KR101418784B1

KR101418784B1 - 백색 부후균 유래의 재조합 자일로시다아제/아라비노퓨라노시다아제 다기능 효소의 고생산 방법

Info

Publication number: KR101418784B1
Application number: KR1020130012708A
Authority: KR
Inventors: 박승문; 김대혁; 권태호
Original assignee: (주)엔비엠; 전북대학교산학협력단
Priority date: 2013-02-05
Filing date: 2013-02-05
Publication date: 2014-07-11

Abstract

본 발명은 백색 부후균 유래의 재조합 자일로시다아제/아라비노퓨라노시다아제 다기능 효소의 고생산 방법에 관한 것으로, 백색 부후균 (Phanerochate chrysosporium) 유래의 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제 유전자가 형질전환된 효모 (Pichia pastoris)를 이용하여 사료 첨가제, 종이 제조, 세제 및 바이오 에너지 생산 등에 폭 넓게 이용할 수 있는 헤미셀룰로오스의 분해용 효소인 재조합 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제를 대량 생산할 수 있는 효과가 있다.

Description

백색 부후균 유래의 재조합 자일로시다아제/아라비노퓨라노시다아제 다기능 효소의 고생산 방법 {Method for high production of recombinant bifunctional xylosidase/arabinofuranosidase from Phanerochaete chrysosporium}

본 발명은 백색 부후균 유래의 재조합 자일로시다아제/아라비노퓨라노시다아제 다기능 효소의 고생산 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 백색 부후균 (Phanerochate chrysosporium) 유래의 β-자일로시다아제 (β-xylosidase)/α-L-아라비노퓨라노시다아제 (α-L-arabinofuranosidase) 단백질, 상기 단백질 코딩 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환되어 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제를 생산하는 숙주세포, 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 재조합 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제를 대량 생산하는 방법, 상기 방법에 의해 생산된 재조합 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제 단백질, 상기 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제 단백질을 유효성분으로 포함하는 자일란 (xylan) 분해 증진용 조성물, 상기 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제 단백질을 자일란에 처리하여 자일로오스를 생산하는 방법 및 상기 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제 단백질에 대한 항체에 관한 것이다.

헤미셀룰로오스는 주로 펜토오스 (자일로오스, 아라비노오스) 및 헥소오스 (글루코오스, 만노오스) 당으로 구성된 복합 다당류 구조를 포함하는데, 그들 중 가장 풍부한 것은 자일로오스이다. 헤미셀룰로오스의 완전한 가수분해를 위해서는 수많은 효소들의 공동 작용이 요구된다. 이들 효소에는 엔도-자일라나아제 (E.C 3.2.1.8), β-자일로시다아제 (E.C 3.2.1.37), 엔도-아라비나나아제 (E.C.3.2.1.99), α-L-아라비노퓨라노시다아제 (E.C 3.2.1.55), α-글루쿠로니다아제 (E.C 3.2.1.139), 엔도-만나나아제 (E.C 3.2.1.78), β-만노시다아제 (3.2.1.25), α-갈락토시다아제 (E.C 3.2.1.22), β-글루코시다아제 (E.C 3.2.1.21) 및 에스터라아제 (E.C.3.1.1.-)가 포함된다. 이들 중에서, 자일라나아제 및 β-자일로시다아제는 헤미셀룰로오스의 주요 구성요소인 자일란의 가수분해를 담당하는 결정적인 효소이다. 자일라나아제는 자일란의 주요 사슬 내부의 β-1,4 연결을 가수분해하여 짧은 자일로-올리고머 (xylo-oligomer)를 만들고, 여기서 β-자일로시다아제가 자일로-올리고머를 절단하여 자일로오스의 단일 단위체를 방출한다 (Juturu and Wu, Biotechnol Adv, 30, 1219-1227 (2012)).

β-자일로시다아제는 그들의 아미노산 서열 유사성 및 생화학적 특성을 기준으로 글리코시드 히드롤라아제의 8개 패밀리로 분류된다. 패밀리 3, 30, 39, 52, 54, 116 및 120의 효소는 보유하고 있는 기작을 통해 자일로-올리고머의 가수분해를 촉매하지만, 패밀리 43의 효소는 자일로-올리고머의 아노머 구조배치 (anomeric configuration)를 전도시켜 가수분해를 수행한다 (Shao et al ., Appl Environ Microbiol, 77, 719-276 (2011)). β-자일로시다아제는 자일라나아제와 함께 미생물에서의 자일라놀리틱 시스템 (xylanolytic system)의 필수 효소이고, 자일로-올리고머에 의한 가수분해 효소의 최종-산물 억제 (end-product inhibition)를 방해한다.

자일로시다아제 및 아라비노퓨라노시다아제는 바이오매스 당화에 중요한 효소이다. 상기 효소들은 환원당의 방출을 증가시킬 뿐만 아니라, 자일라나아제 또는 셀룰라아제와의 공동 작용에서 다른 가수분해 효소의 저해를 방지한다 (Qing et al., Biotechnol Biofuels, 4, 18 (2011)). 따라서, 본 발명의 자일로시다아제 및 아라비노퓨라노시다아제는 그들의 공동 활성으로 인해 생물공학 및 공업적 적용에 커다란 잠재성이 있다.

자일로오스는 헤미셀룰로오스에 풍부한 당이다. 게다가, 자일로오스는 보리 짚, 옥수수 줄기, 옥수수대, 볏짚 및 밀짚과 같은 농업 및 농공 재료에서 발견되고, 각 식물 건조 중량의 15% 내지 35%를 차지한다. 자일로오스는 바이오에탄올 또는 식품, 의약품 및 산업에서 사용되는 가치있는 화합물을 생산하기 위해 이용될 수 있다. 바이오매스 공급원으로부터 자일로오스를 생산하기 위해, 화학적 및 효소적 방법을 포함하는 수많은 방법이 개발되어 있다 (Girio et al ., Bioresour . Technol., 101, 4775-4800 (2010)). 효소의 환경 친화성, 재활용성 및 유효성 때문에 효소 처리가 바람직하다.

한편, 한국등록특허 제1183114호에는 '백색 부후균 유래 베타-글루코시다아제 유전자, 상기 유전자를 함유한 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체의 제조 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2013-0002311호에는 '백색 부후균 유래의 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 대량 생산을 위한 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 대량 생산 방법'이 개시되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이, 백색 부후균 유래의 재조합 자일로시다아제/아라비노퓨라노시다아제 다기능 효소의 고생산 방법 및 이의 용도에 대해서는 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 백색 부후균 (Phanerochate chrysosporium) BKM-F-1767의 cDNA 유전자 라이브러리로부터 β-자일로시다아제 (β-xylosidase) 추정 유전자를 분리하여 β-자일로시다아제 유전자를 포함하는 효모 형질전환용 재조합 벡터를 제작하였고, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 효모에서 발현된 재조합 단백질이 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제 (α-L-arabinofuranosidase) 활성을 갖는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 백색 부후균 (Phanerochate chrysosporium) 유래의 β-자일로시다아제 (β-xylosidase)/α-L-아라비노퓨라노시다아제 (α-L-arabinofuranosidase) 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 백색 부후균 (Phanerochate chrysosporium) 유래의 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환되어 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제를 생산하는 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 재조합 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제의 대량 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 재조합 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제를 유효성분으로 포함하는 자일란 (xylan) 분해 증진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제 단백질을 헤미셀룰로오스 유래의 자일란에 처리하여 자일로오스를 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제 단백질에 대한 항체를 제공한다.

