CN105400751A - 阿魏酸酯酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体公开了一种阿魏酸酯酶，其为首次在桧状青霉的基因组测序中被发现，所述阿魏酸酯酶的序列较新，与常见的黄曲霉、米曲霉的阿魏酸酯酶的氨基酸序列相似度只有60％。本发明还公开了应用阿魏酸酯酶进行木质纤维素降解的方法，将所述阿魏酸酯酶与纤维素酶混合后添加入水热预处理后的木质纤维素溶液中进行木质素降解，其中，所述阿魏酸酯酶的添加量为20μg-120μg/g底物，所述的纤维素酶用量为10FPU/g底物。本发明提供的阿魏酸酯酶与商业纤维素酶复配后，对不同预处理的木质纤维素材料都有促进水解的作用，且在相同的水解条件下，相同时间内水解效率明显高于现有其他种类的阿魏酸酯酶。

Description

阿魏酸酯酶及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种阿魏酸酯酶及其应用。
背景技术
阿魏酸酯酶(E.C.3.1.1.73,Ferulicacidesterases,FAE)又称肉桂酸酯酶。它是一种羧酸酯酶,指能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键,将阿魏酸游离出来的酶。阿魏酸在植物细胞壁结构中起着重要的作用,它可以在植物细胞壁的木质素与木质素之间、木质素与半纤维素之间、半纤维素与半纤维素之间形成交接,从而构成一个骨架结构,使得整个细胞壁变得坚硬。在生物质材料中阿魏酸主要以酯键的形式连接在阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖残基上，构成了木质素和半纤维素的链接，形成了生物质材料的抗降解屏障。为了提高纤维素酶酶解生物质的效率，需要额外补充添加阿魏酸酯酶。阿魏酸酯酶处理植物性原料在食品、饲料和造纸工业中有着光明的前景。在食品工业中可利用阿魏酸酯酶打断阿魏酸与细胞壁材料如麸皮、秸秆中多糖的交联,高效降解多糖并获得反式阿魏酸,它和阿拉伯木聚糖酶联合作用的水解产物低聚糖(主要是低聚木糖)、阿魏酸都是重要的功能性食品基料,戊糖可用于酒精发酵、生产木糖醇等。在饲料工业中,利用阿魏酸酯酶处理植物性的原材料,可以将阿魏酸从植物细胞壁的结构中游离出来,从而破坏细胞壁的骨架结构,使得木质素、半纤维素及纤维素之间的连接被部分打破,结构变得比处理前疏松,变得疏松的原料更容易被牲畜消化吸收利用,可以提高饲料的利用效率。
阿魏酸是天然抗氧化剂,也是近年来国际认知的防癌物质。其具有很好的抗氧化活性,对过氧化氢、超氧自由基、羟自由基、过氧化亚硝基都有强烈的清除作用,且能调节生理机能,抑制产生自由基的酶,增加清除自由基酶的活性。同时,阿魏酸可以作为合成天然香兰素的前体,以阿魏酸为原料,利用微生物的方法生产的香兰素与合成的香兰素相比,具有毒性低,安全性高的特点,可以用作食品和化妆品行业的香料。阿魏酸广泛存在于食品原料中,目前已经使用阿魏酸酯酶或与其他酶协同作用从各种农作物的副产品中如麦麸、玉米麸皮、啤酒糟、谷物纤维、甜菜渣、燕麦壳和苹果渣等作为原材料来提取阿魏酸。
国外在阿魏酸酯酶的研究上已取得了一些卓有成效的工作。首先筛选了一批产阿魏酸酯酶的微生物；其次对部分微生物产阿魏酸酯酶进行了纯化,并对其酶学性质进行了研究,如酶的结构、最适温度、最适pH值及影响酶稳定性的其他因素；第3探讨了阿魏酸酯酶与一些多糖降解酶的协同作用；第4探讨了微生物产酶的影响因素和酶的工业化分离方法。现在阿魏酸酯酶的酶活力，酶学特性仍然限制了它的应用。迫切需要找到高酶活力的，与纤维素酶协同作用强烈的新型阿魏酸酯酶。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种阿魏酸酯酶，其为由桧状青霉表达获得；
本发明的目的之二是提供应用阿魏酸酯酶进行木质纤维素降解的方法。
本发明公开了一种阿魏酸酯酶，其特征在于，所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列为SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。
优选的是，其中，用于编码所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列的基因序列为(a)或(b)所示：
