CN114259062A - 高效调节肠道菌群的益生元组合物制备方法、设备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及益生元组合物制备技术领域,具体公开了一种高效调节肠道菌群的益生元组合物制备方法、设备及应用,按重量份计包括以下组份,半乳甘露聚糖20~30份,褐藻寡糖15~20份,甲壳低聚糖15~20份,低聚半乳糖5~10份,复合乳酸杆菌5~10份,双歧杆菌10~15份,保护剂15~20份。本发明具有成本低廉、具有多菌群调节效果和调节效果较为明显的特点。
Description
技术领域
本发明涉及益生元组合物制备技术领域,特别涉及一种高效调节肠道菌群的益生元组合物制备方法、设备及应用。
背景技术
益生元是指能选择性刺激一种或几种细菌在宿主肠道内生长或活化,增进宿主健康而又不被宿主胃肠道消化的物质。补充益生元可以促进肠道内益生菌增殖,改善肠道菌群结构。深入研究表明,单一的益生元对益生菌的促进作用不具有广谱性,如低聚木糖能促进青春双歧杆菌、长双歧杆菌和唾液乳杆菌增殖,对干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和两歧双歧杆菌无明显影响;低聚果糖能促进嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌和多数的双歧杆菌增殖,对两歧双歧杆菌、干酪乳杆菌和发酵乳杆菌促进效果有限;甲壳低聚糖能促进双歧杆菌增殖,对乳杆菌数量无明显影响。而肠道微生态是有种类繁多、数量庞大的微生物组成的复杂群体,单一菌群或少数菌群的增殖对肠道菌群结构的改善较为有限。因此,根据单一益生元的性质进行科学的组合配伍,立足促进多菌群生长,带动肠道菌群结构整体性改善,成为今后益生元应用与产品开发的主要方向。
肠道微生物与人体的健康之间的关系已经有了很多的研究报道,研究表明,益生元可以调节肠道菌群,促进人体的健康。益生元是被宿主微生物选择性利用的有益物质,它是食物中宿主不能消化的成分在肠道中被肠道菌群选择性代谢并有益于宿主健康的物质。这些特征被认为是益生元与膳食纤维的区别。因此,即使膳食纤维可能导致肠道共生成分的改变,选择性利用的标准或健康益处尚未得到充分证明。
瓜尔胶是从印度、巴基斯坦等地栽培的“瓜尔胶”中提取的一种水溶性膳食纤维,具有良好的生理作用。部分水解的瓜尔胶(PHGG)是一种瓜尔胶水解后的产物,其线性主链由β-1,4-连接的D-甘露糖残基组成,每2个甘露糖中就有1,6-连接的α-D-半乳糖残基。这种半乳甘露聚糖完全溶于水,不形成凝胶,并通过增加乳酸杆菌和双歧杆菌的丰度以及结肠SCFA含量显示出益生元特性。而目前没有一款充分利用半乳甘露聚糖特性的益生元组合物产品来满足高效调节人体肠道菌群和改善人体肠道功能的需要。
在功能性胃肠疾病如肠易激综合征(IBS)中,PHGG可以改善腹胀以及改善肠易激综合征相关症状。微生物菌群对PHGG的发酵可以增加短链脂肪酸的丰度,包括乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐,SCFAs是结肠上皮细胞的重要能量来源,对肠道生理、代谢和免疫具有多种调节功能
发明内容
本发明为了解决现有益生元组合物所存在的上述技术问题,提供了一种高效调节肠道菌群的益生元组合物制备方法、设备及应用,它具有成本低廉、具有多菌群调节效果和调节效果较为明显的特点。
本发明的第一种技术方案:高效调节肠道菌群的益生元组合物,按重量份计包括以下组份,
半乳甘露聚糖20~30份,褐藻寡糖15~20份,甲壳低聚糖15~20份,低聚半乳糖5~10份,复合乳酸杆菌5~10份,双歧杆菌10~15份,保护剂15~20份。本发明主要通过添加半乳甘露聚糖,利用半乳甘露聚糖对改善腹胀和改善肠易激综合征相关症状的良好效果,又按照合适的配比,加入褐藻寡糖、甲壳低聚糖、低聚半乳糖、复合乳酸杆菌、双歧杆菌和保护剂多种组份,各种组份配合后相互协同,使得制得的益生元组合物能够显著促进多种肠道内或外源补充的益生菌增殖,并抑制多种肠道条件致病菌,从而起到调节人体肠道菌群、改善肠道功能和促进人体营养吸收的作用,且这些效果均明显优于现有单一低聚糖或简单单一低聚糖配合使用后的作用,其组合配伍不仅合理有效,还克服了单一低聚糖或简单单一低聚糖配合作用的局限性,各种组份混合制备简单,成本的低廉,具有良好的肠道调节效果。
作为优选,按重量份计包括以下组份,
半乳甘露聚糖23~28份,褐藻寡糖16~18份,甲壳低聚糖17~19份,低聚半乳糖6~8份,复合乳酸杆菌7~9份,双歧杆菌12~14份,保护剂16~18份。
作为优选,按重量份计包括以下组份,
半乳甘露聚糖25份,褐藻寡糖17份,甲壳低聚糖18份,低聚半乳糖7份,复合乳酸杆菌8份,双歧杆菌13份,保护剂17份。
作为优选,所述复合乳酸杆菌按重量份计包括以下组份,
植物乳杆菌2~4份,嗜酸乳杆菌2~4份,保加利亚杆菌1~4份。
由植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚杆菌组成的复合乳酸杆菌,协同配合半乳甘露聚糖等组份,使得整个益生元组合物在人体胃肠道中具有更好的抑制幽门螺杆菌和调理肠胃的效果。
作为优选,所述保护剂按重量份计包括以下组份,
胰蛋白胨5~10份,酵母提取物3~8份,L-半胱氨酸1~5份,血红素1~2份,氯化钠1~5份,氯化钙1~5份,磷酸二氢钾1~5份,硫酸镁1~5份,维生素0.5~4份,刃天青0.1~0.5份。
通过加入含有能量物质的保护剂,能够有效的保证复合乳酸杆菌和双歧杆菌的存活,使得复合乳酸杆菌和双歧杆菌能在最终制得的益生元组合物中发挥更高效调理人体肠道的作用;由胰蛋白胨、酵母提取物、 L-半胱氨酸、血红素、氯化钠、氯化钙、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素和刃天青按适量份配比之后形成的保护剂,对复合乳酸杆菌和双歧杆菌的存活具有良好的保护效果。
本发明的第二种技术方案:高效调节肠道菌群的益生元组合物的制备方法,包括以下步骤,
(S01)选取瓜尔豆,在酵素存在和40~60℃的温度条件下对瓜尔豆进行水解,待水解完成后对水解从产物进行超滤和冷冻干燥后,制得部分水解瓜尔胶产物;
(S02)选取源于米黑根毛霉CAU432的甘露聚糖酶的基因,并将所述基因转入毕赤酵母GS115中进行发酵,待酶活力达到72626U/mL时,制得β-甘露聚糖酶;
(S03)将β-甘露聚糖酶加入部分水解瓜尔胶产物中进行酶解,待酶解完成后将酶解产物进行超滤和冷冻干燥后,制得半乳甘露聚糖;
(S04)称取适量的半乳甘露聚糖、褐藻寡糖、甲壳低聚糖、低聚半乳糖、复合乳酸杆菌、双歧杆菌和保护剂置于混合装置内,在50~100r/min的搅拌速度下混合0.5~2h,即制得益生元组合物。
本发明部分水解瓜尔胶是指利用瓜尔豆在酵素存在的条件下水解、干燥后得到的,采用生物酶解工艺,精准控制目标产物降解,将来源于米黑根毛霉CAU432的甘露聚糖酶的基因转入毕赤酵母GS115中,进行高密度发酵得到酶活力达到72626U/mL的β-甘露聚糖酶,再将得到的部分水解瓜尔胶使用甘露聚糖酶酶解得到半乳甘露聚糖(PHGG),得到的半乳甘露聚糖完全溶于水,不形成凝胶,并通过增加乳酸杆菌和双歧杆菌的丰度以及结肠SCFA含量显示出益生元特性,在功能性胃肠疾病如肠易激综合征(IBS)中,PHGG可以改善腹胀以及改善肠易激综合征相关症状,微生物菌群对PHGG的发酵可以增加短链脂肪酸的丰度,包括乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐;本发明通过混合装置将半乳甘露聚糖、褐藻寡糖、甲壳低聚糖、低聚半乳糖、复合乳酸杆菌、双歧杆菌和保护剂充分混合后形成益生元组合物,方式简单,生产效率较高。
