CN105112396A - 黑曲霉果胶裂解酶的突变体及玉米酒精发酵生产中糖浆的降粘剂 - Google Patents

黑曲霉果胶裂解酶的突变体及玉米酒精发酵生产中糖浆的降粘剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供黑曲霉果胶裂解酶的突变体及玉米酒精发酵生产中糖浆的降粘剂，涉及生物技术领域。所述突变体，是将黑曲霉果胶裂解酶氨基酸序列第241位的赖氨酸用甲硫氨酸取代后所得。本发明还提供突变体的编码基因。所述突变体的制备方法，包括通过发酵携带所述突变体编码基因的大肠杆菌得到所述突变体。本发明还提供玉米酒精发酵生产中糖浆的降粘剂，是所述突变体与选自纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、谷氨酰胺转氨酶和脂肪酶中的一种或两种以上的混合物。本发明黑曲霉果胶裂解酶的突变体，具有优异的酶稳定性和催化活性，制备方法简单。采用本发明降粘剂，可以在低能耗的条件下对玉米酒精发酵生产中的糖浆进行快速、高效降粘。

Description

黑曲霉果胶裂解酶的突变体及玉米酒精发酵生产中糖浆的降粘剂
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及黑曲霉果胶裂解酶的突变体及玉米酒精发酵生产中糖浆的降粘剂。
背景技术
市场上的玉米酒糟蛋白饲料产品有两种：一种为DDG(DistillersDriedGrains)，是将玉米酒精糟作简单过滤，滤渣干燥，滤清液排放掉，只对滤渣单独干燥而获得的饲料；另一种为DDGS(DistillersDriedGrainswithSolubles)饲料，即含有可溶固形物的干酒糟，是将滤清液干燥浓缩后再与滤渣混合干燥而获得的饲料。后者的能量和营养物质总量均明显高于前者。
玉米酒精发酵后的蒸馏废醪经离心或板框过滤，得到湿酒糟(WDG)和清液(DGS)。受粘度和悬浮物的限制，清液目前只能浓缩为干物质含量约29％的糖浆，再加入湿酒糟(WDG)一起烘干，制备出DDGS。由于糖浆浓度不高，带入大量的水分，极大增加饲料烘干蒸汽能耗，抬升烘干温度，延长高温停留时间，营养物质得到大量破坏，产生大量美拉德反应，使得DDGS颜色较深，极易有焦糊味，影响饲养动物的适口性，最终影响了DDGS饲料的等级和价格，减少玉米燃料乙醇企业的利润。
开发能有效降低糖浆粘度的降粘剂，将有助于减少糖浆蒸发浓缩的时间和能耗，减少糖浆与湿酒糟烘干时的营养物质损失，有利于DDGS饲料品级和价格的提高。
发明内容
本发明的目的是提供一种果胶裂解酶的突变体，具有优异的酶稳定性和催化活性。
本发明的另一目的是提供所述突变体的制备方法，该方法简单，高效。
本发明的再一目的是提供玉米酒精发酵生产中糖浆的降粘剂，可以在低能耗的条件下对玉米燃料乙醇发酵生产中糖浆进行快速、高效降粘。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
黑曲霉果胶裂解酶的突变体，是将黑曲霉果胶裂解酶氨基酸序列第241位的赖氨酸用甲硫氨酸取代后所得。
本发明还提供黑曲霉果胶裂解酶的突变体的编码基因及含有所述编码基因的表达盒、重组载体、重组菌或细胞系。
本发明还提供所述黑曲霉果胶裂解酶的突变体的制备方法，包括下述步骤：通过发酵携带权利要求1所述突变体编码基因的大肠杆菌得到所述突变体。
本发明还提供玉米酒精发酵生产中糖浆的降粘剂，是所述黑曲霉果胶裂解酶的突变体与选自纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、谷氨酰胺转氨酶和脂肪酶中的一种或两种以上的混合物。
优选的技术方案中吗，所述降粘剂按照重量份含有下述成分：
所述黑曲霉果胶裂解酶的突变体17-20份，
纤维素酶40-50份，
木聚糖酶8-15份，
β-葡聚糖酶10-12份，
甘露聚糖酶7-10份，
谷氨酰胺转氨酶0.6-2份，
脂肪酶0.2-2份。
在本发明中，所述降粘剂还含有稳定剂，所述稳定剂选自甘油、乙醇、氯化钠中的一种或两种以上。
在本发明中，所述降粘剂还含有防腐剂，所述防腐剂选自山梨醇、松油、麝香草酚、苯甲酸钠中的一种或两种以上。
