KR101218383B1

KR101218383B1 - 열안정성 및 내산성을 가지는 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101218383B1
Application number: KR1020090049993A
Authority: KR
Inventors: 한성옥; 이채영
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2009-06-05
Filing date: 2009-06-05
Publication date: 2013-01-03
Also published as: KR20100131215A

Abstract

본 발명은 클로스트리디움 셀룰로보란스 (Clostridium cellulovorans) 유래의 엔도-베타-1,4-글루칸아제-디 (endo-β-1,4-glucanase D, 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase , carboxymethylcellulase, CMCase; EC 3.2.1.4)의 돌연변이체 및 그 돌연변이체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 엔도-베타-1,4-클루칸아제-디의 돌연변이체 EGD는 야생형의 셀룰라아제에 비하여 열에 대한 안정성 및 내산성이 향상되었을 뿐만 아니라, 고온에서의 효소활성 자체도 증가하였으므로, 생물공정, 의약, 화장품 및 식품 등에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

엔도-베타-1,4-클루칸아제, 클로스트리디움 셀룰로보란스, 클로스트리디움 써모셀럼, 셀룰라아제

Description

열안정성 및 내산성을 가지는 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체 및 그 제조방법{An endo-beta-1,4-glucanase D mutant with an improved thermostability and acid-resistance and the preparation method}

본 발명은 고온에서 안정성을 가지는 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체 EGD에 관한 것으로 보다 구체적으로 서로 다른 종을 이용한 엇갈림 연장과정(StEP)방법으로 클로스트리디움 셀룰로보란스로부터 유래한 엔도글루칸아제-디와 내열성이 있는 균주 클로스트리디움 써모셀럼의 엔도글루칸아제-이를 혼합하여 생산한 돌연변이체로서 내열성 및/또는 내산성을 가지는 돌연변이체 EGD, 그를 암호화하는 유전자, 돌연변이체를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환 된 미생물, 그로부터 생산된 돌연변이체의 제조하는 방법에 관한 것이다.

셀룰로오스(cellulose)는 포도당이 베타-1,4-당 결합( glycosidic bond)으로 연결된 긴 길이의 선형의 다당류로, 재활용될 수 있는 에너지 자원으로 가치가 매우 높다. 이 다당류는 자연에 존재하는 가장 풍부한 유기물질로써 주로 식물의 세 포벽을 형성하는 주요 성분이다. 이를 분해하는 효소인 셀룰라아제는 미생물이 생산하는 다양한 효소 중에서 앞으로 그 이용 가능성이 증대될 것으로 기대되는 효소중의 하나이다.

셀룰라아제는 다양한 분야에 활용될 수 있는데, 예를 들어 세제, 펄프 및 제지 산업, 가축의 사료와 식품 산업등에 유용하게 사용된다. 또한 화석연료인 석 유와 석탄을 대체할 차세대 에너지원으로, 식물의 바이오매스(biomass)를 분해하 여 에탄올을 생산하는 산업에서 셀룰라아제의 활용이 핵심기술로 쓰이고 있다. 이런 다양한 분야에서 셀룰라아제의 효율적인 활용을 위해서는 효소 분자의 열적 안정성이 무엇보다 중요하다. 특히 그중에서도 높은 온도에서 작동하는 내열성 셀 룰라아제는 불용성 셀룰로오스 기질의 용해도를 극대화 할 수 있기 때문에 내열성 셀룰라아제에 대한 탐색 및 연구개발이 큰 관심의 대상이다.

현재 섬유소 분해 효소를 분비하는 유전자 재조합 효모를 제조하기 위한 연구가 활발히 진행 중이나 미흡한 실정이고 이를 위해서는 열 안정성이 높거나 활성이 우수한 섬유소 분해 효소 유전자의 확보가 필요하다.

한편, 클로스트리디움 셀룰로보란스 (Clostridium cellulovorans)는 혐기중온성 세균으로서, 다양한 섬유소 분해 효소(cellulose)를 생산하고 또한 효소복합체인 셀룰로좀(cellulosome)을 만들어내는 것으로 알려져 있다. 클로스트리디움 셀룰로보란스가 생산하는 섬유소 분해 효소들은 기질 특이성과 반응기작에 큰 차이를 보이기는 하나, 모두 베타-1,4-글루코시드 (β-1,4-glycoside) 결합을 분해하며, 균체 외 배지로 분비되는 특징이 있다고 보고되었다 (Shoseyov et al. 1990). 또 한, 결정형 섬유소의 효과적인 분해에는 적어도 세가지의 섬유소 분해효소, 즉, 엔도글루칸아제 (endoglucanase), 엑소글루칸아제 (exoglucanase) (또는 셀로비오하이드롤라제 cellobiohydrolase) 및 베타-글루코시다제 (β-glucosidase) 가 동시에 필요하며, 이들의 상승작용으로 섬유소 분해능이 크게 증가한다고 보고되었다(Murashima et al. 2002, J Bacteriol 184(18), 5088-5095; Schwarz 2001,Appl Microbiol Biotechnol 56(5-6), 634-649; Shoham et al. 1999, Trends Microbiol 7(7), 275-281).

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 첫번째 목적은 열안정성 및 내산성이 증대된 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체를 제공하는 것이다.

본 발명의 두번째 목적은 전기 돌연변이체를 암호화하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 세번째 목적은 전기 돌연변이체의 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본발명의 네번째 목적은 상기 본 발명의 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체를 제공한다.

본 발명의 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산서열을 가진 것을 특징으로 한다. 또, 서열번호 1의 아미노산서열에 대해서, 이들 아미노산서열을 가진 단백질이 표시하는 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체의 효소 활성이 손상되지 않는 범위 내에서, 1이상의 아미노산의 결실, 치환 및 부가의 적어도 1종의 변이가 도입된 변이 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체도 본 발명에 관한 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체에 포함된다.

또, 본 발명에는 서열번호 1의 아미노산서열을 가진 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체를 코딩하는 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체 유전자가 포함되고, 그 유전자서열로서는 서열번호 2로 표시되는 것을 들 수 있다. 또, 이들 서열번호 2의 염기서열을 변이시켜서 얻게 되는 상기한 변이 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체를 코딩하는 변이 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체 유전자도 본 발명에 관한 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체 유전자에 포함된다.

또, 본 발명에는, 상기 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터에 의해서 형질전환된 형질전환체가 포함된다. 또한, 본 발명에는, 이 형질전환체를 배양하여, 얻게 되는 배양물로부터 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체를 분리하는 것을 특징으로 하는 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체의 제조방법이 포함된다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체는 클로스트리디움 셀룰로보란스의 균체로부터 분리된 것이다. 먼저, 엔도글루칸아제-디 유전자를 가진 균주로부터 염색체 DNA를 취득한다. 염색체 DNA의 분리방법은 공지의 방법을 사용할 수 있다.

