KR101235422B1

KR101235422B1 - 백색부후균 유래의 엔도-1,4-베타 자일라나제 ａ 대량생산을 위한 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 엔도-1,4-베타 자일라나제 ａ 대량생산방법

Info

Publication number: KR101235422B1
Application number: KR1020120155351A
Authority: KR
Inventors: 박승문; 김대혁
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2012-12-27
Filing date: 2012-12-27
Publication date: 2013-02-20
Also published as: KR20130002311A

Abstract

본 발명의 백색부후균 유래의 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 대량생산을 위한 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 대량생산방법은 종래의 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 대량생산방법에 비하여 현저하게 많은 양의 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 대량으로 생산할 수 있다.

Description

백색부후균 유래의 엔도-1,4-베타 자일라나제 Ａ 대량생산을 위한 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 엔도-1,4-베타 자일라나제 Ａ 대량생산방법{Recombinant expression vector for mass production of endo-β-xylanase A derived from Phanerochaete chrysosporium and Manufacturing method thereof}

본 발명은 백색부후균 유래의 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 대량생산을 위한 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 대량생산방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 종래의 재조합 벡터에 비하여 현저하게 높은 수율로서 백색부후균 유래의 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 생산할 수 있는 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 대량생산방법에 관한 것이다.

헤미셀룰로스는 식물의 세포벽을 구성하는 직선형의 다당체로서 셀룰로스 미세섬유와 수소결합을 통해 연결되어 있고 리그닌과도 공유결합을 통해 연결되어 셀룰로스와 함께 복잡하고 튼튼한 네트웍 구조를 유지하고 있다. 현재까지 일려진 바로는 헤미셀룰로스는 일반적으로 네종류 즉, 자일란(xylan), 만난(mannan), 베타글루칸(β-glucan), 자일로글루칸(xyloglucan)의 탄수화물로 구성되어 있으며 주요성분은 자일란이며 D-xylopyranosyl unit가 β-1,4-glycosidic bonds를 통해 연결되어 있다. 헤미셀룰로스는 지구상에 두 번째로 풍부한 탄수화물이며 이는 재생 가능한 유기탄소의 1/3에 해당하는 자원이기도 하다. 이러한 헤미셀룰로스를 분해하기 위해서는 자일란 구조를 가수분해하는 엔도-자일라나제(Ec. 3.2.1.8)가 필요하며 대부분의 xylanase는 GH families 10 또는 11에 속하며 여러 종류의 미생물들에 의해 생산되고 있다. 그중 백색부후균(Phanerochaete chrysosporium ) 유래의 자일라나제는 XynA, XynB 및 XynC의 세가지 종류가 알려져 있다.

백색부후균(Phanerochaete chrysosporium )는 리그닌 페록시다제(lignin peroxidases), 만가나제 페록시다제(manganase peroxidase), 글리옥살 옥시다제(glyoxal oxidase), 셀로비스 디히드로게나제(cellobiose dehydrogenase) 및 자일라나제(xylanase) 등을 분비하여 목재성분을 분해하는 미생물로 잘알려져 있다. 이러한 리그닌 및 헤미셀룰로스의 분해를 위해서는 위와 같은 여러 종류의 효소가 필요하지만 비슷한 활성도를 갖는 여러 종류의 효소가 포함되어 있어 분리 정제 및 특성을 파악하기가 쉽지 않다. 따라서 각각의 효소에 대한 유전자를 cloning하고 적절한 호스트에 발현시킬 필요가 있게 된다.

열 안정성 재조합 자일라나제를 생산하는 자일라나제 유전자, xyn A가 스트렙토마이세스 써모시아네오비오라세우스(Streptomyces thermocyaneoviolaceus)로부터 클로닝되었으며(Choi, J. H. et al., J Microbiol Biotechnol 16:57-63, 2006), 트리코더마 하지아눔(Trichoderma harzianum)이 분리되었고 자일라나제를 생산하는 것으로 발견되었다.

한편, 백색부후균 유래의 자일라나제 A, B, C는 Decelle 등 (2002)에 의해 Aspergillus niger에서 발현이 된바 있으나 최종 생산된 자일라나제의 생산 수율이 높지 않아 이를 대량 생산하는데 적합하지 못한 문제가 있어 보다 많은 생산 방법의 개발 필요성이 제기되고 있다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 첫번째 해결하려는 과제는 종래의 재조합 발현벡터에 비하여 백색부후균 유래의 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 대량생산에 적합한 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 두번째 해결하려는 과제는 본 발명의 재조합 발현벡터를 이용하여 특정조건에서 백색부후균 유래의 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 대량생산할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상술한 첫번째 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은, a) 메탄올에 의해 조절되는 AOXI 프로모터를 코딩하는 핵산서열 및 b) 백색부후균 유래의 분비신호서열(secretion signal sequence)을 포함하는 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 코딩하는 핵산서열이 전사방향으로 작동가능하게 연결되어 있는 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 대량생산을 위한 재조합 발현벡터를 포함한다.

또한 본 발명은 a) 메탄올에 의해 조절되는 AOXI 프로모터를 코딩하는 핵산서열, b) 효모 유래의 α-분비인자(α-secretion factor)를 코딩하는 핵산서열 및 c) 백색부후균 유래의 분비신호서열(secretion signal sequence)를 포함하지 않으면서 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 코딩하는 핵산서열이 전사방향으로 작동가능하게 연결되어 있는 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 대량생산을 위한 재조합 발현벡터를 포함한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 백색부후균은 Phaenerocheate chrysosporium BKM-F-1767(KCTC 6147)일 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 백색부후균 유래의 분비신호서열(secretion signal sequence)을 포함하는 엔도-1,4-베타 자일라나제 A는 서열번호 1로 표시되는 핵산서열일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 백색부후균 유래의 분비신호서열(secretion signal sequence)을 포함하지 않으면서 엔도-1,4-베타 자일라나제 A는 서열번호 2로 표시되는 핵산서열일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, pPICZA 벡터 내부에 백색부후균 유래의 분비신호서열(secretion signal sequence)을 포함하며 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 코딩하는 서열번호 1로 표시되는 핵산서열을 포함하며 도 1의 개열지도를 가지는 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 대량생산을 위한 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, pPICZαA 벡터 내부에 백색부후균 유래의 분비신호서열(secretion signal sequence)를 포함하지 않으면서 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 코딩하는 서열번호 2로 표시되는 핵산서열을 포함하며 도 2의 개열지도를 가지는 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 대량생산을 위한 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 본 발명의 재조합 발현벡터로 형질전환되며, 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 생산하는 효모를 제공하며, 바람직하게는 상기 효모는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)일 수 있다.