作为优选,将得到的益生元组合物进行杀菌处理,在杀菌处理后将其进行定量包装。对益生元组合物的消毒杀菌,可以进一步降低益生元组合物内残留有细菌的可能性,保证产品的绝对质量安全。
作为优选,所述半乳甘露聚糖的制备方法为,
将部分水解瓜尔胶预热后,加入预热后的β-甘露聚糖酶液,获得反应液1,搅拌8~12min后,在45~55℃下反应8.5~12h,再加入3,5-二硝基水杨酸,隔水在115~125℃下加热3~6min后取出冷却,用超滤膜在加压条件下超滤,收集过滤液,冷冻干燥后,即得半乳甘露聚糖。
作为优选,所述低聚半乳糖的制备方法为,
将pH为5.5~6.5的磷酸缓冲液配制成550~600g/L的乳糖溶液,取植物乳杆菌酶液加入乳糖溶液中,获得反应液2,在水浴加热后,隔水在115~120℃下加热3~6min后取出冷却,加入乙腈溶液,搅拌均匀后,过滤、烘干,即得低聚半乳糖。
作为优选,所述褐藻寡糖的制备方法为,
于-70℃选择导入了褐藻胶裂解酶基因的大肠杆菌,在保种管中吸取2.5~3ul的菌种,选取220~250Ml LB液体培养基,进行摇床培养25~30h,逐步扩繁至3L培养基;在5000r/min的转速下离心20min收集菌体,利用binding buffer悬浮菌体,形成混合均匀的菌液,-3℃低温冷藏;在低温环境,进行超声破碎20min~30min;在5000r/min的转速下离心20min收集上层液即是褐藻胶裂解酶;在45~55℃条件下,在120rpm~180rpm的搅拌速率下,反应3~5h,利用褐藻胶裂解酶酶解海藻酸钠,并将酶解产物于不高于 60℃下烘干,即得褐藻寡糖。
作为优选,所述甲壳低聚糖的制备方法为,
将壳聚糖粉末用酸溶解成粘稠状溶液,搅拌均匀后,加入过氧化氢进行第一步反应,反应温度为55~ 70℃,反应2.5小时以上,向反应体系中再加入NaOH,调节反应介质PH值为8~9,继续进行第二步反应,反应3.5~4h后,向反应液中加入溶液体积5~7倍的乙醇进行沉淀,沉淀于不高于70℃下烘干,即得甲壳低聚糖。
本发明的第三种技术方案:高效调节肠道菌群的益生元组合物的制备设备,包括混合装置,所述混合装置包括混合桶,所述混合桶的外端固定连接有多个进料管,所述多个进料管均与混合桶的内部相连通,所述混合桶的上端安装有电机,所述混合桶的内部转动连接有混合杆,所述电机的上端与混合杆的输出端固定连接,所述混合杆的外端固定连接有多个搅拌叶,所述混合桶的上侧设有连接筒,所述连接筒的内部设有导热结构,所述连接筒的下端与混合桶的上端之间固定连接有连接管,所述连接管与连接筒之间设有吸引拨动机构,所述吸引拨动机构与混合桶的上端之间设有降温结构,所述混合桶的左右两端均固定连接有出料管,所述出料管均与混合桶的内部相连通。可以实现先将多种原料分别通过进料管添加到混合桶内,并启动电机带动混合杆和搅拌叶对多种原料进行搅拌混合,而连接筒内的导热结构使电机工作时产生的热空气快速流动,加快热量的散发,且吸引拨动机构实现通过振动影响,使进料管和混合桶内壁残留的原料掉落下来,减少残留,使原料利用更加充分,增强原料利用效果,并且随着电机长时间工作热量积累过高,使混合桶的温度升高,通过降温机构能够有效的吸热降温,避免因高温影响使多种原料发生变化,增强混合效果。
作为优选,所述导热结构包括形变记忆网,所述连接筒的上端为开口设置,所述连接筒的内壁与形变记忆网的外端固定连接,所述连接筒的内壁设有连接板,所述连接板的外端开凿有通口,所述通口的内壁转动连接有导流扇叶,所述连接筒的下端开凿有多个散热孔,所述散热孔位于形变记忆网的下侧。电机工作释放热量,使周围空气被加热,热空气向上流动,而流动的空气经过散热孔,进入到连接筒内,并继续向上流动,而通过空气流动带动导流扇叶缓缓转动起来,导流扇叶的转动加快空气的流动,使热量快速散发出去,同时形变记忆网受热向上弯曲,使形变记忆网的孔径变大,加快热空气的流动。
作为优选,所述吸引拨动机构包括第一磁性球,所述第一磁性球的外端与导流扇叶固定连接,所述连接管的内部设有固定杆,所述固定杆的外端套设有第二磁性球,所述第一磁性球与第二磁性球相互靠近的一端为同性设置,所述第二磁性球的外端固定连接有拨动杆,所述连接管的外端开凿有活动口,所述拨动杆穿过活动口并延伸至其外侧,所述混合桶的上端固定连接有传递框,所述传递框的内部固定连接有多个拨动弦丝,所述拨动杆的外端与拨动弦丝的外端相接触,所述传递框的外端转动连接有敲击杆,所述敲击杆的下端与进料管的外端相接触。在导流扇叶缓缓转动过程中,第一磁性球也随着其缓缓转动,而第一磁性球转动180°时,其与第二磁性球相互靠近的一端为异性,受吸引力影响,第二磁性球向上运动,而当其转动360°时,排斥第二磁性球向下运动,带动拨动杆来回拨动拨动弦丝,使其发生振动,并通过传递框的传递,使敲击杆也发生振动,对进料管进行敲击,从而实现通过传递框和敲击杆的振动,使混合桶和进料管内壁残留的原料掉落下来,使原料利用更加充分。
作为优选,所述第二磁性球的内壁开凿有两个球形槽,所述球形槽内转动连接有滚珠,所述滚珠的外端与固定杆的外端相接触。滚珠的设置,使第二磁性球在固定杆上的运动更加顺畅便捷,减少摩擦影响。
作为优选,所述固定杆的外端为T形结构,所述固定杆的外端套设有伸缩弹簧,所述伸缩弹簧的外端分别与第二磁性球和固定杆固定连接。通过T形状的固定杆和伸缩弹簧,实现对第二磁性球的运动进行限位,同时通过伸缩弹簧的弹性作用,使第二磁性球能够快速复位。
作为优选,所述降温机构包括储料盒,所述储料盒的下端与混合桶的上端固定连接,所述储料盒的内部填充有八水氢氧化钡粉末,所述储料盒与传递框之间固定连接有多个前后设置的振动脱落管,所述振动脱落管与储料盒的内部相连通,所述振动脱落管的内壁开凿有多个存料槽,所述存料槽的内部填充有氯化铵粉末。传递框发生振动时带动振动脱落管也发生振动,使存料槽内的部分氯化铵粉末因振动影响而掉落下去至储料盒内与八水氢氧化钡粉末混合反应,吸收热量,有效的降低了混合桶的温度,避免因高温影响使多种原料发生变化,增强混合效果。
作为优选,所述散热孔的内壁固定连接有透气隔膜,所述透气隔膜的外端设有耐高温涂层,所述透气隔膜的外端开凿有多个透气微孔。通过透气隔膜和透气微孔的设置,实现空气的流通,同时阻挡灰尘随着空气流动进入到连接筒内,耐高温涂层增强透气隔膜的耐高温性能,使其在高温下不易发生损坏,延长其使用寿命。
作为优选,所述储料盒的外端设有导热层,所述存料槽的内顶端和内底端均固定连接有超细纤维排,且两个超细纤维排相互接触,所述超细纤维排位于氯化铵粉末的外侧。导热层的设置,实现储料盒内外的冷热传导与交换,且通过超细纤维排的设置,使氯化铵粉末在未受到振动等作用时不易掉落下去。
作为优选,所述多个进料管均匀分布;所述多个搅拌叶均匀分布;所述连接管有两个,两个连接管左右对称设置;所述出料管的外端安装有阀门;所述多个散热孔均匀分布;所述传递框有两个,两个传递框左右对称设置;所述多个拨动弦丝均匀分布。
作为优选,所述形变记忆网采用形状记忆合金材料制成,所述形变记忆网的初始状态为平直状态。
本发明的第四种技术方案:高效调节肠道菌群的益生元组合物在制备用于调节人体肠道菌群和/或改善肠道功能的食品、保健品或药物制剂中的应用。本发明中益生元组合物可以显著促进肠道双歧杆菌属 (Bifidobacterium)的增殖,抑制大肠杆菌志贺氏菌(Escherichia-Shigella),链球菌属(Streptococcus) 的峰度也有所增加,其对于改善腹泻、便秘等症状有很大的作用,对机体的正常运作有协助作用,可以用于机体的生物屏障,规避外界生物入侵,协助机体的胃肠道进行食物的消化和吸收,增强机体抗衰老的能力;此外也有助于净化机体肠道环境,分解致癌物质,刺激人体免疫系统,利于机体饮食和消化吸收。
作为优选,所述高效调节肠道菌群的益生元组合物能够通过有效促进益生菌的增殖以及抑制条件致病菌,达到调节人体肠道菌群和/或改善肠道功能的作用。
作为优选,所述高效调节肠道菌群的益生元组合物在制备用于促进微生物发酵生产短链脂肪酸SCFAs 的制剂中的应用。本发明经微生物发酵产生多种有益于人体健康的SCFAs,尤其是戊酸,SCFAs是结肠上皮细胞的重要能量来源,对肠道生理、代谢和免疫具有多种调节功能。