예를 들면, 클로스트리디움 셀룰로보란스 균주를 LB배지, 또는 M9배지에 적당한 탄소원을 첨가한 것 등에서 배양한 후, 예를 들면, 마머(Marmer)등의 방법(Journal of Molecular Biology, 3권, 208페이지, 1961년) 등에 의해 염색체 DNA를 조제한다. 이 방법에 의해 얻게 된 염색체 DNA를 적당한 제한효소(예를 들면 Sau3AI 등) 를 사용해서 분해하고, 적당한 단편길이를 가진 분해물에 대해서, 이들을 연결가능한 제한효소(예를 들면 BamHI 등)로 절단한 벡터에 연결하여, 유전자 라이브러리를 제작한다. 여기서의 적당한 단편 길이란, 통상의 플라스미드벡터를 사용할 때는 4000～25000염기쌍 정도, 코스미드 또는 파지(phage)벡터를 사용할 때는 15000～30000의 염기쌍정도이다. 적당한 길이의 DNA단편을 분리하여 취하는 방법으로서는, 자당밀도구배를 사용하는 방법이나 아가로즈겔을 사용하는 방법(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory출판(1982년)) 등 공지의 방법을 사용하면 된다.

벡터는, 숙주미생물에 있어서 자율적으로 증식할 수 있는 파지벡터 또는 플라스미드벡터가 사용된다. 파지벡터 또는 코스미드벡터로서는, 예를 들면 pWE15, M13, λEMBL3, λEMBL4, λFIXII, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, Charon4A, Charon21A 등을 들 수 있고, 플라스미드벡터로서는, 예를 들면 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pET계 등을 들 수 있다. 그 외에, 대장균이나 슈도모나스속 등의 복수의 숙주미생물에서 자율적 증식이 가능한 벡터 등의 각종 셔틀벡터를 사용할 수도 있다. 이와 같은 벡터에 대해서도 상기와 마찬가지로 적당한 제한효소에 의해 절단함으로써 원하는 단편을 얻을 수 있다.

염색체 DNA단편과 벡터단편과의 연결은 DNA리가제를 사용하면 되고, 예를 들면 라이게이션 키트(타카라(주) 제품 등)를 사용해서 행할 수 있다. 이와 같이 해서 염색체 DNA단편과 벡터단편을 연결시켜, 여러 가지의 DNA단편을 함유하는 재조합 플라스미드의 혼합물(이하, "유전자 라이브러리"라 기재)을 제작한다. 여기서 유전자 라이브러리제작에 있어서는 적당한 길이의 염색체 DNA단편을 사용하는 방법 외에, 클로스트리디움 셀룰로보란스 균주로부터 mRNA를 추출정제하여, 역전사효소를 이용해서 cDNA단편을 합성하는 방법(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory출판, 1982년)을 이용할 수도 있다. 또, 유전자 라이브러리를, 대장균에 한번 형질전환 또는 형질도입한 후, 유전자 라이브러리를 대량으로 증폭하는 것도 가능하다(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory출판, 1982년).

숙주미생물에의 재조합벡터의 도입은, 공지의 방법에 의해 행한다. 예를 들면, 숙주미생물이 대장균인 경우, 염화칼슘법(Journal of Molecular Biology, 53권, 159페이지, 1970년), 염화루비듐법(Methods in Enzymology, 68권, 253페이지, 1979년)이나 일렉트로포레이션법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 184페이지, 1994년) 등을 이용할 수 있다. 또, 코스미드벡터나 파지벡터를 이용하는 경우의 형질도입에 대해서는 인비트로 패키징법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 571페이지, 1994년) 등을 사용할 수 있다. 그 외에, 접합전달에 의한 방법도 이용가능하다.

다음에, 클로스트리디움 셀룰로보란스 균주의 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체 유전자를 함유하는 DNA단편을 얻기 위한 프로브를 조제한다. 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체 유전자의 염기서열은 서열번호 2에 기재된 것과 같은 염기서열로부터 올리고뉴클레오타이드를 설계한다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면 아마샴-파머시아 바이오테크의 커스텀 합성 서비스 등을 이용해서 합성이 가능하다.

다음에, 설계한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하고, 클로스트리디움 셀룰로보란스 균주의 염색체 DNA를 주형으로 해서 폴리머라제 연쇄반응(이하, "PCR"이라 기재)을 행하여, 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체 유전자를 부분적으로 증폭한다. 이와 같이 해서 얻게 된 PCR증폭단편은 클로스트리디움 셀룰로보란스 균주의 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체 유전자에 100% 가까운 상동성을 가진 단편으로서, 콜로니하이브리디제이션을 행할 때의 프로브로서 높은 S/N비를 기대할 수 있는 동시에, 하이브리디제이션의 스트린전시(stringency)제어를 용이한 것으로 하는 것이 가능하다. 상기의 PCR증폭단편을 적당한 시약을 사용해서 표지하고, 상기 염색체 DNA라이브러리에 대해서 콜로니 하이브리디제이션을 행하여, 아라비노스 이성화효소 유전자를 선발한다(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 603페이지, 1994년).

상기의 어느 하나의 방법에 의해 선발된 대장균으로부터 알칼리법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 161페이지, 1994년)을 사용해서 플라스미드를 회수함으로써, 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체 유전자를 함유하는 DNA단편을 얻을 수 있다. 상기 DNA단편의 염기서열의 결정은, 예를 들면 생거법(Sanger's sequencing method)(Molecular Cloning, 2권, 133페이지,1989년) 등에 의해서 행하는 것이 가능하고, 염기서열 자동분석장치, 예를 들면 DNA시퀀서 377A(퍼킨 엘머) 등을 사용해서 다이프라이머법 또는 다이터미네이터법에 의해 행할 수 있다.

또한, 상기 방법에 의해 전체 염기서열을 결정한 후에는, 화학합성법, 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR법, 또는 상기 염기서열을 가진 DNA단편의 제한효소에 의한 분해 등의 임의의 방법에 의해 조제한 DNA단편을 프로브로 해서 하이브리다이즈 함으로써, 본 발명의 유전자를 얻는 것이 가능하다.

서열번호 2은 본 발명의 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체 유전자의 염기서열을, 서열번호 1에 상기 유전자가 코딩하는 아미노산서열을 표시하나, 앞서 설명한 바와 같이, 상기 아미노산서열을 가진 폴리펩티드가 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체 활성을 가지는 한, 몇 가지의, 예를 들면 1 또는 수개의 아미노산에 대해서 결실, 치환, 부가 등의 변이가 있어도 된다. 또, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 아미노산을 코딩하는 염기서열을 가진 것에 첨가하여, 축중코돈에 있어서만 상이한 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 축중이성체도 포함한다. 여기서 결실, 치환, 부가 등의 변이는, 부위돌연변이 도입방법(Current Protocols in Molecular Biology 1권, 811페이지, 1994년) 등에 의해 도입가능하다.