본 발명의 두번째 해결하려는 과제를 달성하기 위하여, (1) pPICZA 벡터 내부에 백색부후균 유래의 분비신호서열(secretion signal sequence)을 포함하며 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 코딩하는 서열번호 1로 표시되는 핵산서열을 클로닝하여 재조합 발현벡터를 제작하는 단계; (2) 상기 재조합 발현벡터를 효모에 형질전환하는 단계; 및 (3) 상기 형질전환된 효모를 메탄올이 포함된 배양기에서 배양하여 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 분리 정제하는 단계를 포함하는 백색부후균 유래의 엔도-1,4-베타 자일라나제 A의 대량생산방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (1) 단계에서 서열번호 3으로 표시되는 전방 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 후방 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 진행할 수 있다.

또한, 본 발명은 (1) PICZαA 벡터 내부에 백색부후균 유래의 분비신호서열(secretion signal sequence)를 포함하지 않으면서 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 코딩하는 서열번호 2로 표시되는 핵산서열을 클로닝하여 재조합 발현벡터를 제작하는 단계; (2) 상기 재조합 발현벡터를 효모에 형질전환하는 단계; 및 (3) 상기 형질전환된 효모를 메탄올이 포함된 배양기에서 배양하여 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 분리 정제하는 단계를 포함하는 백색부후균 유래의 엔도-1,4-베타 자일라나제 A의 대량생산방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (1) 단계에서 서열번호 5로 표시되는 전방 프라이머 및 서열번호 6으로 표시되는 후방 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 진행할 수 있다.

이하, 본 명세서에서 사용된 용어에 대해 간략히 설명한다.

별도로 설명되어 있지 않다면, 용어 '핵산(nucleic acid)'은 단일- 또는 이중나선 형태에서 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드를 가리키고, 자연 발생하는 뉴클레오타이드와 비슷한 방식에서 핵산과 결합하는 본래 뉴클레오타이드의 알려진 유사체들을 포함하며, 특별한 언급이 없는 한, 특정 핵산 서열은 그들의 상보적 서열을 포함한다.

'작동적으로 결합된(operatively linked to)'은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열(예컨대, KSI-L)사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독 과정을 조절하게 된다.

세포와 관련하여 사용되는 용어 '재조합(recombinant)'은 세포가 이형의 핵산을 복제하거나 이형의 핵산에 의해 코드화되는 펩타이드 또는 단백질을 발현하는 것을 가리킨다. 또한 재조합 세포는 세포의 본래 형태에서 발견되는 유전자를 발현시킬 수 있으나, 변형된 유전자가 인공적인 방법에 의해 세포로 재도입 되어지기도 한다.

'프로모터'는 원하는 단백질의 유전자가 상기 프로모터의 다운스트림에 융합되었을 때 세포에서 단백질의 발현을 조절할 수 있는 프로모터를 의미한다. 또한 본 발명의 프로모터는 다른 전사-번역 활성 서열에 결합하여 더욱 변형될 수 있다.

'프라이머'는 합성 또는 자연의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머는 주형에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합체의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용한다. 증폭의 최대 효율을 위하여, 바람직하게는 프라이머는 단일쇄이다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이다. 본 발명의 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산(PNA)(M. Egholm et al.,Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-,프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

'혼성화'는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우 (perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다. 일반적으로, 혼성화 온도가 높으면, 완전한 매치일 경우 혼성화가 일어날 가능성이 높으며, 혼성화 온도가 낮으면, 일부 미스매치가 존재하더라고 혼성화가 일어날 수 있다. 혼성화 온도가 낮으면, 낮을수록 혼성화가 일어날 수 있는 미스매치의 정도는 증가할 것이다.

'분비신호서열(secretion signal sequence)'이라 함은 단백질의 N-말단에 위치하며 6-30개정도의 아미노산 서열을 갖는 짧은 펩타이드 부분을 말하며 타겟 단백질이 세포외부로 분비될 수 있도록 안내자 역할을 수행한다.

'벡터'는 외래 유전자를 숙주 세포 내로 안정적으로 운반할 수 있는 운반체로서의 DNA 분자를 말한다. 유용한 벡터가 되기 위해서는 복제될 수 있어야 하며, 숙주 세포 내로 유입할 수 있는 방안을 갖추어야 하고, 자신의 존재를 검출할 수 있는 수단을 구비하여 한다. 여기서 외래 유전자는 백색부후균 유래의 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 코딩하는 핵산서열을 의미한다.

'플라스미드'는 일반적으로 외래 유전자가 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 벡터에 작동적으로 연결되어 형성된 환상의 DNA 분자를 말한다. 그러나, 플라스미드는 목적하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 작제하기 위해 유전자 재조합에 의해 특정한 제한 효소에 의해 분해되고 새로운 유전자를 도입하는 벡터로 사용될 수 있다. 따라서, 본원에서는 플라스미드와 벡터는 상호교환적으로 사용되며, 유전공학 분야에 통상의 지식으로 가진 자라면 그들의 명칭을 구분하지 않더라도 그 의미를 충분히 이해할 것이다.