作为优选,所述短链脂肪酸SCFAs包括乳酸、乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸和戊酸。肠道细菌对碳水化合物的降解产物主要为乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等短链脂肪酸(SCFA)。短链脂肪酸(SCFA) 是宿主和肠道微生物组之间的重要纽带。乙酸盐和丙酸盐都是有效的抗炎介质,它们可以抑制中性粒细胞和巨噬细胞释放促炎细胞因子,另外,丙酸盐可以诱导人结肠细胞调亡的抗癌作用,丁酸盐增加肠道紧密连接蛋白的表达,以降解潜在的肠道的通透性。
本发明具有如下有益效果:
(1)本发明主要通过添加半乳甘露聚糖,利用半乳甘露聚糖对改善腹胀和改善肠易激综合征相关症状的良好效果,又按照合适的配比,加入褐藻寡糖、甲壳低聚糖、低聚半乳糖、复合乳酸杆菌、双歧杆菌和保护剂多种组份,各种组份配合后相互协同,使得制得的益生元组合物能够显著促进多种肠道内或外源补充的益生菌增殖,并抑制多种肠道条件致病菌,从而起到调节人体肠道菌群、改善肠道功能和促进人体营养吸收的作用,且这些效果均明显优于现有单一低聚糖或简单单一低聚糖配合使用后的作用,其组合配伍不仅合理有效,还克服了单一低聚糖或简单单一低聚糖配合作用的局限性,各种组份混合制备简单,成本的低廉,具有良好的肠道调节效果;
(2)部分水解瓜尔胶是指利用瓜尔豆在酵素存在的条件下水解、干燥后得到的,采用生物酶解工艺,精准控制目标产物降解,将来源于米黑根毛霉CAU432的甘露聚糖酶的基因转入毕赤酵母GS115中,进行高密度发酵得到酶活力达到72626U/mL的β-甘露聚糖酶,再将得到的部分水解瓜尔胶使用甘露聚糖酶酶解得到半乳甘露聚糖(PHGG),得到的半乳甘露聚糖完全溶于水,不形成凝胶,并通过增加乳酸杆菌和双歧杆菌的丰度以及结肠SCFA含量显示出益生元特性,在功能性胃肠疾病如肠易激综合征(IBS)中,PHGG可以改善腹胀以及改善肠易激综合征相关症状,微生物菌群对PHGG的发酵可以增加短链脂肪酸的丰度,包括乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐;
(3)通过混合装置将半乳甘露聚糖、褐藻寡糖、甲壳低聚糖、低聚半乳糖、复合乳酸杆菌、双歧杆菌和保护剂充分混合后形成益生元组合物,方式简单,生产效率较高。
(4)可以实现先将多种原料分别通过进料管添加到混合桶内,并启动电机带动混合杆和搅拌叶对多种原料进行搅拌混合,而连接筒内的导热结构使电机工作时产生的热空气快速流动,加快热量的散发,且吸引拨动机构实现通过振动影响,使进料管和混合桶内壁残留的原料掉落下来,减少残留,使原料利用更加充分,增强原料利用效果,并且随着电机长时间工作热量积累过高,使混合桶的温度升高,通过降温机构能够有效的吸热降温,避免因高温影响使多种原料发生变化,增强混合效果;
(5)益生元组合物可以显著促进肠道双歧杆菌属(Bifidobacterium)的增殖,
以及抑制大肠杆菌志贺氏菌(Escherichia-Shigella),链球菌属(Streptococcus)的峰度也有所增加,其对于改善腹泻、便秘等症状有很大的作用,对机体的正常运作有协助作用,可以用于机体的生物屏障,规避外界生物入侵,协助机体的胃肠道进行食物的消化和吸收,增强机体抗衰老的能力;此外也有助于净化机体肠道环境,分解致癌物质,刺激人体免疫系统,利于机体饮食和消化吸收。
附图说明
图1为本发明基于observed ASV(sobs指数)构建的稀释曲线图;
图2为本发明41名志愿者的未发酵样本属水平的菌群组成柱状图;
图3为本发明41名志愿者样本中加入半乳甘露聚糖培养24h之后的样板属水平菌群第一组成柱状图;
图4为本发明41名志愿者样本中加入半乳甘露聚糖培养24h之后的样板属水平菌群第二组成柱状图;
图5为本发明原始与发酵样本群落PcoA图;
图6为本发明采用2种培养基对41例样本进行体外发酵模拟的第一产气情况柱状图;
图7为本发明采用2种培养基对41例样本进行体外发酵模拟的第二产气情况柱状图;
图8为本发明采用2种培养基对41例样本进行体外发酵模拟的第三产气情况柱状图。
图9为本发明采用2种培养基对41例样本进行体外发酵模拟的第四产气情况柱状图;
图10为本发明采用2种培养基对41例样本进行体外发酵模拟的第五产气情况柱状图;
图11为本发明采用2种培养基对41例样本进行体外发酵模拟的第六产气情况柱状图;
图12为本发明采用2种培养基对41例样本进行体外发酵模拟的第七产气情况柱状图;
图13为本发明采用2种培养基对41例样本进行体外发酵模拟的第八产气情况柱状图;
图14为本发明不同人群粪便菌群体外发酵产短链脂肪酸的检测结果第一柱状图;
图15为本发明不同人群粪便菌群体外发酵产短链脂肪酸的检测结果第二柱状图;
图16为本发明不同人群粪便菌群体外发酵产短链脂肪酸的检测结果第三柱状图。
图17为本发明不同人群粪便菌群体外发酵产短链脂肪酸的检测结果第四柱状图
图18为本发明不同人群粪便菌群体外发酵产短链脂肪酸的检测结果第五柱状图;
图19为本发明不同人群粪便菌群体外发酵产短链脂肪酸的检测结果第六柱状图;
图20为本发明不同人群粪便菌群体外发酵产短链脂肪酸的检测结果第七柱状图;
图21为本发明相关性分析的第一Heatmap图;
图22为本发明相关性分析的第二Heatmap图;
图23为本发明的立体结构示意图;
图24为本发明的整体结构示意图;
图25为本发明中导热结构的剖面结构示意图;
图26为本发明中形变记忆网弯曲时的结构示意图;
图27为本发明中吸引拨动机构的局部剖面结构示意图;
图28为图27中A处放大的结构示意图;
图29为本发明中固定框的立体结构示意图;
图30为本发明中存料槽的正视结构示意图。
附图中的标记为:1-混合桶;2-进料管;3-电机;4-混合杆;5-搅拌叶;6-出料管;7-阀门;8-连接筒;801-导流扇叶;802-散热孔;9-形变记忆网;10-连接管;11-第一磁性球;12-第二磁性球;1201-滚珠;13-伸缩弹簧;14-固定杆;15-拨动杆;16-传递框;17-拨动弦丝;18-敲击杆;19-振动脱落管;20- 存料槽;2001-超细纤维排;21-储料盒。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明,但并不作为对本发明限制的依据。
在本发明的描述中,需要说明的是,术语“上”、“下”、“内”、“外”、“顶/底端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系,仅是为了便于描述本发明和简化描述,而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作,因此不能理解为对本发明的限制。此外,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中,需要说明的是,除非另有明确的规定和限定,术语“安装”、“设置有”、“套设/接”、“连接”等,应做广义理解,例如“连接”,可以是固定连接,也可以是可拆卸连接,或一体地连接;可以是机械连接,也可以是电连接;可以是直接相连,也可以通过中间媒介间接相连,可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言,可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
高效调节肠道菌群的益生元组合物,按重量份计包括以下组份,
半乳甘露聚糖20~30份,褐藻寡糖15~20份,甲壳低聚糖15~20份,低聚半乳糖5~10份,复合乳酸杆菌5~10份,双歧杆菌10~15份,保护剂15~20份。