본 발명의 형질전환된 미생물은, 본 발명의 재조합벡터를, 상기 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주속에 도입함으로써 얻게 된다. 숙주로서는, 에셰리키아(Esherichia)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 랄스토니아(Ralstonia)속, 알칼리게네스(Alcaligenes)속, 코마모나스(Comamonas)속, 버크홀데리아(Burkholderia)속, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 플라보박테리움(Flabobacterium)속, 비브리오(Vibrio)속, 엔테로박터(Enterobacter)속, 리조비움(Rhizobium)속, 글루코노박터(Gluconobacter)속, 아시네토박터(Acinetobacter)속, 모라셀라(Moraxella)속, 니트로조모나스(Nitrosomonas)속, 아에로모나스(Aeromonas)속, 파라코커스(Paracoccus)속, 바실루스(Bacillus)속, 클로스트리디움(Clostridium)속, 락토바실루스(Lactobacillus)속, 코리네박테리 움(Corynebacterium)속, 아르트로박터(Arthrobacter)속, 아크로모박터(Achromobacter)속, 미크로코커스(Micrococcus)속, 마이코박테리움(Mycobacterium)속, 스트렙토코커스(Streptococcus)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 악티노마이세스(Actinomyces)속, 노카르디아(Nocardia)속, 메틸로박테리움 (Methylobacterium)속 등의 각종 세균을 들 수 있다. 또, 상기 세균 이외에, 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 칸디다(Candida)속 등의 효모, 또한 각종 곰팡이 등을 숙주로서 들 수 있다.

예를 들면 대장균 등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우는, 본 발명에 관한 재조합벡터는, 그 자신이 숙주속에서 자율복제가능한 동시에, 프로모터, 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체 유전자를 함유하는 DNA 및 전사종결서열 등의 발현에 필요한 구성을 가진 것임이 바람직하다. 본 발명에 사용된 발현벡터로서는 pETEGD를 사용하였으나 상기의 요건을 만족하는 발현벡터이면 어느 것이나 사용가능하다.

프로모터는, 숙주속에서 발현할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용가능하고, 예를 들면, trp프로모터, trc프로모터, tac프로모터, lac프로모터, PL프로모터, PR프로모터, T7프로모터, T3프로모터 등의 대장균이나 파지 등에 유래하는 프로모터를 사용할 수 있다. 세균에의 재조합 DNA의 도입방법으로서는, 상기한 염화칼슘법이나 일렉트로포레이션법 등이 이용가능하다.

효모를 숙주로서 사용하는 경우는, 발현벡터로서, 예를 들면 YEp13, YCp50, pRS계, pYEX계 벡터 등이 이용가능하다. 프로모터로서는, 예를 들면 GAL프로모터, AOD프로모터 등을 사용할 수 있다. 효모에의 재조합체 DNA의 도입방법으로서

는, 예를 들면 일렉트로포레이션법(Method Enzymol., 194, 182-187(1990)), 스페로플라스트법(Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 84, 1929-1933(1978)), 아세트산리튬법(J. Bacteriol., 153, 163-168(1983)) 등이 이용가능하다.

또, 재조합벡터에는, 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 또는, 균체밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자 등을 또 가진 것도 가능하다.

본 발명에 관한 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체의 제조는, 예를 들면, 이것을 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물(배양균체 또는 배양상청액)속에 유전자 산물인 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체를 생성축적시켜, 배양물로부터 취득함으로써 행하여진다.

본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다.

또 배양방법은, 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등, 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다.대장균 등의 세균을 숙주로 해서 얻게 된 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 완전배지 또는 합성배지, 예를 들면 LB배지,M9배지 등을 들 수 있다. 또, 배양온도는 상기 언급한 적온의 범위에서 배양함으로써 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체를 균체 내에 축적시키고, 회수한다.

탄소원은 미생물의 증식에 필요하고, 예를 들면 글루코스, 프럭토스, 슈크로 스, 말토스, 갈락토스, 전분 등의 당류; 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급알콜류; 글리세롤 등의 다가알콜류; 아세트산, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 락트산, 글루콘산 등의 유기산; 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산 등의 지방산 등을 이용할 수 있다.

질소원으로서는, 예를 들면 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄등의 암모늄염 외에, 펩톤, 고기즙, 효모엑기스,맥아엑기스, 카제인분해물, 옥수수 침지액 등의 천연물유래의 것을 들 수 있다. 또, 무기물로서는, 예를 들면 인산제 1칼륨,인산제 2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨 등을 들 수 있다. 배양액에, 카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가해도 된다.

또, 프로모터가 유도성의 발현벡터를 사용해서 형질전환한 미생물을 배양하는 경우는, 프로모터의 종류에 적합한 유도물질을 배지에 첨가하면 된다. 예를 들면, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 테트라사이클린, 인돌아크릴산

(IAA) 등을 유도물질로서 들 수 있다.

엔도글루칸아제-디의 돌연변이체의 취득 및 정제는, 얻게 되는 배양물중으로부터, 균체 또는 상청액을 원심 회수하여, 균체파쇄, 추출, 친화성크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피, 겔여과 등을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 행할 수 있다.

얻게 된 정제물질이 목적의 효소인 것의 확인은, 통상의 방법, 예를 들면 SDS-폴리아크릴아미드겔전기영동, 웨스턴블로팅등에 의해 행할 수 있다.

