leu Asp Val His Lys Asp Tyr Tyr Asp Gly Leu Phe Asp Val Lys Arg

145 150 155 160

Asp Ala Asp Tyr Ile Thr Phe Ser Trp Asn Tyr Val His Asp Ser Trp

165 170 175

Lys Ser Met Leu Met Gly Ser Ser Asp Ser Asp Ser Tyr Gly Arg Lys

180 185 190

Ile Thr Phe His Asn Asn Tyr Phe Glu Asn Leu Asn Ser Arg Val Pro

195 200 205

Ser Val Arg Phe Gly Glu Ala His Ile Phe Ser Asn Tyr Tyr Ala Asp

210 215 220

Ile Arg Glu Thr Gly Ile Asn Ser Arg Met Gly Ala Gln Val Arg Ile

225 230 235 240

Glu Glu Asn Tyr Phe Glu Arg Ala Asn Asn Pro Ile Val Ser Arg Asp

245 250 255

Ser Lys Glu Ile Gly Tyr Trp His Leu Val Asn Asn Arg Tyr Val Ser

260 265 270

Ser Thr Gly Glu Gln Pro Thr Val Ser Thr Thr Thr Tyr Asn Pro Pro

275 280 285

Tyr Ser Tyr Gln Ala Thr Pro Val Asn Gln Val Lys Asp Val Val Arg

290 295 300

Ala Asn Ala Gly Val Gly Val Ile Ser Pro

305 310

<210> 11

<211> 6178

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360

ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540

tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600

tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atggcttctg ccttaaactc gggcaaagta 5100

aatccgcttg ccgacttcag cttacaaggt tttgccactc tcaatggcgg taccacaggc 5160

ggtgcggggg gtgatgtggt gaccgttagc accggcgacc agctgatcgc agcgctgaag 5220

aacaagaaag ctaacacccc cctgaccatc tatatcgatg gtaccatcac cccagctaat 5280

accagcgcgt cgaagatcga tatcaaagat gtcaatgatg ttagcttgct gggcgttggt 5340

acgaacggtg agttgaacgg tattggcatt aaggtgtggc gtgcgaacaa cgttatcatc 5400

cgtaatctga agattcatca tgtaaacacg ggtgataaag acgcgatctc cattgaaggt 5460

ccgtcgaaga acatctgggt tgatcacaac gagctgtata attcgctgga cgtgcacaaa 5520

gactactatg atggcctgtt cgacgtgaaa agagatgcag actacatcac gttcagctgg 5580

aattacgtgc acgattcttg gaaaagcatg ctgatgggta gttccgacag cgatagctat 5640

ggtcgtaaaa tcactttcca caataactat ttcgagaacc tgaacagccg tgttccgtct 5700

gttcgctttg gtgaggcaca tattttcagc aattattacg cagacatccg cgaaaccggc 5760

atcaactctc gtatgggtgc acaggttcgc attgaggaga actacttcga acgcgcgaac 5820

aacccgattg ttagccgcga ttcaaaagaa attggttact ggcacctggt taataaccgt 5880

tacgtttcct ccaccggtga gcaaccgacc gtttccacca ccacgtataa tccgccgtac 5940

agctaccaag cgaccccggt caatcaggtt aaggacgttg tgcgtgctaa tgcaggtgta 6000

ggcgtcatct cgccgctcga gcaccaccac caccaccact gagatccggc tgctaacaaa 6060

gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc accgctgagc aataactagc ataacccctt 6120

ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt ttgctgaaag gaggaactat atccggat 6178

<210> 12

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgggcaaagt aaatccgctt gccgacttca gcttacaagg ttttgccact ctcaatg 57