본 발명의 백색부후균 유래의 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 대량생산을 위한 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 대량생산방법은 종래의 재조합 발현벡터 및 이를 이용한 대량생산방법에 비하여 현저하게 많은 양의 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 대량으로 생산할 수 있다. 또한 단백질의 분리정제를 용이하게 하기 위해 His-tag이 결합되어 있어 비교적 간단한 친화성 크로마토그래피 (affinity chromatography column)을 이용해 분리정제 할 수 있다.

또한, 본 발명의 백색부후균 유래의 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 대량생산을 위한 재조합 발현벡터는 펄프제지의 탈색 및 헤미셀룰로스의 분해에 폭넓게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 효모에 도입될 수 있는 재조합 발현벡터의 개열지도이다.
도 2는 본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따른 효모에 도입될 수 있는 재조합 발현벡터의 개열지도이다.
도 3은 메탄올에 의한 유도아래 실시예 1, 2의 P. pastoris 형질전환체에서 나타나는 XynA의 활성도를 7일간 확인한 그래프이다.
도 4는 형질전환체에서 분리된 XynA의 SDS-PAGE 분석 사진이다.
도 5a는 온도에 따른 활성도를 나타낸 그래프이고, 도 5b는 pH 에 따른 활성도를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 종래의 백색부후균 유래의 재조합 발현벡터를 통해 생산된 재조합 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 효소는 효율이 낮아 이를 상용화하기 어려운 문제가 있었다.

이에 본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, a) 메탄올에 의해 조절되는 AOX 프로모터를 코딩하는 핵산서열 및 b) 백색부후균 유래의 분비신호서열(secretion signal sequence)을 포함하는 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 코딩하는 핵산서열이 전사방향으로 작동가능하게 연결되어 있는 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 대량생산을 위한 재조합 발현벡터(이하 '제1 재조합 발현벡터'라 함)를 제작하였다. 이를 통해 종래의 재조합 발현벡터를 이용하는 것에 비하여 4배 이상의 재조합 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 생산할 수 있게 되었다(실시예 및 비교예 참조).

먼저, 도 1의 본 발명의 바람직한 일구현예에 따른 제1 재조합 발현벡터의 개열지도를 참조하면, 본 발명의 재조합 벡터는 메탄올에 의해 조절되는 AOXI(alcohol oxidaseI) 프로모터를 코딩하는 핵산서열을 필수적으로 포함한다. AOXI 프로모터는 효모 Pichia pastoris에서 유래하는 프로모터로서 메탄올의 존재하에서 형질전환체의 단백질 발현효율을 극대화시키는 역할을 수행한다. 메탄올 자화를 통해 성장하는 Pichia pastoris는 메탄올을 분해하기 위해 alcohol oxydase를 자기 몸무게 대비 30% 까지 생산하게 되는 데 이 효소의 생산을 위한 프로모터가 AOXI(Gene bank accession no : U96967)이며, 메탄올에 의해 발현효율이 크게 유도되는 특성을 가지고 있다. 본 발명에서는 바람직하게는 효모 Pichia pastoris 유래의 AOXI 프로모터를 사용할 수 있으며, 상기 AOXI 프로모터는 인비트로젠사에서 상업적으로 판매하고 있는 pPICZA 벡터 및 pPICZaA 벡터에 포함되어 있다.

다음, 본 발명의 제1 재조합 벡터는 상술한 AOXI 프로모터를 코딩하는 핵산서열의 전사방향으로 백색부후균 유래의 분비신호서열(secretion signal sequence)을 포함하는 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 코딩하는 핵산서열이 작동 가능하도록 연결된다.

상술한 바와 같이 백색부후균(Phanerochaete chrysosporium )은 자일란을 분해할 수 있는 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 효소를 생산하는 xynA 유전자 (GeneBank accession no.AF301903.1)를 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일구현예에서는 한국생명공학연구원으로부터 분양받은 백색부후균 Phanerochaete chrysosporium BKM-F-1767(기탁번호:KCTC 6147, reference number F-1767) 유래의 서열번호 1로 표시되는 xynA 유전자를 벡터에 클로닝하였으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 서열번호 1로 표시되는 xynA 유전자는 통상의 xynA 유전자와 마찬가지로 분비신호서열을 포함하며, 상기 분비서열신호는 단순히 타겟 단백질이 세포외부로 분비될 수 있도록 안내자 역할을 수행할 뿐 세포외부로 발현되지 않는 영역으로서 서열번호 1에서 1번째에서 57번째에 해당한다.

도 1은 본 발명의 일구현예에 따른 제1 재조합 벡터의 개열지도로서, AOXI 프로모터를 포함하는 pPICZA 벡터(인비트로젠사)에 서열번호 1로 표시되는 백색부후균 유래의 분비신호서열(secretion signal sequence)을 포함하는 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 코딩하는 핵산서열이 작동가능하게 연결되어 있다. 이를 통해 벡터 자체적으로 별도의 분비신호서열을 포함하지 않더라도 종래의 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 코딩하는 핵산서열이 포함된 재조합 벡터에 비하여 현저하게 많은 양의 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 대량으로 생산할 수 있게 된다.

한편, 본 발명의 제1 재조합 발현벡터 및 후술하는 제2 재조합 발현벡터는 그로부터 발현되는 재조합 엔도-1,4-베타 자일라나제의 정제를 용이하게 하기 위하여, 재조합 발현벡터의 내부에 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 결합 단백질(MBP), FLAG, 5 ~ 7x His (hexahistidine), NusA (N utilization substance A) 또는 Trx(Thioredoxin)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 추가적으로 포함될 수 있다. 그러나 가장 바람직하게는 5 ~ 7x His (hexahistidine)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 추가적으로 포함되는 경우에 발현효율을 극대화시킬 수 있다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피 등을 통하여 신속하고 간단하게 정제될 수 있는 것이다.