本发明还提供所述降粘剂在降低玉米酒精发酵生产中糖浆粘度方面的应用。
本发明黑曲霉果胶裂解酶的突变体，具有优异的酶稳定性和催化活性。本发明所述突变体的制备方法，简单、高效。采用本发明降粘剂，可以在低能耗的条件下对玉米酒精发酵生产中的糖浆进行快速、高效降粘。本发明降粘剂，对糖浆的降粘可实现将清液浓缩到70％浓度以上，减少了酒精发酵过程中蒸汽的消耗，提高副产品DDGS的一级品率。本发明为玉米燃料乙醇的节能减排生产、副产品DDGS的提升，提供了一条有效方法。
附图说明
图1降粘剂1及对照降粘剂1添加量对浓度为29％糖浆粘度的影响，其中Cx表示添加的降粘剂与糖浆的质量比，Cp表示粘度(单位mPa·S)。
图2降粘剂2及对照降粘剂2添加量对浓度为29％糖浆粘度的影响，其中Cx表示添加的降粘剂与糖浆的质量比，Cp表示粘度(单位mPa·S)。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1黑曲霉果胶裂解酶突变体的制备及性质
1.突变体的序列
黑曲霉(Aspergillusniger)果胶裂解酶的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示(该序列由NCBI的黑曲霉果胶裂解酶(GenBank:AIE38009.1)原始序列中的127位和204位的X分别取为K与D而得)，基因cDNA序列如SEQIDNO:2所示。
经过分子模拟软件PROPKAsoftware分析，将黑曲霉果胶裂解酶氨基酸序列第241位的赖氨酸(K)用甲硫氨酸(M)取代，得到突变体K241M，相应地替换密码子。针对大肠杆菌，利用http://www.jcat.de网站进行密码子优化，最终得到突变体K241M的编码基因序列，如SEQIDNO:3所示。
2.黑曲霉果胶裂解酶突变体的制备
委托南京金斯瑞生物科技有限公司(http://www.genscript.com.cn/)合成突变体K241M的基因片段(SEQIDNO:3)。通过酶切位点NdeI和XhoI，将突变体K241M的基因片段插入pET-22b表达载体质粒，然后导入大肠杆菌，得到重组菌1。采用IPTG诱导重组菌1表达突变体K241M。将诱导培养后的重组菌1发酵液离心，分离上清液和沉淀，分别进行SDS-PAGE电泳，发现仅沉淀泳道出现大小约为42kDa的条带。将沉淀采用PBS缓冲液洗涤后，采用上清液相同体积的PBS缓冲液悬浮后超声破碎，离心取上清液作为突变体K241M粗酶液。
采用常规方法，针对大肠杆菌，利用http://www.jcat.de网站对原始黑曲霉果胶裂解酶基因cDNA序列(SEQIDNO:2)进行密码子优化，得到序列A。采用上述相同方法，构建携带序列A的重组菌2。采用IPTG诱导后，超声裂解破碎菌体，取上清液作为原始黑曲霉果胶裂解酶粗酶液。在制备果胶裂解酶的发酵过程中，发现重组菌1和重组菌2的生长密度仅有微小差别。
3.黑曲霉果胶裂解酶突变体及原始酶在稳定性及催化活性方面的比较
(1)按照前述方法，诱导表达原始黑曲霉果胶裂解酶、突变体K241M，分别定义为WT组和K241M组；
(2)上述两个实验组中，分别取5mL同样密度(OD600相同)的重组菌液，超声破碎制得粗酶液，待用；
(3)测试各组粗酶液初始酶活力，以及冻融1次、反复冻融3次和反复冻融5次后酶活力。酶活力测试方法具体如下：用pH9.5、浓度为0.05mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制5mg/mL的聚半乳糖醛酸钠溶液，作为底物溶液。取2mL底物溶液预热到55℃，添加1mL稀释适当倍数的酶液和4.5μL浓度为1mol/L的CaCl2溶液，充分混匀，55℃准确反应10min后，煮沸灭活，测定OD235。用沸水浴充分灭活的酶液替代上述酶液，作相同处理，作为对照。果胶裂解酶定义为：在55℃条件下，底物每分钟释放出相当于1μmol不饱和半乳糖醛酸酐所需的酶量为1个酶活力单位(以IU表示)。
表1原始黑曲霉果胶裂解酶及突变体K241M酶活力及稳定性测试(单位：IU/ml)
原始酶组 K241M组
初始酶活力 6.3 9.6
冻融1次 4.3 8.8
冻融3次 2.35 7.62
冻融5次 1.87 7.11