<210> 13

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aagcggattt actttgcccg agtttaaggc agaagccatg gtatatctcc ttcttaaagt 60

taaac 65

<210> 14

<211> 942

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gcttctgcct taaactcggg caaagtaaat ccgcttgccg acttcagctt aaaaggcttt 60

gccgcactaa acggcggaac aacgggcgga gaagggggtg atgtggtgac cgttagcacc 120

ggcgaccagc tgatcgcagc gctgaagaac aagaaagcta acacccccct gaccatctat 180

atcgatggta ccatcacccc agctaatacc agcgcgtcga agatcgatat caaagatgtc 240

aatgatgtta gcttgctggg cgttggtacg aacggtgagt tgaacggtat tggcattaag 300

gtgtggcgtg cgaacaacgt tatcatccgt aatctgaaga ttcatcatgt aaacacgggt 360

gataaagacg cgatctccat tgaaggtccg tcgaagaaca tctgggttga tcacaacgag 420

ctgtataatt cgctggacgt gcacaaagac tactatgatg gcctgttcga cgtgaaaaga 480

gatgcagact acatcacgtt cagctggaat tacgtgcacg attcttggaa aagcatgctg 540

atgggtagtt ccgacagcga tagctatggt cgtaaaatca ctttccacaa taactatttc 600

gagaacctga acagccgtgt tccgtctgtt cgctttggtg aggcacatat tttcagcaat 660

tattacgcag acatccgcga aaccggcatc aactctcgta tgggtgcaca ggttcgcatt 720

gaggagaact acttcgaacg cgcgaacaac ccgattgtta gccgcgattc aaaagaaatt 780

ggttactggc acctggttaa taaccgttac gtttcctcca ccggtgagca accgaccgtt 840

tccaccacca cgtataatcc gccgtacagc taccaagcga ccccggtcaa tcaggttaag 900

gacgttgtgc gtgctaatgc aggtgtaggc gtcatctcgc cg 942

<210> 15

<211> 314

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Ala Ser Ala Leu Asn Ser Gly Lys Val Asn Pro Leu Ala Asp Phe Ser