한편, 본 발명의 재조합 발현벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 바람직한 다른 구현예에 따르면, a) 메탄올에 의해 조절되는 AOXI 프로모터를 코딩하는 핵산서열, b) 효모 유래의 α-분비인자(α-secretion factor)를 코딩하는 핵산서열 및 c) 백색부후균 유래의 분비신호서열(secretion signal sequence)를 포함하지 않으면서 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 코딩하는 핵산서열이 전사방향으로 작동가능하게 연결되어 있는 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 대량생산을 위한 재조합 발현벡터(이하 '제2 재조합 발현벡터'라 함)를 제공한다.

상기 상술한 제2 재조합 발현벡터를 전술한 제1 재조합 발현벡터와의 차이점을 도 2의 개열지도를 중심으로 설명하면, 먼저 a) 메탄올에 의해 조절되는 AOXI 프로모터를 코딩하는 핵산서열은 동일하나, 제1 재조합 발현벡터에서 사용된 b)를 대체하여, b) 효모 유래의 α-분비인자(α-secretion factor)를 코딩하는 핵산서열 및 c) 백색부후균 유래의 분비신호서열(secretion signal sequence)를 포함하지 않으면서 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 코딩하는 핵산서열을 포함하는 것에 차이가 있다.

본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 상기 c) 백색부후균 유래의 분비신호서열(secretion signal sequence)를 포함하지 않으면서 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 코딩하는 핵산서열은 통상의 xynA 유전자에서 상술한 분비신호서열(secretion signal sequence)을 제외한 나머지 부분을 의미한다. 구체적으로 본 발명에서는 서열번호 1로 표시되는 xynA 핵산서열에서 분비신호서열(secretion signal sequence)을 제외한 나머지 부분의 핵산서열을 포함하며, 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 분비신호서열(secretion signal sequence)을 제외한 xynA 핵산서열을 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 제2 재조합 발현벡터에 포함되는 xynA 핵산서열은 분비신호서열을 포함하지 않으므로, 효모 유래의 α-분비인자(α-secretion factor)를 코딩하는 핵산서열을 포함하며, 바람직하게는 효모 사카로마이세서 세레비지에(Scccharomyces cerevisiae) 유래의 a-분비인자(a-secretion factor, Gene bank accession no : NP_015137)를 일부 또는 전부 포함하여 타겟 단백질이 세포외부로 분비될 수 있도록 안내자 역할을 수행할 수 있다.

도 2는 본 발명의 일구현예에 따른 제2 재조합 벡터의 개열지도로서, AOXI 프로모터, α-분비인자 및 세레비지에(Scccharomyces cerevisiae) 유래의 를 포함하는 pPICZαA 벡터(인비트로젠사)에 서열번호 2로 표시되는 백색부후균 유래의 분비신호서열(secretion signal sequence)을 포함하지 않는 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 코딩하는 핵산서열이 작동가능하도록 연결된다. 이를 통해 생산되는 재조합 엔도-1,4-베타 자일라나제 A는 종래의 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 코딩하는 핵산서열이 포함된 재조합 벡터에 비하여 현저하게 많은 양의 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 대량으로 생산할 수 있을 뿐 아니라, 상기 제1 재조합 벡터과 대비하여도 많은 양의 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 안정적으로 수득할 수 있다(실시예 및 비교예 참조).

본 발명의 다른 실시예에 따른 재조합 엔도-1,4-베타 자일라나제 A의 대량생산방법은 (1) 상기 제1 재조합 발현벡터 또는 제2 재조합 발현벡터를 제작하는 단계; (2) 상기 제1 재조합 발현벡터 또는 제2 재조합 발현벡터를 효모에 형질전환하는 단계; 및 (3) 상기 형질전환된 효모를 메탄올이 포함된 배양기에서 배양하여 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 분리 정제하는 단계를 포함한다.

먼저, (1) 단계로서 상기 제1 재조합 발현벡터 또는 제2 재조합 발현벡터를 제작한다. 재조합 발현벡터의 제작은 통상적으로 사용되는 클로닝 방법을 사용하여 제작할 수 있으며, 본 발명에서는 백색부후균으로부터 엔도-1,4-β-자일라나제A를 합성하는 cDNA를 분리하고 이를 발현벡터 내부에 클로닝하여 PCR 방법을 포함하여 재조합 발현벡터를 제작할 수 있다. 이 경우 제1 재조합 발현벡터를 제작하기 위하여 서열번호 3으로 표시되는 전방 프라이머 및 서열번호 4로 표시되는 후방 프라이머를 사용하여 PCR 과정을 수행할 수 있으며 서열번호 3, 4의 프라이머 쌍은 본 발명자들이 자체 제작한 신규한 프라이머 서열이다.

제2 재조합 발현벡터를 제조하기 위하여 서열번호 5로 표시되는 전방 프라이머 및 서열번호 6으로 표시되는 후방 프라이머를 사용하여 PCR 과정을 수행할 수 있으며 서열번호 5, 6의 프라이머 쌍은 본 발명자들이 자체 제작한 신규한 프라이머 서열이다.

한편, 본 발명의 일구현예에 사용될 수 있는 프라이머 어닐링, 프라이머 신장 및 변성 단계를 실시하여 타깃 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 방법은 당업계 에 잘 알려져 있다.

본 발명에서 바람직하게는, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다.

바람직하게는 변이를 포함하는 핵산 서열을 증폭하기 위한 본 발명의 방법은 소망하는 어떠한 변이도 검출할 수 있도록 한다. 이러한 핵산 분자는 DNA 또는 RNA이다. 상기 핵산 분자는 이중쇄 또는 단일쇄일 수 있고, 바람직하게는 이중쇄이다. 출발물질로서 핵산이 이중쇄인 경우, 두 쇄를 단일쇄로, 또는 부분적인 단일쇄 형태로 만드는 것이 바람직하다. 쇄를 분리하는 방법은, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 쇄 분리는 80-105℃의 온도로 열 처리하여 달성될 수 있다. 상술한 처리의 일반적인 방법은 Joseph Sambrook 등, MolecularCloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 개시되어 있다.