본 발명에 따른 백색 부후균 유래의 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제 유전자가 형질전환된 효모 (Pichia pastoris)를 이용하면, 사료 첨가제, 종이 제조, 세제 및 바이오 에너지 생산 등에 폭 넓게 이용할 수 있는 헤미셀룰로오스의 분해용 효소로서 산업적 이용 가치가 큰 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제를 대량 생산할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 ClustalW2 도구를 이용한 백색 부후균 (P. chrysosporium) 자일로시다아제/아라비노퓨라노시다아제 (PcXyl) 및 지오바실러스 스테아로써모필러스 (G. Stearothermophilus)(PDB: 2EXK_A), 부티리비브리오 피브리솔벤스 (Butyrivibrio fibrisolvens)(AAA63609), 셀레노모나스 루미난티움 (Selenomonas ruminantium) (AAB97967), 푸사리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum)(XP_391670) 및 아스퍼질러스 나이거 (Aspergilus niger)(EIT77121) 유래의 다른 자일로시다아제 (Xyl)의 추측된 아미노산 서열 정렬을 나타낸다. 동일한 아미노산은 검은색 문자로 기재했다. 자일로시다아제의 보존성 촉매 잔기인 Asp48, Asp169 및 Glu223은 색칠된 역삼각형으로 나타냈다. 자일로시다아제에서 기질 인식에 필수적인 보존성 잔기들은 닫힌 원으로 나타냈다. N-글리코실화 부위 (Asn-Xaa-Ser/Thr)는 박스로 표시하였다.
도 2는 정제된 재조합 자일로시다아제/아라비노퓨라노시다아제 (rPcXyl)의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. M: 분자량 마커, 1: 정제된 재조합 자일로시다아제/아라비노퓨라노시다아제 (rPcXyl), 2: EndoH로 처리된 rPcXyl.
도 3은 재조합 자일로시다아제 및 아라비노퓨라노시다아제 활성에 대한 pH (A) 및 온도 (B)의 영향을 나타낸다. 반응은 2.5 mM 의 pNPβX 또는 pNPA를 포함하는 50 mM 소듐 아세테이트 버퍼 100 ㎕에서, 적당한 pH 및 온도에서 10분 동안 수행되었다. 닫힌 마름모 및 닫힌 원은 각각 적당한 pH 및 온도에서의 자일로시다아제 및 아라비노퓨라노시다아제의 상대적인 활성을 나타낸다. 데이터는 3회 실험의 평균을 나타내며, 오차 막대는 평균±표준 오차를 나타낸다.
도 4는 재조합 자일로시다아제/아라비노퓨라노시다아제 (rPcXyl)의 활성에 영향을 미치는 요인들을 분석한 결과를 나타낸다. (A) 재조합 자일로시다아제/아라비노퓨라노시다아제 (rPcXyl)의 자일로시다아제 활성에 대한 당 농도의 영향. 5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM의 당 농도가 조사되었다. rPcXyl는 100 ㎕의 50 mM 소듐 아세테이트 버퍼에서 각각의 농도의 각 당과 함께 45℃에서 1시간 동안 배양하였다. 반응은 pNPβX를 최종 농도가 2.5 mM이 되도록 첨가하여 10분 동안 수행했다. 당 부재하에서의 대조구의 잔류 활성을 100%로 설정했고, 샘플의 잔류 활성은 대조구와 비교하였다. 데이터는 3회 실험의 평균을 나타내며, 오차 막대는 평균±표준 오차를 나타낸다.
(B) rPcXyl의 자일로시다아제 활성에 대한 pNPA의 저해. rPcXyl에 대한 pPNA의 경쟁적 저해는 5 mM의 pNPβX를 포함하는 50 mM 소듐 아세테이트 버퍼 100 ㎕에서 분석하였고, 5 mM, 10 mM, 15 mM 및 20 mM 농도 범위의 pNPA를 반응물에 첨가한 후, 10분 동안 45℃에서 반응시켰다. 잔류 활성은 표준 방법으로 측정하였다. 데이터는 3회 실험의 평균을 나타내며, 오차 막대는 평균±표준 오차를 나타낸다.
도 5는 가수분해 동안 생산된 당의 박층 크로마토그램 (TLC)를 나타낸다. (A) 자일로-올리고머 가수분해 산물: 레인 1: 자일로-올리고머, 레인 2, 3, 5 및 7은 각각 자일로오스 (X1), 자일로비오스 (X2), 자일로트리오스 (X3) 및 자일로펜타오스 (X5)를 나타냄, 레인 4, 6, 8은 재조합 자일로시다아제/아라비노퓨라노시다아제 (rPcXyl)에 의한 자일로비오스, 자일로트리오스 및 자일로펜타오스 분해를 나타냄. 각각 5 μmol, 3.3 μmol 또는 2 μmol 농도의 자일로비오스, 자일로트리오스 또는 자일로펜타오스는 100 ㎕의 50 mM 소듐 아세테이트 버퍼 (pH 5.0)에서 50 U의 rPcXyl과 10분 동안 45℃에서 반응시켰다. 100℃에서 5분간 가열하여 반응을 종료한 후, 1 ㎕의 반응 산물을 취해 TLC 실리카 겔에 주입했다. 가수분해 산물은 분리되어, TLC 실리카 겔 상에서 가시화되었다.
(B) 자일란 가수분해 산물: 레인 1 및 5는 너도밤나무 및 자작나무 자일란을 나타냄; 레인 2 및 6은 재조합 자일라나아제 C (rPcXynC)에 의한 너도밤나무 및 자작나무 자일란의 가수분해를 나타냄; 레인 3 및 7은 rPcXyl에 의한 너도밤나무 및 자작나무 자일란의 가수분해를 나타냄; 레인 4 및 8은 rPcXyl 및 rPcXynC의 조합물에 의한 너도밤나무 및 자작나무 자일란의 가수분해를 나타냄; 레인 9는 자일로오스 (X1), 자일로비오스 (X2), 자일로트리오스 (X3) 및 자일로펜타오스 (X5)의 자일로-올리고머를 나타냄. 40 U 및 0.5 U 농도의 rPcXyl 및 rPcXynC는 pH 5.0의 50 mM 소듐 아세테이트 100 ㎕에서 0.5% 기질과 함께 20시간 동안 45℃로 반응시켰다. 반응은 100℃에서 5분간 가열하여 종결시켰고, 1 ㎕의 반응 산물을 취하여 TLC 실리카 겔에 주입했다. 가수분해 산물은 분리되어 TLC 실리카 겔 상에서 가시화되었다.
(C) pNPβX 가수분해 산물: 레인 1 및 7은 자일로오스 (X1)를 나타냄; 레인 2는 pNPβX를 나타냄; 레인 3, 4, 5 및 6은 각각 알콜, 에탄올, 메탄올 및 이소프로판올 없이 rPcXyl에 의한 pNPβX의 가수분해를 나타낸다. rPcXyl의 트랜스글리코실화 (transglycosylation) 능력은 pNPβX 및 다양한 알콜 (에탄올, 메탄올 및 이소프로판올)을 이용해 결정했다. rPcXyl은 5 mM pNPβX를 포함하는 pH 4.5의 50 mM 소듐 아세테이트 100 ㎕에서 10%의 각 알콜과 함께 반응시켰다. 반응은 45℃에서 10분 동안 수행하였고, 이후 1 ㎕의 반응 산물을 취하여 TLC 실리카 겔 상에 주입했다. 가수분해 산물은 분리되어 TLC 실리카 겔 상에서 가시화되었다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 백색 부후균 (Phanerochate chrysosporium) 유래의 β-자일로시다아제 (β-xylosidase)/α-L-아라비노퓨라노시다아제 (α-L-arabinofuranosidase) 단백질을 제공한다. 상기 백색 부후균은 바람직하게는 파네로캐테 크리소스포리움 (Phanerochate chrysosporium) BKM-F-1767 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제 단백질의 범위는 백색 부후균으로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 백색 부후균 (Phanerochate chrysosporium) 유래의 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제 단백질 코딩 유전자는 1797개의 뉴클레오티드로 구성되어 있으며, 26개 잔기의 예측 신호 펩티드를 포함하는 총 598개의 아미노산을 암호화하고 있다.

