CN110885850A - 制备褐藻寡糖的方法及其用于改良大菱鲆品质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是制备褐藻寡糖的方法及其用于改良大菱鲆品质的方法。利用酶解法制备聚合度2‑7的褐藻寡糖，改善褐藻寡糖的分子量、粘度、溶解度等理化性质，提高褐藻寡糖活性和稳定性，充分发挥褐藻寡糖的生物学功能；并将该方法下制得的褐藻寡糖应用于水产养殖业，以大大改良大菱鲆的品质。

Description

制备褐藻寡糖的方法及其用于改良大菱鲆品质的方法
技术领域
本发明涉及一种制备褐藻寡糖的方法，本发明还涉及所述方法制得的褐藻寡糖用于改良大菱鲆品质的方法。
背景技术
褐藻寡糖具有多项生物学功能，在医药、食品、饲料和农业方面有广泛的应用。第一，具备降血糖，抗自由基氧化，清除过多自由基和抗脂质过氧化的作用；第二，良好抗炎替代品，具有良好的药用价值；第三，使机体的免疫系统得到恢复和加强，通过免疫调节作用发挥多种生理活性；第四，在植物体内也是重要的信号分子，促进植物的生长，提高植物对病虫害的抵抗力。
褐藻寡糖在水产养殖方面，作为新型绿色环保型制剂，具有提高水产品免疫功能、抗逆、增产等多重功效，是解决农业高产、优质、生态、安全的有效途径，其产业化与推广应用，对构建我国绿色可持续农业体系大有裨益，将产生较大的社会效益。
利用多糖等海洋生物资源开发免疫佐剂、饲料添加剂等农用制剂，对于促进水产业养殖业的结构调整，保障食品安全、农产品质量安全、农业生态环境安全等都具有重要意义。
目前，针对褐藻寡糖的制备技术较少，仅有CN107474155B，CN1414002A等十余项发明专利；且研究内容主要集中在化学法降解方面，采用化学氧化的方法对海藻中提取的多糖进行水解，用以制备低聚合度的褐藻寡糖，但是该方法存在反应条件剧烈、产物结构易破坏等缺陷，反应条件和产物聚合度难以控制。目前所发现的褐藻胶裂解酶大多存在比活力不高，稳定性差、较易受到各种离子的抑制等瓶颈，难以在工业大规模应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，利用酶解法制备聚合度2-7的褐藻寡糖，改善褐藻寡糖的分子量、粘度、溶解度等理化性质，提高褐藻寡糖活性和稳定性，充分发挥褐藻寡糖的生物学功能；并将该方法下制得的褐藻寡糖应用于水产养殖业，以大大改良大菱鲆的品质。
本发明的技术方案如下：
一种制备褐藻寡糖的方法，其特征在于具体制备步骤如下：
第一步，于-70℃选择导入了褐藻胶裂解酶基因的大肠杆菌，在保种管中吸取1-2ul的菌种，选取100-200Ml LB液体培养基，进行摇床培养20-34h，逐步扩繁至5L培养基；
第二步，6000r/min离心15min收集菌体，利用binding buffer悬浮菌体，形成混合均匀的菌液，-4℃低温冷藏；
第三步，在低温环境，进行超声破碎(10min-60min)；
第四步，6000r/min离心15min收集上层液即是褐藻胶裂解酶；
第五步，在33-40℃条件下，在一定的搅拌速率(100rpm-200rpm)下，反应时间2-6h，利用第四步所得的褐藻胶裂解酶酶解海藻酸钠，制备褐藻寡糖干粉。
优选地，第一步中，在保种管中吸取2ul的菌种。
优选地，第一步中，选取200Ml LB液体培养基。
优选地，第一步中，进行摇床培养26h。
优选地，第三步中，进行超声破碎的时间为20min。
优选地，第五步中，温度为29℃。
优选地，第五步中，搅拌速率为160rpm。
优选地，第五步中，反应时间为5h。
所述的制备褐藻寡糖的方法所制得的褐藻寡糖用于改良大菱鲆品质的方法，其特征在于，将0.2％褐藻寡糖加入到大菱鲆的基础饲料中，制成等氮等脂的饲料饲喂给大菱鲆。
优选地，所述的基础饲料中含48％粗蛋白和12％粗脂肪，其中以鱼粉为主要蛋白源，以豆油和鱼油为脂肪源，以小麦粉为糖源。
本发明的积极效果在于：
1、不同于之前的现有技术所采用的化学法，改用酶解法制备褐藻寡糖。采用微生物发酵的方法，使海藻大分子物质降解成为植物容易吸收利用的小分子营养成分，与传统方法相比，不仅保留了海藻本身的有效成分，更加通过微生物代谢产生更多活性物质，而且这些物质都来源于微生物本身代谢产生，可降解，不污染，环境友好，有利于农业的可持续发展。
2、利用褐藻胶裂解酶制备褐藻寡糖，具备活力高，稳定性强，酶的特异性使酶解速率快，效率高。同时反应条件温和，无任何污染物的产生，清洁环保，具有优良的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例详细描述本发明。
实施例1：
第一步，于-70℃选择导入了褐藻胶裂解酶基因的大肠杆菌，在保种管中吸取1ul的菌种，选取100Ml LB液体培养基，进行摇床培养20h，逐步扩繁至5L培养基；
第二步，6000r/min离心15min收集菌体，利用binding buffer悬浮菌体，形成混合均匀的菌液，-4℃低温冷藏；
第三步，在低温环境，进行超声破碎(20min-30min)；
第四步，6000r/min离心15min收集上层液即是褐藻胶裂解酶；
第五步，在33-40℃条件下，在一定的搅拌速率(100rpm)下，反应时间2-6h，利用第四步所得的褐藻胶裂解酶酶解海藻酸钠，制备褐藻寡糖干粉。
实施例2：
第一步，于-70℃选择导入了褐藻胶裂解酶基因的大肠杆菌，在保种管中吸取1ul的菌种，选取100Ml LB液体培养基，进行摇床培养24h，逐步扩繁至5L培养基；
第二步，6000r/min离心15min收集菌体，利用binding buffer悬浮菌体，形成混合均匀的菌液，-4℃低温冷藏；
第三步，在低温环境，进行超声破碎(20min-30min)；
第四步，6000r/min离心15min收集上层液即是褐藻胶裂解酶；
第五步，在33-40℃条件下，在一定的搅拌速率(120rpm)下，反应时间2-6h，利用第四步所得的褐藻胶裂解酶酶解海藻酸钠，制备褐藻寡糖干粉。
实施例3：
第一步，于-70℃选择导入了褐藻胶裂解酶基因的大肠杆菌，在保种管中吸取2ul的菌种，选取200Ml LB液体培养基，进行摇床培养26h，逐步扩繁至5L培养基；
第二步，6000r/min离心15min收集菌体，利用binding buffer悬浮菌体，形成混合均匀的菌液，-4℃低温冷藏；
第三步，在低温环境，进行超声破碎20min；
第四步，6000r/min离心15min收集上层液即是褐藻胶裂解酶；
第五步，在39℃条件下，在一定的搅拌速率(160rpm)下，反应时间5h，利用第四步所得的褐藻胶裂解酶酶解海藻酸钠，制备褐藻寡糖干粉。
取实施例1到3所制得的褐藻寡糖干粉，通过下述相同方法，分别将0.2％褐藻寡糖加入到大菱鲆的基础饲料中，制成等氮等脂的饲料饲喂给大菱鲆，观察不同饲料喂养后对大菱鲆生长的影响。所述的基础饲料中含48％粗蛋白和12％粗脂肪，其中以鱼粉为主要蛋白源，以豆油和鱼油为脂肪源，以小麦粉为糖源。
选择初始体重4.6左右健康大菱鲆，随机分配到12个300L玻璃钢桶中，每个钢桶35尾大菱鲆，经过56天饲喂，记录个体体重，计算增重率和特定生长率。
表1：
初始平均体重 终末平均体重 增重率(％) 相比对照组增重率(％)
基础饲料组 4.5 22.2 394 0
实施例1 4.47 23.0 414 5.1
实施例2 4.53 24.4 439 11.4
实施例3 4.57 24.8 442 12.2
表2：
特定生长率 相比对照组的变化％
基础饲料组 2.85 0
实施例1 2.92 2.5
实施例2 3.01 5.6
实施例3 3.02 6.0
由表1和表2可知，添加褐藻寡糖的实施例在增重率和特定生长率上比基础饲料组都有提高，但实施例1提高较少，实施例3在增重率和特定生长率上分别增加12.2％和6.0％,效果表现最好，使大菱鲆生长状况更好，因此，实施例3为最优实施例。