由表1可见，突变体K241M在初始酶活力和抗冻融性能上，均显著优于原始黑曲霉果胶裂解酶。
实施例2降粘剂的制备
分别制备如下组成的降粘剂。本实施例中的份数为质量份。本实例中原始黑曲霉果胶裂解酶、突变体K241M，分别按照实施例1中的方法获得发酵液，采用磷酸缓冲液悬浮菌体，制成OD600均为4.5的悬浊液，超声破碎制得粗酶液，粗酶液的酶活分别为6.47IU/ml和9.8IU/ml。随后按照文献(成莉凤等，一种果胶裂解酶基因(pel)表达体系构建及其表达产物的酶学性质，农业生物技术学报，2013,21(5)：546-553)中方法纯化果胶裂解酶并冷冻干燥，通过SDS-PAGE电泳发现纯化后的原始黑曲霉果胶裂解酶和突变体K241M的纯度分别达到98.9％与98.1％。原始黑曲霉果胶裂解酶的比活力为14.4IU/g，突变体K241M的比活力为30.2IU/g，可见相同蛋白量的突变体K241M活力显著高于原始黑曲霉果胶裂解酶。其余所用酶的信息如表2所示。
表2复合降粘剂中所用酶信息
酶名称 厂家 产品编号 比活力
纤维素酶 上海阿拉丁生化科技股份有限公司 C128647-5g 25U/mg
木聚糖酶 上海源叶生物科技有限公司 MFCD00132594 60000U/mg
β-葡聚糖酶 上海源叶生物科技有限公司 MFCD00130940 50U/mg
甘露聚糖酶 湖北远成赛创科技有限公司 37288-54-3 10000U/g
谷氨酰胺转氨酶 郑州裕和食品添加剂有限公司 TG-K 10000U/g
脂肪酶 Sigma公司 MFCD02685893 10000U/g
降粘剂1：纤维素酶41份、果胶裂解酶突变体K241M19份、木聚糖酶13份、β-葡聚糖酶12份、甘露聚糖酶8份、谷氨酰胺转氨酶1份和脂肪酶0.5份。
对照降粘剂1：纤维素酶41份、原始果胶裂解酶19份、木聚糖酶13份、β-葡聚糖酶12份、甘露聚糖酶8份、谷氨酰胺转氨酶1份和脂肪酶0.5份。
降粘剂2：纤维素酶46份、果胶裂解酶突变体K241M18份、木聚糖酶8份、β-葡聚糖酶10份、甘露聚糖酶9份、谷氨酰胺转氨酶1.5份和脂肪酶0.6份。
对照降粘剂2：纤维素酶46份、原始果胶裂解酶18份、木聚糖酶8份、β-葡聚糖酶10份、甘露聚糖酶9份、谷氨酰胺转氨酶1.5份和脂肪酶0.6份。
实施例3降粘剂的应用
玉米酒精发酵的工艺流程为：玉米粉—调浆—加入酶制剂及酵母—生料发酵—蒸馏—脱水—燃料乙醇。发酵中各物质的添加量为玉米粉2kg、酵母0.1-0.5％、α-淀粉酶20-80U/g玉米粉、糖化酶100-200U/g玉米粉。发酵条件：料水比1:2-1:5,28-35℃恒温，搅拌速度100-200r/min，无蒸煮发酵3-6天。发酵结束后，蒸馏出燃料乙醇，将蒸馏废醪板框过滤，得到清液。将清液浓缩至浓度(干物质质量百分浓度，下同)为29％的糖浆。分别采用实施例2中降粘剂1与对照降粘剂1，降粘剂2与对照降粘剂2对糖浆进行降粘。
实验方法：取pH2.5、浓度29％的糖浆500ml，置于40℃水浴锅中100rpm条件下振荡加热到40℃，用4℃、5％NaOH溶液(5gNaOH溶于水、定容到100ml)调pH至5.0。在糖浆中加入降粘剂并搅拌均匀，保温40℃维持3h。测定溶液粘度。Cx表示添加的降粘剂与糖浆的质量比，Cp表示粘度(单位mPa·S)。
实验结果：由图1可以看出，在添加量相同的条件下，与对照降粘剂1相比，降粘剂1使得糖浆粘度下降更多。在添加量均为1.25‰时，对照降粘剂使糖浆粘度降低7.2mPa·S(由21.8mPa·S降低到14.6mPa·S)，而降粘剂1使糖浆粘度降低11.71mPa·S(由21.6mPa·S降低到9.89mPa·S)。由图2可以看出，在添加量相同的条件下，与对照降粘剂2相比，降粘剂2使得糖浆粘度下降更多。在添加量均为0.75‰时，对照降粘剂2使糖浆粘度降低3.4mPa·S(由20.5mPa·S降低到17.1mPa·S)，而降粘剂2使糖浆粘度降低6.7mPa·S(由20.8mPa·S降低到14.1mPa·S)。
有上述结果可见，本实例中的降粘剂1和2可将浓度为29％的糖浆粘度显著降低，再次浓缩，可将糖浆浓缩至浓度达到70％，这样将减少燃料酒精发酵过程中蒸汽的消耗，提高副产品DDGS的一级品率。