(a)SEQIDNo.2所示的多核苷酸序列；
(b)与(a)中多核苷酸序列根据碱基互补配对原则互补的多核苷酸序列。
一种阿魏酸酯酶在木质纤维素降解中的应用。
一种应用阿魏酸酯酶进行木质纤维素降解的方法，其特征在于，将所述阿魏酸酯酶与纤维素酶混合后添加入水热预处理后的木质纤维素溶液中进行木质素降解，其中，所述阿魏酸酯酶的添加量为20μg-120μg/g底物，所述的纤维素酶的添加量为10FPU/g底物。
优选的是，其中，将所述阿魏酸酯酶与纤维素酶混合后加入水热预处理后的木质纤维素溶液中，在50℃下保温进行木质素降解处理48h。
优选的是，其中，所述阿魏酸酯酶的添加量为66.3μg/g底物。
本发明的有益效果是：
本发明提供的阿魏酸酯酶的序列较新，与常见的黄曲霉、米曲霉的阿魏酸酯酶的氨基酸序列相似度只有60％；
本发明提供的阿魏酸酯酶的新颖的酶学性质：最适pH为3.0，偏酸性。最适温度为70℃，耐高温；
本发明提供的阿魏酸酯酶与商业纤维素酶复配后，对不同预处理的木质纤维素材料都有促进水解的作用，且在相同的水解条件下，相同时间内水解效率明显高于现有其他种类的阿魏酸酯酶。
附图说明
图1为本发明所述阿魏酸酯酶的进化树；
图2为本发明中阿魏酸酯酶基因扩增片段；
图3为本发明中阿魏酸酯酶-pET28aPCR验证的结果；
图4为本发明中阿魏酸酯酶-pET28a双酶切验证的结果；
图5为本发明中阿魏酸酯酶在大肠杆菌中诱导表达情况；
图6为本发明中异源表达的阿魏酸酯酶的分离纯化结果；
图7为本发明中阿魏酸酯酶与纤维素酶协同作用结果，其中，底物分别为水解水热预处理的玉米秸秆，汽爆玉米秸秆和木薯酒糟；
图8为本发明中阿魏酸酯酶与纤维素酶协同作用结果，其中，底物为水解水热预处理的玉米秸秆；
图9为本发明中阿魏酸酯酶与纤维素酶协同作用结果，其中，底物为水解水热预处理的玉米秸秆。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供了一种阿魏酸酯酶，其特征在于，所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列为SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。
一个优选方案中，用于编码所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列的基因序列为(a)或(b)所示：
(a)SEQIDNo.2所示的多核苷酸序列；
(b)与(a)中多核苷酸序列根据碱基互补配对原则互补的多核苷酸序列。
一种阿魏酸酯酶在木质纤维素降解中的应用。
一种应用阿魏酸酯酶进行木质纤维素降解的方法，其特征在于，将所述阿魏酸酯酶与纤维素酶混合后添加入水热预处理后的木质纤维素溶液中进行木质素降解，其中，所述阿魏酸酯酶的添加量为20μg-120μg/g底物，所述的纤维素酶的添加量为10FPU/g底物。
一个优选方案中，将所述阿魏酸酯酶与纤维素酶混合后加入水热预处理后的木质纤维素溶液中，在50℃下保温进行木质素降解处理48h。
一个优选方案中，所述阿魏酸酯酶的添加量为66.3μg/g底物。
一、阿魏酸酯酶种类鉴定：
如图1所示，可以看到桧状青霉的阿魏酸酯酶序列与黄曲霉，米曲霉的阿魏酸酯酶相似度只有60％，该蛋白序列较新。
二、阿魏酸酯酶的表达和分离纯化：
包括以下几个部分：阿魏酸酯酶基因的扩增，大肠杆菌系统质粒的构建，大肠杆菌中表达和阿魏酸酯酶蛋白的分离纯化，具体为：
1、阿魏酸酯酶基因的扩增：
我们首先培养桧状青霉9-3菌株，采用天根植物总RNA提取试剂盒提取基因组RNA后，采用Thermofermentas试剂盒RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKitK1621-1622进行逆转录后得到cDNA。根据FAE2基因序列设计带有NheI酶切位点的上游引物和带有XhoI酶切位点的下游引物(上游引物序列为：FAE-S2，其多核苷酸序列为SEQIDNo.3所示的多核苷酸序列，下游引物为：FAE-X2，其多核苷酸序列为SEQIDNo.4所示的多核苷酸序列，进行PCR扩增得到FAE2基因全长(1539bp)，如图2所示。
2、大肠杆菌系统质粒的构建：
