CN105039287B - GH61家族糖苷水解酶基因PpGH61及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了PpGH61及其用途。本发明公开了一种具有促进纤维素水解功能的核苷酸序列，所述核苷酸序列的碱基序列如(a)或(b)或(c)或(d)所示：(a)如SEQ ID NO：1所示；(b)如SEQ ID NO：2所示；(c)编码如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)在严谨杂交条件下与(a)或(b)限定的核苷酸序列杂交且编码具有促进纤维素底物水解功能的核苷酸序列。本发明还涉及有转化有PpGH61基因或其变体的宿主细胞，本发明还涉及PpGH61基因、蛋白、或其变体等用于促进纤维素水解的用途及促进纤维素水解的方法。

Description

GH61家族糖苷水解酶基因PpGH61及其用途

技术领域

本发明涉及从真菌中分离的GH61家族糖苷水解酶基因，尤其涉及一种从桧状青霉(Penicillium piceum)中克隆得到的GH61家族糖苷水解酶基因及其cDNA序列，本发明还提供了涉及含有该GH61家族糖苷水解酶cDNA序列的重组表达载体及重组宿主细胞，以及它们在木质纤维素水解等的应用，属于真菌的功能基因的分离和应用领域。

背景技术

近年来，随着能源危机的加剧，可持续再生能源的研究成为当今研究热点。利用可再生的纤维素资源生产生物乙醇(bioethanol)已成为克服能源危机的有效途径之一。在生产生物乙醇的流程中，纤维素酶降解木质纤维素是整个过程的至关重要的一步。目前，纤维素酶水解效率低下是纤维素乙醇(由木质纤维素转化生成的燃料乙醇)工业化生产的主要瓶颈之一。除提高纤维素酶的本身活性外，一些具有促进纤维素酶活性的蛋白逐渐进入人们的视野，如GH61糖苷水解酶家族蛋白。

GH61家族蛋白在水解过程中起的作用直到近年来才被认知。Thielaviaterrestris的胞外酶液对木质纤维素和传统的糖苷水解酶底物无水解作用。但将T.terrestris的发酵液与等量的里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶混合后，使复合纤维素酶的总量减少一半仍能保证相同的水解效果。通过比较蛋白质组学分析，在T.terrestris找到了3个蛋白，可以显著提高纤维素酶水解效率(Harris et al.2010)。这一系列的酶由于具有具有微弱的内切葡聚糖酶活性，所以起初一直被作为糖苷水解酶。后来发现GH61蛋白并不是传统意义上的糖苷水解酶，GH61蛋白的这种结构类似于CBM33家族蛋白，被认为是CBM33家族的真菌类似物(Vaajc-Kolstad et al.2010)，但目前尚沿用GH61糖苷水解酶这个名称。GH61家族糖苷水解酶在纤维素的水解中起着关键的作用。

发明内容

发明人在已有桧状青霉9-3中克隆得到GH61家族糖苷酶编码基因，研究该基因对水解的影响。通过与对照组相比，发现PpGH61糖苷水解酶基因与纤维素酶的机制不同，GH61蛋白虽然没有酶活，但是通过在木质纤维素水解过程中在固有酶系里添加GH61蛋白能够促使其他纤维素酶发挥更高效力。本发明转基因验证了其功能，初步验证了PpGH61基因促使纤维素水解。

鉴于上述状况，本发明目的之一在于提供一种从桧状青霉中克隆得到的GH61家族糖苷酶编码基因PpGH61及其cDNA序列以及编码蛋白。

本发明的另一目的在于构建一种涉及包括所述GH61家族糖苷酶PpGH61cDNA的重组表达载体及重组宿主细胞。

本发明的目的之三是将含有该GH61糖苷酶编码基因PpGH61或其cDNA应用于木质纤维素水解等方面的作用。

具体地，本发明提供的技术方案为：

一种具有促进纤维素水解功能的核苷酸序列，所述核苷酸序列的碱基序列如(a)或(b)或(c)或(d)所示：

(a)如SEQ ID NO：1所示；

(b)如SEQ ID NO：2所示；

(c)编码如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(d)在严谨杂交条件下与(a)或(b)限定的核苷酸序列杂交且编码具有促进纤维素底物水解功能的核苷酸序列。

