CN113549608A - 一种果胶裂解酶突变体△PelG403及其编码基因、制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种果胶裂解酶突变体ΔPelG403及其编码基因、制备方法和应用，该果胶裂解酶突变体ΔPelG403为将野生型果胶裂解酶PelG403柔性区第129位的氨基酸由小分子量丙氨酸突变为大分子量缬氨酸；其氨基酸序列和核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。本发明提供的突变体酶在碱性条件下，酶活力和耐热性能有明显的提高，解决了野生型果胶裂解酶在碱性条件下催化活性低和热稳定性不足的问题，为利用该酶在棉麻加工、制浆造纸、工业废水处理等行业中的应用创造了良好条件。

Description

一种果胶裂解酶突变体ΔPelG403及其编码基因、制备方法和 应用

技术领域

本发明属于分子生物学的技术领域，更具体地，涉及一种果胶裂解酶突变体ΔPelG403及其编码基因、制备方法和应用。

背景技术

果胶裂解酶(Pectate lyase，简称Pel，EC 4.2.2.2)通过反式消去作用以随机方式切割果胶酸或果胶的α-1，4-糖苷键，生成C₄-C₅不饱和寡聚半乳糖醛酸；其最适pH一般在碱性范围，催化作用依赖于Ca²⁺。Starr和Moran于1962年在Erwinia carotovora和Bacilluspolymyxa的培养物中首次发现果胶裂解酶；随后，在Penicillium sp.、Paenibacillus sp.和Psedomonas sp.等微生物资源中均发现了果胶裂解酶。

果胶裂解酶被广泛应用于许多领域，如造纸、咖啡和茶发酵、纺织和植物纤维加工、采油和处理工业废水等。

作为一种重要的清洁生产用酶，果胶裂解酶备受关注，其主要应用于纸浆漂白和纺织品的生物精炼等行业。酶解精炼方法能从根本上解决传统工艺存在的环境和能源等问题，在质量与环保方面具有传统工艺无法比拟的优点。果胶裂解酶的工业化应用主要取决于其酶活力的最适温度、最适pH、稳定温度和稳定pH等酶学性质。因此，从微生物菌种资源中发掘优良的果胶裂解酶，选择适合工业化生产应用的果胶裂解酶是关注的焦点之一。

果胶裂解酶在工业化应用过程中常会遇到高温环境，温度过高会破坏果胶酶蛋白中的盐桥、氢键、范德华力和疏水相互作用等非共价键，从而破坏果胶酶的空间结构，使其从折叠状态变为相对展开状态，果胶酶活力降低，甚至酶失活。据报道，目前大多数果胶裂解酶都来源于常温微生物，其在50℃下保温1h，基本全部失活。

随着分子生物学技术的发展，对现有果胶裂解酶进行分子改造，是获得高酶活力和耐高温优良酶种的有效手段之一。定点突变是基于果胶裂解酶已知或预测的结构信息及催化机理，对其结构与功能关系进行分析，推测出影响酶稳定性、催化活性等的主要位点，再对其关键位点进行修饰或替换；其具有突变率高、重复性好等优点，已被广泛用于酶性能的改良。

截至目前，尚未见到点突变改造果胶裂解酶的有关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种果胶裂解酶突变体ΔPelG403及其编码基因、制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种果胶裂解酶突变体ΔPelG403，其将柔性区第129位的氨基酸由小分子量丙氨酸突变为大分子量缬氨酸。

具体地，在上述技术方案中，通过将位于第128-137位的柔性区(无规卷曲和转角区)中的第129位的氨基酸进行点突变，具体为在GenBank数据库中公布的pelG403基因序列(GenBank登录号：JX964998)的基础上，对其编码的氨基酸进行取代，所述氨基酸取代点为第129位丙氨酸，增加柔性区域的分子间作用力(范德华力等)，从而提高酶的耐热性。

进一步地，在上述技术方案中，所述果胶裂解酶突变体ΔPelG403的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了编码所述果胶裂解酶突变体的基因ΔpelG403。

进一步地，在上述技术方案中，所述基因ΔpelG403的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了含有所述基因ΔpelG403的载体。