得到FAE2片段后我们根据事先设计好的酶切位点NheI和XhoI酶切FAE2片段回收获得两端NheI和XhoI的粘性末端，同时采用NheI和XhoI双酶切pET28a,胶回收获得载体片段，T4DNAligas酶连获得重组载体FAE2-pET28a。获得重组载体后分别进行菌落PCR和酶切验证，验证结果如图3所示。
由于FAE2基因和载体pET28a上都存在一个SmaI酶切位点，酶切之后产生4600bp和2200bp的片段，因而我们采用SmaI酶切，结果如图4所示。
采用T7通用引物测序我们扩增的DNA片段序列，DNAMAN软件进行与阿魏酸酯酶序列比对，发现相似度为100％，证明我们构建的质粒是正确的。得到正确的重组载体FAE2-pET28a后，我们将其转化进大肠杆菌BL21(DE3)。
3、大肠杆菌中表达：
转化成功之后，采用IPTG诱导表达，经过温度和IPTG浓度的摸索，我们选择24℃，0.6mMIPTG作为表达条件，12小时和24小时取样进行SDS-PAGE电泳，如图5所示。
4、阿魏酸酯酶蛋白的分离纯化：
FAE2表达出的蛋白大小为56KD，SDS-PAGE表明FAE2有明显表达，然后大量诱导，采用镍柱层析进行目的蛋白的纯化，纯化结果如图6所示。
纯化成功后，将FAE2的片段从胶上割下，送去进行蛋白质谱，质谱结果如下，带有下划线部分为检测到的肽段。
MELFILVYFLSSIAFARSAQPSKLECASIAKERTNPAVEISRAVEVPAHGLNISSVVNEIPLCWVQGTIKYNANDKLDVSGNNTLTWELFLPSPDTYNGRYLMTGDGGFAGAIENNTMLTYLNLGYAVAGSDAGHPEAANGDGTYAPFLQNPAELQAWIHNSVAMATPVTRSLVAKYYSKHPDYSYFWGCSTGGAQGYALAQYHPELFDGIYAGSPGNWYSHLVLSFLWNGLHTTGSAFMSQQVLSFVTDRVVAACDQLD GVKDGLIENPLRCSFDVTSLRCKSEQAPDSGEPTCLTADQIAALQKIYEGPKDVRSGNQIYPGFSLGSENGLLDQEQVLYLNYTAPILREVVLDDQDFNITHFNWGSDVDAVDKKASPFIDSLSPNLSQFQRRGGKLLTTQGWSDQYNAALWPIQHLQEIQRTMGPRSDFVQVFMVPGGGHCGPNPYYPHVPGVYHVMEALVPWVEDGKRPRDMLATEPPDRSDTTRKLCPWPATAKHVGGDVDDWKSYDCA
确认是我们的目的蛋白之后，我们将纯化后的蛋白进行复性，Bradford法进行浓度测定，结果表明FAE2蛋白的浓度达到40.5mg/L。
三、阿魏酸酯酶的性质：
应用本领域常规方法测定异源表达的阿魏酸酯酶的酶活力：阿魏酸酯酶对阿魏酸甲酯进行酶活力，阿魏酸酯酶最适pH，阿魏酸酯酶最适温度检测，阿魏酸酯酶最适pH分析结果如表1所示，阿魏酸酯酶的最适温度分析结果如表2所示。检测结果如下表1和表2，该阿魏酸酯酶最适pH为3.0，最适温度为70℃。在最适酶活力检测环境下，阿魏酸酯酶的酶活力可以达到22.02IU/mg。该酶蛋白具有嗜酸性，耐高温的特点。
表1：阿魏酸酯酶最适pH分析
表2：阿魏酸酯酶的最适温度分析
四、阿魏酸酯酶在木质纤维素降解中的应用：
以水热预处理玉米秸秆，汽爆玉米秸秆和木薯酒糟分别为底物，底物浓度为5％，反应体积为20mL。
商业纤维素酶的酶用量保持在10FPU/g底物，当PpCel3E以低浓度蛋白量(66.3μg/g底物)添加到商业纤维素酶中，该糖化实验在50℃水浴摇床中反应48h。糖化过程中每隔12小时取样一次，样品高速离心后，通过HPLC-87P柱分析葡萄糖浓度的变化。
如图7所示，商业纤维素酶在上述糖化条件下，水解水热预处理的玉米秸秆，汽爆玉米秸秆，木薯酒糟48小时后，葡萄糖浓度分别为2.2，3.25，2.15g/L。当添加66.3μg阿魏酸酯酶/g底物到纤维素酶中，水热预处理的玉米秸秆，汽爆玉米秸秆，木薯酒糟水解效率大大提高，其释放的葡萄糖量分别3.05,3.65,2.5g/L，较未添加阿魏酸酯酶的葡萄糖释放量提高38.64％，12.31％，16.28％。
如图8所示，商业纤维素酶在上述糖化条件下，水解水热预处理的玉米秸秆48小时后，葡萄糖浓度分别为2.2g/L。当添加20μg阿魏酸酯酶/g底物到纤维素酶中，水热预处理的玉米秸秆水解效率大大提高，其释放的葡萄糖量分别2.5g/L，较未添加阿魏酸酯酶的葡萄糖释放量提高13.6％。