바람직하게는 mRNA가 출발물질로 이용되는 경우, 역전사 단계가 증폭 전에 필요로 하며, 역전사 단계의 상세한 내용은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)에 개시되어 있다. 역전사 단계에서, mRNA의 폴리 A 테일에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머가 이용될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머는 dTMPs로 이루어져 있고, dT 프라이머가 프라이머로서 작용할 수 있는 한도 내에서 dTMPs 중 하나 또는 그 이상은 다른 dNMPs로 대체될 수 있다. 역전사 단계는 RNase H 활성을 갖는 역전사 효소에 의해 이루어질 수 있다. RNase H 활성을 갖는 효소를 이용하는 경우, 반응조건을 주의하여 선택하면 개별적인 RNase H 절단 과정을 피할 수 있다.

바람직하게는 본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성할 수 있다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

바람직하게는 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다. 또한, 본 발명에 이용되는 중합효소는 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg² ⁺와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 바람직하다.

증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

다음, (2) 단계로서 상기 제1 재조합 발현벡터 또는 제2 재조합 발현벡터를 효모에 형질전환한다. 보다 바람직하게는 통상의 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 재조합 발현벡터를 효모 내부로 운반할 수 있다.

한편, 본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 재조합 발현벡터의 숙주세포로서 효모를 사용하는 것이, 대장균 등의 통상의 균주를 사용하는 것에 비하여 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 대량생산에 유리하다. 바람직하게는 상기 효모는 Pichia pastoris 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

다음, (3) 단계로서 상기 형질전환된 효모를 메탄올이 포함된 배양기에서 배양하여 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 분리 정제하였다. 본 발명의 제1 재조합 벡터 및 제2 재조합 벡터는 모두 메탄올에 의해 조절되는 AOXI 프로모터를 포함하고 있으므로, 상기 재조합 벡터가 형질전환된 효모를 통해 목적하는 재조합 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 생산하기 위해서는 반드시 배양기 내부에 AOXI 프로모터를 조절할 수 있는 메탄올 성분이 포함되어야 한다. 이 경우 포함되는 메탄올의 농도는 바람직하게는 0.1 ~ 1중량%일 수 있으며, 배양중 추가로 메탄올을 추가하는 것이 가능하다. 이 경우 종래의 알려진 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)를 통해 재조합 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 생산하는 것에 비하여 4배 정도 높은 수율을 나타내는 것을 사용할 수 있다.

효모 P.pastoris로부터 분비된 재조합 엔도-1,4-베타 자일라나제 A는 통상의 분리 정제방법을 통해 재조합 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 최종 생산할 수 있으며, His-Tag column을 이용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

결국, 본 발명의 재조합 발현벡터를 통해 메탄올이 포함된 배양기에서 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 수득하는 경우 통상의 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)를 통해 재조합 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 생산하는 것에 비하여 4배 이상의 현저하게 향상된 수득량을 가지므로 대량생산에 적합하여 펄프제지의 탈색 및 헤미셀룰로스의 분해에 상업적으로 활용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

<실시예 1> 제1 재조합 발현벡터의 제작

백색부후균(Phanerochaete chrysosporium ) 유래의 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 코딩하는 핵산서열(서열번호 1)을 포함하는 도 1의 개열지도를 가지는 제1 재조합 발현벡터를 제작하였다.

(1) 미생물의 배양

백색부후균(Phanerochaete chrysosporium ) BKM-F-1767 균주(KCTC 6147)는 한국생명공학연구원에서 분양받아 yeast extract-malt extract-peptone-glucose (YMPG) slants에 접종하여 25 ℃에서 배양는 방법으로 보존 및 유지하였다. Escherichia coli Top10 은 LB한천 배지에서 37℃에서 18시간 배양했으며 필요에 따라 앰피실린 50/ml, 지오신 50/ml을 첨가해 선별했다. Pichia pastoris GS115 균주는 Invitrogen에서 구매하여 사용했으며 YPD 배지에서 25℃, 3일간 배양하여 콜로니를 형성한 뒤 필요한 목적에 따라 배양하였다.

(2) 제1 재조합 발현벡터의 제작

백색부후균으로부터 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 코딩하는 염기서열을 클로닝하기 위해 질소원이 부족한 배지에서 30℃에서 5일 동안 배양한 세포에서 전장 mRNA를 분리하였으며 Clonetech 회사의 SMARTer PCR cDNA synthesis Kit를 이용하여 cDNA를 합성하였다.

합성된 전장 cDNA로부터 XynA 유전자(서열번호 1)의 클로닝을 위해 다음과 같은 신규한 프라이머를 디자인하였다(forward primer: 5'-GCGAATTCATGAAGCTCTCTGCCTCCTTCGCG-3' 서열번호 3, reverse primer: 5'-CGGGGCCCATTGCCGAAGCCAATAGCGATA-3' 서열번호 4).

PCR 조건은 94℃ 1분, 94℃ 30초, 51℃ 30초, 72℃ 2분을 30cycles 진행하였다. 이를 통해 만들어진 DNA 조각은 pGEM-T 벡터(Invitrogen)에 클로닝하고 대장균에 1차 형질전환 한 뒤 형질전환체를 분리하고 이들로부터 유래된 xynA 유전자의 염기서열을 결정하였다(서열번호 1). 염기서열에 이상이 없는 재조합 xynA 유전자를 대장균으로부터 분리 정제하고 제한효소 EcoRI 및 ApaI을 처리하여 다시 분리 정제한 뒤 AOXI 프로모터를 포함하는 pPICZA 벡터(인비트로젠)의 내부에 클로닝하여 도 1의 개열지도를 갖는 제1 재조합 발현벡터를 제작하였다.