高效调节肠道菌群的益生元组合物,按重量份计包括以下组份,
半乳甘露聚糖23~28份,褐藻寡糖16~18份,甲壳低聚糖17~19份,低聚半乳糖6~8份,复合乳酸杆菌7~9份,双歧杆菌12~14份,保护剂16~18份。
高效调节肠道菌群的益生元组合物,按重量份计包括以下组份,
半乳甘露聚糖25份,褐藻寡糖17份,甲壳低聚糖18份,低聚半乳糖7份,复合乳酸杆菌8份,双歧杆菌13份,保护剂17份。
所述复合乳酸杆菌按重量份计包括以下组份,
植物乳杆菌2~4份,嗜酸乳杆菌2~4份,保加利亚杆菌1~4份。
所述保护剂按重量份计包括以下组份,
胰蛋白胨5~10份,酵母提取物3~8份,L-半胱氨酸1~5份,血红素1~2份,氯化钠1~5份,氯化钙1~5份,磷酸二氢钾1~5份,硫酸镁1~5份,维生素0.5~4份,刃天青0.1~0.5份。
高效调节肠道菌群的益生元组合物的制备方法,包括以下步骤,
(S01)选取瓜尔豆,在酵素存在和35~60℃的温度条件下对瓜尔豆进行水解,待水解完成后对水解从产物进行超滤和冷冻干燥后,制得部分水解瓜尔胶产物;
(S02)选取源于米黑根毛霉CAU432的甘露聚糖酶的基因,并将所述基因转入毕赤酵母GS115中进行发酵,待酶活力达到72626U/mL时,制得β-甘露聚糖酶;
(S03)将β-甘露聚糖酶加入部分水解瓜尔胶产物中进行酶解,待酶解完成后将酶解产物进行超滤和冷冻干燥后,制得半乳甘露聚糖;
(S04)称取适量的半乳甘露聚糖、褐藻寡糖、甲壳低聚糖、低聚半乳糖、复合乳酸杆菌、双歧杆菌和保护剂置于混合装置内,在50~100r/min的搅拌速度下混合0.5~2h,即制得益生元组合物。
所述半乳甘露聚糖的制备方法为,
将部分水解瓜尔胶预热后,加入预热后的β-甘露聚糖酶液,获得反应液1,搅拌8~12min后,在35~ 55℃下反应8.5~24h,再加入3,5-二硝基水杨酸,隔水在115~125℃下加热3~6min后取出冷却,用超滤膜在加压条件下超滤,收集过滤液,冷冻干燥后,即得半乳甘露聚糖。
所述低聚半乳糖的制备方法为,
将pH为5.5~6.5的磷酸缓冲液配制成550~600g/L的乳糖溶液,取植物乳杆菌酶液加入乳糖溶液中,获得反应液2,在水浴加热后,隔水在115~120℃下加热3~6min后取出冷却,加入乙腈溶液,搅拌均匀后,过滤、烘干,即得低聚半乳糖。
所述褐藻寡糖的制备方法为,
于-70℃选择导入了褐藻胶裂解酶基因的大肠杆菌,在保种管中吸取2.5~3ul的菌种,选取220~250Ml LB液体培养基,进行摇床培养25~30h,逐步扩繁至3L培养基;在5000r/min的转速下离心20min收集菌体,利用binding buffer悬浮菌体,形成混合均匀的菌液,-3℃低温冷藏;在低温环境,进行超声破碎20min~30min;在5000r/min的转速下离心20min收集上层液即是褐藻胶裂解酶;在45~55℃条件下,在120rpm~180rpm的搅拌速率下,反应3~5h,利用褐藻胶裂解酶酶解海藻酸钠,并将酶解产物于不高于 60℃下烘干,即得褐藻寡糖。
所述甲壳低聚糖的制备方法为,
将壳聚糖粉末用酸溶解成粘稠状溶液,搅拌均匀后,加入过氧化氢进行第一步反应,反应温度为55~ 70℃,反应2.5小时以上,向反应体系中再加入NaOH,调节反应介质PH值为8~9,继续进行第二步反应,反应3.5~4h后,向反应液中加入溶液体积5~7倍的乙醇进行沉淀,沉淀于不高于70℃下烘干,即得甲壳低聚糖。
通过对瓜尔胶进行水解获得水解产物,水解产物其线性主链由β-1,4-连接的D-甘露糖残基组成,每 2个甘露糖中就有1,6-连接的α-D-半乳糖残基,这种半乳甘露聚糖完全溶于水,不形成凝胶,并通过增加乳酸杆菌和双歧杆菌的丰度以及结肠SCFA含量显示出益生元特性,在功能性胃肠疾病如肠易激综合征 (IBS)中,可以改善腹胀以及改善肠易激综合征相关症状,微生物菌群对瓜尔胶的发酵可以增加短链脂肪酸的丰度,包括乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐,对肠道生理、代谢和免疫具有多种调节功能;
本方案中通过上述步骤获得的益生元组合物能够显著促进多种肠道内益生菌增殖,一方面借助含有水解瓜尔胶的益生元组合物可以为益生菌提供生命活动所需要的养分,同时可以改善腹胀以及改善肠易激综合征相关症状,微生物菌群对瓜尔胶的发酵可以增加短链脂肪酸的丰度,包括乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐,对肠道生理、代谢和免疫具有多种调节功能,并借助混合装置将半乳甘露聚糖、褐藻寡糖、甲壳低聚糖、低聚半乳糖、复合乳酸杆菌、双歧杆菌和保护剂原料进行混合,可以提高益生元组合物的生产效率,另一方面,益生元组合物可以调节人体肠道菌群并改善肠道功能,促进人体对营养物质吸收的作用。
如图23和图24所示的高效调节肠道菌群的益生元组合物的制备设备,包括混合装置,混合装置包括混合桶1,混合桶1的外端固定连接有多个进料管2,多个进料管2均与混合桶1的内部相连通,混合桶1 的上端安装有电机3,混合桶1的内部转动连接有混合杆4,电机3的上端与混合杆4的输出端固定连接,混合杆4的外端固定连接有多个搅拌叶5,混合桶1的上侧设有如图25所示的连接筒8,连接筒8的内部设有导热结构,连接筒8的下端与混合桶1的上端之间固定连接有如图27所示的连接管10,连接管10与连接筒8之间设有吸引拨动机构,吸引拨动机构与混合桶1的上端之间设有降温结构,混合桶1的左右两端均固定连接有出料管6,出料管6均与混合桶1的内部相连通。
导热结构包括如图26所示的形变记忆网9,连接筒8的上端为开口设置,连接筒8的内壁与形变记忆网9的外端固定连接,连接筒8的内壁设有连接板,连接板的外端开凿有通口,通口的内壁转动连接有导流扇叶801,连接筒8的下端开凿有多个散热孔802,散热孔802位于形变记忆网9的下侧。
吸引拨动机构包括第一磁性球11,第一磁性球11的外端与导流扇叶801固定连接,连接管10的内部设有固定杆14,固定杆14的外端套设有如图28所示的第二磁性球12,第一磁性球11与第二磁性球12 相互靠近的一端为同性设置,第二磁性球12的外端固定连接有拨动杆15,连接管10的外端开凿有活动口,拨动杆15穿过活动口并延伸至其外侧,混合桶1的上端固定连接有如图29所示的传递框16,传递框16 的内部固定连接有多个拨动弦丝17,拨动杆15的外端与拨动弦丝17的外端相接触,传递框16的外端转动连接有敲击杆18,敲击杆18的下端与进料管2的外端相接触。
第二磁性球12的内壁开凿有两个球形槽,球形槽内转动连接有滚珠1201,滚珠1201的外端与固定杆 14的外端相接触。
固定杆14的外端为T形结构,固定杆14的外端套设有伸缩弹簧13,伸缩弹簧13的外端分别与第二磁性球12和固定杆14固定连接。
降温机构包括储料盒21,储料盒21的下端与混合桶1的上端固定连接,储料盒21的内部填充有八水氢氧化钡粉末,储料盒21与传递框16之间固定连接有多个前后设置的如图30所示的振动脱落管19,振动脱落管19与储料盒21的内部相连通,振动脱落管19的内壁开凿有多个存料槽20,存料槽20的内部填充有氯化铵粉末。
散热孔802的内壁固定连接有透气隔膜,透气隔膜的外端设有耐高温涂层,透气隔膜的外端开凿有多个透气微孔。
储料盒21的外端设有导热层,存料槽20的内顶端和内底端均固定连接有超细纤维排2001,且两个超细纤维排2001相互接触,超细纤维排2001位于氯化铵粉末的外侧。
多个进料管2均匀分布;多个搅拌叶5均匀分布;连接管10有两个,两个连接管10左右对称设置;出料管6的外端安装有阀门7;多个散热孔802均匀分布;传递框16有两个,两个传递框16左右对称设置;多个拨动弦丝17均匀分布。
形变记忆网9采用形状记忆合金材料制成,形变记忆网9的初始状态为平直状态。