1 5 10 15

Leu Lys Gly Phe Ala Ala Leu Asn Gly Gly Thr Thr Gly Gly Glu Gly

20 25 30

Gly Asp Val Val Thr Val Ser Thr Gly Asp Gln Leu Ile Ala Ala Leu

35 40 45

Lys Asn Lys Lys Ala Asn Thr Pro Leu Thr Ile Tyr Ile Asp Gly Thr

50 55 60

Ile Thr Pro Ala Asn Thr Ser Ala Ser Lys Ile Asp Ile Lys Asp Val

65 70 75 80

Asn Asp Val Ser Leu Leu Gly Val Gly Thr Asn Gly Glu Leu Asn Gly

85 90 95

Ile Gly Ile Lys Val Trp Arg Ala Asn Asn Val Ile Ile Arg Asn Leu

100 105 110

Lys Ile His His Val Asn Thr Gly Asp Lys Asp Ala Ile Ser Ile Glu

115 120 125

Gly Pro Ser Lys Asn Ile Trp Val Asp His Asn Glu Leu Tyr Asn Ser

130 135 140

Leu Asp Val His Lys Asp Tyr Tyr Asp Gly Leu Phe Asp Val Lys Arg

145 150 155 160

Asp Ala Asp Tyr Ile Thr Phe Ser Trp Asn Tyr Val His Asp Ser Trp

165 170 175

Lys Ser Met Leu Met Gly Ser Ser Asp Ser Asp Ser Tyr Gly Arg Lys

180 185 190

Ile Thr Phe His Asn Asn Tyr Phe Glu Asn Leu Asn Ser Arg Val Pro

195 200 205

Ser Val Arg Phe Gly Glu Ala His Ile Phe Ser Asn Tyr Tyr Ala Asp

210 215 220

Ile Arg Glu Thr Gly Ile Asn Ser Arg Met Gly Ala Gln Val Arg Ile

225 230 235 240

Glu Glu Asn Tyr Phe Glu Arg Ala Asn Asn Pro Ile Val Ser Arg Asp

245 250 255

Ser Lys Glu Ile Gly Tyr Trp His Leu Val Asn Asn Arg Tyr Val Ser

260 265 270

Ser Thr Gly Glu Gln Pro Thr Val Ser Thr Thr Thr Tyr Asn Pro Pro

275 280 285

Tyr Ser Tyr Gln Ala Thr Pro Val Asn Gln Val Lys Asp Val Val Arg

290 295 300

Ala Asn Ala Gly Val Gly Val Ile Ser Pro

305 310

<210> 16

<211> 6085

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gggggtgatg tggtgaccgt tagcaccggc gaccagctga tcgcagcgct gaagaacaag 60

aaagctaaca cccccctgac catctatatc gatggtacca tcaccccagc taataccagc 120

gcgtcgaaga tcgatatcaa agatgtcaat gatgttagct tgctgggcgt tggtacgaac 180

ggtgagttga acggtattgg cattaaggtg tggcgtgcga acaacgttat catccgtaat 240

ctgaagattc atcatgtaaa cacgggtgat aaagacgcga tctccattga aggtccgtcg 300

aagaacatct gggttgatca caacgagctg tataattcgc tggacgtgca caaagactac 360

tatgatggcc tgttcgacgt gaaaagagat gcagactaca tcacgttcag ctggaattac 420

gtgcacgatt cttggaaaag catgctgatg ggtagttccg acagcgatag ctatggtcgt 480

aaaatcactt tccacaataa ctatttcgag aacctgaaca gccgtgttcc gtctgttcgc 540

tttggtgagg cacatatttt cagcaattat tacgcagaca tccgcgaaac cggcatcaac 600

tctcgtatgg gtgcacaggt tcgcattgag gagaactact tcgaacgcgc gaacaacccg 660

attgttagcc gcgattcaaa agaaattggt tactggcacc tggttaataa ccgttacgtt 720

tcctccaccg gtgagcaacc gaccgtttcc accaccacgt ataatccgcc gtacagctac 780

caagcgaccc cggtcaatca ggttaaggac gttgtgcgtg ctaatgcagg tgtaggcgtc 840

atctcgccgc tcgagcacca ccaccaccac cactgagatc cggctgctaa caaagcccga 900

aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc 960

tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg attggcgaat 1020

gggacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 1080

ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 1140

ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 1200

ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 1260

ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 1320

gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 1380

tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 1440

ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttc aggtggcact tttcggggaa 1500

atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca 1560

tgaattaatt cttagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa actgcaattt attcatatca 1620

ggattatcaa taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta atgaaggaga aaactcaccg 1680

aggcagttcc ataggatggc aagatcctgg tatcggtctg cgattccgac tcgtccaaca 1740

tcaatacaac ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt tatcaagtga gaaatcacca 1800

tgagtgacga ctgaatccgg tgagaatggc aaaagtttat gcatttcttt ccagacttgt 1860

tcaacaggcc agccattacg ctcgtcatca aaatcactcg catcaaccaa accgttattc 1920

attcgtgatt gcgcctgagc gagacgaaat acgcgatcgc tgttaaaagg acaattacaa 1980

acaggaatcg aatgcaaccg gcgcaggaac actgccagcg catcaacaat attttcacct 2040

gaatcaggat attcttctaa tacctggaat gctgttttcc cggggatcgc agtggtgagt 2100

aaccatgcat catcaggagt acggataaaa tgcttgatgg tcggaagagg cataaattcc 2160

gtcagccagt ttagtctgac catctcatct gtaacatcat tggcaacgct acctttgcca 2220

tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca atcgatagat tgtcgcacct 2280

gattgcccga cattatcgcg agcccattta tacccatata aatcagcatc catgttggaa 2340

tttaatcgcg gcctagagca agacgtttcc cgttgaatat ggctcataac accccttgta 2400

ttactgttta tgtaagcaga cagttttatt gttcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt 2460

ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt 2520

ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg 2580

tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca 2640

gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt 2700

agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga 2760

taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc 2820

gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact 2880

gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga 2940

caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg 3000

aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt 3060

tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt 3120

acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga 3180

ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac 3240

gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcctgatgc ggtattttct 3300

ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catatatggt gcactctcag tacaatctgc 3360

tctgatgccg catagttaag ccagtataca ctccgctatc gctacgtgac tgggtcatgg 3420

ctgcgccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg 3480

catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac 3540

cgtcatcacc gaaacgcgcg aggcagctgc ggtaaagctc atcagcgtgg tcgtgaagcg 3600

attcacagat gtctgcctgt tcatccgcgt ccagctcgtt gagtttctcc agaagcgtta 3660

atgtctggct tctgataaag cgggccatgt taagggcggt tttttcctgt ttggtcactg 3720

atgcctccgt gtaaggggga tttctgttca tgggggtaat gataccgatg aaacgagaga 3780

ggatgctcac gatacgggtt actgatgatg aacatgcccg gttactggaa cgttgtgagg 3840

gtaaacaact ggcggtatgg atgcggcggg accagagaaa aatcactcag ggtcaatgcc 3900

agcgcttcgt taatacagat gtaggtgttc cacagggtag ccagcagcat cctgcgatgc 3960

agatccggaa cataatggtg cagggcgctg acttccgcgt ttccagactt tacgaaacac 4020

ggaaaccgaa gaccattcat gttgttgctc aggtcgcaga cgttttgcag cagcagtcgc 4080

ttcacgttcg ctcgcgtatc ggtgattcat tctgctaacc agtaaggcaa ccccgccagc 4140

ctagccgggt cctcaacgac aggagcacga tcatgcgcac ccgtggggcc gccatgccgg 4200

cgataatggc ctgcttctcg ccgaaacgtt tggtggcggg accagtgacg aaggcttgag 4260

cgagggcgtg caagattccg aataccgcaa gcgacaggcc gatcatcgtc gcgctccagc 4320

gaaagcggtc ctcgccgaaa atgacccaga gcgctgccgg cacctgtcct acgagttgca 4380

tgataaagaa gacagtcata agtgcggcga cgatagtcat gccccgcgcc caccggaagg 4440

agctgactgg gttgaaggct ctcaagggca tcggtcgaga tcccggtgcc taatgagtga 4500

gctaacttac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt 4560

gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgcc 4620

agggtggttt ttcttttcac cagtgagacg ggcaacagct gattgccctt caccgcctgg 4680

ccctgagaga gttgcagcaa gcggtccacg ctggtttgcc ccagcaggcg aaaatcctgt 4740

ttgatggtgg ttaacggcgg gatataacat gagctgtctt cggtatcgtc gtatcccact 4800

accgagatat ccgcaccaac gcgcagcccg gactcggtaa tggcgcgcat tgcgcccagc 4860

gccatctgat cgttggcaac cagcatcgca gtgggaacga tgccctcatt cagcatttgc 4920

atggtttgtt gaaaaccgga catggcactc cagtcgcctt cccgttccgc tatcggctga 4980

atttgattgc gagtgagata tttatgccag ccagccagac gcagacgcgc cgagacagaa 5040

cttaatgggc ccgctaacag cgcgatttgc tggtgaccca atgcgaccag atgctccacg 5100

cccagtcgcg taccgtcttc atgggagaaa ataatactgt tgatgggtgt ctggtcagag 5160

acatcaagaa ataacgccgg aacattagtg caggcagctt ccacagcaat ggcatcctgg 5220

tcatccagcg gatagttaat gatcagccca ctgacgcgtt gcgcgagaag attgtgcacc 5280

gccgctttac aggcttcgac gccgcttcgt tctaccatcg acaccaccac gctggcaccc 5340

agttgatcgg cgcgagattt aatcgccgcg acaatttgcg acggcgcgtg cagggccaga 5400