<실시예 2> 제2 재조합 발현벡터의 제작

백색부후균(Phanerochaete chrysosporium ) 유래의 분비신호서열을 제외한 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 코딩하는 핵산서열(서열번호 2)을 포함하는 도 2의 개열지도를 가지는 제2 재조합 발현벡터를 제작하였다. 미생물의 배양은 제1 재조합 발현벡터와 동일하게 실시하였다.

백색부후균으로부터 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 코딩하는 유전자(서열번호 2)를 클로닝하기 위해 질소원이 부족한 배지에서 30℃에서 5일 동안 배양한 세포에서 전체 mRNA를 분리하였으며 Clonetech 회사의 SMARTer PCR cDNA synthesis Kit를 이용하여 cDNA를 합성하였다.

합성된 전장 cDNA로부터 XynA 유전자(서열번호 2)의 클로닝을 위해 다음과 같은 신규한 프라이머를 디자인하였다(forward primer: 5'-CGAATTCCAGTCGCCTGTTTGGGGCC, 서열번호 5; reverse primer: 5'-CGCCGCGGAATTGCCGAAGCCAATAG-3', 서열번호 6).

PCR 조건은 94 1분, 94 30초, 51 30초, 72 2분을 30cycles 진행하였다. 이를 통해 만들어진 DNA 조각은 pGEM-T 벡터(Invitrogen)에 클로닝하고 대장균에 1차 형질전환 한 뒤 형질전환체를 분리하고 이들로부터 유래된 xynA 유전자의 염기서열을 결정하였다(서열번호 2). 염기서열에 이상이 없는 재조합 xynA 유전자를 대장균으로부터 분리 정제하고 제한효소 EcoRI 및 SacII를 처리하여 다시 정제 한 뒤 AOXI 프로모터 및 사카로마이세스 세레비지에 (Scccharomyces cerevisiae) 유래의 a-분비인자를 포함하는 pPICZaA 벡터(인비트로젠)의 내부에 클로닝하여 도 2의 개열지도를 갖는 제2 재조합 발현벡터를 제작하였다.

<실시예 3> 재조합 발현벡터의 형질전환

실시예 1, 2에서 제작된 제1 재조합 발현벡터 및 제2 제조합 발현벡터를 Pichia pastoris GS115(인비트로젠)에 형질전환하여 형질전환체를 제작하였다. 이때 형질전환 조건은 상기의 제1 발현벡터의 제조방법과 동일하다.

구체적으로 제1 재조합 발현벡터 및 제2 재조합 발현벡터는 각각 DNA 염기서열 분석을 통해 정상적인 클로닝이 이루어 졌는지를 확인하고 Pichia pastoris GS115내로 형질전환 시켰다. 이를 위해 형질전환 시키기 위해 10의 재조합 DNA를 제한효소 PmeI을 처리하여 linear DNA 형태로 만든뒤 전기충격 (electrophoration) 방법으로 형질전환 한 뒤 형질전환된 세포를 100 ug/ml 의 Zeocin이 포함된 YPD 배지에 도말하여 30℃에서 2-3일 배양한 뒤 나타나는 형질전환체를 선별하였다.

<실시예 4> 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 효소의 생산

제1 재조합 발현벡터 및 제2 재조합 발현벡터로부터 각각 최소 열 개의 형질전환체를 선발하여 PCR을 통해 재확인한 뒤 1%의 메탄올이 포함된 YP medium 50ml에 접종하여 세포외로 분비되는 효소의 활성도를 측정하였다. 배양방법은 확인된 형질전환체의 콜로니를 5ml YPD 배지에 접종하여 30℃, 200rpm으로 12시간 배양한 뒤 5ml 배양액을 100 ml의 YPD 배지에 재접종한 뒤 30℃, 150rpm에서 2일간 진탕배양 하였다. 배양액은 2000 rpm, 5분간 원심분리하여 회수하였다. 회수된 세포는 10 ml YP 배지 (1% yeast extract, 2% peptone)에 재현탁하고 천천히 90ml의 YP 배지를 optical density 1이 되도록 희석하며 최종 100ml이 되도록 하였다. 자일라나제 A의 생산을 위하여 100% 메탄올 1ml을 넣어 최종 1%정도 되게 유지하고 매 24시간마다 추가로 1ml의 메탄올을 넣어주며 1주일 동안 배양하였다. 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 분리정제 하기 위하여 활성도가 제일 높았던 2일째의 배양액을 3000rpm에서 5분동안 원심분리하여 Pichia 세포를 제거한 뒤 0.45 ㎛ 필터에 통과시켜 부유 고형물을 제거하고 10×binding buffer (20 mM sodium phosphate, 0.5M NaCl, and 20 mM imidazole; pH 7.4)를 섞은 뒤 AKTA FPLC 시스템의 his-tag column (Histrap-GE Healthcare)에 통과시킨 뒤 elution buffer (20mM sodium phosphate, 0.5M NaCl and 500mM imidazole; pH7.4)를 통해 분리정제 하였다. 분리된 단백질의 농도는 Bradford 방법을 통해 확정했다.

<비교예 1>

종래에 알려진 방법(논문제목: Cloning, functional expression and characterization of three Phanerochaete chrysosporium endo-1,4-b-xylanases; 저자: Barbara Decelle, Adrian Tsang, Reginald K. Storms; 논문집명 및 페이지: Curr Genet (2004) 46: 166 - 175)인 Aspergillus niger를 통해 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 효소를 수득하였다. Decelle 등은 Phanerochaete chrysosporium으로부터 분리된 XynA 유전자를 ANEp2 plasmid에 클로닝하고 Aspergillus niger에 형질전환시켜 자일라나제 A를 세포 외부로 발현시켜 분리정제 하였다. 분비된 효소의 양은 0.43 U/ml로 나타났으며 정제된 효소의 활성도를 통해 최적온도 70℃ 및 최적 pH는 4.5로 나타났다.