또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열 (추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제 (즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 대장균 발현 벡터 또는 효모 발현 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 대장균 발현 벡터로는 pET28a 벡터를 예로 들수 있으며, 효모 발현 벡터로는 pPICZA 또는 pPICZαA 벡터를 예로 들 수 있으나, 해당 숙주에서 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제 단백질의 발현에 적합한 벡터라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 효모 발현 벡터는 바람직하게는 5'에서 3' 방향으로

(a) 메탄올에 의해 조절되는 AOXI 프로모터를 코딩하는 핵산 서열;

(b) 효모 유래의 α-분비 인자 (α-secretion factor)를 코딩하는 핵산 서열; 및

(c) 백색 부후균 유래의 분비 신호 서열 (secretion signal sequence)을 포함하지 않는 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제를 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용된 상기 AOXI (alcohol oxydase I) 프로모터는 피키아 파스토리스에서 유래하는 프로모터로서 메탄올의 존재하에서 형질전환체의 단백질 발현 효율을 극대화시키는 역할을 수행한다. 메탄올 자화를 통해 성장하는 피키아 파스토리스는 메탄올을 분해하기 위해 알코올 옥시다아제 (alcohol oxydase)를 균주 자체 중량 대비 30%까지 생산하는데, 이 효소의 생산을 위한 프로모터가 AOXI (Gene bank 등록번호: U96967)이며, 메탄올에 의해 발현이 크게 유도되는 특성을 가지고 있다. 본 발명에서는 바람직하게는 피키아 파스토리스 유래의 AOXI 프로모터를 사용할 수 있으며, 상기 AOXI 프로모터는 Invitrogen에서 상업적으로 판매하고 있는 pPICZA 벡터 및 pPICZaA 벡터에 포함되어 있다.

본 발명에서 사용된 효모 유래의 α-분비 인자 (α-secretion factor)를 코딩하는 핵산 서열은 바람직하게는 효모 사카로마이세스 세레비지애 (Scccharomyces cerevisiae) 유래의 α-분비 인자 (Genbank 등록번호: NP_015137)를 일부 또는 전부 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 a-분비 인자는 목적 단백질을 세포 외부로 분비시키는 역할을 수행한다.

본 발명에서 사용된 백색 부후균 유래의 분비 신호 서열 (secretion signal sequence)을 포함하지 않는 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열 중 1번에서 26번까지의 분비 신호 서열을 포함하지 않는 아미노산 서열, 즉 서열번호 2의 아미노산 서열 중 27번에서 598번까지의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 의미한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들면, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보솜 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균 (E. coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ 프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들면, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터) 또는 효모 유래의 프로모터 (예를 들면, 피키아 파스토리스의 AOXI 프로모터)가 이용될 수 있으며, 바람직하게는 본 발명의 숙주 세포가 효모인 경우에 AOXI 프로모터를 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 일반적으로 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pPICZA, pPICZaA, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으며, 바람직하게는 pPICZA 또는 pPICZaA 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 앰피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환되어 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제를 생산하는 숙주세포를 제공한다. 상기 숙주세포는 바람직하게는 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 한세뉼라 폴리모파 (Hansenula polymorpha), 야로위아 (Yarrowia), 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주 (예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스 (K. lactis), 클루이베로마이세스 프라길리스 (K. fragilis), 클루이베로마이세스 불가리쿠스 (K. bulgaricus), 클루이베로마이세스 위커라미 (K. wickeramii), 클루이베로마이세스 왈티 (K. waltii), 클루이베로마이세스 드로소필라룸 (K. drosophilarum), 클루이베로마이세스 테르모톨레란스 (K. thermotolerans) 및 클루이베로마이세스 마르시아누스 (K. marxianus))와 같은 효모일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및/또는 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli Top10, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스, 다양한 슈도모나스 종 균주 또는 효모 등의 균주가 있다. 본 발명에서 클로닝을 위한 숙주세포로는 E. coli Top10, 발현을 위한 숙주 세포로는 효모 피키아 파스토리스를 이용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 형질전환 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol . Biol ., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 (Dower, W.J. et al ., Nucleic . Acids Res ., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법 (Neumann, E. et al ., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al ., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol . Cell Biol ., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

또한, 본 발명은

(a) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환하는 단계; 및

(b) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제의 발현을 유도한 후 분리 정제하는 단계를 포함하는 재조합 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제 단백질의 대량 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 숙주세포는 바람직하게는 효모일 수 있으며, 상기 효모는 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 형질전환된 효모의 배양은 공지된 기술을 이용하여 재조합 단백질의 생산에 적합한 배지에서 이루어질 수 있다. 적합한 배양 배지는 상업적으로 입수하거나 예를 들면, American Type Culture Collection의 카탈로그와 같은 간행물에 기재된 성분 및 조성비에 따라 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 AOXI 프로모터에 의해 조절된다. 따라서 상기 형질전환된 효모를 메탄올이 포함된 배양 배지에서 배양하여 재조합 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제의 분비를 유도할 수 있다. 재조합 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제를 생산하기 위해 배지 내에 포함되는 메탄올의 농도는 바람직하게는 배지 중량 대비 0.1~1%일 수 있으며, 배양 중 추가로 메탄올을 첨가하는 것이 가능하다.

본 발명의 피키아 파스토리스로부터 분비된 재조합 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제는 통상의 분리 정제 방법을 통해 최종 생산될 수 있다. 예를 들어 단백질은 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 통상적인 방법에 의해서 배지로부터 분리될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 더 나아가 단백질은 크로마토그래피 (예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별 용해 (예를 들면 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하는 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질의 β-자일로시다아제 최적 활성 온도 및 pH는 각각 41~45℃, pH 4.6~5.4, 바람직하게는 45℃, pH 5.0일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 단백질의 α-L-아라비노퓨라노시다아제 최적 활성 온도 및 pH는 각각 46~51℃, pH 5.0~5.5, 바람직하게는 50℃, pH 5.5일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제 단백질은 헤미셀룰로오스 유래의 자일란 (xylan), 바람직하게는 p-니트로페닐-β-D-자일로피라노시드 (pNPβX), p-니트로페닐-α-L-아라비노퓨라노시드 (pNPA), 밀 아라비노자일란, 탈분지화 아라비난, 자작나무 자일란, 너도밤나무 자일란 또는 사탕무 아라비난, 더욱 바람직하게는 p-니트로페닐-β-D-자일로피라노시드 (pNPβX), p-니트로페닐-α-L-아라비노퓨라노시드 (pNPA), 밀 아라비노자일란 또는 탈분지화 아라비난에 기질 특이성을 갖는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제를 유효성분으로 포함하는 자일란 (xylan) 분해 증진용 조성물은 사료 첨가제, 세제 첨가제, 헤미셀룰로오스 당화용 첨가제, 펄프제지 가공 및 생산용 첨가제, 자일리톨 생산용 첨가제, 삼베나 린넨 섬유 연화용 첨가제, 식품 가공용 첨가제, 바이오에너지 생산을 위한 바이오매스 전처리용 첨가제로 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 β-자일로시다아제/α-L-아라비노퓨라노시다아제 단백질에 대한 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 본 발명의 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현 벡터에 클로닝하여 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론 항체, 단클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 균주, 플라스미드 및 배지

백색 부후균인 P. chrysosporium BKM-F-1767은 한국 생명공학연구원 유전자은행에서 입수하였고, Tien에 의해 기재된 것과 같은 배지에서 유지하였다 (Meth . Enzymol., 161, 238-249 (1988)). 유전자 클로닝은 pGEM-T Easy 벡터 (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 수행되었다. 재조합 벡터는 대장균 (Escherichia coli) Top10에 이동시켰고, 이어서 IPTG 및 X-Gal이 첨가된 50 ㎍/ml 앰피실린을 포함하는 LB 아가 플레이트에서 스크리닝하였다. 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) GS115 (his4), 벡터 pPICZ 및 pPICZα는 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였고, 각각 발현 숙주 및 벡터로 사용하였다. PcXyl 유전자는 pPICZA 또는 pPICZαA를 이용해 구축했다. 이어서, 결과로서 수득한 구축물은 대장균 Top10에 도입하였고, 제오신 (zeocin) 25 ㎍/ml를 포함하는 저염 LB 배지를 이용해 선별하였다. 재조합 β-자일로시다아제 (rPcXyl) 발현은 1% 메탄올을 포함하는 YP 배지 (1% 효모 추출물 및 2% 펩톤)에 재조합 피키아 파스토리스를 접종하여 연구했다.