또한, 숙주로서 미생물을 사용한 형질전환체의 배양, 형질전환체에 의한 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체의 생산과 균체내에의 축적, 및, 균체로부터의 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체의 회수는, 상기의 방법에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 돌연변이체는 내산성 및/또는 내열성을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명은 또한 상기의 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체의 유전자를 포함하는 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 클로스트리디움 셀룰로보란스(Clostridium cellulovorans) 유래의 내산성 엔도글루칸아제-디와 내열성이 있는 균주 클로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum)의 엔도글루칸아제-이를 혼합하여서 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 클로스트리디움 셀룰로보란스(Clostridium cellulovorans) 유래의 내산성 엔도글루칸아제-디는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니하고, 상기 클로스트리디움 셀룰로보란스(Clostridium cellulovorans) 유래의 내산성 엔도글루칸아제-디는 서열번호 4에 기재된 염기 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 클로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum)의 엔도글루칸아제-이는 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하고, 상기 클로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum)의 엔도글루칸아제-이는 서열번호 6에 기재된 염기 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 제조방법은 엇갈린 연장과정을 통하여 이루어지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다. "엇갈린 연장 과정(staggered extnesion process)"이란 "StEP"이라고도 하며, 1998년 Zhao, H.et al. (Nat Biotechnol. 16(3): 258-61 (1998); US 6,177, 263)에 의해 개발된 방법으로, 이 방법은 주형 서열(들)을 프라이밍한 후, 변성 사이클을 반복하고 극히 단축된 아닐링/중합효소-촉매작용 연장을 행하는 것으로 각 사이클에서, 성장하는 단편 중 일부가 서열 상보성에 기초하여 상이한 주형과 아닐링하고 추가로 연장되는 방법이다. 주형 교환(template switching)으로 인해, 셔플링된 폴리뉴클레오티드는 상이한 모 서열로부터의 서열 정보를 함유하므로 상기 방법은 폴리뉴클레오티드 서열의 재조합 및 시험관내 돌연변이 모두에 유효한 것으로 입증되었다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명자들은 생물공정에 다양하게 응용할 수 있는 열안정성이 향상된 셀룰라아제 변이체를 제조하기 위하여 클로스트리디움 셀룰로보란스로 부터의 엔도글루칸아제-디와 그와 다른 종인 호열성섬유소 분해균 클로스트리듐 써모쎌륨으로부터의 상동성이 높고 내열성이 있는 엔도 글루칸아제-이를 혼합하여 열안전성이 높은 돌연변이체를 유발시킨 후 대장균에 도입시킴으로써 열안전성이 야생형에 비해 향상된 돌연변이체를 제조 할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명자들은 StEP 방법을 사용하여 클로스트리디움 셀룰로보란스로부터의 엔도글루칸아제-디와 그와 다른종인 호열성섬유소 분해균 클로스트리듐 써모쎌륨 엔도글루칸아제-이로부터의 상동성이 높고 내열성이 있는 엔도 글루칸아제를 혼합하여 엔도글루칸아제의 돌연변이체인 EGD를 제작하였으며 이는 열에 대한 안정성이 향상되었을 뿐만 아니라, 고온에서의 효소활성 자체도 증가하는 것을 확인하였다.

따라서 본 발명의 목적은 상기와 같은 사실을 감안하여 열안정성이 증대된 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체 EGD, 이를 암호화하는 유전자, 전기 돌연변이체 의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환 된 미생물 및 엔도글루칸아제 디의 돌연변이체 EGD를 제작하는 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서로 다른 두종의 엔도글루칸아제를 혼합하여 열안정성을 가지는 엔도글루칸아제-디의 돌연변이 EGD에 관한 것이다.

본 발명자들은 클로스트리디움 셀룰로보란스로부터 유래한 엔도글루칸아제-디와 클로스트리디움 써모셀럼으로부터 유래한 엔도글루칸아제-이의 촉매활성 부위(CAD)를 PCR로 증폭하여 얻어낸 유전자로 StEP 반응을 진행하여 제한효소 XhoI과 BamHI으로 절단한 후에, 엔도글루칸아제의 돌연변이체의 발현에 효율적인 벡터인 pET25b에 접합시켜, 재조합 플라스미드를 작제하였다. 이를 이용하여 DNA 염기서열을 분석하였고 이 유전자로부터 번역이 되는 단백질의 아미노산 서열을 분석함으로써 지금까지 와는 다른 엔도글루칸아제 돌연변이체를 분리하는데 성공하였다.(실시예1)

본 발명에 있어서, 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체인 EGD의 아미노산 서열 과 염기서열을 각각 서열번호 1, 서열번호 2로 표시하였다.

가장 바람직하게는, 서열번호 2의 유전자 염기서열은 1,452bp의 길이로, GC(Guanine+Cytosine) 함량은 36.84%다.

또다른 양태로서, 본 발명은 상기 엔도-클루칸아제-디의 돌연변이체 EGD를 인코딩하는 상술한 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 본 발명의 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체인 EGD의 유전자를 포함하는 어떠한 재조합 벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 도4의 개열지도를 갖는 pETEGD인 것을 특징으로 한다. 상기 pET25b 벡터는 히스티딘을 결합시킨 재조합 효소 단백질을 과 발현 시킬 수 있으며 정제가 용이하다(실시예1).

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환 된 균주를 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 예컨데 대장균 DH5a, XL1-Blue, BL21, JM109등을 이용할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 재조합 벡터 pET25b를 대장균 JM109(DE3)에 형질 전환하여 재조합 균주를 얻었다(실시예1).

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 균주를 배양하여 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체인 EGD 효소를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에서는 서로 다른 두 종의 엔도클루칸아제를 StEP으로 돌연변이 시킨 후 이 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환 된 균주를 배양한 뒤 , 상 기 배양액을 원심분리하여 균체를 회수한 뒤 세포를 파쇄시켜, 파쇄된 세포용액을 이용하여 재조합된 엔도글루칸아제 EGD를 얻었으며, 이렇게 분리된 조효소액을 니켈-니트로아세트산 아가로스 수지 (nickel-nitrotriacetic acid agarose resin)를 이용하여 정제하여 본 발명에 따른 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체 EGD를 생산할 수 있었다(실시예4).

본 발명은 클로스트리디움 셀룰로보란스로부터 유래한 엔도글루칸아제-디와 클로스트리디움 써모셀럼부터 유래한 엔도글루칸아제-이를 StEP방법을 이용하여 변이(mutation)을 통해 열안정성을 증가시켜 산업적으로 유용한 단백질 개발을 목적으로 하였다. 본 발명을 통해 생산된 EGD 53.3kDa으로 측정이 되었으며 50℃에서 가장 높은 효소 활성을 가졌다. 아미노산 분석 결과 엔도 글루칸아제 EGD의 경우, 157번째, 158번째 아미노산 서열이 각각 L(Leucine)에서 N(Asparagine)으로, Q(Glutamine)에서 E(Glutamic acid)로 치환된 돌연변이체임을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 이 효소 단백질이 효소활성을 증대시키면서, 열 안정성을 증가시킨다고 결론 내릴 수 있었다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 셀룰로오스 분해 효소인 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체로서 내열성 및 내산성을 가지는 엔도 글루칸아제 EGD, 그를 암호화하는 유전자, 전기 돌연변이체의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환 된 미생물 및 그로부터 엔도글루칸아제의 돌연변이체를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체는 내열성 및 내산성을 가지며 야생형의 엔도글루칸아제-디에 비하여 효소의 안정성과 활성이 증가하였으므로, 이러한 특성은 생물공정 뿐만 아니라, 식품산업, 바이오소재산업, 그리고 바이오 에너지산업등의 매우 광범위한 응용성을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 돌연변이 엔도글루칸아제 라이브러리의 제조

클로스트리디움 셀룰로보란스로부터 유래한 엔도글루칸아제-디와 클로스트리디움 써모셀럼으로부터 유래한 엔도글루칸아제-이의 촉매활성 부위(CAD)를 증폭하기 위해 중합효소 연쇄반응(PCR)을 진행하였다.