Claims (10)

1.一种制备褐藻寡糖的方法，其特征在于具体制备步骤如下：
第一步，于-70℃选择导入了褐藻胶裂解酶基因的大肠杆菌，在保种管中吸取1-2ul的菌种，选取100-200Ml LB液体培养基，进行摇床培养20-34h，逐步扩繁至5L培养基；
第二步，6000r/min离心15min收集菌体，利用binding buffer悬浮菌体，形成混合均匀的菌液，-4℃低温冷藏；
第三步，在低温环境，进行超声破碎（10min-60min）；
第四步，6000r/min离心15min收集上层液即是褐藻胶裂解酶；
第五步，在33-40℃条件下，在一定的搅拌速率（100rpm-200rpm）下，反应时间2-6h，利用第四步所得的褐藻胶裂解酶酶解海藻酸钠，制备褐藻寡糖干粉。
2.根据权利要求1所述的制备褐藻寡糖的方法，其特种在于：第一步中，在保种管中吸取2ul的菌种。
3.根据权利要求1所述的制备褐藻寡糖的方法，其特种在于：第一步中，选取200Ml LB液体培养基。
4.根据权利要求1所述的制备褐藻寡糖的方法，其特种在于：第一步中，进行摇床培养26h。
5.根据权利要求1所述的制备褐藻寡糖的方法，其特种在于：第三步中，进行超声破碎的时间为20min。
6.根据权利要求1所述的制备褐藻寡糖的方法，其特种在于：第五步中，温度为29℃。
7.根据权利要求1所述的制备褐藻寡糖的方法，其特种在于：第五步中，搅拌速率为160rpm。
8.根据权利要求1所述的制备褐藻寡糖的方法，其特种在于：第五步中，反应时间为5h。
9.一种利用权利要求1至8中任意一项所述的制备褐藻寡糖的方法所制得的褐藻寡糖用于改良大菱鲆品质的方法，其特征在于：将0.2%褐藻寡糖加入到大菱鲆的基础饲料中，制成等氮等脂的饲料饲喂给大菱鲆。
10.根据权利要求9所述的褐藻寡糖用于改良大菱鲆品质的方法，其特征在于：所述的基础饲料中含48%粗蛋白和12%粗脂肪，其中以鱼粉为主要蛋白源，以豆油和鱼油为脂肪源，以小麦粉为糖源。
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