一种具有促进纤维素水解功能的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。由于氨基酸密码子存在简并性，同一种氨基酸具有两个或更多个密码子的现象称为密码子的简并性(degeneracy)。对应于同一种氨基酸的不同密码子称为同义密码子(synonymouscodon)。简并性使得那些即使密码子中碱基被改变，仍然能编码出原氨基酸。密码子的简并性也使核苷酸分子上碱基组成有较大余地的变动。所以，本发明所述的核苷酸分子包括但不限于以上的多核苷酸序列，还存在很多能够编码PpGH61蛋白的可能的多核苷酸序列，这里不在一一列举。

一种载体，所述载体含有所述的核苷酸序列和与所述核苷酸序列可操作地连接的用于表达的调节序列。本发明中使用的用于表达的调节序列可以使用多种适于该核苷酸序列的表达载体，它们能够在多种真核宿主细胞和原核宿主细胞中表达。

在本发明的其中一个实施例中，所述载体为PpGH61的敲除载体。所述基因敲除载体包括GH61糖苷酶PpGH61DNA的上游1000bp-2000bp长度序列，抗性筛选基因，GH61糖苷酶PpGH61DNA的下游1000bp-2000bp长度序列；其中，抗性筛选基因在GH61糖苷酶PpGH61DNA的上游序列和下游序列中间。通过将该基因敲除载体转化至桧状青霉中得到重组转化体，即GH61糖苷酶PpGH61基因功能缺失的突变体。

本发明构建的PpGH61基因敲除载体包含PpGH61DNA序列的上下游同源重组片段，利用重组质粒进行基因敲除时，目的基因就能被抗性筛选基因完全替换。

对PpGH61敲除突变体的酶活以及水解效率测定结果表明，该基因的缺失并不影响纤维素酶各个组分酶活以及蛋白分泌量。但是PpGH61敲除突变体的水解效率大大降低。

宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的核苷酸序列、或所述的载体。该宿主细胞可以与PpGH6同源或异源。

在一个优选的实施方案中，该宿主细胞为里氏木霉细胞。

在本发明的一个实施例中，一种获得所述的载体的方法，包括：

利用SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示的引物序列，及SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的引物序列，分别各自从桧状青霉(Penicillium piceum)9-3中克隆得到如SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：5所示的两条核苷酸序列，并将所述两条多核苷酸序列分别各自连接到敲除载体pBS-Hygr(Liu XH，Lu JP，Zhang L，Dong B，Min H，Lin FC.Involvement of aMagnaporthe grisea serine/threonine kinase gene，MgATG1，in appressorium turgorand pathogenesis.Eukaryotic Cell 2007；6：997-1005.)上，以构建得到PpGH61基因的敲除载体。

一种促进纤维素水解的方法，包括：

a.提供

(1)纤维素水解过程中的固有酶系；和，

(2)PpGH61蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；以及，

b.提供含有纤维素底物的样品，并使该含有纤维素底物的样品暴露于a中。

优选的是，所述的促进纤维素水解的方法中，所述步骤a中，提供纤维素水解过程中的固有酶系和PpGH61蛋白的具体步骤包括：

步骤一、构建PpGH61基因过表达载体，并将其转化到里氏木霉中异源表达获得里氏木霉PpGH61基因过表达菌株；

步骤二、培养步骤一中得到的里氏木霉PpGH61基因异源过表达菌株并收集发酵液；所述发酵液中含有纤维素水解过程中的固有酶系和PpGH61蛋白；

所述b中，所述发酵液的用量按照该发酵液中的纤维素酶活为10IU/g纤维素底物添加，使该含有纤维素底物的样品暴露于所述发酵液中。所述的核苷酸序列、所述的蛋白质、所述的载体、或所述的宿主细胞用于促进纤维素底物水解的用途。