2. cDNA 라이브러리

총 mRNA는 Oligotex mRNA Mini 키트 (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 백색 부후균 균사에서 분리하였다. cDNA 라이브러리는 제조사의 지시에 따라 SMARTer PCR cDNA Synthesis 키트 (Clontech, Mountain View, CA, USA)를 사용하여 합성하였다.

3. 유전자 조작

PcXyl의 추정 (putative) cDNA의 뉴클레오티드 서열은 RP78 게놈 데이터베이스 (http://genome.jgi-psf.org/Phchr1/Phchr1.home.html)에서 얻었다. PcXyl의 전장 cDNA는 정방향 프라이머 (PcXyl-F 5'-GAATTCATGCACCGTATTGCGAGGGC-3': 서열번호 3) 및 역방향 프라이머 (PcXyl-R 5'-GGGCCCATAAACGTTCTCTACAGGTT-3': 서열번호 4)를 이용해 증폭했다. 추가적으로, 분비 신호가 없는 PcXyl α cDNA는 정방향 프라이머 (PcXylα-F 5'-GAATTCGGTCGTGTCGCTCACTCGAA-3': 서열번호 5) 및 역방향 프라이머 (PcXylα-R 5'-CCGCGGAATAAACGTTCTCTACAGGT-3': 서열번호 6)를 각각 이용해서 생성했고, PcXyl α로 간주되는 앰플리콘 (amplicon)을 얻었다. 94℃에서 1분, 30회 반복의 94℃에서 30초, 62℃에서 30초, 72℃에서 2분 및 72℃에서 10분인 PCR 조건이 Pfu DNA 중합효소 (Solgent)를 이용한 PCR 증폭에 사용되었다. 예상 PCR 산물은 0.8% 아가로스 겔에서 잘라내어 정제한 후, Taq DNA 중합효소 (Takara)를 이용하여 72℃에서 30분간 A-tail을 추가하였고, 이어서 pGEM-T Easy Vector와 연결 (ligation)시켰다. 대장균 형질전환체는 PcXyl-F 및 PcXyl-R 또는 PcXylα-F 및 PcXylα-R 프라이머를 이용한 콜로니 PCR로 스크리닝했다. 3개의 재조합 플라스미드를 무작위로 분리하여 서열 분석하였다. PcXyl -pGEM-T 유전자는 EcoRI 및 ApaI를 이용하여 잘랐고, PcXylα-pGEM-T는 EcoRI 및 SacII를 처리하여 잘랐다. PcXyl 및 PcXyl α유전자는 0.8% 아가로스 겔 상에서 분리하고, 더 정제하였다. 이어서, 정제된 PcXyl 및 PcXyl α 유전자는 각각 pPICZA 및 pPICZαA 벡터에 삽입하였고, 그 결과 pPICZA-PcXyl 및 pPICZαA-PcXyl α를 얻었다. pPICZA-PcXyl 또는 pPICZαA-PcXylα에 대한 서열 분석은 제조사의 지시에 따라 AOX1 정방향 프라이머 (5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3': 서열번호 7) 및 역방향 프라이머 (5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3': 서열번호 8)를 사용하여 수행되었다.

pPICZA-PcXyl 및 pPICZαA-PcXyl α 플라스미드는 PmeI를 이용하여 직선화하였고, 이후 둘 중 하나를 제조사 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)에서 제시한 전기천공법을 이용하여 피키아 파스토리스 GS115에 형질전환하였다. 형질전환된 세포는 콜로니가 관찰될 때까지 (2 내지 3일), 30℃에서 100 ㎍/ml의 제오신 및 1 M 솔비톨을 포함하는 YPD 아가 플레이트 상에서 선별했다. PcXyl 또는 PcXyl α의 피키아 파스토리스 게놈으로의 통합 (intergration)은 AOX1 프라이머를 이용한 PCR로 확인하였다.

4. 효소 유도

20개의 양성 피키아 파스토리스 형질전환체의 정량적 발현은 Vasu 등의 문헌에 기재된 바와 같이 His-태그 항체를 이용한 닷 블랏 (dot blot) 분석으로 시험했다 (Reviews and Protocols, vol 824. Methods in Molecular Biology, 3rd ed. Humana Press, New York, pp 433-450 (2012)). 최대로 분비된 피키아 파스토리스 형질전환체를 5 ml YPD 배지에서 30℃ 및 200 rpm으로 24시간 동안 배양하였고, 이어서 1% 글리세롤을 포함하는 새로운 YP 배지 50ml에 옮겨 30℃ 및 180 rpm의 교반 배양기에서 배양하였다. 효소 유도는 최초 세포 광학 밀도 1.0인 100ml의 YP 배지에 7일 동안 매 24시간마다 1% 메탄올을 첨가하여 수행하였다. 배양액 1ml을 24시간마다 수집하여 5분 동안 15,000 rpm에서 원심분리하였고, 이후 효소 활성을 측정하였다.

5. 효소 활성 결정

자일로시다아제 활성은 Kim 등에 의해 기재된 것처럼 p-니트로페닐-β-D-자일로피라노시드 (pNPβX)(Sigma, St. Louis, MO, USA)로부터의 p-니트로페닐 (pNP)의 방출을 측정하여 결정하였다 (Kim et al ., J Microbiol Biotechnol, 20, 1711-1716 (2010)). 간략하게, 90 ㎕의 상층액은 pH 5.0, 40℃의 100 mM 소듐 아세테이트 100 ㎕와 혼합하였다. 반응은 에탄올 중의 50 mM pNPX 10 ㎕를 첨가하여 개시하였고, 40℃에서 10분 동안 반응시켰다. 1 ml의 1 M 소듐 카보네이트를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 방출된 pNP의 양은 TCC-240A UV 분광광도계 (Shimadzu)를 이용하여 410 nm 파장에서 측정하였다. 표준 곡선은 pNP를 기질로 사용해서 생성했고, 흡광도는 방출된 pNP의 몰로 변환했다. 자일로시다아제 활성의 1 유닛 (unit)은 실험 조건 하에서 분당 pNP 1nmol의 방출로 정의되었다.

6. 효소 정제 및 탈당화

세포가 없는 상층액은 2,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 수집하였고, 0.45 ㎛ 필터로 여과한 후, 10×결합 버퍼 (20 mM 소듐 포스페이트, 0.5 M NaCl 및 20 mM 이미다졸; pH 7.4)와 혼합하였다. 효소는 Ni² ⁺ His-태그 컬럼 (Histrap-GE Healthcare, Picataway, NJ, USA)을 이용하여 AKTA 고속 단백질 액체 크로마토그래피 정제 시스템으로 정제했다. 효소는 용출 버퍼 (20 mM 소듐 포스페이트, 0.5 M NaCl 및 500 mM 이미다졸; pH 7.4)로 용출했고, 15 ml 코니컬 튜브에 수집했다. 정제된 효소 (rPcXyl)는 4℃에서 셀룰로오스 투석 튜빙 막 (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 증류로 밤새 투석하였다. 단백질 농도는 표준 물질로 혈청 알부민을 사용하여 Thermo Scientific Protein Assay 키트 (Rockford, IL, USA)를 이용한 Bradford 방법으로 추정했다.

rPcXyl의 글리코실화는 엔도글리코시다아제 H를 사용하여 분석했다. 약 5 ㎍의 정제된 rPcXyl를 500 유닛의 효소와 함께 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 정제된 rPcXyl 및 탈글리코실화된 (deglycosylated) rPcXyl의 분자량은 SDS-PAGE로 확인하였다.