<실시예 5> 효소의 활성도 측정

자일라나제의 활성도는 birchwood xylan을 기질로하여 생성되는 reducing-sugar의 양을 3,5-dinitrosalicylic acid (DNSA) 정량 방법을 통해 측정하였다. 배양액 (100 ㎕) 또는 정제된 효소 (1 ㎍)를 증류수에 섞어 200 ㎕ 로 만들고 sodium citrate buffer (100mM, pH 4.5)에 1% (w/v) birchwood xylan이 녹아있는 용액 200 ㎕를 섞어 of 1% (w/v) 70℃에서 10분간 배양한 후 200㎕의 DNSA 용액을 첨가한 뒤 10분간 끓여 효소의 활성도를 없앤뒤 540nm에서 reducing sugar의 양을 결정했다. 효소 활성도 측정을 위한 표준곡선은 D-xylose를 기질로하여 나타나는 흡광도를 reducing sugar의 mole 농도로 변환하여 사용했으며 자이라나제 1 unit는 xylose 1 μmol/min의 활성도로 정의하였다.

도 3은 메탄올에 의한 유도아래 실시예 1, 2의 P. pastoris 형질전환체에서 나타나는 XynA의 활성도를 7일간 확인한 그래프로서 상기 도 3에서 원형그래프는 실시예 1의 제1 재조합 발현벡터이고, 삼각형 그래프는 제2 재조합 발현벡터이다. 1일째에 효소 활성도가 1536 Ul^-1 및 1089 Ul^-1로 각각 나타났고 2일째에 가장 높게 나타나 2496 Ul^-1 및 1946 Ul^- ¹으로 각각 활성도를 나타냈다. 이러한 발현양은 기존의 Aspergillus niger 를(비교예 1) 통해 발현 시켰을 때 보다 약 4배정도 높게 생산되는 것을 알 수 있다. 또한, 제1 재조합 발현벡터에 비하여 별도의 신호분비서열을 포함하는 제2 재조합 발현벡터의 활성도가 현저하게 높은 것을 확인할 수 있었다.

도 4는 형질전환체에서 분리된 XynA의 SDS-PAGE 분석 사진(레인 1 : 분자량 마커, 레인 2 : 제2 재조합 발현벡터, 레인 3 : 제1 제조합 발현벡터)이다.분비된 효소의 분리정제를 위해 His-Tag column (HiTrap, GE healthcare)에 직접 적용하여 순수 분리된 효소를 확인 할 수 있었다. 분리정제는 쉽게 효율적으로 진행되었으나 SDS-PAGE 상에서 확인했을 때 예상했던 크기인 43 kDa 보다 크게 약 50kDa로 만들어지는 것을 확인했다. 이렇게 예상했던 크기보다 커지는 이유는 Pichia 균주에서 나타나는 glycosylation 때문으로 추측된다. 크기가 커진 자일라나제 A를 검정하기 위해 trypsin 처리후 matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS)를 실행했다. 그 peptide mapping 결과 분리 정제된 효소는 XynA과 일치하는 것으로 나타났다.

<실시예 6> 효소의 생화학적 특성

자일라나제 활성을 위한 최적온도의 측정은 30℃에서 80℃ 까지 측정하였고 최적 pH의 결정을 위해서는 Sodium citrate 또는 sodium phosphate buffer 등을 사용하여 pH 범위 3.0에서 8.0 까지 측정하였다.

도 5a는 온도에 따른 활성도를 나타낸 그래프이고, 도 5b는 pH 에 따른 활성도를 나타낸 그래프로서 사각형 그래프는 제1 재조합 벡터이고, 원형 그래프는 제2 재조합 벡터이다.

재조합 자이라나제의 최적 온도를 30℃에서 80℃ 까지 검정한 결과 70℃에서 가장 활성도가 높은 것으로 나타났고 (도 5a), 최적 pH는 5.0으로 나타났다 (도 5b). 이와 같은 결과는 기존의 A. niger에서 발현된 특징과 거의 유사한 값으로 나타난 결과이다.