所述的蛋白质用于在丝状真菌中寻找同源蛋白的用途。本发明提供了利用上述PpGH61编码的蛋白质为目标，在NCBI数据库中搜索其他亲缘关系较近的丝状真菌中寻找同源蛋白的思路上，如：黑曲霉(Aspergillus niger)，里氏木霉等。

本发明所述的蛋白可具有多种蛋白变体，蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备转录因子的氨基酸序列变体或片段，其中由于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨基酸残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。

本发明将克隆得到的GH61糖苷酶PpGH61eDNA或全基因可操作的与表达调控元件相连接，构建获得重组表达载体，将重组表达载体转化到里氏木霉中异源表达，可以提高里氏木霉的水解率。所述重组表达载体或表达盒包括启动子、PpGH61cDNA或全基因、终止子；其中，PpGH61cDNA序列或全基因位于启动子的下游，终止子在PpGH61cDNA序列的下游。

本发明的有益效果为：

本发明在桧状青霉中克隆得到GH61糖苷酶编码基因，初步验证了GH61基因促使纤维素水解。因此，通过在木质纤维素水解过程中在固有酶系里添加GH61蛋白，可以大大提高酶解效率，降低酶用量，进而降低生产成本。成为突破纤维素乙醇工业化生产的主要瓶颈的一个关键突破口，在生产生物乙醇的产业中迈出了巨大的一步。

定义

为了便于理解本发明，定义了大量术语和短语

本发明所涉及到的术语定义。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen，Techniques inBiochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes，″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(Tm)约5-10℃。Tm为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH 7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

术语“基因敲除”意指在所属领域中外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，使机体特定的基因失活或缺失的技术从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。用于基因突变，也用于正确纠正机体的基因突变，及推测相应基因的功能，还包括引入新基因及引入定点突变。本发明中意指向乙醇胺激酶编码基因PpGH61中插入外源抗性标记基因代替该乙醇胺激酶PpGH61基因使GH61糖苷酶PpGH61基因失活，经基因敲除后，即获得含有抗性标记基因的敲除载体。

术语“转化子”或“重组宿主菌株”意指涉及本发明GH61糖苷酶PpGH61基因或其编码的cDNA的重组质粒载体的受体细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生受体细胞，例如直接吸取、转导或所属领域中已知的其它方法。

术语“转化”指将外源基因序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“多核苷酸或核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Cassol等人，(1992)；Rossolini等人，Mol Cell.Probes 8：91-98(1994))。

术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

术语“反向互补”，指通过碱基配对原则关联的核苷酸序列。例如，序列“5’-A-T-G-3”’与序列“5’-C-A-T-3”’反向互补。

术语“基因”是指一种DNA分子，基因是遗传变异的主要物质，是控制生物性状的基本遗传单位，基因中编码RNA或蛋白质的碱基序列成为结构基因，本发明中所称的基因为结构基因。

术语“载体”是指能够转运与其连接的另一个核酸的核酸分子，一种类型的载体是“质粒”，质粒是其他的DNA片段可与其连接的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其可将其他的DNA片段连接至病毒基因组。某些载体整合至宿主细胞基因组中，并得以与宿主基因组一起复制。并且，某些载体能指导与其可操作连接的基因的表达，一般使用的这样的表达载体为质粒形式。在本发明中，可交互使用“质粒”和“载体”。

术语“重组载体”是指已连接了基因的表达载体。在本发明中，可交互使用“重组质粒”和“重组载体”。

术语“引物”，又名引子。是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3’-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3’-OH，必须是游离的。之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。DNA上携带有编码蛋白质氨基酸信息的核苷酸序列的链称为正义链，又称编码链。另一条链核苷酸序列与正义链互补，称为反义链。一般将与正义链互补的一个引物成为上游引物，与反义链互补的一个引物称为下游引物。

术语“纤维素酶”是指能降解纤维素β-1，4-葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，是起协同作用的多组分酶系。纤维素酶的主要组分是内切β-1，4-葡萄糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。前两种酶主要溶解纤维，后一种酶将纤维二糖转化为葡萄糖，适当调节组合物(即对组分酶系)中这三种主要成分活性的比例，实现完成纤维素的降解。