7. 효소 활성에 대한 pH , 온도, 금속 이온 및 당의 영향

rPcXyl 활성에 대한 pH의 영향은 pH 3.0 내지 6.0 (50 mM 소듐 아세테이트 이용) 및 pH 7.0 내지 8.0 (50 mM 소듐 포스페이트 버퍼 이용)의 다양한 pH 값에서 40℃에서의 효소 활성에 대한 분석으로 결정되었다. 반응 혼합물은 정해진 온도에서 30분 동안 반응시킨 후 10 ㎕의 정제된 효소를 첨가하여 10분 동안 반응시켰다. 이어서, 방출된 pNP의 양은 상기 기재된 바와 같이 측정했다. rPcXyl 활성에 대한 최적 온도는 최적 pH에서 30 내지 60℃의 온도로 시험했다.

rPcXyl 활성에 대한 금속 이온들 (Mn² ⁺, K⁺, Ca² ⁺, Co² ⁺,Fe² ⁺, Fe³ ⁺, Cu² ⁺, Mg² ⁺, Zn²⁺ 및 Ni² ⁺)의 영향은 효소의 특징을 더 분석하기 위해 조사되었다. rPcXyl은 최적 pH 및 온도에서 각 금속 이온 10 mM과 함께 반응시켰다. rPcXyl의 보유 활성을 비-금속 이온 반응에서의 rPcXyl의 효소 활성과 비교하였다.

추가적으로, rPcXyl 활성에 대한 당 (글루코오스, 자일로오스 및 아라비노오스 (Sigma))의 영향도 연구되었다. 이를 위해, rPcXyl를 최적 pH 및 온도에서 5 mM, 10 mM, 50 mM 또는 100 mM의 각 당과 함께 1시간 동안 반응시켰다. rPcXyl의 보유 활성을 측정하였고, 당 부재하의 활성과 비교하였다.

8. 기질 특이성

rPcXyl의 기질 특이성은 사탕무 아라비난, 탈분지화 아라비난, 밀 아라비노자일란 (Megazyme, Bray, Co. Wicklow), 자작나무 자일란, 너도밤나무 자일란 뿐만 아니라, p-니트로페닐-β-D-글루코피라노시드 (pNPG), p-니트로페닐-α-D-자일로피라노시드 (pNPαX), p-니트로페닐-α-L-아라비노퓨라노시드 (pNPA) 및 p-니트로페닐-β-D-자일로피라노시드 (pNPβX)(Sigma)를 이용하여 조사했다. pNPG, pNPαX 및 pNPA 가수분해는 pNPβX 검정에서 수행된 것과 동일한 방식으로 수행되었다. 사탕무 아라비난, 탈분지화 아라비난, 밀 아라비노자일란, 자작나무 자일란 및 너도밤나무 자일란의 가수분해 반응에 의해 방출된 당은 DNSA (3,5-Dinitrosalicylic acid) 방법으로 측정되었다. 효소 활성의 1 유닛은 분 당 1 μmol 환원당을 생산하는 효소의 양으로 정의되었다.

rPcXyl의 자일로시다아제 활성에 대한 α-L-아라비노퓨라노시다아제 기질의 경쟁적인 저해는 5 mM의 pNPβX를 포함하는 pH 5.0의 50 mM 소듐 아세테이트 반응물 100 ㎕에 pNPA를 첨가하여 수행하였다. 반응은 10분 동안 45℃에서 실시하고, 이후 방출된 pNP의 양을 상기 기재된 바와 같이 측정하였다.

9. 자일라나아제와의 상승적 작용에서의 자일로올리고머 및 자일란 기질의 가수분해

rPcXyl의 작용 방식은 자일로-올리고머 (자일로비오스, 자일로트리오스 및 자일로펜타오스)를 사용하여 시험했고, rPcXyl 및 rPcXynC의 공동 작용은 자작나무 및 너도밤나무 자일란을 사용하여 평가했다. 자일로-올리고머 및 자일란 기질의 가수분해 산물은 클로로포름/아세트산/H₂O (6:7:1)을 이동상으로 이용한 박층 크로마토그래피 (TLC)로 분석하였다. 반응 산물은 TLC 플레이트에 1 mg/ml의 오르시놀 (orcinol)을 포함하는 황산/에탄올 (5:95, v/v)을 분사한 후, 110℃에서 5분 동안 베이킹 (baking)하여 가시화되었다. 자일로오스, 자일로비오스, 자일로트리오스 및 자일로펜타오스는 표준 물질로 사용되었다.

추가적으로, rPcXyl의 트랜스글리코실화 활성은 pNPβX 및 다양한 알콜 수용체 (에탄올, 메탄올, 이소프로판올)를 이용하여 Shao 등에 기재된 방법으로 측정하였다 (Appl Environ Microbiol, 77, 719-276 (2011)). 가수분해 산물은 분리되어 상기 기재된 바와 같이 TLC 분석에 의해 가시화되었다.

실시예 1. PcXyl 의 클로닝 및 서열 분석

선행기술에서, 본 발명자들은 백색 부후균 (P. chrysosporium) 자일라나아제의 성공적인 클로닝 및 발현을 보고했다 (Huy et al ., J. Biosci . Bioeng ., 111, 654-657 (2011)). 헤미셀룰로오스 기질을 분해하기 위해, 본 발명자들은 자일라나아제의 공동 작용 향상에 이용하기 위한 다른 백색 부후균 헤미셀룰라아제를 조사하였다. 백색 부후균 RP78 게놈 데이터베이스를 근거로 하여, 본 발명자는 자일로시다아제 보존성 도메인을 포함하는 패밀리 43 글리코시드 히드롤라아제로 추정되는 유전자를 발견했다. 상기 추정 자일로시다아제 유전자는 26개 잔기의 예측 신호 펩티드를 갖는 598개 아미노산을 코딩하는 10개의 엑손 및 9개의 인트론으로 구성된다. 상기 추정 자일로시다아제의 예측 cDNA 서열은 총 백색 부후균 BKM-F-1767 cDNA 라이브러리로부터의 유전자 증폭을 위한 프라이머 고안을 위한 주형으로 사용되었다. PCR 앰플리콘은 백색 부후균 RP78의 예측 Xyl 유전자의 예상 크기와 완벽하게 일치했으며, 그에 따라 PcXyl로 명명하였다. 뉴클레오티드 서열은 PcXyl가 598개의 아미노산을 코딩하는 1797개의 뉴클레오티드를 포함한다는 것을 나타냈다. 본 연구의 PcXyl의 전장 cDNA 뉴클레오티드 서열은 GenBank에 등록하였다 (등록 번호 JX625152).