ctggaggtgg caacgccaat cagcaacgac tgtttgcccg ccagttgttg tgccacgcgg 5460

ttgggaatgt aattcagctc cgccatcgcc gcttccactt tttcccgcgt tttcgcagaa 5520

acgtggctgg cctggttcac cacgcgggaa acggtctgat aagagacacc ggcatactct 5580

gcgacatcgt ataacgttac tggtttcaca ttcaccaccc tgaattgact ctcttccggg 5640

cgctatcatg ccataccgcg aaaggttttg cgccattcga tggtgtccgg gatctcgacg 5700

ctctccctta tgcgactcct gcattaggaa gcagcccagt agtaggttga ggccgttgag 5760

caccgccgcc gcaaggaatg gtgcatgcaa ggagatggcg cccaacagtc ccccggccac 5820

ggggcctgcc accataccca cgccgaaaca agcgctcatg agcccgaagt ggcgagcccg 5880

atcttcccca tcggtgatgt cggcgatata ggcgccagca accgcacctg tggcgccggt 5940

gatgccggcc acgatgcgtc cggcgtagag gatcgagatc tcgatcccgc gaaattaata 6000

cgactcacta taggggaatt gtgagcggat aacaattccc ctctagaaat aattttgttt 6060

aactttaaga aggagatata ccatg 6085

<210> 17

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gcttctgcct taaactcggg caaagtaaat ccgcttgccg acttcagctt aaaaggcttt 60

gccgcactaa acggcggaac aacgggcgga gaa 93

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gggggtgatg tggtgaccg 19

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

catggtatat ctccttctta aagttaaaca 30

<210> 20

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

taagaaggag atataccatg gcttctgcct taaactcggg c 41

<210> 21

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

acggtcacca catcaccccc ttctccgccc gttgttcc 38

<210> 22

<211> 6004

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

atctatatcg atggtaccat caccccagct aataccagcg cgtcgaagat cgatatcaaa 60

gatgtcaatg atgttagctt gctgggcgtt ggtacgaacg gtgagttgaa cggtattggc 120

attaaggtgt ggcgtgcgaa caacgttatc atccgtaatc tgaagattca tcatgtaaac 180

acgggtgata aagacgcgat ctccattgaa ggtccgtcga agaacatctg ggttgatcac 240

aacgagctgt ataattcgct ggacgtgcac aaagactact atgatggcct gttcgacgtg 300

aaaagagatg cagactacat cacgttcagc tggaattacg tgcacgattc ttggaaaagc 360

atgctgatgg gtagttccga cagcgatagc tatggtcgta aaatcacttt ccacaataac 420

tatttcgaga acctgaacag ccgtgttccg tctgttcgct ttggtgaggc acatattttc 480

agcaattatt acgcagacat ccgcgaaacc ggcatcaact ctcgtatggg tgcacaggtt 540

cgcattgagg agaactactt cgaacgcgcg aacaacccga ttgttagccg cgattcaaaa 600

gaaattggtt actggcacct ggttaataac cgttacgttt cctccaccgg tgagcaaccg 660

accgtttcca ccaccacgta taatccgccg tacagctacc aagcgacccc ggtcaatcag 720

gttaaggacg ttgtgcgtgc taatgcaggt gtaggcgtca tctcgccgct cgagcaccac 780

caccaccacc actgagatcc ggctgctaac aaagcccgaa aggaagctga gttggctgct 840

gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct ctaaacgggt cttgaggggt 900

tttttgctga aaggaggaac tatatccgga ttggcgaatg ggacgcgccc tgtagcggcg 960

cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc 1020

tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc 1080

gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg 1140

accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg 1200

tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg 1260

gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt 1320

cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa 1380

tattaacgtt tacaatttca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt 1440

gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gaattaattc ttagaaaaac 1500

tcatcgagca tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag gattatcaat accatatttt 1560

tgaaaaagcc gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga ggcagttcca taggatggca 1620