本发明还提供了含有所述基因ΔpelG403或所述载体的宿主细胞。

本发明还提供了含有所述基因ΔpelG403或所述载体的工程菌。

本发明又一方面还提供了所述基因ΔpelG403及其所编码的酶在降解棉麻胶质、造纸原料胶质和工业废水中果胶中的应用。

本发明再一方面还提供了生产所述果胶裂解酶突变体ΔPelG403的方法，包括：

将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列以能表达该酶的质粒为表达载体，以能表达该酶的菌株为表达宿主，实现SEQ ID NO.1所示的突变体基因的高效表达。

详细地，在上述技术方案中，将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列以pET28a或能表达该酶的质粒为表达载体，以大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)或能表达该酶的菌株为表达宿主，实现突变体基因pelG403^A129V的高效表达。

具体地，在上述技术方案中，所述果胶裂解酶基因pelG403来自一种麻类脱胶高效菌种Dickeya dadantii DCE-01(保藏编号：CGMCC 5522，专利号：ZL201110410078.7)；所用的pET28a表达单元的启动子为常用的T₇启动子，在T₇启动子的作用下，突变体酶可以直接在宿主细胞E.coli BL21(DE3)中，完成胞内的可溶性表达。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

本发明提供的突变体酶在碱性条件下，酶活力和耐热性能有明显的提高，解决了野生型果胶裂解酶在碱性条件下催化活性低和热稳定性不足的问题，为利用该酶在棉麻加工、制浆造纸、工业废水处理等行业中的应用创造了良好条件。

本发明通过比较野生酶PelG403和突变酶PelG403在碱性条件下对聚半乳糖醛酸钠的降解能力，结果表明：在pH为9.0的条件下，突变体酶PelG403^A129V的比酶活为9820.5U/mg，为野生型PelG403的1.2倍；在50℃条件下保温2h，突变体酶PelG403^A129V的剩余酶活力为1689.8U/mg，为野生型PelG403的4.7倍，即突变体酶在碱性条件下具有耐热和高酶活力的特性，预示着其在需高温碱性条件下的工业化生产中具有重要的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例中突变果胶裂解酶工程菌株的构建流程图；

图2为本发明实施例中重组质粒pET28a(+)-pelG403的构建图谱；

图3为本发明实施例中定点突变的原理示意图；

图4为本发明实施例中野生型和突变型酶诱导表达的SDS-PAGE图谱；

图5为本发明实施例中野生型和突变酶的稳定温度比较图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中，如无特别说明，所用手段均为本领域常规的手段。

本文中所用的术语“包含”、“包括”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

材料和试剂：

表达载体pET28a、原核克隆感受态E.coli TOP10与原核表达感受态E.coli BL21(DE3)均购自Novagen公司；

超强高保真PCR试剂盒Ultra HiFidelity PCR Kit、离心柱型细菌基因组抽提试剂盒、快速定点突变试剂盒、DNAMarker III、2×Taq PCR Mix试剂、普通琼脂糖凝胶NDA回收试剂盒、质粒小提试剂盒、IPTG、卡那霉素(Kan)均购自Tiangen生物公司；

聚半乳糖醛酸钠盐、胰蛋白胨、酵母提取物和琼脂粉购自Sigma公司；

引物合成和核酸测序由擎科生物科技有限公司完成；

其余的化学试剂都为分析纯级的商业化产品，购自国药集团。

如图1所示为本发明实施例中突变果胶裂解酶工程菌株的构建流程图。

实施例一：重组质粒的构建

将D.dadantii DCE-01培养至对数生长期，取1.5mL菌液在12000rpm下离心1min，收集菌体沉淀；然后按照试剂盒说明书提取基因组DNA。

根据果胶裂解酶基因pelG403和载体pET28a的MCS区段依次选取酶切位点Nde I、Xho I用生物信息学软件SnapGene设计如下引物：

F：5’CGCATATGATGAAATCACTCATTACCCC 3’(Nde I)(SEQ ID NO.3)

R：5’CCTCGAGTTATTTACAGGCTGCGCTGGT 3’(Xho I)(SEQ ID NO.4)。

PCR反应体系为：基因组DNA，1μL；Primer F(10μM)，0.75μL；Primer R(10μM)，0.75μL；2×UltraHiFi Mix(with dye)12.5μL；用ddH₂O补足到25μL；混匀后进行PCR反应。