附图说明

图1为桧状青霉GH61糖苷酶PpGH61基因敲除载体构建示意图；

图2为桧状青霉GH61糖苷酶PpGH61基因表达载体构建示意图；

图3为桧状青霉GH61糖苷酶PpGH61基因敲除突变体Southern blot杂交结果图，其中WT为桧状青霉野生型菌株；

图4为桧状青霉野生型及PpGH61基因敲除突变体水解率比较图，其中WT为桧状青霉野生型菌株；

图5为里氏木霉异源表达PpGH61基因转化子琼脂糖凝胶电泳验证图；

图6为在里氏木霉异源表达PpGH61基因突变体水解率图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1：

PpGH61敲除载体以及表达载体的构建

1、PpGH61敲除载体的构建：从桧状青霉(Penicillium piceum)9-3基因组中分别扩增PpGH61目的基因的上下游片段，各片段长度约为1.1kb，PpGH61上游核苷酸序列如SEQID NO：4所示，PpGH61下游核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，将上下游核苷酸序列分别连到pUCM-T载体中，上游采用Kpn I和Sal I限制性内切酶双酶切位点，下游采用EcoR V和BamHI限制性内切酶双酶切位点，从pUCM-T载体切下后，先将上游片段连到用同样限制性内切酶酶切过的pBS-Hygr(参见Liu XH，Lu JP，Zhang L，Dong B，Min H，Lin FC.Involvement ofa Magnaporthe grisea serine/threonine kinase gene，MgATG1，in appressoriumturgor and pathogenesis.Eukaryotic Cell2007；6：997-1005.)上，然后再用EcoR V和BamH I酶切上述载体，再将从pUCM-T载体上酶切后的下游片段连到该酶切位点处，即构建好基因PpGH61敲除载体。

桧状青霉(Penicillium piceum)9-3菌株的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2011年10月9日，保藏号：CGMCC5314。已在中国专利申请号为201110351663.4的文件中记载。

其中，扩增PpGH61目的基因的上游片段的上下游引物序列如下：

PpGH61UPP1：5’-TAggtaccTCGATGGCGCAAACTATGGGAAGC-3’(SEQ ID NO：6)

PpGH61UPP2：5’-TAgtcgacCCTGGGGATATGCAAGAGTTTAGC-3’(SEQ ID NO：7)

扩增PpGH61目的基因的下游片段的上下游引物序列如下：

PpGH61DNP1：5’-TAgatatcGCTCGGCTTAGTGGTCGCAACAA-3’(SEQ ID NO：8)

PpGH61DNP2：5’-TAggatccTGGCCAGTCCGGGAGTCATCAG-3’(SEQ ID NO：9)

引物序列中，小写字母表示酶切位点。

PCR反应条件为：94℃预变性5分钟，然后以94℃变性30秒，55℃退火1分钟，68℃延伸1分30秒，进行共计35个循环，最后以72℃延伸10分钟。

PCR反应体系为：

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后胶回收纯化，与pUCM-T载体连接，经大肠杆菌DH-5α转化，挑取阳性克隆，并经菌落PCR及酶切验证，验证正确后提取质粒，用Kpn I和Sal I酶切之后，回收目的片段，连接到同样使用Kpn I和Sal I酶切的pBS-Hygr载体上；之后再采用同样的方法连接下游片段至上述载体上，如图1所示，即构建完成基因敲除载体。

2、PpGH61表达载体的构建：采用高保真长片段PCR方法，以桧状青霉9-3基因组cDNA为模板扩增得到含有PpGH61基因cDNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；(PpGH61基因genome DNA如SEQ ID NO：2所示)先将该片段插入到pGEM-T载体中，然后用限制性内切酶Xba I单酶切从pGEM-T载体上切下目的片段，插入到含有rp2启动子和终止子的载体prp2-egfp上(He et al.2013)，替换原有质粒的eGFP基因即构建好PpGH61基因的表达载体prp2-GH61(图2)。