Phyre 서버 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)를 이용한 단백질 결정 구조 데이터베이스의 상동성 검색은 PcXyl가 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) (PDB 1YIF), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum) (PDB 1YI7), 지오바실러스 스테아로써모필러스 (Geobacillus stearothermophilus) (PDB 2EXK) 및 바실러스 할로두란스 (Bacillus halodurans) (PDB 1YRZ) 유래의 β-자일로시다아제와 높은 수준으로 일치한다는 것을 나타냈다. 지오바실러스 스테아로써모필러스의 모델 (Brux et al ., J Mol Biol, 359, 97-109 (2006))을 근거로, 3가지의 PcXyl Asp48, Asp169 및 Glu223 촉매 잔기가 각각 일반 염기 (general base), pK_a의 조절인자 (modulator) 및 일반 산 (general acid)으로 동정되었다. 10개의 아미노산 잔기, 즉 Ser63, Phe65, Trp109, Ala110, Phe191, Thr243, His284, Leu300, Arg313 및 Phe564는 기질 결합에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이들 아미노산은 백색 부후균 (P. chrysosporium) 자일로시다아제/아라비노퓨라노시다아제 (PcXyl) 및 지오바실러스 스테아로써모필러스 (G. Stearothermophilus)(PDB: 2EXK_A), 부티리비브리오 피브리솔벤스 (Butyrivibrio fibrisolvens)(AAA63609), 셀레노모나스 루미난티움 (Selenomonas ruminantium) (AAB97967), 푸사리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum)(XP_391670) 및 아스퍼질러스 나이거 (Aspergilus niger)(EIT77121) 유래의 다른 자일로시다아제 (Xyl)의 추측된 아미노산에서 높은 수준으로 보존되어 있다. 도 1은 선행기술에서 공개된 자일로시다아제 서열과 PcXyl를 비교한 결과를 나타낸다. 그 결과는 PcXyl이 부티리비브리오 피브리솔벤스 (31%), 활성제 (starter) 혼합물 메타게놈 (30%), 셀레노모나스 루미난티움 (28%) 및 푸사리움 그라미네아룸 (33%) 유래의 자일로시다아제/아라비노퓨라노시다아제와 유사성을 나타낸다는 것을 보여주었다 (Carapito et al ., Bioresour Technol, 100, 845-850 (2009)). 반면에 PcXyl과 반추위 메타게놈, 페니실리움 푸르푸로게눔, 패니바실러스 우송겐시스, 클로스트리디움 스테르코라리움 (Clostridium stercorarium) 및 써모아내로박터 에타놀리쿠스 유래의 자일로시다아제 사이에는 관찰가능한 유사성이 없었다 (Zhou et al ., J Ind Microbiol Biotechnol, 39, 143-152 (2012)). 균류의 탄수화물 결합 도메인은 발견되지 않았으나, 12개의 잠재적인 N-글리코실화 부위 (Asn-Xaa-Ser/Thr)가 PcXyl 서열에서 동정 되었다.

실시예 2. rPcXyl 의 발현 및 정제

본 발명자는 PcXyl 내재 및 α-분비 신호 펩티드의 두 가지를 이용하여 피키아 파스토리스에서 rPcXyl를 발현시켰다. 그러나, 효소 분석 및 웨스턴 블럿 분석 두 가지에 의하면 내재 신호 펩티드가 있는 PcXyl를 보유하는 재조합 피키아 파스토리스는 rPcXyl를 생산하지 않았다 (데이터 미제시). 이전에 본 발명자들은 피키아 파스토리스에서 백색 부후균의 내재 신호 펩티드를 이용한 재조합 백색 부후균 자일라나아제의 발현을 보고했다 (Huy et al ., J. Biosci . Bioeng ., 111, 654-657 (2011)). 이와 같이, 피키아 파스토리스에서의 내재 신호 펩티드의 존재의 유효성은 피키아 파스토리스의 분비 시스템이 검출 및 가공될 수 있으며, PcXyl에는 존재하지 않을 수도 있는 특정한 아미노산 부위에 좌우될 수 있다.

총 20개의 재조합 콜로니 중에서, 본 발명자는 웨스턴 블럿으로 최대 면역 검출 유의성을 갖는 단일 콜로니를 선별하였고, 이는 rPcXyl 효소를 생산하는데 더 이용하였다. rPcXyl의 효소 활성은 4일째까지 극적으로 증가하여, 최대 26,141 U/L에 도달했다 (데이터 미제시). 정제된 rPcXyl은 1,797 U/mg의 특이적 활성을 나타냈다. rPcXyl의 β-자일로시다아제 활성의 K_m 및 V_max는 12.7 mM 및 2812 U/mg이었고, α-L-아라비노퓨라노시다아제 활성의 동일한 동역학적 매개변수는 K_m 및 V_max에 대해 각각 12.6 mM 및 492 U/mg인 것으로 나타났다. 정제된 rPcXyl의 분자량은 SDS-PAGE를 이용한 측정에 의해 약 83 kDa인 것으로 나타났다 (도 2). 그러나, endoH-처리 rPcXyl의 분자량은 서열 내에 존재하는 아미노산의 수로 산출한 이론적인 분자량 65.6 kDa과 유사한 약 66 kDa으로 나타났다. 따라서, 예측 및 재조합 효소 사이의 차이는 글리코실화 때문인 것으로 보인다 (Huy et al ., J. Biosci . Bioeng., 111, 654-657 (2011)).

실시예 3. rPcXyl 에 대한 pH , 온도 및 당 농도의 영향

최대 rPcXyl 활성을 위한 최적 pH는 5.0인 것으로 나타났고, 최적 온도는 45℃였다 (도 3A, 3B). 이 효소 활성은 pH 및 온도가 각각 4.5 및 40℃ 미만 또는 5.5 및 45℃를 초과할 때 급격히 감소했다.

rPcXyl의 활성에 대한 다양한 금속 이온의 영향 또한 조사했다. 표 1에 나타낸 것처럼, rPcXyl은 Cu² ⁺ 및 Zn² ⁺에 의해 거의 완전히 저해되었다. 게다가, Ni² ⁺, Mn²⁺, Co² ⁺ 및 Fe² ⁺은 각각 17.2%, 21.2%, 20.4% 및 47.6%로 rPcXyl 활성을 감소시켰다. Ca² ⁺ 및 K⁺은 중간 정도의 저해를 유도한 반면, Mg² ⁺및 Fe³ ⁺는 rPcXyl 활성에 약간의 영향만 미쳤다. 하기 실험에서 아라비노퓨라노시다아제 활성이 나타난 것 때문에, 아라비노퓨라노시다아제에 대한 최적 pH, 온도 및 금속 이온의 영향도 연구되었다. 그 결과는 rPcXyl의 아라비노퓨라노시다아제 활성에 대한 최적 pH 및 온도가 각각 5.5 및 50℃라는 것을 보여주었다 (도 3A, 3B). 자일로시다아제 활성에 대한 영향과 유사하게, 모든 금속 이온들은 아라비노퓨라노시다아제 활성에 대해 저해 효과를 나타냈는데, 여기서 Zn² ⁺, Cu² ⁺, Ni² ⁺, Mn² ⁺, Co² ⁺ 및 Fe² ⁺은 아라비노퓨라노시다아제 활성을 강력하게 저해했고, Mg² ⁺, Ca² ⁺, K⁺ 및 Fe³ ⁺은 rPcXyl 활성을 부분적으로 감소시켰다 (표 1).

재조합 자일로시다아제/아라비노퓨라노시다아제 (rPcXyl)의 자일로시다아제 및 아라비노퓨라노시다아제 활성에 대한 금속 이온의 영향

첨가 물질	상대적 활성 (%)
첨가 물질	자일로시다아제	아라비노퓨라노시다아제
None	100	100
Mg² ⁺	93	81.4
Zn² ⁺	0.3	0.1
Cu² ⁺	5.8	2.3
Ni² ⁺	17.2	14.5
Mn² ⁺	21.2	23.8
Ca² ⁺	76.2	73.8
Co² ⁺	20.4	16.9
K⁺	73.7	70.1
Fe² ⁺	47.6	35.5
Fe³ ⁺	90.4	91.8

데이터는 3회 실험의 평균값을 나타낸다.

rPcXyl에 대한 당의 영향을 평가하기 위해, 본 발명자는 다양한 농도의 글루코오스, 자일로오스 및 아라비노오스의 존재 하에서 rPcXyl의 효소 활성을 시험했다 (도 4A). 자일로오스 및 아라비노오스는 rPcXyl에 대해 글루코오스보다 더 강력한 영향을 발휘했다. 이들 당들은 5 mM의 농도에서 각각 151%, 126% 및 123%로 효소 활성을 증가시켰다. 10 mM의 농도에서, 글루코오스는 여전히 효소 활성을 향상시켰으나, 자일로오스 및 아라비노오스는 rPcXyl 활성을 감소시켰다. 50 mM 이상의 농도에서는 세 가지 당 모두가 rPcXyl를 저해했다.