参数设置为：

(1)94℃预变性2min；(2)98℃变性10s；(3)60℃复性30s；(4)68℃延伸15s；重复步骤(2)-(4)，35个循环；(5)68℃保温5min。

用相应的限制性内切酶分别对纯化后PCR产物和pET28a(+)载体进行双酶切，切胶回收pET28a(+)线性载体和目标基因，用T4 DNA连接酶在16℃条件下过夜连接载体和目标基因；连接产物转化至原核克隆感受态E.coli TOP10，将转化菌液均匀涂布到LB筛选平板(Kan 50ug/mL)，37℃培养过夜；挑取转化子液体培养，提取质粒，通过酶切和PCR验证获得重组质粒pET28a-pelG403(图2)，再将重组质粒转到E.coli BL21(DE3)，获得pET28a-pelG403/BL21工程菌。

实施例二：定点突变

定点突变原理：点突变质粒的构建采用Dpn I法(图3)。

根据待突变的氨基酸位点来设计PCR点突变引物如下：

F_A129v：5′CACCATCATCGGCGTGAACGGTTCTTCCGC 3′(SEQ ID NO.5)

R_A129V：5′GCGGAAGAACCGTTCACGCCGATGATGGTG 3′(SEQ ID NO.6)；

其中，下划线部分代表突变体基因编码的第129位缬氨酸所对应的密码子。

利用快速定点突变试剂盒以pET28a-pelG403重组质粒为模板，进行全质粒PCR引入突变位点。

PCR反应体系为：Primer F(10μM)1μL，Primer R(10μM)1μL，5×FastAlterationBuffer 5μL，质粒DNA 1μL，Fast Alteration DNA Polymerase 0.5μL，用ddH₂O补足到25μL。

参数设置为：

(1)95℃预变性2min；(2)94℃变性20s；(3)60℃复性10s；(4)68℃延伸2.5min；重复步骤2-4，18个循环；(5)68℃保温5min，产物4℃保存。

将0.5μL限制性内切酶Dpn I加入至突变好的25μL PCR产物中，充分混匀后，置于37℃条件下消化1h；取5μL Dpn I消化产物转进DH5α，将转化菌液均匀涂布到LB筛选平板(Kan 50ug/mL)，37℃培养过夜，得到相关突变株的转化子，提取质粒，经过EcoR I单酶切和突变基因PCR扩增、测序，得到正确突变株，将构建成功的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)，得到基因工程突变株pET28a-pelG403^A129V/BL21。

实施例三：野生酶和突变酶的诱导表达及SDS-PAGE分析

将基因工程菌pET28a-pelG403/BL21和pET28a-pelG403^A129V/BL21的单菌落接种于含有50mg/LKan的LB液体培养基中，37℃、220r/min培养至OD₆₀₀至0.6，加入0.5mmol/LIPTG，28℃、120r/min诱导表达12-15h。

取1mL诱导成熟的发酵菌液于1.5mL离心管中，10000r/min离心5min，弃上清液，加入500μL的生理盐水漩涡震荡，离心，洗涤两次。用40μL灭菌ddH₂O悬浮菌体沉淀，加入10μL的5×蛋白上样缓冲液，煮沸5min，自然冷却，-20℃保存备用(注：上样前用沸水浴3min)。

对制备好的样品通过不连续的SDS-PAGE(5％浓缩胶和12％分离胶)进行分析(如图4所示)，以未插入目的基因的pET28a/BL21菌株做相同处理作为空白对照，结果发现野生型果胶裂解酶工程菌株pET28a-pelG403/BL21及突变体工程菌株pET28a-pelG403^A129V/BL21均能成功表达出特异蛋白质谱带。

实施例四：野生酶和突变酶的酶液制备

(1)取诱导成熟的发酵液，3000r/min，4℃离心10min，收集菌体；

(2)每1mL细菌蛋白抽提试剂中加入1μL DNase I、2μL溶菌酶和10μL蛋白酶抑制剂混合液，涡旋震荡混匀；

(3)按照每克菌体沉淀加入20mL细菌蛋白抽提试剂的比例，向菌体沉淀中加入抽提液，用移液枪上下吹打直至菌体完全重悬；

(4)重悬后，室温孵育10-15min；

(5)15000r/min离心5min；

(6)转移上清至新的离心管中(上清液即为胞内可溶性蛋白)，进行蛋白定量及酶活力测定。

实施例五：野生酶和突变酶体外的催化能力比较

为了比较野生酶和突变酶在碱性条件下的生物催化能力，在相同条件下进行酶活力测定。

酶活力测定方法：用0.05mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.0)配置5mg/mL的聚半乳糖醛酸钠溶液。取1mL底物预热至50℃，添加10μL适当稀释的酶液，50℃准确反应10min，立即加入2mL DNS。沸水浴中显色5min，冰水浴迅速冷却。以煮沸灭活的相同酶液，做相同反应为阴性对照，测定样品的OD₅₂₀。