扩增PpGH61基因eDNA片段的引物序列如下：

PpGH61Xba I：5’-TTtctagaATGCCTTCTGCTGGAATCACCTCG-3’，如SEQ ID NO：10所示；

PpGH61Xba I：5’-TTtctagaCTACTCGTAGAGAGCCGGTCCGGG-3’，如SEQ ID NO：11所示；

引物序列中，小写字母表示酶切位点。

PCR反应条件为：94℃预变性5分钟，然后以94℃变性30秒，55℃退火1分钟，68℃延伸1分钟，进行35个反应循环，最后72℃延伸10分钟。

PCR反应体系为：

实施例2：

PpGH61基因的敲除

裂解酶：崩溃酶，浓度为5mg/mL，每克菌丝加5mL酶液；

STC溶液：1.2M Sorbitol，10mM Tris-HCl(pH7.5)，20mM CaCl₂。

PTC溶液：60％PEG4000，10mM Tris-HCl(pH 7.5)，20mM CaCl₂。

CM液体培养基：20×nitrate salts，50mL；trace elements，1mL；D-glucose，10g；Peptone(蛋白胨)，2g；Yeast extract(酵母提取物)，1g；casamino acid(酪蛋白氨基酸)，1g；vitamin solution(维生素溶液)，1mL；1mol/LNaOH调pH值至6.5；加ddH₂O定容至1000mL。

OCM液体培养基：20×nitrate salts(硝酸盐)，50mL；trace elements(微量元素)，1mL；D-glucose(葡萄糖)，10g；peptone(蛋白胨)，2g；yeast extract(酵母提取物)，1g；casamino acid(酪蛋白氨基酸)，1g；vitamin solution(维生素溶液)，1mL；sucrose(蔗糖)，200g；1mol/LNaOH调pH值至6.5；加ddH₂O定容至1000mL。

桧状青霉原生质体制备：将1mL浓度为10⁷个/mL的桧状青霉孢子悬液接入100mL的CM液体培养基中，30℃、180rpm培养48h。所得菌丝体经3层无菌纱布过滤，并用无菌水洗涤3次，挤干至于100mL三角瓶中。所得菌丝经裂解酶在30℃、80-90rpm条件下酶解2-3h。所得酶解液经三层滤纸过滤，除去残渣获得滤液，滤液于4℃、3000-4000rpm离心10min，弃去上清得沉淀，用STC溶液悬浮沉淀，然后于4℃下3000-4000rpm离心悬浮液10min，重复两次，所得到的沉淀原生质体用STC悬浮，调节其终浓度为原生质体10⁸个/mL。

2、桧状青霉原生质体转化：取150μL浓度为10⁸个/mL的原生质体于50mL离心管中，加入2μg质粒DNA，轻轻混匀，4℃放置25min；逐滴加入1mL PTC溶液，轻轻混匀，4℃放置25min；最后缓慢加入5mL的OCM液体培养基(Liu XH，Lu JP，Zhang L，Dong B，Min H，LinFC.Involvement of a Magnaporthe grisea serine/threonine kinase gene，MgATG1，inappressorium turgor andpathogenesis.Eukaryotic Cell 2007；6：997-1005.)，轻轻混匀后，置于30℃，100rpm，恢复生长2-3h。将恢复生长后的原生质体，涂布含有100μg/mL潮霉素B的平板上，28℃黑暗培养3-5天至转化子长出。

3、转化子验证

敲除突变体验证：将在含有潮霉素B抗性的平板筛选得到的转化子挑出，使用CM液体培养基，28℃，170rpm，培养24h，之后使用CTAB法(Sambrook et al.1989)提取菌丝体DNA，进行PCR验证。引物序列如下：

PpGH61checkp1：5’-GGCAGCCCGGACATCATTTG-3’，如SEQ ID NO：12所示；

PpGH61checkp2：5’-TGCCTGGGTCATCTTCCTTGTAG-3’，如SEQ ID NO：13所示；

PCR反应条件如下：94℃预变性2分钟，然后以94℃变性30秒，55℃退火30秒，68℃延伸30秒，进行25个反应循环，最后72℃延伸3分钟。

选取未出现扩增条带的转化子进行纯化培养并大量提取其基因组DNA，进行Southern blot验证。如图3所示，野生型菌株桧状青霉的条带大小为1.5kb，而突变体GH61-17的条带大小为20kb，Southern blot结果说明突变体菌株GH61-17中该基因GH61已经成功敲除。