如图9所示，商业纤维素酶在上述糖化条件下，水解水热预处理的玉米秸秆48小时后，葡萄糖浓度分别为2.2g/L。当添加120μg阿魏酸酯酶/g底物到纤维素酶中，水热预处理的玉米秸秆水解效率大大提高，其释放的葡萄糖量分别3.15g/L，较未添加阿魏酸酯酶的葡萄糖释放量提高43.2％。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。
术语“碱基互补配对原则”意指在DNA分子结构中，由于碱基之间的氢键具有固定的数目和DNA两条链之间的距离保持不变，使得碱基配对必须遵循一定的规律，这就是Adenine(A，腺嘌呤)一定与Thymine(T，胸腺嘧啶)配对，Guanine(G，鸟嘌呤)一定与Cytosine(C，胞嘧啶)配对，反之亦然。
术语“表达载体”意指在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点(如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp)，其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。本发明中的目的基因为SEQIDNO.1所示的多核苷酸序列(a)或(b)中多核苷酸序列的cDNA。
术语“多核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷(DNA)、核糖核苷或核糖核苷酸(RNA)及其聚合物。如本发明中所述二硫键异构酶基因的“DNA”或“cDNA”以及等。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人,NucleicAcidRes.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Cassol等人,(1992)；Rossolini等人,MolCell.Probes8:91-98(1994))。其中，本发明中提到的二硫键异构酶基因的cDNA是由二硫键异构酶基因的DNA经转录后获得的RNA逆转录而来。
术语“氨基酸”意指构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使他的分子具有生化活性。蛋白质是生物体内重要的活性分子，包括催化新陈代谢的酵素和酶。不同的氨基酸脱水缩合形成肽(蛋白质的原始片段)，是蛋白质生成的前体。
术语“蛋白”意指氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。
术语“质粒”意指细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子，存在于许多细菌以及酵母菌等生物中。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (6)

1.一种阿魏酸酯酶，其特征在于，所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列为SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的阿魏酸酯酶，其特征在于，用于编码所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列的基因序列为(a)或(b)所示：
(a)SEQIDNo.2所示的多核苷酸序列；
(b)与(a)中多核苷酸序列根据碱基互补配对原则互补的多核苷酸序列。
3.一种如权利要求1所述的阿魏酸酯酶在木质纤维素降解中的应用。
4.一种应用如权利要求1所述的阿魏酸酯酶进行木质纤维素降解的方法，其特征在于，将所述阿魏酸酯酶与纤维素酶混合后添加入水热预处理后的木质纤维素溶液中进行木质素降解，其中，所述阿魏酸酯酶的添加量为20μg-120μg/g底物，所述的纤维素酶的添加量为10FPU/g底物。
5.如权利要求4所述的应用阿魏酸酯酶进行木质纤维素降解的方法，其特征在于，将所述阿魏酸酯酶与纤维素酶混合后加入水热预处理后的木质纤维素溶液中，在50℃下保温进行木质素降解处理48h。
6.如权利要求4所述的应用阿魏酸酯酶进行木质纤维素降解的方法，其特征在于，所述阿魏酸酯酶的添加量为66.3μg/g底物。
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