果胶裂解酶活力定义为：底物每分钟释放出1μmol不饱和半乳糖醛酸的还原糖所需的酶量为1个酶活力单位，以U表示。

结果发现，在pH9.0条件下，突变体PelG403^A129V的比酶活为9820.5U/mg，为野生型PelG403的1.2倍，其催化聚半乳糖醛酸钠降解能力大幅度提高。

实施例六：野生酶和突变酶的耐热性能比较

将粗酶液置于在50℃条件下保温2h，测定剩余酶活力(如图5所示)，用来表征酶的热稳定性。结果发现在50℃条件下保温2h，突变体PelG403^A129V的剩余酶活力为3636.3U/mg，为野生型PelG403的4.7倍；说明A129位点的突变使该果胶裂解酶的热稳定性提高。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。

应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国农业科学院麻类研究所

<120> 一种果胶裂解酶突变体△PelG403及其编码基因、制备方法和应用

<141> 2021-05-24

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 387

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Pro Ile Ser His Phe Ser Lys Thr Gly Ile Leu Leu Met Lys Ser

1 5 10 15

Phe Ile Ala Pro Ile Ala Ala Gly Leu Leu Leu Ala Phe Ser Gln Ser

20 25 30

Ser Leu Ala Ala Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Thr Ser Gly Gly Asn Val