SEQUENCELISTING
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<400>1
MetLysTyrAlaAlaAlaLeuThrAlaIleAlaAlaLeuAlaAlaArg
151015
AlaAlaAlaValGlyValSerGlyThrProValGlyPheAlaSerSer
202530
AlaThrGlyGlyGlyAspAlaThrProValTyrProThrThrThrAsp
354045
GluLeuValSerTyrLeuGlyAspAspGluAlaArgValIleValLeu
505560
SerLysPheAspPheThrAspThrGluGlyThrThrThrThrThrGly
65707580
CysAlaProTrpGlyThrAlaSerGlyCysGlnLeuAlaIleAsnLys
859095
AspAspTrpCysThrAsnTyrGluProAspAlaProThrThrThrVal
100105110
ThrAsnThrAlaGlyGluLeuGlyIleThrValAsnSerAsnLysSer
115120125
LeuIleGlyGluArgTyrGlnArgLysHisProArgAlaValValSer
130135140
AlaTrpValSerGlyValSerAsnIleIleIleGlnLeuCysIleVal
145150155160
ProGlyLeuHisThrLeuLeuProSerGlnThrLysProTrpAsnSer
165170175
HisArgAsnIleAlaValThrAspIleAsnProGluTyrThrAlaArg
180185190
IleGlyArgGlnHisTyrValLeuGlyThrAspAspAspSerArgVal
195200205
SerIleThrAsnAsnTyrIleAsnGlyGluSerAspTyrPheAlaThr
210215220
CysAspGlyHisHisTyrTrpAsnValTyrLeuAspGlySerSerAsp
225230235240
LysValThrPheSerGlyAsnTyrLeuTyrLysThrSerGlyArgAla
245250255
ProLysValGlnAspAsnThrTyrLeuHisIleTyrAsnAsnTyrTrp
260265270
GluAsnAsnSerGlyHisAlaPheGluIleGlySerGlyGlyTyrVal
275280285
LeuAlaGluGlyAsnTyrPheSerAsnValAspThrValLeuGluThr
290295300
AspThrPheGluGlyAlaLeuPheSerSerAspSerAlaSerSerThr
305310315320
CysGluSerTyrIleGlyArgSerCysValAlaAsnValAsnGlyGly
325330335
AspLeuThrGlyThrSerThrThrValLeuSerAsnLeuSerGlyAsp
340345350
ThrLeuProSerAlaAspAlaAlaSerThrSerProAlaSerAsnAla
355360365
GlyGlnGlyAsnLeu
370
<210>2
<211>1122
<212>DNA
<213>黑曲霉（Aspergillusniger）
<400>2
atgaagtacgctgctgctctcacggctattgccgccctcgctgcccgcgccgctgctgtc60
ggtgtctccggcactcccgtgggtttcgcctcctccgccactggtggtggtgatgctacc120
cccgtctaccctaccaccaccgatgagctggtctcttacctcggtgatgacgaggcccgt180
gtcattgtcctgtccaagttcgacttcactgacactgagggcactaccacgaccaccggt240