PCR 반응액은 각각 0.1 μM의 N 말단 프라이머(5'GGA TCC GTC TAC TGC TTT TAC AGG TGT ACG T-3'(서열번호 7), 5'GGA TCC GTC GGG AAC AAA GCT TTT G-3'(서열번호 8)) 및 C 말단 프라이머(5'CTC GAG TTT TAC TGT GCA TTC AGT ACC AT-3'(서열번호 9), 5'CTC GAG TAT TGA GCG CAG TAG ATA TTT TTT-3'(서열번호 10), 주형 으로서는 재조합 플라스미드 pET25b EngD(Novagen pET25b 플라스미드를 산업적으로 변형), pET25b EgE(Novagen pET25b 플라스미드를 산업적으로 변형) 100ng, 20mM 트 리스 완충액 (Tris-HCl, pH 8.3), 10mM KCl, 2mM MgSO₄ , 0.1mM MnCl₂ , 0.25mM dNTP mixture 및 Taq 중합효소 5 효소단위(unit)를 포함하도록 100㎕를 조제하였다. 이어, 전기 반응액을 94℃, 30초(첫번째 사이클에서는 10분), 68℃, 30초, 72℃, 1분(마지막 사이클에서는 7분) 의 조건으로 PCR을 25회 수행하였다. 상기와 같이 증폭된 PCR 산물들은 한천 겔 전기영동법을 통해 분리하였고 이후, 각각의 결과 유전자로 StEP 반응을 진행하였다. 반응액은 각각 125ng의 DNA와 0.4 Μm 프라이머, 0.2Mm dNTP, 2.5Mm MgCl₂, 10Mm Tris-HCl buffer(pH 9.0), 50Mm KCl, 0.1% Triton X-100 and 5U 중합효소를 포함했으며 이어 반응액을 94℃ 30초(초기 사이클에서는 95℃ 5분), 55℃ 5초 40회 반복하고 72℃ 5분동안 PCR반응을 수행하였다.

상기와 같이 산물들은 한천 겔 전기영동법을 통해 분리되었고, 엔도글루칸아제-디의 셀룰로오즈 결합도메인(CBD)를 결합시키기 위해 Overlap PCR을 실시하였다. 반응액은 각각100ng의 주형DNA와 400nM의 프라이머와 1.25U의 중합효소, 50mMKCl, 1.5mM MgCl₂, 10mM Tris-HCl을 포함한다.

전기 반응액을 94℃, 30초(첫번째 사이클에서는 95℃ 5분), 56℃, 30초, 72℃, 30분(마지막 사이클에서는 5분)의 조건으로 PCR을 30회 수행하였다.

증폭된 DNA단편은 한천 겔 전기영동법을 통해 분리되었고 분리된 DNA 단편을 제한효소 XhoI과 BamHI으로 절단한 후에, 엔도글루칸아제의 돌연변이체의 발현에 효율적인 벡터인 pET25b에 접합시켜, 재조합 플라스미드를 작제하였다. 이 플라스미드는 유전자 복제와 단백질 발현에 효과적인 숙주세포인 JM109(DE3)에 형질전환 되었다.

실시예 2: 엔도글루칸아제 돌연변이체의 탐색

실시예 1에서 제조된 엔도글루칸아제 돌연변이체의 라이브러리는 0.5% 박토 트립톤, 1% 효모 추출물, 1% NaCl, 1.5% 아가를 포함하는 LB 평판배지에 도말하였다. 대장균체가 성장하면 평판배지위에 0.5% 카르복시메틸셀룰로오즈 (CMC), 0.8% 아가를 포함하는 평판배지를 분주하여 건조한 후 내열성 돌연변이체 엔도글루칸아제를 탐색하기 위하여, 상기 과정을 거친 페트리디쉬(Petri dish)를 65℃이상의 고온에서 6시간동안 방치함으로써 열처리 과정을 수행하였다. 고온 열처리가 끝난 평판배지 상의 돌연변이체 라이브러리는 투명원형지대(halo)를 작은 크기로 나타내는 야생형 셀룰라아제와 비교하여 투명원형지대를 나타내는 효소활성이 유지된 돌연변이체를 선별하였다.

실시예 3: 엔도글루칸아제의 돌연변이체를 암호화하는 유전자의 염기서열 결정

돌연변이체인 EGD를 야생형의 엔도글루칸아제-디의 아미노산 서열과 비교하였을 경우, 2개의 아미노산이 변환된 새로운 아미노산 배열을 갖는 단백질임을 확인할 수 있었다. 즉, 돌연변이체인 EGD의 경우, 157번째, 158번째 아미노산 서열이 각각 L(Leucine)에서 N(Asparagine)으로 Q(Glutamine)에서 E(Glutamic acid)로 치환된 돌연변이체임을 확인할 수 있었다.

상술한 아미노산 서열 및 셀룰라아제 활성 탐색 방법에 의하여, 본 발명의 돌연변이체인 EGD는 아미노산 배열이 기존의 엔도글루칸아제와 상이할 뿐만 아니라 고온에서 안정성을 갖는 엔도글루칸아제의 돌연변이체임을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 재조합 엔도글루칸아제 돌연변이체의 생산과 정제

단백질 발현 벡터인 pETEGD는 내열성 엔도글루칸아제에 Histidine-tag을 가지도록 고안되었으며 지속적인 내열성 단백질 발현이 가능하도록 작제되었는 바, 이를 이용하여 대장균(Escherichia coli) JM109(DE3)을 형질전환시켰다.

Histidine-tag은 내열성 단백질의 정제를 용이하게 하기 위함이었으며,니켈-니트로아세트산 아가로스 수지(nickel-nitrotriacetic acid agarose resin)을 이용하였을 때 한번에 단백질 정제가 가능하였다. 각각의 재조합 대장균 JM109/pETEGD를 0.5% 트립톤, 1% 효모 추출물, 1% NaCl, 1.5% 아가를 포함하는 LB액체 배지에 배양하였다. 이어, 균체 농도가 약 O.D600 = 3.5에 이르렀을 때 IPTG를 첨가하여 계속 배양하여 내열성 엔도글루칸아제의 돌연변이체가 지속적으로 발현되게 한 후, 8000rpm으로 15분 동안 원심분리하여 균체를 회수하였다.

전기 회수된 재조합 대장균 균체를 pH 8.0의 50mM 인산염 나트륨 완충용액(sodium phosphate, 300mM NaCl, 10mM 이미다졸(imidazole))이 포함된 세포용해완충액 (cell lysis buffer)으로 현탁시켜 초음파 파쇄한 후, 이를 원심분리하여 수득한 상등액을 니켈-니트로트리아세트산 아가로스 수지에 흡착시켰다. 그런 다 음, 수회에 걸쳐 세척완충액(washing buffer)으로 세척한 후, 250mM의 이미다졸이 포함된 용액으로 내열성 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체를 용출시켰다.

실시예 5: 돌연변이체의 고온에서의 안정성 및 효소활성 평가

엔도글루칸아제 효소활성은 효소에 의해 환원당을 DNS법에 의하여, 흡광 마이크로 플레이트를 이용하여 37℃에서 효소반응을 수행함으로써 측정되었다.