高效调节肠道菌群的益生元组合物的制备设备,包括混合装置,混合装置包括混合桶1,混合桶1的外端固定连接有多个均匀分布的进料管2,且多个进料管2均与混合桶1的内部相连通,混合桶1的上端安装有电机3,混合桶1的内部转动连接有混合杆4,电机3的上端与混合杆4的输出端固定连接,混合杆4的外端固定连接有多个均匀分布的搅拌叶5,混合桶1的上侧设有连接筒8,连接筒8的内部设有导热结构,连接筒8的下端与混合桶1的上端之间固定连接有两个左右对称的连接管10,两个连接管10与连接筒8之间均设有吸引拨动机构,吸引拨动机构与混合桶1的上端之间设有降温结构,混合桶1的左右两端均固定连接有出料管6,且两个出料管6均与混合桶1的内部相连通,出料管6的外端安装有阀门7,可以实现先将多种原料分别通过进料管2添加到混合桶1内,并启动电机3带动混合杆4和搅拌叶5对多种原料进行搅拌混合,而连接筒8内的导热结构使电机3工作时产生的热空气快速流动,加快热量的散发,且吸引拨动机构实现通过振动影响,使进料管2和混合桶1内壁残留的原料掉落下来,减少残留,使原料利用更加充分,增强原料利用效果,并且随着电机3长时间工作热量积累过高,使混合桶1的温度升高,通过降温机构能够有效的吸热降温,避免因高温影响使多种原料发生变化,增强混合效果。
导热结构包括形变记忆网9,连接筒8的上端为开口设置,连接筒8的内壁与形变记忆网9的外端固定连接,形变记忆网9采用形状记忆合金材料制成,形变记忆网9的初始状态为平直状态,,连接筒8的内壁之间固定连接有连接板,连接板的外端开凿有通口,通口的内壁转动连接有两个导流扇叶801,连接筒8的下端开凿有多个均匀分布的散热孔802,散热孔802位于形变记忆网9的下侧,电机3工作释放热量,使周围空气被加热,热空气向上流动,而流动的空气经过散热孔802,进入到连接筒8内,并继续向上流动,而通过空气流动带动导流扇叶801缓缓转动起来,导流扇叶801的转动加快空气的流动,使热量快速散发出去,同时形变记忆网9受热向上弯曲,使形变记忆网9的孔径变大,加快热空气的流动。
吸引拨动机构包括第一磁性球11,第一磁性球11的外端与两个导流扇叶801固定连接,连接管10的内部设有两个固定杆14,固定杆14的外端套设有第二磁性球12,第一磁性球11与第二磁性球12相互靠近的一端为同性设置,第二磁性球12的外端固定连接有拨动杆15,连接管10的外端开凿有活动口,拨动杆15穿过活动口,并延伸至其外侧,混合桶1的上端固定连接有两个左右对称的传递框16,传递框16的内部固定连接有多个均匀分布的拨动弦丝17,拨动杆15的外端与拨动弦丝17的外端相接触,传递框16 的外端转动连接有两个前后对称的敲击杆18,敲击杆18的下端与进料管2的外端相接触,在导流扇叶801 缓缓转动过程中,第一磁性球11也随着其缓缓转动,而第一磁性球11转动180°时,其与第二磁性球12 相互靠近的一端为异性,受吸引力影响,第二磁性球12向上运动,而当其转动360°时,排斥第二磁性球 12向下运动,带动拨动杆15来回拨动拨动弦丝17,使其发生振动,并通过传递框16的传递,使敲击杆 18也发生振动,对进料管2进行敲击,从而实现通过传递框16和敲击杆18的振动,使混合桶1和进料管 2内壁残留的原料掉落下来,使原料利用更加充分。
第二磁性球12的内壁开凿有两个球形槽,球形槽内转动连接有滚珠1201,滚珠1201的外端与固定杆 14的外端相接触,滚珠1201的设置,使第二磁性球12在固定杆14上的运动更加顺畅便捷,减少摩擦影响,固定杆14的外端为T形设置,固定杆14的外端套设有伸缩弹簧13,伸缩弹簧13的外端分别与第二磁性球12和固定杆14固定连接,通过T形状的固定杆14和伸缩弹簧13,实现对第二磁性球12的运动进行限位,同时通过伸缩弹簧13的弹性作用,使第二磁性球12能够快速复位。
降温机构包括储料盒21,储料盒21的下端与混合桶1的上端固定连接,储料盒21的内部填充有八水氢氧化钡粉末,储料盒21与传递框16之间固定连接有多个前后设置的振动脱落管19,振动脱落管19与储料盒21的内部相连通,振动脱落管19的内壁开凿有多个均匀分布的存料槽20,存料槽20的内部填充有氯化铵粉末,传递框16发生振动时带动振动脱落管19也发生振动,使存料槽20内的部分氯化铵粉末因振动影响而掉落下去至储料盒21内与八水氢氧化钡粉末混合反应,吸收热量,有效的降低了混合桶1 的温度,避免因高温影响使多种原料发生变化,增强混合效果。
散热孔802的内壁固定连接有透气隔膜,透气隔膜的外端设有耐高温涂层,透气隔膜的外端开凿有多个均匀分布的透气微孔,通过透气隔膜和透气微孔的设置,实现空气的流通,同时阻挡灰尘随着空气流动进入到连接筒8内,耐高温涂层增强透气隔膜的耐高温性能,使其在高温下不易发生损坏,延长其使用寿命,储料盒21的外端设有导热层,存料槽20的内顶端和内底端均固定连接有超细纤维排2001,且两个超细纤维排2001相互接触,超细纤维排2001位于氯化铵粉末的外侧,导热层的设置,实现储料盒21内外的冷热传导与交换,且通过超细纤维排2001的设置,使氯化铵粉末在未受到振动等作用时不易掉落下去。
高效调节肠道菌群的益生元组合物制备方法,包括以下步骤:
1、先将多种原料分别通过进料管2添加到混合桶1内,并启动电机3带动混合杆4和搅拌叶5对多种原料进行搅拌混合,同时电机3工作放热,带动热空气向上流动使导流扇叶801缓缓转动;
2、导流扇叶801缓缓转动带动第一磁性球11转动,使其带动第二磁性球12来回运动,促使拨动杆 15来回拨动拨动弦丝17发生振动,并通过传递框16带动敲击杆18敲击进料管2,使混合桶1和进料管2 内壁残留的原料掉落下来;
3、传递框16振动带动振动脱落管19振动,使存料槽20内的部分氯化铵粉末受振动影响掉落下去,与储料盒21内的八水氢氧化钡粉末混合反应,吸收热量,降低混合桶1的温度。
在本发明中,相关内的技术人员在使用时,首先将多种原料分别通过进料管2添加到混合桶1内,并启动电机3带动混合杆4和搅拌叶5对多种原料进行搅拌混合,电机3工作释放热量,使周围空气被加热,热空气向上流动,而流动的空气经过散热孔802,进入到连接筒8内,并继续向上流动,而通过空气流动带动导流扇叶801缓缓转动起来,导流扇叶801的转动加快空气的流动,使热量快速散发出去,同时形变记忆网9受热向上弯曲,使形变记忆网9的孔径变大,加快热空气的流动,且在导流扇叶801缓缓转动过程中,第一磁性球11也随着其缓缓转动,而第一磁性球11转动180°时,其与第二磁性球12相互靠近的一端为异性,受吸引力影响,第二磁性球12向上运动,而当其转动360°时,排斥第二磁性球12向下运动,带动拨动杆15来回拨动拨动弦丝17,使其发生振动,并通过传递框16的传递,使敲击杆18也发生振动,对进料管2进行敲击,从而实现通过传递框16和敲击杆18的振动,使混合桶1和进料管2内壁残留的原料掉落下来,并且传递框16发生振动时带动振动脱落管19也发生振动,使存料槽20内的部分氯化铵粉末因振动影响而掉落下去至储料盒21内与八水氢氧化钡粉末混合反应,吸收热量,有效的降低了混合桶1的温度,避免因高温影响使多种原料发生变化,增强混合效果。
实施例1:
高效调节肠道菌群的益生元组合物,按重量份计包括以下组份,
半乳甘露聚糖20份,褐藻寡糖15份,甲壳低聚糖15份,低聚半乳糖5份,复合乳酸杆菌5份,双歧杆菌10份,保护剂15份;
植物乳杆菌2份,嗜酸乳杆菌2份,保加利亚杆菌1份;
胰蛋白胨5份,酵母提取物3份,L-半胱氨酸1份,血红素1份,氯化钠1份,氯化钙1份,磷酸二氢钾1份,硫酸镁1份,维生素0.5份,刃天青0.5份。
实施例2:
高效调节肠道菌群的益生元组合物,按重量份计包括以下组份,
半乳甘露聚糖30份,褐藻寡糖20份,甲壳低聚糖20份,低聚半乳糖10份,复合乳酸杆菌10份,双歧杆菌15份,保护剂20份;
植物乳杆菌4份,嗜酸乳杆菌4份,保加利亚杆菌2份;
胰蛋白胨8份,酵母提取物3份,L-半胱氨酸2份,血红素1份,氯化钠1份,氯化钙1份,磷酸二氢钾1份,硫酸镁1份,维生素1.5份,刃天青0.5份。
实施例3:
高效调节肠道菌群的益生元组合物,按重量份计包括以下组份,
半乳甘露聚糖23份,褐藻寡糖16份,甲壳低聚糖17份,低聚半乳糖6份,复合乳酸杆菌7份,双歧杆菌12份,保护剂16份;
植物乳杆菌3份,嗜酸乳杆菌3份,保加利亚杆菌1份;
胰蛋白胨5份,酵母提取物3份,L-半胱氨酸1份,血红素1份,氯化钠1份,氯化钙1份,磷酸二氢钾1份,硫酸镁2份,维生素0.7份,刃天青0.3份。
实施例4:
高效调节肠道菌群的益生元组合物,按重量份计包括以下组份,
半乳甘露聚糖28份,褐藻寡糖18份,甲壳低聚糖19份,低聚半乳糖8份,复合乳酸杆菌9份,双歧杆菌14份,保护剂18份;
植物乳杆菌3份,嗜酸乳杆菌3份,保加利亚杆菌3份;
胰蛋白胨8份,酵母提取物3份,L-半胱氨酸1份,血红素1份,氯化钠1份,氯化钙1份,磷酸二氢钾1份,硫酸镁1份,维生素0.6份,刃天青0.4份。
实施例5:
高效调节肠道菌群的益生元组合物,按重量份计包括以下组份,
半乳甘露聚糖25份,褐藻寡糖17份,甲壳低聚糖18份,低聚半乳糖7份,复合乳酸杆菌8份,双歧杆菌13份,保护剂17份;
植物乳杆菌4份,嗜酸乳杆菌2份,保加利亚杆菌2份;
胰蛋白胨5~10份,酵母提取物3~8份,L-半胱氨酸1~5份,血红素1~2份,氯化钠1~5份,氯化钙1~5份,磷酸二氢钾1~5份,硫酸镁1~5份,维生素0.5~4份,刃天青0.1~0.5份。
高效调节肠道菌群的益生元组合物在制备用于调节人体肠道菌群和/或改善肠道功能的食品、保健品或药物制剂中的应用。
所述高效调节肠道菌群的益生元组合物能够通过有效促进益生菌的增殖以及抑制条件致病菌,达到调节人体肠道菌群和/或改善肠道功能的作用。
所述高效调节肠道菌群的益生元组合物在制备用于促进微生物发酵生产短链脂肪酸SCFAs的制剂中的应用。
所述短链脂肪酸SCFAs包括乳酸、乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸和戊酸。
为了充分说明本发明益生元组合物用于调节人体肠道菌群和改善肠道功能方面的应用效果,下面以实验进行说明:
1.材料与方法
1.1主要实验仪器、试剂
主要试剂:电子天平,王鑫衡器有限公司;分析天平,德国sartorius公司;涡旋震荡仪,上海启前电子科技有限公司;自动压力蒸汽灭菌器,致徽(厦门)仪器有限公司;F100自动粪便分析处理仪,中国江苏海路生物科技有限公司;洁净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;生物安全柜,Heal Force;厌氧工作站,瑞世康科技集团有限公司;隔水式恒温培养箱,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;紫外可见分光光度计,上海光谱仪器有限公司;超低温冰箱,美国Thermo公司;肠道微生物发酵气体分析仪,杭州伯助生物科技有限公司;冷冻离心机,Thermo;0.22um针式水系无菌过滤器,迈博瑞生物膜技术有限公司;GC2010 plus气相色谱仪,日本Shimadzu公司;DB-FFAP型气相色谱柱(0.32mm×30m×0.5um),美国Agilent公司。
主要试剂:胰蛋白胨、酵母提取物、L-半胱氨酸、NaCl、KH2PO4、K2HPO4、血红素、维生素I、MgSO4、 CaCl2、巴豆酸、刃天青、半乳甘露聚糖、褐藻寡糖、甲壳低聚糖、低聚半乳糖、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚杆菌和双歧杆菌均购于美国Sigma公司;样本稀释液(氯化钠9g/L、硫酸钠1g/L、磷酸盐 0.1g/L、苯甲酸钠0.1g/L)购于苏州海路生物技术有限公司;
1.2实验方法
1.2.1培养基的配制
YCFA培养基配制:胰蛋白胨:10g;酵母提取物:2.5g;L-半胱氨酸:1g;血红素溶液:2mL;NaCl: 0.9g;CaCl2·6H2O溶液:125μL;KH2PO4:0.45g;KH2PO4:0.45g;MgSO4·7H2O溶液:500μL;维生素I溶液:200μL;刃天青溶液1mL,溶解于1L去离子水中。在配制YCFA的基础上按8g/L的比例加入PHGG、褐藻寡糖、甲壳低聚糖和低聚半乳糖配制PHGG培养基,并以不加PHGG、褐藻寡糖、甲壳低聚糖和低聚半乳糖的培养基YCFA培养基为空白对照,在厌氧的条件下分装至10mL的西林瓶中,压盖密封,高压蒸汽灭菌后使用。
1.2.2样品的采集
挑选杭州本地健康人群志愿者(没有肠道疾病的正常人作为健康人群,并在最近4周内未服用抗生素、益生元、益生菌等为选样标准)填写志愿者个人信息健康调查表,分发无菌粪便取样盒,志愿者按要求使用粪便取样盒在排便时迅速挑取食物残渣少且氧气接触少的中间粪便不少于3g,用磷酸盐缓冲液(PBS) 制成10%的粪便悬浮接种液备用。
1.2.3体外发酵实验
在厌氧操作台上将500μl处理好的样品接种到配制好的培养基中,每种培养基做三个平行,轻摇混匀后放置到37℃的恒温培养箱中培养24h,之后用气体分析仪器测定气体总量和气体成分,然后取发酵液,9000r/min离心3min后沉淀用来提DNA,上清进行代谢产物分析,
1.2.4发酵后瓶内气体测定
发酵24h后取出,待冷却至室温后,用发酵气体分析仪进行气体分析,记录数据。
1.2.5发酵后短链脂肪酸(SCFA)测定
(1)标准溶液的配制和标准曲线的建立
称取2.500g偏磷酸,加入去离子水定容至100mL配制成2.5%的偏磷酸溶液。称取巴豆酸0.6464g,偏磷酸溶液定容至100mL,制成巴豆酸/偏磷酸溶液。采用面积外标法,用乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸标准样品配制6个不同浓度的标准溶液,然后测定混标中各标准品的保留时间及标准浓度下的峰面积,利用峰面积绘出各组分浓度的标准曲线。
(2)样品处理
吸取500μl发酵液,加入100μl巴豆酸偏磷酸溶液振荡混匀后放到-40℃冰箱酸化24h。酸化后4℃、 13000r/min离心3min,吸取上清液,用0.22μm的水系微孔滤膜过滤到进样小瓶。
(3)气相色谱测定
柱温:80℃/min,10℃/min,升至190℃,维持0.50min;再以40℃/min的速率到达240℃,维持5 min;FID检测器:240℃;气化室:240℃;载气:氮气,流速20mL/min,氢气流速40mL/min,空气流速400mL/min。
1.2.616SrDNA基因序列测序
取发酵液,9000r/min离心3min后沉淀用来提DNA,送上海吉美公司进行16SrDNA测序。
1.3数据统计与分析
用GraphPad Prism8对实验室测得的数据进行统计作图分析,测序公司负责对菌群数据关联代谢数据建模分析。
2.结果
2.1志愿者招募取样情况:
按照要求,选取了41例健康志愿者新鲜粪便样本,其中年龄在20~30岁之间的男性11名、女性10 名,年龄在40~60岁之间的男女各10名。
2.2半乳甘露聚糖的制备:
将部分水解瓜尔胶预热后,加入预热后的β-甘露聚糖酶液,获得反应液1,搅拌8~12min后,在35~ 55℃下反应8.5~24h,再加入3,5-二硝基水杨酸,隔水在115~125℃下加热3~6min后取出冷却,用超滤膜在加压条件下超滤,收集过滤液,冷冻干燥后,即得半乳甘露聚糖。
低聚半乳糖的制备:
将pH为5.5~6.5的磷酸缓冲液配制成550~600g/L的乳糖溶液,取植物乳杆菌酶液加入乳糖溶液中,获得反应液2,在水浴加热后,隔水在115~120℃下加热3~6min后取出冷却,加入乙腈溶液,搅拌均匀后,过滤、烘干,即得低聚半乳糖。
褐藻寡糖的制备:
于-70℃选择导入了褐藻胶裂解酶基因的大肠杆菌,在保种管中吸取2.5~3ul的菌种,选取220~250Ml LB液体培养基,进行摇床培养25~30h,逐步扩繁至3L培养基;在5000r/min的转速下离心20min收集菌体,利用binding buffer悬浮菌体,形成混合均匀的菌液,-3℃低温冷藏;在低温环境,进行超声破碎20min~30min;在5000r/min的转速下离心20min收集上层液即是褐藻胶裂解酶;在45~55℃条件下,在120rpm~180rpm的搅拌速率下,反应3~5h,利用褐藻胶裂解酶酶解海藻酸钠,并将酶解产物于不高于 60℃下烘干,即得褐藻寡糖。
甲壳低聚糖的制备:
将壳聚糖粉末用酸溶解成粘稠状溶液,搅拌均匀后,加入过氧化氢进行第一步反应,反应温度为55~ 70℃,反应2.5小时以上,向反应体系中再加入NaOH,调节反应介质PH值为8~9,继续进行第二步反应,反应3.5~4h后,向反应液中加入溶液体积5~7倍的乙醇进行沉淀,沉淀于不高于70℃下烘干,即得甲壳低聚糖。
2.3菌群差异
为了探究本发明益生元组合物对肠道菌群的影响,我们将发酵离心后的沉淀进行16SrRNA测序,图1 是基于observed ASV(sobs指数)构建的稀释曲线表明,YCFA、PHGG两种培养基的稀释曲线均趋于平缓,测序量充足,能够覆盖所有样本中的微生物群落。图2是41名志愿者的未发酵样本属水平的菌群组成柱状图,结果显示,不同年龄阶段以及不同性别之间的原始粪便菌群存在差异。
图3是加入本发明益生元组合物培养24h之后的属水平菌群组成情况,结果显示,不同的人群的粪便样本中菌群组成存在差异。与未发酵的粪便样本相比,大肠杆菌志贺氏菌(Escherichia-Shigella)的丰度明显减少了,志贺氏菌属是一类革兰阴性短小杆菌,是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌,在PHGG组中结果显示,老年男性的肠道菌群组成中志贺氏菌丰度较高,但老年女性中的丰度最少,年轻男性与女性中的丰度也不同,总的来说,男性肠道菌群组成中志贺氏菌的丰度较女性的高,具体如图4所示。双歧杆菌属(Bifidobacterium)的丰度明显增加了,双歧杆菌在机体中属于一类有益菌,对于改善腹泻、便秘等症状有很大的作用,对机体的正常运作有协助作用,可以用于机体的生物屏障,规避外界生物入侵,协助机体的胃肠道进行食物的消化和吸收,增强机体抗衰老的能力;此外有助于净化机体肠道环境,分解致癌物质,刺激人体免疫系统,利于机体饮食和消化吸收。在PHGG组中,年轻女性肠道菌群组成中双歧杆菌的丰度较多,但相比之下老年女性中最少。链球菌属(Streptococcus)的丰度在本发明益生元组合物存在下,也有所提高,男性肠道菌群组成中链球菌属的丰度高于女性的,老年人的肠道菌群组成中链球菌属的丰度高于年轻人的。
如图5所示,通过基于Bray-Curtis距离的PCoA分析研究原始与发酵样本的肠道微生物组群落组成。结果表明,加入本发明益生元组合物后微生物组群落明显发生变化。
2.4产气情况
如图6、图7、图8、图9、图10、图11、图12和图13所示,为了分析不同人群体外发酵不同寡糖的产气差异,我们采用2种培养基对41例样本进行体外发酵模拟,发酵24h结束后,采用粪便气体分析仪对发酵瓶进行气体测定,包含CO2、H2、H2S、CH4、NH3五种气体的检测。CO2、H2、H2S、CH4以及各种微量气体,都是由肠道内的化学物相互作用和微生物菌群产生的。分析这些肠道气体及其对饮食变化的反应可以揭示肠道微生物群的产物和功能及其对人体健康的影响。结果显示,PHGG组中H2与CO2的产气量高于YCFA组,H2S与NH3的产量要低于YCFA组。在PHGG组中,女性产H2高于男性,年轻人群高于老年人群。但其男性产CO2高于女性,年轻人群高于老年人群,这是由于不同人群对本发明益生元组合物的代谢差异引起的。
2.5不同人群粪便菌群体外发酵产短链脂肪酸的检测结果
如图14、图15、图16、图17、图18、图19和图20所示,为了探究不同人群中SCFA的差异,我们利用气相色谱检测了SCFA的含量,通过比较不同组之间的SCFA含量,发现PHGG组中,乙酸盐、丙酸盐以及丁酸盐的含量高于YCFA组。在PHGG组中,女性的乙酸和丁酸含量高于男性,但丙酸含量低于男性;老年人的乙酸、丙酸和丁酸均高于年轻人的,结果表明,在加入本发明益生元组合物培养24h后,不同人群的肠道菌群代谢产SCFA的方式发生了改变,所以本发明益生元组合物对肠道菌群有一定的调节作用。
2.6相关性分析
为了探究发酵菌群与代谢产物短链脂肪酸和气体之间的关系,我们分析了所有发酵样本中细菌属水平丰度排名前12的的肠道菌群与6中代谢短链脂肪酸和细菌属水平丰度排名前15的肠道菌群与5种代谢气体含量相关性分析。如图21和图22所示,我们检测的这几种短链脂肪酸与气体是多种菌共同影响的。 Megasphaera与异丁酸、异戊酸、戊酸呈正相关,丰度占比最高的Escherichia-Shigella与丙酸和丁酸呈显著负相关,说明Escherichia-Shigella的丰度会影响丙酸与丁酸的含量。丰度占比最高的 Escherichia-Shigella与CO2和H2S呈显著负相关。
许多研究表明,肠道微生物菌群的结构和功能影响到宿主的健康状态,参与了多种疾病的发生。所以肠道菌群的健康与人体健康之间的关系受到越来越多的关注。体外发酵系统是研究人类肠道菌群结构的重要方法,体外发酵模拟与人体原始粪便菌群相比可以达到90%以上的相似性。通过体外模拟肠道发酵技术,检测细菌代谢产物,并分析其与菌群结构变化的关联性,可用于评估不同的膳食组分对肠道菌群的生态变化,且目前被认为是一种更加简捷快速的方法。
肠道细菌对碳水化合物的降解产物主要为乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等短链脂肪酸(SCFA)。短链脂肪酸(SCFA)被认为是宿主和肠道微生物组之间的重要纽带。乙酸盐和丙酸盐都是有效的抗炎介质,它们可以抑制中性粒细胞和巨噬细胞释放促炎细胞因子,另外,丙酸盐可以诱导人结肠细胞调亡的抗癌作用,丁酸盐增加肠道紧密连接蛋白的表达,以降解潜在的肠道的通透性。本研究中,PHGG组中,菌群代谢使乙酸、丙酸和丁酸的含量升高,由于不同人群之间存在个体差异,对本发明益生元组合物的代谢能力也不同。
人体肠道微生物的代谢产物还包括气体、有机胺、甲酚、吲哚、维生素和一些对人体有害的产物如神经毒素、致癌化合物和免疫毒素等。人体肠道内主要气体有N2(59%)、H2(20.9%)、CO2(9%)、CH4 (7.2%)、O2(3.9%)和H2S(0.00028%)。除人体自身产生的小部分CO2和H2S之外,肠道内大部分气体均为细菌代谢产物。肠道气体主要受菌群和饮食的影响,临床上通过调整饮食中的碳水化合物(包括膳食纤维)、蛋白质和脂肪,可调节肠道气体组成和体积,可以达到防治相关胃肠疾病的有力方案。肠道菌群中有部分细菌可以氧化含硫化合物,产生H2S气体,它是硫酸盐还原菌代谢的最终产物。高浓度的H2S 气体和硫酸盐还原菌可以导致人类出现血性腹泻的现象,这是由于人体肠道中的微生物感染导致的。在本研究中,PHGG组中,H2S的含量低于YCFA组,说明PHGG可以降低代谢物H2S的生产,PHGG可以增加CO2 与H2的含量,降低NH3与H2S的含量。代谢产物的含量受菌群代谢的调节,PHGG提供调节志贺氏菌的丰度与双歧杆菌的丰度,从而增加或减少气体以及SCFA的含量,可以得出PHGG是调节肠道菌群,发挥其功效的。
3.结论
碳水化合物因其结构不同,导致人类肠道菌群利用存在一定的差异,从而产生不同的代谢产物,继而影响人类肠道健康。本文采用体外模拟技术研究了本发明益生元组合物对不同人群粪便菌群的代谢差异。本实验收集了41例健康人群的新鲜粪便,并根据年龄和性别差异分成了四组,每组样本大于等于10个,采用体外模拟发酵技术,设立空白对照组(YCFA)组和本发明益生元组合物实验组(PHGG)组,在37℃的恒温培养箱中密闭厌氧培养24h后,检测粪便菌群发酵后的产气量、短链脂肪酸(SCFA)含量、菌群组成差异。实验结果表明,本发明益生元组合物对调节人体肠道菌群和改善肠道功能均具有很好的效果,高效调节肠道菌群的益生元组合物能够通过有效促进益生菌的增殖以及抑制条件致病菌,达到调节人体肠道菌群和/或改善肠道功能的作用,在制备用于促进微生物发酵生产短链脂肪酸SCFAs的制剂方面,也能发挥很好的作用。