实施例3：

PpGH61对桧状青霉纤维素酶活的影响

发酵培养基成分：微晶纤维素20g/L，玉米浆干粉17g/L，硫酸铵5g/L，碳酸钙2.5g/L，磷酸二氢钾6g/L，硫酸镁1g/L，初始pH5.5。

将菌株按照接种量3％接于液体发酵培养基中，30℃、200rpm发酵培养120h。发酵结束后，将发酵液样品于8000rpm离心，收集上清液，进行酶活测定。所述的酶活检测方法均根据国际方法IUPAC进行。

测定野生型和敲除突变体GH61-17中各个纤维素酶组分以及蛋白分泌情况，结果如表1所示，从表1中可以看出，PpGH61基因的缺失不影响纤维素酶酶活以及蛋白的分泌。

表1桧状青霉野生型及基因敲除突变体酶活及蛋白测定

实施例4

PpGH61对桧状青霉水解效率的影响

将桧状青霉野生型以及突变体GH61-17按照上述实施例3中的培养条件培养并收集获得发酵液，发酵液中含有PpGH61蛋白，PpGH61蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；按照发酵液中的纤维素酶活10IU/g底物微晶纤维素的量添加，在55℃条件下，分别于48h和60h取样测定水解液中的残糖含量，并计算水解率。水解率结果如图4所示，敲除突变体GH61-17的水解率要远低于野生菌株，48h时，敲除突变体GH61-17的水解率与野生型菌株相比降低42％，60h时降低51％；同时还发现，随着水解时间的延长，野生菌株的水解率提高而敲除突变体GH61-17的水解率并无显著变化。综合实施例3和4的结果进一步印证，GH61基因或者很有可能GH61家族糖苷水解酶并不影响纤维素酶的活力，而是对纤维素产生作用进而直接影响对纤维素底物的水解效率。

实施例5

桧状青霉PpGH61基因在里氏木霉中异源表达

诱导液体培养基AIM：

0.8mL 1.25K-Phosphate-buffer K-磷酸-缓冲液pH4.8(make stocks ofKH₂PO₄and K₂HPO₄.Add one to the other until pH 4.8is reached.由KH₂PO₄和K₂HPO₄贮存液制成。彼此混合直到溶液pH达到4.8)

20mL MN-buffer(30g/l MgSO₄×7H₂O，15g/l NaCl)

1mL 1％CaCl₂×2H₂O(w/v)

10mL 0.01％FeSO₄(w/v)

5mL spore elements孢子元素(100mg/l ZnSO₄×7H₂O，100mg/l CuSO₄×5H₂O，100mg/l H₃BO₃，100mg/l Na₂MoO₄×2H₂O)-filter sterilised过滤灭菌

2.5mL 20％NH₄NO₃(w/v)

10mL 50％glycerol丙三醇(v/v)

40mL 1M MES pH5.5(adjustpH withNaOH用NaOH调节pH)

20％glucose葡萄糖(w/v)：10mL for liquid medium，5mL for solid medium液体培养基添加10mL，固体培养基添加5mL；

加H₂O定容至1000mL。

PDA平板：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，pH自然，加水至1000mL。

1、农杆菌介导的转化：采用冻融法转化。从新鲜培养的LB平板(含50μg/mL卡那霉素)上挑选一农杆菌AGL-1单菌落接种于5mL含卡那霉素的LB中，28℃、200rpm过夜培养；第二天将200-400μL培养液转移到5mL含200μmol/L AS和50μg/mL卡那霉素的诱导液体培养基AIM中，OD值约0.15，28℃培养5-6h使OD600达到0.5-0.6。

里氏木霉RUT C30孢子的收集：用5mL灭菌蒸馏水从培养5天的PDA平板上洗下孢子置于装有无菌玻璃珠的试管中，涡旋振荡后，三层擦镜纸过滤后，5000rpm离心，用无菌水清洗两次后，用血球计数板计数。