즉, CMC 포함된 효소반응액을 기질로 하여 엔도글루칸아제 효소액을 첨가하여 측정하였다. 이때, 엔도글루칸아제의 효소활성은 1분당 1μmole의 글루코즈(glucose)가 생성될 때의 효소활성을 1단위활성(unit)으로 정의하였다.

고온에서의 안정성은 실시예 4에서 분리한 내열성 엔도글루칸아제를 이용하여 측정하였다. 정제된 효소를 각각 50mM 인산염 완충액(sodium phosphate buffer, pH 8.0)에 동일한 농도로 희석한 후, 30℃에서 80℃까지 매 10℃간격의 지시된 온도에서 20분간 방치하였다.

산성에서의 안정성 역시 실시예 4에서 분리한 내열성 엔도글루칸아제를 이용하여 측정하였다. 정제된 효소를 각각 50mM 인산염 완충액(sodium phosphate buffer, pH 6.0)에 동일한 농도로 희석한 후, pH 2에서 pH 12까지 매 pH 1간격의 지시된 pH에서 30분간 방치하였다.

도 6은 본 발명의 내열성을 갖는 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체인 EGD의 열안정성을 효소활성(%)으로 나타낸 그래프이다: 이때, ■는 기존의 야생형 엔도글루칸아제의 효소활성을, ◆ 신규한 돌연변이체인 EGD의 효소활성을 나타낸다. 도 6에서 보듯이, 최초 활성의 50%가 감소할 때의 온도를 보면 EGD는 52℃에서 65℃로 13℃ 증가하였다. 따라서, 인위적 분자진화에 의해 얻어낸 엔도글루칸아제-디의 돌 연변이체인 EGD는 야생형의 엔도글루칸아제-디에 비해 열에 대해 훨씬 더 안정적인 특성을 가지고 있음이 확인되었다.

또한 도 7에서는 본 발명의 내열성을 갖는 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체인 EGD가 다양한 pH에서 야생형의 엔도글루칸아제-디보다 안정적인 특성을 보인다. 특히, 산성에서의 활성이 야생형보다 높음이 확인되었다.

또한 도 8에서는 본 발명의 내열성을 갖는 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체인 EGC의 효소활성을 나타낸다. 효소활성을 나타내는 kcat/Km 값을 통해 야생형 엔도글루칸아제-디에 비해 효소의 활성이 높음이 확인되었다.

도 1은 본 발명에서 내열성을 갖는 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체를 제조하는 과정을 개략적으로 도시한 그림이며,

도 2는 본 발명의 내열성을 갖는 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체의 선별을 위하여 열처리한 후 투명원형지대(halo)를 통해 선별한 그림이며, 도 2에서 좌측편부터 우측으로 (A) EgE (B) EngD (C) 돌연변이체이고,

도 3은 본 발명의 내열성을 갖는 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체 EGD를 최종적으로 선별하여 열처리 후 야생형의 엔도글루칸아제-디와 비교한 것을 투명원형지대(halo)를 통해 나타낸 그림이며, 좌측은 투명원형지대 (A) EngD이고 우측은 (B) 돌연변이체를 나타낸다.

도 4는 본 발명의 내열성을 갖는 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체 EGD의 유전자를 함유하는 발현벡터인 pETEGD를 나타내는 그림이며,

도 5는 본 발명의 내열성을 갖는 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체 EGD를 포함하는 단백질의 발현을 나타내는 그림이며, 레인 1: EGD 유도 전이고, 레인2: EGD 유도 후를 나타낸다.

도 6은 본 발명의 내열성을 갖는 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체인 EGD의 열안정성을 나타내는 그래프이며

도 7은 본 발명의 내열성을 갖는 엔도클루칸아제-디의 돌연변이체인 EGD의 내산성을 나타내는 그래프이며,

도 8은 본 발명의 내열성을 갖는 엔도클루칸아제-디의 돌연변이체인 EGD의 효소 활성을 측정한 표이다.