由于试验使用的原始粪便样本菌群组成存在一定年龄和性别的差异,且发酵过程中粪菌结构发生了较大的改变,与空白对照组YCFA组相比,实验组PHGG组菌群组成发生显著变化,PHGG组可以显著减少粪便菌群志贺氏菌的丰度,增加双歧杆菌的丰度,发酵过程中也代谢了不同的气体含量和和短链脂肪酸产量,可见本实验使用的本发明益生元组合物对肠道菌群具有较好的调节作用,从而影响了代谢差异,可作为一种高效调节肠道菌群的益生元,但要考虑到性别和年龄等个体差异;本发明益生元组合物对不同的人群肠道菌群的调节情况不同,总的来说,本发明益生元组合物表现出对女性肠道菌群的调节效果较好于男性,由于菌群调控受个体差异、年龄、性别等的影响,导致不同的菌群丰度以及代谢差异。不同的人群可以通过服用不同的益生元调节肠道微生物,促进人体健康。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式;但本发明的保护范围并不局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.高效调节肠道菌群的益生元组合物,其特征是:按重量份计包括以下组份,
半乳甘露聚糖20~30份,褐藻寡糖15~20份,甲壳低聚糖15~20份,低聚半乳糖5~10份,复合乳酸杆菌5~10份,双歧杆菌10~15份,保护剂15~20份。
2.根据权利要求1所述的高效调节肠道菌群的益生元组合物,其特征是:所述复合乳酸杆菌按重量份计包括以下组份,
植物乳杆菌2~4份,嗜酸乳杆菌2~4份,保加利亚杆菌1~4份。
3.根据权利要求1所述的高效调节肠道菌群的益生元组合物,其特征是:所述保护剂按重量份计包括以下组份,
胰蛋白胨5~10份,酵母提取物3~8份,L~半胱氨酸1~5份,血红素1~2份,氯化钠1~5份,氯化钙1~5份,磷酸二氢钾1~5份,硫酸镁1~5份,维生素0.5~4份,刃天青0.1~0.5份。
4.高效调节肠道菌群的益生元组合物的制备方法,其特征是:包括以下步骤,
(S01)选取瓜尔豆,在酵素存在和35~60℃的温度条件下对瓜尔豆进行水解,待水解完成后对水解从产物进行超滤和冷冻干燥后,制得部分水解瓜尔胶产物;
(S02)选取源于米黑根毛霉CAU432的甘露聚糖酶的基因,并将所述基因转入毕赤酵母GS115中进行发酵,待酶活力达到72626U/mL时,制得β~甘露聚糖酶;
(S03)将β~甘露聚糖酶加入部分水解瓜尔胶产物中进行酶解,待酶解完成后将酶解产物进行超滤和冷冻干燥后,制得半乳甘露聚糖;
(S04)称取适量的半乳甘露聚糖、褐藻寡糖、甲壳低聚糖、低聚半乳糖、复合乳酸杆菌、双歧杆菌和保护剂置于混合装置内,在50~100r/min的搅拌速度下混合0.5~2h,即制得益生元组合物。
5.根据权利要求4所述的高效调节肠道菌群的益生元组合物的制备方法,其特征是:所述半乳甘露聚糖的制备方法为,
将部分水解瓜尔胶预热后,加入预热后的β~甘露聚糖酶液,获得反应液1,搅拌8~12min后,在35~55℃下反应8.5~24h,再加入3,5~二硝基水杨酸,隔水在115~125℃下加热3~6min后取出冷却,用超滤膜在加压条件下超滤,收集过滤液,冷冻干燥后,即得半乳甘露聚糖;
所述低聚半乳糖的制备方法为,
将pH为5.5~6.5的磷酸缓冲液配制成550~600g/L的乳糖溶液,取植物乳杆菌酶液加入乳糖溶液中,获得反应液2,在水浴加热后,隔水在115~120℃下加热3~6min后取出冷却,加入乙腈溶液,搅拌均匀后,过滤、烘干,即得低聚半乳糖;
所述褐藻寡糖的制备方法为,
于~70℃选择导入了褐藻胶裂解酶基因的大肠杆菌,在保种管中吸取2.5~3ul的菌种,选取220~250MlLB液体培养基,进行摇床培养25~30h,逐步扩繁至3L培养基;在5000r/min的转速下离心20min收集菌体,利用binding buffer悬浮菌体,形成混合均匀的菌液,~3℃低温冷藏;在低温环境,进行超声破碎20min~30min;在5000r/min的转速下离心20min收集上层液即是褐藻胶裂解酶;在45~55℃条件下,在120rpm~180rpm的搅拌速率下,反应3~5h,利用褐藻胶裂解酶酶解海藻酸钠,并将酶解产物于不高于60℃下烘干,即得褐藻寡糖;
所述甲壳低聚糖的制备方法为,
将壳聚糖粉末用酸溶解成粘稠状溶液,搅拌均匀后,加入过氧化氢进行第一步反应,反应温度为55~70℃,反应2.5小时以上,向反应体系中再加入NaOH,调节反应介质PH值为8~9,继续进行第二步反应,反应3.5~4h后,向反应液中加入溶液体积5~7倍的乙醇进行沉淀,沉淀于不高于70℃下烘干,即得甲壳低聚糖。
6.根据权利要求4所述的高效调节肠道菌群的益生元组合物的制备方法,其特征是:所述混合装置包括混合桶(1),所述混合桶(1)的外端固定连接有多个进料管(2),所述多个进料管(2)均与混合桶(1)的内部相连通,所述混合桶(1)的上端安装有电机(3),所述混合桶(1)的内部转动连接有混合杆(4),所述电机(3)的上端与混合杆(4)的输出端固定连接,所述混合杆(4)的外端固定连接有多个搅拌叶(5),所述混合桶(1)的上侧设有连接筒(8),所述连接筒(8)的内部设有导热结构,所述连接筒(8)的下端与混合桶(1)的上端之间固定连接有连接管(10),所述连接管(10)与连接筒(8)之间设有吸引拨动机构,所述吸引拨动机构与混合桶(1)的上端之间设有降温结构,所述混合桶(1)的左右两端均固定连接有出料管(6),所述出料管(6)均与混合桶(1)的内部相连通。
7.根据权利要求6所述的高效调节肠道菌群的益生元组合物的制备方法,其特征是:所述导热结构包括形变记忆网(9),所述连接筒(8)的上端为开口设置,所述连接筒(8)的内壁与形变记忆网(9)的外端固定连接,所述连接筒(8)的内壁设有连接板,所述连接板的外端开凿有通口,所述通口的内壁转动连接有导流扇叶(801),所述连接筒(8)的下端开凿有多个散热孔(802),所述散热孔(802)位于形变记忆网(9)的下侧。
8.根据权利要求6所述的高效调节肠道菌群的益生元组合物的制备方法,其特征是:所述吸引拨动机构包括第一磁性球(11),所述第一磁性球(11)的外端与导流扇叶(801)固定连接,所述连接管(10)的内部设有固定杆(14),所述固定杆(14)的外端套设有第二磁性球(12),所述第一磁性球(11)与第二磁性球(12)相互靠近的一端为同性设置,所述第二磁性球(12)的外端固定连接有拨动杆(15),所述连接管(10)的外端开凿有活动口,所述拨动杆(15)穿过活动口并延伸至其外侧,所述混合桶(1)的上端固定连接有传递框(16),所述传递框(16)的内部固定连接有多个拨动弦丝(17),所述拨动杆(15)的外端与拨动弦丝(17)的外端相接触,所述传递框(16)的外端转动连接有敲击杆(18),所述敲击杆(18)的下端与进料管(2)的外端相接触。
9.根据权利要求6所述的高效调节肠道菌群的益生元组合物的制备方法,其特征是:所述降温机构包括储料盒(21),所述储料盒(21)的下端与混合桶(1)的上端固定连接,所述储料盒(21)的内部填充有八水氢氧化钡粉末,所述储料盒(21)与传递框(16)之间固定连接有多个前后设置的振动脱落管(19),所述振动脱落管(19)与储料盒(21)的内部相连通,所述振动脱落管(19)的内壁开凿有多个存料槽(20),所述存料槽(20)的内部填充有氯化铵粉末。
10.高效调节肠道菌群的益生元组合物在制备用于调节人体肠道菌群和/或改善肠道功能的食品、保健品或药物制剂中的应用。
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