자일로시다아제 활성에 대한 α-L-아라비노퓨라노시다아제 기질의 영향을 결정하기 위해, rPcXyl을 다양한 농도의 두 가지 기질 (pNPβX 및 pNPA)과 함께 반응시켰다. 도 4B에 나타낸 것처럼, pNPA 보충은 효소 활성을 감소시켰다. 5 mM pNPA의 존재 하에서는 효소 활성이 51.9% 였으나, pNPA 농도가 10 mM, 15 mM 및 20 mM일 때에는 pNPA가 없는 대조군에 비해 각각 36.8%, 26.4% 및 17.0%까지 효소 활성이 떨어졌다.

실시예 4. 기질 특이적 활성

pNPG, pNPαX, pNPA, 사탕무 아라비난, 탈분지화 아라비난, 밀 아라비노자일란, 자작나무 자일란 및 너도밤나무 자일란에 대한 rPcXyl의 가수분해 활성은 표 2에 제시하였다. rPcXyl은 pNPG 및 pNPαX를 가수분해하지 못했으나, pNPA에는 작용했다. pNPA를 기질로 사용했을 때, rPcXyl의 특이적 활성은 197 U/mg이었다. rPcXyl은 헤미셀룰로오스 기질에 대해서는 약한 가수분해 활성을 나타냈다. 이들 중에서도, rPcXyl은 0.28 U/mg 미만의 특이적 활성으로 밀 아라비노자일란을 효율적으로 분해했다.

재조합 자일로시다아제/아라비노퓨라노시다아제 (rPcXyl)의 기질 특이적 활성

기질	활성 (U/mg)
p-니트로페닐-β-D-자일로피라노시드 (pNPβX)	1,797
p-니트로페닐-α-L-아라비노퓨라노시드 (pNPA)	197
p-니트로페닐-α-D-자일로피라노시드 (pNPαX)	nd
4-니트로페닐-β-D-글루코피라노시드 (pNPG)	nd
자작나무 자일란	<0.03
너도밤나무 자일란	<0.1
사탕무 아라비난	<0.08
탈분지화 아라비난	<0.18
밀 아라비노자일란	<0.28

nd: 검출되지 않음

실시예 5. 자일로- 올리고머 당의 가수분해 및 자일라나아제와의 상승 작용

rPcXyl의 작용 방식은 자일로-올리고머를 이용하여 분석되었다. 도 5A에 제시한 것처럼, rPcXyl는 자일로비오스를 자일로오스로, 자일로트리오스를 자일로오스 및 자일로비오스로 분해했다. 그러나, 이들 자일로-올리고머는 완전히 분해되지 않았다. 한편, 자일로테트라오스에 해당하는 스팟이 rPcXyl 및 자일로펜타오스의 반응 혼합물에서 관찰되었다.

추가적으로, 본 발명자는 또한 자작나무 자일란 및 너도밤나무 자일란에 대한 rPcXyl 및 rPcXynC의 상승 작용의 효율성을 평가했다. rPcXyl은 자작나무 자일란 또는 너도밤나무 자일란을 가수분해하지 못했으나, rPcXyl 및 rPcXynC의 조합물은 자일로오스 농도를 증가시켰다 (도 5B). 상기 결과는 rPcXyl 및 rPcXyn의 상승 작용이 최종 가수분해 산물을 증가시킨다는 것을 나타내며, 이는 rPcXyl이 자일란 또는 다른 헤미셀룰로오스 기질을 분해하는데 이용될 수 있다는 것을 제시한다.

rPcXyl는 자일로오스의 최종 산물로 가수분해하나, 자일로시드를 pNPβX로부터 알킬 알콜로 옮기지 못하였다 (도 5C). 상기 결과는 rPcXyl이 가수분해 반응을 수행하지만, 상기 효소의 트랜스글리코실화 활성은 없다는 것을 나타낸다. 게다가, rPcXyl 활성은 알콜, 특히 이소프로판올에 의해 유의하게 억제되었다.