agatcctggt atcggtctgc gattccgact cgtccaacat caatacaacc tattaatttc 1680

ccctcgtcaa aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat gagtgacgac tgaatccggt 1740

gagaatggca aaagtttatg catttctttc cagacttgtt caacaggcca gccattacgc 1800

tcgtcatcaa aatcactcgc atcaaccaaa ccgttattca ttcgtgattg cgcctgagcg 1860

agacgaaata cgcgatcgct gttaaaagga caattacaaa caggaatcga atgcaaccgg 1920

cgcaggaaca ctgccagcgc atcaacaata ttttcacctg aatcaggata ttcttctaat 1980

acctggaatg ctgttttccc ggggatcgca gtggtgagta accatgcatc atcaggagta 2040

cggataaaat gcttgatggt cggaagaggc ataaattccg tcagccagtt tagtctgacc 2100

atctcatctg taacatcatt ggcaacgcta cctttgccat gtttcagaaa caactctggc 2160

gcatcgggct tcccatacaa tcgatagatt gtcgcacctg attgcccgac attatcgcga 2220

gcccatttat acccatataa atcagcatcc atgttggaat ttaatcgcgg cctagagcaa 2280

gacgtttccc gttgaatatg gctcataaca ccccttgtat tactgtttat gtaagcagac 2340

agttttattg ttcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga 2400

ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg 2460

cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc 2520

aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct 2580

agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc 2640

tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt 2700

ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg 2760

cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct 2820

atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag 2880

ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag 2940

tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg 3000

gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg 3060

gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac 3120

cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt 3180

gagcgaggaa gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat 3240

ttcacaccgc atatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc 3300

cagtatacac tccgctatcg ctacgtgact gggtcatggc tgcgccccga cacccgccaa 3360

cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg 3420

tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga 3480

ggcagctgcg gtaaagctca tcagcgtggt cgtgaagcga ttcacagatg tctgcctgtt 3540

catccgcgtc cagctcgttg agtttctcca gaagcgttaa tgtctggctt ctgataaagc 3600

gggccatgtt aagggcggtt ttttcctgtt tggtcactga tgcctccgtg taagggggat 3660

ttctgttcat gggggtaatg ataccgatga aacgagagag gatgctcacg atacgggtta 3720

ctgatgatga acatgcccgg ttactggaac gttgtgaggg taaacaactg gcggtatgga 3780

tgcggcggga ccagagaaaa atcactcagg gtcaatgcca gcgcttcgtt aatacagatg 3840

taggtgttcc acagggtagc cagcagcatc ctgcgatgca gatccggaac ataatggtgc 3900

agggcgctga cttccgcgtt tccagacttt acgaaacacg gaaaccgaag accattcatg 3960

ttgttgctca ggtcgcagac gttttgcagc agcagtcgct tcacgttcgc tcgcgtatcg 4020

gtgattcatt ctgctaacca gtaaggcaac cccgccagcc tagccgggtc ctcaacgaca 4080

ggagcacgat catgcgcacc cgtggggccg ccatgccggc gataatggcc tgcttctcgc 4140

cgaaacgttt ggtggcggga ccagtgacga aggcttgagc gagggcgtgc aagattccga 4200

ataccgcaag cgacaggccg atcatcgtcg cgctccagcg aaagcggtcc tcgccgaaaa 4260

tgacccagag cgctgccggc acctgtccta cgagttgcat gataaagaag acagtcataa 4320

gtgcggcgac gatagtcatg ccccgcgccc accggaagga gctgactggg ttgaaggctc 4380

tcaagggcat cggtcgagat cccggtgcct aatgagtgag ctaacttaca ttaattgcgt 4440

tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg 4500

gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgcca gggtggtttt tcttttcacc 4560