<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Recombinant expression vector for mass production of endo-beta-xylanase A derived from Phanerochaete chrysosporium and Manufacturing method thereof <130> XNA-A <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1227 <212> DNA <213> Phaenerocheate chrysosporium BKM-F-1767 <400> 1 atgaagctct ctgcctcctt cgcggccctc gctctcctcc tgccgttcgt gcaggcccag 60 tcgcctgttt ggggccaatg cggtggtatt ggctggaccg gccccacgac ctgtacggct 120 ggcaacgtct gccaggagta cagcgcgtac tactcgcagt gcatccccgc tagccaggca 180 acgtccgtca cgtccgtctc caccgcgccg aacccgcctc cgacgtcgca cacgagcacg 240 tcgtctgccc cgtccggtgc ctcgacctcg accgcgaagc tgaacacgct cgcgaaggcc 300 aagggcaagc tctacttcgg cacggcgacg gacaacggcg agctctcgga caccgcgtac 360 accgcgatcc tcgatgacaa cacgatgttc ggccagatca cgcctgcgaa cagcatgaaa 420 tgggatgcca ccgagccgca gcagggccag ttcaccttca gcggaggtga ccagattgcc 480 aaccttgcca aatcaaatgg catgctcctg cgtggtcaca attgcgtgtg gtacaaccag 540 ctcccaagct gggtgtccaa cggcaagttc accgcagccc agcttacctc catcatccaa 600 aaccactgct cgaccctcgt cacccactac aagggccagg tctacgcctg ggacgtcgtc 660 aacgagccct tcaacgacga cggctcgtgg cgcacggacg tcttctacaa cacgctcggc 720 acgtcgtacg tgcagattgc gctcgaggcc gcccgcgcgg cggacccgga cgcgaagctg 780 tacatcaacg agtacaacat cgagtacgcg ggcgcgaagg cgacgtcgct gctcaacctc 840 gtaaagacgc tcaaggctgc atccgtaccg ctcgacggca ttggcttcca gagccacttc 900 atcgtcggcc aggtcccgac gggcctgcag tcgcagctca cgacattcgc cgcgcagggc 960 gtcgaggtcg cgatcaccga gctcgacatc cgcatgacgc tcccgtcgac gcccgcgctc 1020 ctcgcgcagc agaagacgga ctactcgaac gtcatcaagg cgtgcgcgtc cgtcgaggcg 1080 tgtgtcggcg tcaccgtgtg ggactggacg gacaaatact cgtgggtgcc aaacacgttc 1140 tctggccagg gtgcggcctg cccgtgggac cagaacttcg tcaggaagcc cgcctacgat 1200 ggtatcgcta ttggcttcgg caattag 1227 <210> 2 <211> 1170 <212> DNA <213> Phaenerocheate chrysosporium BKM-F-1767 <400> 2 cagtcgcctg tttggggcca atgcggtggt attggctgga ccggccccac gacctgtacg 60 gctggcaacg tctgccagga gtacagcgcg tactactcgc agtgcatccc cgctagccag 120 gcaacgtccg tcacgtccgt ctccaccgcg ccgaacccgc ctccgacgtc gcacacgagc 180 acgtcgtctg ccccgtccgg tgcctcgacc tcgaccgcga agctgaacac gctcgcgaag 240 gccaagggca agctctactt cggcacggcg acggacaacg gcgagctctc ggacaccgcg 300 tacaccgcga tcctcgatga caacacgatg ttcggccaga tcacgcctgc gaacagcatg 360 aaatgggatg ccaccgagcc gcagcagggc cagttcacct tcagcggagg tgaccagatt 420 gccaaccttg ccaaatcaaa tggcatgctc ctgcgtggtc acaattgcgt gtggtacaac 480 cagctcccaa gctgggtgtc caacggcaag ttcaccgcag cccagcttac ctccatcatc 540 caaaaccact gctcgaccct cgtcacccac tacaagggcc aggtctacgc ctgggacgtc 600 gtcaacgagc ccttcaacga cgacggctcg tggcgcacgg acgtcttcta caacacgctc 660 ggcacgtcgt acgtgcagat tgcgctcgag gccgcccgcg cggcggaccc ggacgcgaag 720 ctgtacatca acgagtacaa catcgagtac gcgggcgcga aggcgacgtc gctgctcaac 780 ctcgtaaaga cgctcaaggc tgcatccgta ccgctcgacg gcattggctt ccagagccac 840 ttcatcgtcg gccaggtccc gacgggcctg cagtcgcagc tcacgacatt cgccgcgcag 900 ggcgtcgagg tcgcgatcac cgagctcgac atccgcatga cgctcccgtc gacgcccgcg 960 ctcctcgcgc agcagaagac ggactactcg aacgtcatca aggcgtgcgc gtccgtcgag 1020 gcgtgtgtcg gcgtcaccgt gtgggactgg acggacaaat actcgtgggt gccaaacacg 1080 ttctctggcc agggtgcggc ctgcccgtgg gaccagaact tcgtcaggaa gcccgcctac 1140 gatggtatcg ctattggctt cggcaattag 1170 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FORWARD PRIMER <400> 3 gcgaattcat gaagctctct gcctccttcg cg 32 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BACKWARD PRIMER <400> 4 cggggcccat tgccgaagcc aatagcgata 30 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FORWARD PRIMER <400> 5 cgaattccag tcgcctgttt ggggcc 26 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BACKWARD PRIMER <400> 6 cgccgcggaa ttgccgaagc caatag 26

Claims

a) 메탄올에 의해 조절되는 AOXI 프로모터를 코딩하는 핵산서열, b) 효모 유래의 α-분비인자(α-secretion factor)를 코딩하는 핵산서열 및 c) 백색부후균 유래의 분비신호서열(secretion signal sequence)를 포함하지 않으면서 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 코딩하는 서열번호 2로 표시되는 핵산서열이 전사방향으로 작동가능하게 연결되어 있는 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 대량생산을 위한 재조합 발현벡터.
제1항에 있어서,
상기 백색부후균은 Phaenerocheate chrysosporium BKM-F-1767(KCTC 6147)인 것을 특징을 하는 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 대량생산을 위한 재조합 발현벡터.
pPICZαA 벡터 내부에, 백색부후균 유래의 분비신호서열(secretion signal sequence)를 포함하지 않으면서 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 코딩하는 서열번호 2로 표시되는 핵산서열을 포함하며 도 2의 개열지도를 가지는 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 대량생산을 위한 재조합 발현벡터.
제1항, 제2항 또는 제3항의 재조합 발현벡터로 형질전환되며, 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 생산하는 효모.
제4항에 있어서,
상기 효모는 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)인 것을 특징으로 하는 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 생산하는 효모.
제4항의 효모로부터 생산된 재조합 엔도-1,4-베타 자일라나제 A.
(1) PICZαA 벡터 내부에 백색부후균 유래의 분비신호서열(secretion signal sequence)를 포함하지 않으면서 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 코딩하는 서열번호 2로 표시되는 핵산서열을 클로닝하여 재조합 발현벡터를 제작하는 단계;
(2) 상기 재조합 발현벡터를 효모에 형질전환하는 단계; 및
(3) 상기 형질전환된 효모를 메탄올이 포함된 배양기에서 배양하여 엔도-1,4-베타 자일라나제 A를 분리 정제하는 단계를 포함하는 백색부후균 유래의 엔도-1,4-베타 자일라나제 A의 대량생산방법.
제7항에 있어서, 상기 (1) 단계에서 서열번호 5로 표시되는 전방 프라이머 및 서열번호 6으로 표시되는 후방 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 진행하는 것을 특징으로 하는 백색부후균 유래의 엔도-1,4-베타 자일라나제 A의 대량생산방법.
제7항 또는 제8항의 방법으로 생산된 엔도-1,4-베타 자일라나제 A.