共转化：将100μL培养好的农杆菌AGL-1菌液和100μL稀释好的106个孢子/mL的里氏木霉RUT C30孢子悬浮液混合，然后均匀涂布混合液于铺有硝酸纤维素膜(NC)的AIM平板上，20℃共培养48h；将膜剪成小片，在选择性培养基PDA上25℃培养，直到转化子出现。选择性培养基中含200μg/mL潮霉素、400μg/mL头孢霉素、60μg/mL链霉素。转化子长出后，再在含有100μg/mL潮霉素的PDA平板上再次筛选。

2、过表达转化子验证：将抗性平板上生长的转化子挑出，液体培养，提取菌丝体DNA，进行PCR验证。引物序列如下：

PpGH61hetercheckp1：5’-GGCTATGTCTCCACCATCATC-3’，如SEQ ID NO：14所示；

PpGH61hetercheckp2：5’-TCCGACTCGTACGGATACTT-3’，如SEQ ID NO：15所示；

PCR反应条件如下：94℃预变性2分钟，然后以94℃变性30秒，55℃退火20秒，68℃延伸30秒，进行25个循环，最后以72℃延伸3分钟。

如图5所示，选取扩增出目的条带的转化子纯化培养，进行后续酶活以及水解率的测定。

3、异源表达PpGH61转化子的纤维素酶活以及水解率的测定

将菌株按照上述实施例3中的条件进行培养、发酵液收集和酶活测定，滤纸酶活测定根据国际方法IUPAC进行。发酵液按照其中的纤维素酶活10IU/g底物微晶纤维素添加，在55℃条件下，于60h取样测定水解液中的残糖含量，并计算水解率。结果显示，在里氏木霉RUT C30中异源表达桧状青霉PpGH61基因并不影响宿主的滤纸酶活和蛋白含量，但是与野生型相比，异源表达转化子的水解率提高14％(图6)。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.一种具有促进纤维素水解功能的核苷酸序列，所述核苷酸序列的碱基序列如(a)或(b)或(c)所示：

(a)如SEQ ID NO:1所示；

(b)如SEQ ID NO:2所示；

(c)编码如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.一种具有促进纤维素水解功能的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

3.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的核苷酸序列和与所述核苷酸序列可操作地连接的用于表达的调节序列。

4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体为PpGH61的敲除载体。

5.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求1所述的核苷酸序列、或权利要求3或4所述的载体。

6.一种获得如权利要求4所述的载体的方法，其特征在于，包括：

利用SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的引物序列，及SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的引物序列，分别各自从桧状青霉(Penicillium piceum)9-3中克隆得到如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的两条核苷酸序列，并将所述两条多核苷酸序列分别各自连接到敲除载体pBS-Hygr上，以构建得到PpGH61基因的敲除载体。

7.一种促进纤维素水解的方法，其特征在于，包括：

a.提供

(1)里氏木霉纤维素水解过程中的固有酶系；和，

(2)PpGH61蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；以及，

b.提供含有纤维素底物的样品，并使该含有纤维素底物的样品暴露于a中。

8.如权利要求7所述的促进纤维素水解的方法，其特征在于，所述步骤a中，提供纤维素水解过程中的固有酶系和PpGH61蛋白的具体步骤包括：

步骤一、构建PpGH61基因过表达载体，并将其转化到里氏木霉中异源表达获得里氏木霉PpGH61基因过表达菌株；

步骤二、培养步骤一中得到的里氏木霉PpGH61基因过表达菌株并收集发酵液；所述发酵液中含有纤维素水解过程中的固有酶系和PpGH61蛋白；

所述b中，所述发酵液的用量按照该发酵液中的纤维素酶活为10IU/g纤维素底物添加，使该含有纤维素底物的样品暴露于所述发酵液中。

9.权利要求1所述的核苷酸序列、权利要求2所述的蛋白质、权利要求3或4所述的载体、或权利要求5所述的宿主细胞用于促进纤维素水解的用途。

10.权利要求2所述的蛋白质用于在丝状真菌中寻找同源蛋白的用途。