<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> A endo-beta-1,4-glucanase D mutant with an improved thermostability and acid-resistance and the preparation method <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 484 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> endo-beta-1,4-glucanase D mutant <400> 1 Ser Thr Ala Phe Thr Gly Val Arg Asp Val Pro Ala Gln Gln Ile Val 1 5 10 15 Asn Glu Met Lys Val Gly Trp Asn Leu Gly Asn Thr Met Asp Ala Ile 20 25 30 Gly Gly Glu Thr Asn Trp Gly Asn Pro Met Thr Thr His Ala Met Ile 35 40 45 Asn Lys Ile Lys Glu Ala Gly Phe Asn Thr Leu Arg Leu Pro Val Thr 50 55 60 Trp Asp Gly His Met Gly Ala Ala Pro Glu Tyr Thr Ile Asp Gln Thr 65 70 75 80 Trp Met Lys Arg Val Glu Glu Ile Ala Asn Tyr Ala Phe Asp Asn Asp 85 90 95 Met Tyr Val Ile Ile Asn Leu His His Glu Asn Glu Trp Leu Lys Pro 100 105 110 Phe Tyr Ala Asn Glu Ala Gln Val Lys Ala Gln Leu Thr Lys Val Trp 115 120 125 Thr Gln Ile Ala Asn Asn Phe Lys Lys Tyr Gly Asp His Leu Ile Phe 130 135 140 Glu Thr Met Asn Glu Pro Arg Pro Val Gly Ala Ser Asn Glu Trp Thr 145 150 155 160 Gly Gly Ser Tyr Glu Asn Arg Glu Val Val Asn Arg Tyr Asn Leu Thr 165 170 175 Ala Val Asn Ala Ile Arg Ala Thr Gly Gly Asn Asn Ala Thr Arg Tyr 180 185 190 Ile Met Val Pro Thr Leu Ala Ala Ser Ala Met Ser Thr Thr Ile Asn 195 200 205 Asp Leu Val Ile Pro Asn Asn Asp Ser Lys Val Ile Val Ser Leu His 210 215 220 Met Tyr Ser Pro Tyr Phe Phe Ala Met Asp Ile Asn Gly Thr Ser Ser 225 230 235 240 Trp Gly Ser Asp Tyr Asp Lys Ser Ser Leu Asp Ser Glu Phe Asp Ala 245 250 255 Val Tyr Asn Lys Phe Val Lys Asn Gly Arg Ala Val Val Ile Gly Glu 260 265 270 Met Gly Ser Ile Asn Lys Asn Asn Thr Ala Ala Arg Val Thr His Ala 275 280 285 Glu Tyr Tyr Ala Lys Ser Ala Lys Ala Arg Gly Leu Thr Pro Ile Trp 290 295 300 Trp Asp Asn Gly Tyr Ser Val Ala Gly Lys Ala Glu Thr Phe Gly Ile 305 310 315 320 Phe Asn Arg Ser Asn Leu Thr Trp Asp Ala Pro Glu Val Met Lys Ala 325 330 335 Phe Ile Lys Gly Ile Gly Gly Ser Ser Thr Thr Thr Pro Thr Thr Pro 340 345 350 Thr Thr Pro Thr Thr Pro Thr Thr Pro Thr Thr Pro Thr Thr Pro Thr 355 360 365 Thr Pro Thr Thr Pro Thr Thr Pro Gln Ser Ala Val Glu Val Thr Tyr 370 375 380 Ala Ile Thr Asn Ser Trp Gly Ser Gly Ala Ser Val Asn Val Thr Ile 385 390 395 400 Lys Asn Asn Gly Thr Thr Pro Ile Asn Gly Trp Thr Leu Lys Trp Thr 405 410 415 Met Pro Ile Asn Gln Thr Ile Thr Asn Met Trp Ser Ala Ser Phe Val 420 425 430 Ala Ser Gly Thr Thr Leu Ser Val Thr Asn Ala Gly Tyr Asn Gly Thr 435 440 445 Ile Ala Ala Asn Gly Gly Thr Gln Ser Phe Gly Phe Asn Ile Asn Tyr 450 455 460 Ser Gly Val Leu Ser Lys Pro Thr Gly Phe Thr Val Asn Gly Thr Glu 465 470 475 480 Cys Thr Val Lys <210> 2 <211> 1452 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> endo-beta-1,4-glucanase D mutant <400> 2 tctactgctt ttacaggtgt acgtgacgta ccagcacaac agattgttaa tgaaatgaag 60 gttggttgga atttaggaaa tacaatggat gccataggtg gagaaactaa ctggggaaat 120 cctatgacaa ctcacgctat gattaataaa attaaagaag caggctttaa tactttaaga 180 cttccagtaa cttgggatgg tcatatggga gcagcacctg aatatactat cgatcaaaca 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caacaacacc aacaacacca acgacaccta caacaccaca atcagcagtt 1140 gaggttacat atgctattac aaatagttgg ggatcaggag cttctgttaa tgtaacaata 1200 aagaacaatg gtacaacacc tattaatgga tggacattaa agtggacaat gcctattaac 1260 caaactataa caaatatgtg gagtgctagt tttgtagcaa gtggaactac tttatcagta 1320 actaacgcag gttataatgg tacaatagca gctaacggag gtactcaaag ctttggcttc 1380 aatataaact atagtggagt attaagcaaa ccaactgggt tcacagtgaa tggtactgaa 1440 tgcacagtaa aa 1452 <210> 3 <211> 484 <212> PRT <213> Clostridium cellulovorans <400> 3 Ser Thr Ala Phe Thr Gly Val Arg Asp Val Pro Ala Gln Gln Ile Val 1 5 10 15 Asn Glu Met Lys Val Gly Trp Asn Leu Gly Asn Thr Met Asp Ala Ile 20 25 30 Gly Gly Glu Thr Asn Trp Gly Asn Pro Met Thr Thr His Ala Met Ile 35 40 45 Asn Lys Ile Lys Glu Ala Gly Phe Asn Thr Leu Arg Leu Pro Val Thr 50 55 60 Trp Asp Gly His Met Gly Ala Ala Pro Glu Tyr Thr Ile Asp Gln Thr 65 70 75 80 Trp Met Lys Arg Val Glu Glu Ile Ala Asn Tyr Ala Phe Asp Asn Asp 85 90 95 Met Tyr Val Ile Ile Asn Leu His His Glu Asn Glu Trp Leu Lys Pro 100 105 110 Phe Tyr Ala Asn Glu Ala Gln Val Lys Ala Gln Leu Thr Lys Val Trp 115 120 125 Thr Gln Ile Ala Asn Asn Phe Lys Lys Tyr Gly Asp His Leu Ile Phe 130 135 140 Glu Thr Met Asn Glu Pro Arg Pro Val Gly Ala Ser Leu Gln Trp Thr 145 150 155 160 Gly Gly Ser Tyr Glu Asn Arg Glu Val Val Asn Arg Tyr Asn Leu Thr 165 170 175 Ala Val Asn Ala Ile Arg Ala Thr Gly Gly Asn Asn Ala Thr Arg Tyr 180 185 190 Ile Met Val Pro Thr Leu Ala Ala Ser Ala Met Ser Thr Thr Ile Asn 195 200 205 Asp Leu Val Ile Pro Asn Asn Asp Ser Lys Val Ile Val Ser Leu His 210 215 220 Met Tyr Ser Pro Tyr Phe Phe Ala Met Asp Ile Asn Gly Thr Ser Ser 225 230 235 240 Trp Gly Ser Asp Tyr Asp Lys Ser Ser Leu Asp Ser Glu Phe Asp Ala 245 250 255 Val Tyr Asn Lys Phe Val Lys Asn Gly Arg Ala Val Val Ile Gly Glu 260 265 270 Met Gly Ser Ile Asn Lys Asn Asn Thr Ala Ala Arg Val Thr His Ala 275 280 285 Glu Tyr Tyr Ala Lys Ser Ala Lys Ala Arg Gly Leu Thr Pro Ile Trp 290 295 300 Trp Asp Asn Gly Tyr Ser Val Ala Gly Lys Ala Glu Thr Phe Gly Ile 305 310 315 320 Phe Asn Arg Ser Asn Leu Thr Trp Asp Ala Pro Glu Val Met Lys Ala 325 330 335 Phe Ile Lys Gly Ile Gly Gly Ser Ser Thr Thr Thr Pro Thr Thr Pro 340 345 350 Thr Thr Pro Thr Thr Pro Thr Thr Pro Thr Thr Pro Thr Thr Pro Thr 355 360 365 Thr Pro Thr Thr Pro Thr Thr Pro Gln Ser Ala Val Glu Val Thr Tyr 370 375 380 Ala Ile Thr Asn Ser Trp Gly Ser