tgcgctccctggggtactgcctccggctgccagctggccatcaacaaggacgactggtgc300
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atcaccgtcaactccaacaagtccttgatcggtgagaggtaccagcggtgtcatccaagg420
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gctgtcaccgacatcaaccccgagtacactgcccgcattggtcgccagcactacgtyctt600
ggtaccgacgacgacagycgtgtstccatcaccaacaactacatcaacggcgagtctgac660
tactttgctacttgcgacggccaccactactggaacgtgtaccttgacggctctagcgac720
aaggtcaccttcagtggcaactacctgtacaagacctccggccgtgcccccaaggtccag780
gacaacacctacctccacatctacaacaactactgggagaacaactcgggccacgctttc840
gagatcggctccggtgggtacgtcctcgccgagggtaactacttttccaacgttgacacc900
gtcctcgagaccgacaccttcgagggtgctctcttttcctctgacagcgcctcctccacc960
tgcgagtcctacattggccgttcctgcgttgccaacgtcaacggcggtgacctcaccggc1020
acctccaccaccgtcctctccaacctcagcggcgacaccctcccctctgctgatgctgcc1080
agcaccagccccgcctccaacgctggtcagggtaacctgtaa1122
<210>3
<211>1119
<212>DNA
<213>artificial
<220>
<223>K241M
<400>3
atgaagtacgctgctgctctcacggctattgccgccctcgctgcccgcgccgctgctgtc60
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tccaccaccgtcctctccaacctcagcggcgacaccctcccctctgctgatgctgccagc1080
accagccccgcctccaacgctggtcagggtaacctgtaa1119

Claims (9)

1.黑曲霉果胶裂解酶的突变体，是将黑曲霉果胶裂解酶氨基酸序列第241位的赖氨酸用甲硫氨酸取代后所得。
2.权利要求1所述黑曲霉果胶裂解酶的突变体的编码基因。
3.含有权利要求2所述编码基因的表达盒、重组载体、重组菌或细胞系。
4.权利要求1所述黑曲霉果胶裂解酶的突变体的制备方法，包括下述步骤：通过发酵携带权利要求1所述突变体编码基因的大肠杆菌得到所述突变体。
5.玉米酒精发酵生产中糖浆的降粘剂，其特征在于该降粘剂是权利要求1所述黑曲霉果胶裂解酶的突变体与选自纤维素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、谷氨酰胺转氨酶和脂肪酶中的一种或两种以上的混合物。
6.根据权利要求5所述降粘剂，其特征在于所述降粘剂按照重量份含有下述成分：权利要求1所述黑曲霉果胶裂解酶的突变体17-20份，
纤维素酶40-50份，
木聚糖酶8-15份，
β-葡聚糖酶10-12份，
甘露聚糖酶7-10份，
谷氨酰胺转氨酶0.6-2份，
脂肪酶0.2-2份。
7.根据权利要求5或6所述降粘剂，其特征在于所述降粘剂还含有稳定剂，所述稳定剂选自甘油、乙醇、氯化钠中的一种或两种以上。
8.根据权利要求7所述降粘剂，其特征在于所述降粘剂还含有防腐剂，所述防腐剂选自山梨醇、松油、麝香草酚、苯甲酸钠中的一种或两种以上。
9.权利要求5-8之一所述降粘剂在降低玉米酒精发酵生产中糖浆粘度方面的应用。
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