agtgagacgg gcaacagctg attgcccttc accgcctggc cctgagagag ttgcagcaag 4620

cggtccacgc tggtttgccc cagcaggcga aaatcctgtt tgatggtggt taacggcggg 4680

atataacatg agctgtcttc ggtatcgtcg tatcccacta ccgagatatc cgcaccaacg 4740

cgcagcccgg actcggtaat ggcgcgcatt gcgcccagcg ccatctgatc gttggcaacc 4800

agcatcgcag tgggaacgat gccctcattc agcatttgca tggtttgttg aaaaccggac 4860

atggcactcc agtcgccttc ccgttccgct atcggctgaa tttgattgcg agtgagatat 4920

ttatgccagc cagccagacg cagacgcgcc gagacagaac ttaatgggcc cgctaacagc 4980

gcgatttgct ggtgacccaa tgcgaccaga tgctccacgc ccagtcgcgt accgtcttca 5040

tgggagaaaa taatactgtt gatgggtgtc tggtcagaga catcaagaaa taacgccgga 5100

acattagtgc aggcagcttc cacagcaatg gcatcctggt catccagcgg atagttaatg 5160

atcagcccac tgacgcgttg cgcgagaaga ttgtgcaccg ccgctttaca ggcttcgacg 5220

ccgcttcgtt ctaccatcga caccaccacg ctggcaccca gttgatcggc gcgagattta 5280

atcgccgcga caatttgcga cggcgcgtgc agggccagac tggaggtggc aacgccaatc 5340

agcaacgact gtttgcccgc cagttgttgt gccacgcggt tgggaatgta attcagctcc 5400

gccatcgccg cttccacttt ttcccgcgtt ttcgcagaaa cgtggctggc ctggttcacc 5460

acgcgggaaa cggtctgata agagacaccg gcatactctg cgacatcgta taacgttact 5520

ggtttcacat tcaccaccct gaattgactc tcttccgggc gctatcatgc cataccgcga 5580

aaggttttgc gccattcgat ggtgtccggg atctcgacgc tctcccttat gcgactcctg 5640

cattaggaag cagcccagta gtaggttgag gccgttgagc accgccgccg caaggaatgg 5700

tgcatgcaag gagatggcgc ccaacagtcc cccggccacg gggcctgcca ccatacccac 5760

gccgaaacaa gcgctcatga gcccgaagtg gcgagcccga tcttccccat cggtgatgtc 5820

ggcgatatag gcgccagcaa ccgcacctgt ggcgccggtg atgccggcca cgatgcgtcc 5880

ggcgtagagg atcgagatct cgatcccgcg aaattaatac gactcactat aggggaattg 5940

tgagcggata acaattcccc tctagaaata attttgttta actttaagaa ggagatatac 6000

catg 6004

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

atctatatcg atggtaccat caccc 25

<210> 24

<211> 174

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gcttctgcct taaactcggg caaagtaaat ccgcttgccg acttcagctt aaaaggcttt 60

gccgcactaa acggcggaac aacgggcgga gaaggcggtc agacggtaac cgtaacaacg 120

ggagatcagc tgattgcggc attaaaaaat aagaatgcaa atacgccttt aaaa 174

<210> 25

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

taagaaggag atataccatg gcttctgcct taaactcggg c 41

Claims

1.一种突变果胶裂解酶PGLA-rep4编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种突变果胶裂解酶PGLA-rep4的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

优选的，一种重组载体，包含权利要求1所述突变果胶裂解酶PGLA-rep4编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示；

优选的，一种重组菌，包含权利要求1所述突变果胶裂解酶PGLA-rep4编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。

3.一种含突变果胶裂解酶PGLA-rep4基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(4)制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将步骤(3)制得的重组质粒pET-28a(+)-PGLA-rep4转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，即得含突变果胶裂解酶PGLA-rep4的大肠杆菌工程菌；

优选的，所述步骤(1)中，正向PCR扩增以pET-28a(+)-PGLA质粒为模板，扩增引物分别为F1、R1，扩增引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6；