Gly Ala Ser Val Asn Val Thr Ile 385 390 395 400 Lys Asn Asn Gly Thr Thr Pro Ile Asn Gly Trp Thr Leu Lys Trp Thr 405 410 415 Met Pro Ile Asn Gln Thr Ile Thr Asn Met Trp Ser Ala Ser Phe Val 420 425 430 Ala Ser Gly Thr Thr Leu Ser Val Thr Asn Ala Gly Tyr Asn Gly Thr 435 440 445 Ile Ala Ala Asn Gly Gly Thr Gln Ser Phe Gly Phe Asn Ile Asn Tyr 450 455 460 Ser Gly Val Leu Ser Lys Pro Thr Gly Phe Thr Val Asn Gly Thr Glu 465 470 475 480 Cys Thr Val Lys <210> 4 <211> 1452 <212> DNA <213> Clostridium cellulovorans <400> 4 tctactgctt ttacaggtgt acgtgacgta ccagcacaac agattgttaa tgaaatgaag 60 gttggttgga atttaggaaa tacaatggat gccataggtg gagaaactaa ctggggaaat 120 cctatgacaa ctcacgctat gattaataaa attaaagaag caggctttaa tactttaaga 180 cttccagtaa cttgggatgg tcatatggga gcagcacctg aatatactat cgatcaaaca 240 tggatgaaaa gagtagagga aatagcaaat tatgcttttg ataatgatat gtatgttatt 300 atcaatctcc atcatgagaa tgaatggctt aagcctttct acgcaaatga agctcaagta 360 aaagcgcaac ttacaaaagt ttggactcaa attgcaaata acttcaaaaa atatggtgat 420 catttaattt tcgaaacaat gaatgagcca agaccagtag gcgcttcgtt acagtggaca 480 ggcggttctt atgaaaatcg tgaagtagtt aatagatata atttaactgc tgtaaatgca 540 attagagcaa ctggaggaaa taacgcaaca agatatatca tggtaccaac tcttgcagct 600 tctgcgatga gtactacaat aaatgattta gtgattccaa ataacgatag caaagtcatc 660 gtatctttac atatgtattc accatatttc tttgctatgg atattaacgg aacatcatct 720 tggggaagtg attacgataa gagttcactt gattcagaat ttgatgctgt ttacaataag 780 tttgtgaaaa atggtagagc tgtagttatt ggtgaaatgg gctctattaa taaaaataat 840 acagctgcta gagtaactca tgcagaatat tatgctaagt cagcaaaagc tagaggactt 900 actcctatat ggtgggataa cggatattct gttgctggaa aagcagagac ttttggtata 960 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Lys 275 280 285 Asn Asn Leu Ser Ser Arg Val Ala His Ala Glu His Tyr Ala Arg Glu 290 295 300 Ala Val Ser Arg Gly Ile Ala Val Phe Trp Trp Asp Asn Gly Tyr Tyr 305 310 315 320 Asn Pro Gly Asp Ala Glu Thr Tyr Ala Leu Leu Asn Arg Lys Thr Leu 325 330 335 Ser Trp Tyr Tyr Pro Glu Ile Val Gln Ala Leu Met Arg Gly Ala Gly 340 345 350 Val Glu Pro Leu Val Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Leu Met Pro Thr 355 360 365 Pro Ser Pro Thr Val Thr Ala Asn Ile Leu Tyr Gly Asp Val Asn Gly 370 375 380 Asp Gly Lys Ile Asn Ser Thr Asp Cys Thr Met Leu Lys Arg Tyr Ile 385 390 395 400 Leu Arg Gly Ile Glu Glu Phe Pro Ser Pro Ser Gly Ile Ile Ala Ala 405 410 415 Asp Val Asn Ala Asp Leu Lys Ile Asn Ser Thr Asp Leu Val Leu Met 420 425 430 Lys Lys Tyr Leu Leu Arg Ser Ile 435 440 <210> 6 <211> 1320 <212> DNA <213> Clostridium thermocellum <400> 6 tcgggaacaa agcttttgga tgcaagcgga aacgagcttg taatgagggg catgcgtgat 60 atttcagcaa tagatttggt taaagaaata aaaatcggat ggaatttggg aaatactttg 120 gatgctccta cagagactgc ctggggaaat ccaaggacaa ccaaggcaat gatagaaaag 180 gtaagggaaa tgggctttaa tgccgtcaga gtgcctgtta cctgggatac gcacatcgga 240 cctgctccgg actataaaat tgacgaagca tggctgaaca gagttgagga agtggtaaac 300 tatgttcttg actgcggtat gtacgcgatc ataaatcttc accatgacaa tacatggatt 360 atacctacat atgccaatga gcaaaggagt aaagaaaaac ttgtaaaagt ttgggaacaa 420 atagcaaccc gttttaaaga ttatgacgac catttgttgt ttgagacaat gaacgaaccg 480 agagaagtag gttcacctat ggaatggatg ggcggaacgt atgaaaaccg agatgtgata 540 aacagattta atttggcggt tgttaatacc atcagagcaa gcggcggaaa taacgataaa 600 agattcatac tggttccgac caatgcggca accggcctgg atgttgcatt aaacgacctt 660 gtcattccga acaatgacag cagagtcata gtatccatac atgcttattc accgtatttc 720 tttgctatgg atgtcaacgg aacttcatat tggggaagtg actatgacaa ggcttctctt 780 acaagtgaac ttgatgctat ttacaacaga tttgtgaaaa acggaagggc tgtaattatc 840 ggagaattcg gaaccattga caagaacaac ctgtcttcaa gggtggctca tgccgagcac 900 tatgcaagag aagcagtttc aagaggaatt gctgttttct ggtgggataa cggctattac 960 aatccgggtg atgcagagac ttatgcattg ctgaacagaa aaactctctc atggtattat 1020 cctgaaattg tccaggctct tatgagaggt gccggcgttg aacctttagt ttcaccgact 1080 cctacaccta cattaatgcc gaccccctcg cccacggtga cagcaaatat tttgtacggt 1140 gacgtaaacg gggacggaaa aataaattct acagactgta caatgctaaa gagatatatt 1200 ttgcgtggca tagaagaatt cccaagtcct agcggaatta tagccgctga cgtaaatgcg 1260 gatctgaaaa tcaattccac cgacttggta ttgatgaaaa aatatctact gcgctcaata 1320 1320 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggatccgtct actgctttta caggtgtacg t 31 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggatccgtcg ggaacaaagc ttttg 25 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ctcgagtttt actgtgcatt cagtaccat 29 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ctcgagtatt gagcgcagta gatatttttt 30

Claims

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서열번호 4에 기재된 염기 서열을 가지는 클로스트리디움 셀룰로보란스(Clostridium cellulovorans) 유래의 내산성 엔도글루칸아제-디 유전자 및 서열번호 6에 기재된 염기 서열을 가지는 내열성이 있는 균주 클로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum)의 엔도글루칸아제-이 유전자를 대상으로 엇갈린 연장과정(staggered extnesion process)을 수행하여, 서열번호 2의 염기 서열을 가지며, 내산성 및 내열성 중 하나 이상의 특성을 가지는 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체를 제조하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 클로스트리디움 셀룰로보란스(Clostridium cellulovorans) 유래의 내산성 엔도글루칸아제-디는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 서열번호 2의 염기 서열을 가지며, 내산성 및 내열성 중 하나 이상의 특성을 가지는 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체를 제조하는 방법.
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제7항에 있어서, 상기 클로스트리디움 써모셀럼(Clostridium thermocellum)의 엔도글루칸아제-이는 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 서열번호 2의 염기 서열을 가지며, 내산성 및 내열성 중 하나 이상의 특성을 가지는 엔도글루칸아제-디의 돌연변이체를 제조하는 방법.
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