<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Method for high production of recombinant bifunctional xylosidase/arabinofuranosidase from Phanerochaete chrysosporium <130> PN13011 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1797 <212> DNA <213> Phanerochaete chrysosporium <400> 1 atgcaccgta ttgcgagggc gaccttcgcc gtgctgtccc ttctgacagc gcttgcaggg 60 gtccctgcag tcgccgctgg tcgtgtcgct cactcgaagt ccaaatcgta tcacaacccg 120 atcatcagcg gcttcgcacc agacccgtcg tgcatccgtg tagatgccca gtacttctgc 180 gtgacgagct cgttcagtgc gttccccggc atacccgtct acacctccag agacttggtg 240 caatggcagc aaatcggtaa cgtgctgtca agaccggaac aactcccaca gctcgcgctc 300 gtaaaccaga cgactggtgg aatttgggcc gctactatac ggcatcacga gggcgtattc 360 tacgtgacga ccacgttggt cttcgacggc gcgccgcagc tgtcgcctac gcgttgggac 420 aatttgattt tcaatactac cgacatctgg gcgaacaatg gcaacggctg gtctgatcca 480 gttcatttca cgttccaagg ctacgacacg tcgctgtttt gggatgacga cggcacggcg 540 tatgtccaag gttcgcatgc ctggcacgta ttcccggcca tagaacagtt caagatcgat 600 gtaaggaccg gagagaacct cagcgagccg attatcctat ggaacggcac cggaggactt 660 gctccggagg ctccccacgt cttcaagagg acagacggtt attacttgat gatcgccgaa 720 ggcggaactg gtctcggcca tatggtgacc atggcgaagt cccctaatgt cactggtccc 780 tataccggct atgcaaataa tccggtctta accaacgcca acacttcgga atacttgcaa 840 acagtaggac acgctgacct cttcaccgac actgctggga actggtgggg agttgccctt 900 gccaccagaa acgctaccgc caactaccct atgggtcgtg aaactgtttt ggtaccggtg 960 gtctgggaag aagggcagtt tcctgtgttc aacggtgcca cgcctggtcg cgcatacgtc 1020 aatatgacag gcccactgcc cgcttcgcaa cggccaactt tcagtgacat gaaggatccg 1080 ctggttggcc gcgcgcagca cgtcgtcttc cccagcggtc cgcatgcatc cctctccgat 1140 atcccacgcc agctcgtcta ctatcggctg ccagatttct ctcgcttcac ggtgtcgccg 1200 ccatcccatc ctaacaccct gcgaatcatg ggctctgcag aaaacatcac aggaacaggc 1260 ggcattggga ccagcacgtt cattgctcgg cgtcaagatg cactcgagtt cactgcagaa 1320 gcgacacttg agtttgctcc gaagctatca gacccagttg tagaagacga agaggccggc 1380 atgacgctct tcattcagag aacgcagcac ttcgacctag gcgtcgtcgc tctccgagat 1440 gccaccagcg ggaagctcgg gaagttcatc cgcttgcgca cgttcagtgc gaactcgagt 1500 gctgacggca tgaacgacgg ctactcacaa cctggtattg tgccccttcc ttccaatgtc 1560 gacaagcttc gccttcgcgt tcaggcagtt aatgcctcca catacgcatt ctcatatctt 1620 gcttccgggg tgagatccag caagtggacg atcgtgggct atggggctgc tagagaagtc 1680 agcggcggct tcactggaac ccttgtagga atgtttgcga caggcaacgg gcataactcg 1740 actacacccg cgtatttcag tgactttaca tacgaacctg tagagaacgt ttattga 1797 <210> 2 <211> 598 <212> PRT <213> Phanerochaete chrysosporium <400> 2 Met His Arg Ile Ala Arg Ala Thr Phe Ala Val Leu Ser Leu Leu Thr 1 5 10 15 Ala Leu Ala Gly Val Pro Ala Val Ala Ala Gly Arg Val Ala His Ser 20 25 30 Lys Ser Lys Ser Tyr His Asn Pro Ile Ile Ser Gly Phe Ala Pro Asp 35 40 45 Pro Ser Cys Ile Arg Val Asp Ala Gln Tyr Phe Cys Val Thr Ser Ser 50 55 60 Phe Ser Ala Phe Pro Gly Ile Pro Val Tyr Thr Ser Arg Asp Leu Val 65 70 75 80 Gln Trp Gln Gln Ile Gly Asn Val Leu Ser Arg Pro Glu Gln Leu Pro 85 90 95 Gln Leu Ala Leu Val Asn Gln Thr Thr Gly Gly Ile Trp Ala Ala Thr 100 105 110 Ile Arg His His Glu Gly Val Phe Tyr Val Thr Thr Thr Leu Val Phe 115 120 125 Asp Gly Ala Pro Gln Leu Ser Pro Thr Arg Trp Asp Asn Leu Ile Phe 130 135 140 Asn Thr Thr Asp Ile Trp Ala Asn Asn Gly Asn Gly Trp Ser Asp Pro 145 150 155 160 Val His Phe Thr Phe Gln Gly Tyr Asp Thr Ser Leu Phe Trp Asp Asp 165 170 175 Asp Gly Thr Ala Tyr Val Gln Gly Ser His Ala Trp His Val Phe Pro 180 185 190 Ala Ile Glu Gln Phe Lys Ile Asp Val Arg Thr Gly Glu Asn Leu Ser 195 200 205 Glu Pro Ile Ile Leu Trp Asn Gly Thr Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ala 210 215 220 Pro His Val Phe Lys Arg Thr Asp Gly Tyr Tyr Leu Met Ile Ala Glu 225 230 235 240 Gly Gly Thr Gly Leu Gly His Met Val Thr Met Ala Lys Ser Pro Asn 245 250 255 Val Thr Gly Pro Tyr Thr Gly Tyr Ala Asn Asn Pro Val Leu Thr Asn 260 265 270 Ala Asn Thr Ser Glu Tyr Leu Gln Thr Val Gly His Ala Asp Leu Phe 275 280 285 Thr Asp Thr Ala Gly Asn Trp Trp Gly Val Ala Leu Ala Thr Arg Asn 290 295 300 Ala Thr Ala Asn Tyr Pro Met Gly Arg Glu Thr Val Leu Val Pro Val 305 310 315 320 Val Trp Glu Glu Gly Gln Phe Pro Val Phe Asn Gly Ala Thr Pro Gly 325 330 335 Arg Ala Tyr Val Asn Met Thr Gly Pro Leu Pro Ala Ser Gln Arg Pro 340 345 350 Thr Phe Ser Asp Met Lys Asp Pro Leu Val Gly Arg Ala Gln His Val 355 360 365 Val Phe Pro Ser Gly Pro His Ala Ser Leu Ser Asp Ile Pro Arg Gln 370 375 380 Leu Val Tyr Tyr Arg Leu Pro Asp Phe Ser Arg Phe Thr Val Ser Pro 385 390 395 400 Pro Ser His Pro Asn Thr Leu Arg Ile Met Gly Ser Ala Glu Asn Ile 405 410 415 Thr Gly Thr Gly Gly Ile Gly Thr Ser Thr Phe Ile Ala Arg Arg Gln 420 425 430 Asp Ala Leu Glu Phe Thr Ala Glu Ala Thr Leu Glu Phe Ala Pro Lys 435 440 445 Leu Ser Asp Pro Val Val Glu Asp Glu Glu Ala Gly Met Thr Leu Phe 450 455 460 Ile Gln Arg Thr Gln His Phe Asp Leu Gly Val Val Ala Leu Arg Asp 465 470 475 480 Ala Thr Ser Gly Lys Leu Gly Lys Phe Ile Arg Leu Arg Thr Phe Ser 485 490 495 Ala Asn Ser Ser Ala Asp Gly Met Asn Asp Gly Tyr Ser Gln Pro Gly 500 505 510 Ile Val Pro Leu Pro Ser Asn Val Asp Lys Leu Arg Leu Arg Val Gln 515 520 525 Ala Val Asn Ala Ser Thr Tyr Ala Phe Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val 530 535 540 Arg Ser Ser Lys Trp Thr Ile Val Gly Tyr Gly Ala Ala Arg Glu Val 545 550 555 560 Ser Gly Gly Phe Thr Gly Thr Leu Val Gly Met Phe Ala Thr Gly Asn 565 570 575 Gly His Asn Ser Thr Thr Pro Ala Tyr Phe Ser Asp Phe Thr Tyr Glu 580 585 590 Pro Val Glu Asn Val Tyr 595 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 gaattcatgc accgtattgc gagggc 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 gggcccataa acgttctcta caggtt 26 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gaattcggtc gtgtcgctca ctcgaa 26 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 ccgcggaata aacgttctct acaggt 26 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 gactggttcc aattgacaag c 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 gcaaatggca ttctgacatc c 21

Claims

서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 백색 부후균 (Phanerochate chrysosporium) 유래의 β-자일로시다아제 (β-xylosidase) 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제 (α-L-arabinofuranosidase) 활성을 갖는 단백질.
제1항의 백색 부후균 (Phanerochate chrysosporium) 유래의 β-자일로시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자.
제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제3항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 대장균 발현 벡터 또는 효모 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제4항에 있어서, 상기 효모 발현 벡터는 5'에서 3' 방향으로
(a) 메탄올에 의해 조절되는 AOXI (alcohol oxydase I) 프로모터를 코딩하는 핵산 서열;
(b) 효모 유래의 α-분비 인자 (α-secretion factor)를 코딩하는 핵산 서열; 및
(c) 백색 부후균 유래의 분비 신호 서열 (secretion signal sequence)을 포함하지 않는 β-자일로시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환되어 β-자일로시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제 활성을 갖는 단백질을 생산하는 숙주세포.
제6항에 있어서, 상기 숙주세포는 효모인 것을 특징으로 하는 β-자일로시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제 활성을 갖는 단백질을 생산하는 숙주세포.
제7항에 있어서, 상기 효모는 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)인 것을 특징으로 하는 β-자일로시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제 활성을 갖는 단백질을 생산하는 숙주세포.
(a) 제3항의 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환하는 단계; 및
(b) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 β-자일로시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제 활성을 갖는 단백질의 발현을 유도한 후 분리 정제하는 단계를 포함하는 재조합 β-자일로시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제 활성을 갖는 단백질의 대량 생산 방법.
제9항에 있어서, 상기 숙주세포는 효모인 것을 특징으로 하는 재조합 β-자일로시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제 활성을 갖는 단백질의 대량 생산 방법.
제9항의 방법에 의해 생산된 재조합 β-자일로시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제 활성을 갖는 단백질.
제11항에 있어서, 상기 단백질은 41~45℃, pH 4.6~5.4에서 β-자일로시다아제 최적 활성 및 46~51℃, pH 5.0~5.5에서 α-L-아라비노퓨라노시다아제 최적 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 재조합 β-자일로시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제 활성을 갖는 단백질.
제11항에 있어서, 상기 단백질은 p-니트로페닐-β-D-자일로피라노시드 (pNPβX), p-니트로페닐-α-L-아라비노퓨라노시드 (pNPA), 밀 아라비노자일란 또는 탈분지화 아라비난에 기질 특이성을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 β-자일로시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제 활성을 갖는 단백질.
제1항 또는 제11항의 β-자일로시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제 활성을 갖는 단백질을 유효성분으로 포함하는 자일란 (xylan) 분해 증진용 조성물.
제1항 또는 제11항의 β-자일로시다아제 및 α-L-아라비노퓨라노시다아제 활성을 갖는 단백질을 헤미셀룰로오스 유래의 자일란에 처리하여 자일로오스를 생산하는 방법.
제1항 또는 제11항의 단백질에 대한 항체.