优选的，所述步骤(1)中，PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：

PCR扩增程序如下：

优选的，所述步骤(2)中，正向PCR扩增模板为Pel SWU基因片段，基因序列在NCBI数据库中的登录号为AB428424，扩增引物分别为F2、R2，扩增引物的核苷酸序列分别为SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8；

优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：

所述的PCR扩增程序如下：

优选的，所述步骤(3)中，无缝克隆PCR扩增体系如下，总体系为20μl：

所述的无缝克隆程序如下：

37℃反应30min，4℃保存；

优选的，所述步骤(4)中，筛选阳性克隆的方法为：将转化细胞涂布在含有50μg/mL卡纳霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养，挑取单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37℃培养过夜，然后通过PCR验证，得到目的基因条带的阳性克隆子，然后测序，保留测序结果正确的菌株作为目的表达菌株。

4.一种突变果胶裂解酶PGLA-rep1编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

5.一种突变果胶裂解酶PGLA-rep1的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；

优选的，一种重组载体，包含权利要求4所述突变果胶裂解酶PGLA-rep1编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.9所示；

优选的，一种重组菌，包含权利要求4所述突变果胶裂解酶PGLA-rep1编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.9所示。

6.一种含突变果胶裂解酶PGLA-rep1基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

①通过反向PCR直接扩增得到pET-28a(+)-PGLA-rep1质粒，其核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示；

②制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将步骤①制得的重组质粒pET-28a(+)-PGLA-rep1转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，即得含突变果胶裂解酶PGLA-rep1的大肠杆菌工程菌；

优选的，所述步骤①中，反向PCR扩增以pET-28a(+)-PGLA质粒为模板，扩增引物分别为F1-1、R1-1，扩增引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13；

优选的，所述步骤①中，PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：

PCR扩增程序如下：

优选的，所述步骤②中，筛选阳性克隆的方法为：将转化细胞涂布在含有50μg/mL卡纳霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养，挑取单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37℃培养过夜，然后通过PCR验证，得到目的基因条带的阳性克隆子，然后测序，保留测序结果正确的菌株作为目的表达菌株。

7.一种突变果胶裂解酶PGLA-rep2编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。

8.一种突变果胶裂解酶PGLA-rep2的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；

优选的，一种重组载体，包含权利要求7所述突变果胶裂解酶PGLA-rep2编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.14所示；

优选的，一种重组菌，包含权利要求7所述突变果胶裂解酶PGLA-rep2编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO.14所示。

9.一种含突变果胶裂解酶PGLA-rep2基因的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

<4>制备大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将步骤<3>制得的重组质粒pET-28a(+)-PGLA-rep2转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，即得含突变果胶裂解酶PGLA-rep2的大肠杆菌工程菌；

优选的，所述步骤<1>中，正向PCR扩增以pET-28a(+)-PGLA质粒为模板，扩增引物分别为F1-1-1、R1-1-1，扩增引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19；

优选的，所述步骤<1>中，PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：

PCR扩增程序如下：

优选的，所述步骤<2>中，正向PCR扩增模板为Pel SWU基因片段，基因序列在NCBI数据库中的登录号为AB428424，扩增引物分别为F1-1-2、R1-1-2，扩增引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21；

优选的，所述步骤<2>中，PCR扩增的反应体系如下，总体系为50μl：

所述的PCR扩增程序如下：

优选的，所述步骤<3>中，无缝克隆PCR扩增体系如下，总体系为20μl：

所述的无缝克隆程序如下：

37℃反应30min，4℃保存；

优选的，所述步骤<4>中，筛选阳性克隆的方法为：将转化细胞涂布在含有50μg/mL卡纳霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养，挑取单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37℃培养过夜，然后通过PCR验证，得到目的基因条带的阳性克隆子，然后测序，保留测序结果正确的菌株作为目的表达菌株。

10.权利要求2中所述重组菌、权利要求5中所述重组菌或权利要求8中所述重组菌在生产果胶裂解酶中的应用。