35 40 45

Thr Gly Thr Val Ser Lys Thr Ala Ala Ser Met Gln Asp Ile Ile Asp

50 55 60

Ile Ile Asp Ala Ala Lys Leu Asp Ala Lys Gly Lys Lys Val Lys Gly

65 70 75 80

Gly Ala Tyr Pro Leu Val Ile Thr Tyr Thr Gly Asn Glu Asp Ser Leu

85 90 95

Ile Asn Ala Ala Ala Ala Asn Ile Cys Gly Gln Trp Ser Lys Asp Ala

100 105 110

Arg Gly Val Glu Ile Lys Asp Phe Thr Lys Gly Ile Thr Ile Ile Gly

115 120 125

Ala Asn Gly Ser Ser Ala Asn Phe Gly Ile Trp Ile Val Asn Ser Ser

130 135 140

Asp Val Val Val Arg Asn Met Arg Ile Gly Tyr Leu Pro Gly Gly Ala

145 150 155 160

Gln Asp Gly Asp Met Phe Arg Ile Asp Asn Ser Pro Asn Ile Trp Leu

165 170 175

Asp His Asn Glu Leu Phe Ala Ala Asn His Glu Cys Asp Gly Thr Lys

180 185 190

Asp Gly Asp Thr Thr Phe Glu Ser Ala Phe Asp Ile Lys Lys Gly Ala

195 200 205

Thr Tyr Val Thr Ile Ser Tyr Asn Tyr Ile His Gly Val Lys Lys Val

210 215 220

Gly Leu Ala Gly Phe Ser Ala Ser Asp Ser Ala Glu Arg Asn Ile Thr

225 230 235 240

Tyr His His Asn Ile Tyr Asn Asp Val Asn Ala Arg Leu Pro Leu Gln

245 250 255

Arg Gly Gly Asn Val His Ala Tyr Asn Asn Leu Tyr Thr Asn Ile Thr

260 265 270

Ser Ser Gly Leu Asn Val Arg Gln Asn Gly Lys Ala Leu Val Glu Ser

275 280 285

Asn Trp Phe Glu Asn Ala Val Asn Pro Val Thr Ser Arg Tyr Asp Gly

290 295 300

Ser Asn Phe Gly Thr Trp Val Leu Lys Asn Asn Asn Ile Thr Lys Pro

305 310 315 320

Ala Asp Phe Ala Thr Tyr Asn Ile Thr Trp Thr Ala Asp Thr Lys Ala

325 330 335

Tyr Val Asn Ala Asp Ser Trp Thr Ser Thr Gly Thr Tyr Pro Thr Val

340 345 350

Thr Tyr Ser Tyr Ser Pro Val Ser Ala Gln Cys Val Lys Asp Lys Leu

355 360 365

Ala Asn Tyr Ala Gly Val Gly Lys Asn Leu Ala Glu Leu Thr Ser Ser

370 375 380

Ala Cys Lys

385

<210> 2

<211> 1164

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atgcccatct cacatttttc aaaaacagga atactactca tgaaatcatt cattgccccg 60

attgccgccg gtctgctgct ggcctttagt caatccagtc tggctgcgac gggcggttat 120

gccaccactt ccgggggcaa cgtgacagga accgtcagca aaaccgcagc atccatgcag 180

gacatcatcg atatcatcga tgccgccaaa ctcgacgcca aaggcaaaaa ggtgaaaggc 240

ggcgcgtacc cgctggtcat cacctatacc ggtaacgaag attcgctgat caacgccgct 300

gccgccaata tctgcggcca gtggagcaaa gacgcccgcg gcgtggaaat caaagacttc 360

accaaaggca tcaccatcat cggcgccaac ggttcttccg ccaacttcgg catctggatc 420

gtgaactcct ccgacgtagt agtacgcaac atgcgtatcg gctacctgcc gggcggcgct 480

caggatggcg atatgttccg tatcgacaac tcgccgaaca tctggctgga ccacaacgaa 540

ctgtttgccg ccaaccacga gtgtgatggc accaaagacg gcgacaccac gttcgaatcc 600

gcctttgaca tcaagaaagg cgccacttac gtcaccattt cctacaacta catccacggc 660

gtgaagaaag tcggtctggc agggttcagc gcctctgaca gcgccgaacg caacatcact 720

taccaccaca atatctacaa tgacgtcaac gcccgtctgc cgttgcagcg cggcggtaac 780

gtacacgcct acaacaacct gtacaccaac atcaccagct ctggtctgaa cgtgcgtcag 840

aacggcaagg cgttggtcga aagcaactgg ttcgaaaacg cggtgaaccc ggtgacgtcc 900

cgctacgacg gcagcaattt cggcacctgg gtgctgaaaa acaacaacat caccaaaccg 960

gctgatttcg ctacctacaa catcacctgg acggcggata ccaaagctta cgtcaacgcc 1020

gatagctgga cttccaccgg cacttacccg actgtgacct acagctacag cccggtcagc 1080

gcacagtgcg tgaaggacaa actggctaac tacgctggtg tcggtaaaaa cctggccgag 1140

ctgaccagct cagcttgtaa ataa 1164

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

cgcatatgat gaaatcactc attacccc 28

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

cctcgagtta tttacaggct gcgctggt 28

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

caccatcatc ggcgtgaacg gttcttccgc 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

gcggaagaac cgttcacgcc gatgatggtg 30

Claims (9)

1.一种果胶裂解酶突变体ΔPelG403，其特征在于，

将野生型果胶裂解酶PelG403柔性区第129位的氨基酸由小分子量丙氨酸突变为大分子量缬氨酸。

2.根据权利要求1所述的果胶裂解酶突变体ΔPelG403，其特征在于，

其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.编码权利要求2所述果胶裂解酶突变体的基因ΔpelG403。

4.根据权利要求3所述的基因ΔpelG403，其特征在于，

其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.含有权利要求3或4所述基因ΔpelG403的载体。

6.含有权利要求3或4所述基因ΔpelG403或权利要求5所述载体的宿主细胞。

7.含有权利要求3或4所述基因ΔpelG403或权利要求5所述载体的工程菌。

8.权利要求3或4所述基因ΔpelG403及其所编码的酶在降解棉麻胶质、造纸原料胶质和工业废水中果胶中的应用。

9.一种生产权利要求2所述果胶裂解酶突变体ΔPelG403的方法，其特征在于，

将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列以能表达该酶的质粒为表达载体，以能表达该酶的菌株为表达宿主，实现SEQ ID NO.1所示的突变体基因的高效表达。

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