KR101439965B1

KR101439965B1 - 백색 부후균 유래의 탄수화물 결합 모듈을 갖는 재조합 아세틸 자일란 에스터라아제 다기능 효소의 고생산 방법

Info

Publication number: KR101439965B1
Application number: KR1020130013785A
Authority: KR
Inventors: 박승문; 김대혁; 권태호
Original assignee: 전북대학교산학협력단; (주)엔비엠
Priority date: 2013-02-07
Filing date: 2013-02-07
Publication date: 2014-09-12
Also published as: KR20140100715A

Abstract

본 발명은 백색 부후균 유래의 탄수화물 결합 모듈을 갖는 재조합 아세틸 자일란 에스터라아제 다기능 효소의 고생산 방법에 관한 것으로, 백색 부후균 유래의 탄수화물 결합 모듈 (CBM)을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제 유전자로 형질전환된 효모에서 생산된 아세틸 자일란 에스터라아제는 자일란 구조 (backbone)의 아세틸기를 제거하고 자일란 및 리그닌을 분해하는 활성을 가질 뿐만 아니라, 자일라나아제와 동시에 사용했을 때 바이오매스 분해 활성을 증가시킬 수 있으므로 사료 첨가제, 종이 제조, 세제, 리그노셀룰로오스계 바이오매스 분해 및 바이오 에너지 생산 등을 위한 산업적 효소로 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

백색 부후균 유래의 탄수화물 결합 모듈을 갖는 재조합 아세틸 자일란 에스터라아제 다기능 효소의 고생산 방법 {Method for high production of recombinant bifunctional acetyl xylan esterase with carbohydrate binding module from Phanerochaete chrysosporium}

본 발명은 백색 부후균 유래의 탄수화물 결합 모듈을 갖는 재조합 아세틸 자일란 에스터라아제 다기능 효소의 고생산 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 백색 부후균 (Phanerochate chrysosporium) 유래의 탄수화물 결합 모듈 (carbohydrate binding module)을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제 (acetyl xylan esterase) 단백질, 상기 단백질 코딩 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환되어 아세틸 자일란 에스터라아제를 생산하는 숙주세포, 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 재조합 아세틸 자일란 에스터라아제 단백질을 대량 생산하는 방법, 상기 방법에 의해 생산된 재조합 아세틸 자일란 에스터라아제 단백질, 상기 단백질을 유효성분으로 포함하는 자일란 또는 리그닌 분해 증진용 조성물, 상기 아세틸 자일란 에스터라아제 단백질을 자일란에 처리하여 자일로오스를 생산하는 방법 및 상기 탄수화물 결합 모듈을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제 단백질에 대한 항체에 관한 것이다.

자일란은 헤미셀룰로오스의 주요 구성 성분으로, 자연에서 셀룰로오스 다음으로 가장 풍부한 재생가능한 다당류이다. 자일란은 경재 (hardwoods) 및 초본 (herbaceous) 식물 바이오매스의 20 내지 30%를 차지하며, 일부 풀 및 곡물 조직에서는 50%까지 증가한다. 자일란은 아라비노퓨라노오스 (arabinofuranose), 글루쿠론산 (glucuronic acid), 메틸글루쿠론산 (methylglucuronic acid) 및 아세틸 측기 (acetyl side group)가 있는 β-1,4-자일로실 백본 (backbone)으로 구성된다 (Scheller et al ., Rev . Plant Biol ., 61, 263-289 (2010)). 경재 자일란에서 자일로오스 잔기의 약 60 내지 70%는 O-2 또는 O-3 위치에서 아세틸기로 치환된다 (Margolles-Clark et al ., Eur . J. Biochem ., 273, 553-560 (1996)).

자일란 분해는 결과적으로 복합 효소들을 필요로 한다. 이들 효소들은 이들이 절단하는 연결의 특성을 근거로 2개의 그룹으로 분류된다. 첫 번째 그룹의 효소는 히드롤라아제 (hydrolase)이며, 이는 글리코시딕 결합을 통해 자일란 가수분해에 관여한다. 자일라나아제 (EC 3.2.1.8)는 자일란의 β-1,4-구조를 파괴하고, β-자일로시다아제 (EC 3.2.1.37)는 자일로올리고당을 절단하여 자일로오스를 생성하며, α-D-글루쿠로니다아제 (EC 3.2.1.139)는 아라비노오스 및 4-O-메틸글루쿠론산 치환기를 제거한다. 두 번째 그룹은 자일로오스 중합체의 자일로오스 단위체 및 아세트산 사이의 에스테르 연결을 파괴하는 효소 (아세틸 자일란 에스터라아제, EC 3.1.1.72) 또는 아라비노오스 측쇄 잔기 및 페놀산 사이의 에스테르 연결을 파괴하는 효소 (페룰산 및 p-쿠마르산 에스터라아제, EC 3.1.1.73)를 포함한다 (Shallom and Shoham, Curr . Opin . Microbiol ., 6, 219-228 (2003)). 아세틸 자일란 에스터라아제의 기작은 식물 세포벽에 결합하여 아세틸기를 제거한 후, 자일란 및 리그닌의 용해도를 증가시키고, 자일라나아제 또는 리그노세룰라아제 작용을 위한 새로운 부위를 제공하는 것이다 (Zhang et al ., Biotechnol . Biofuels ., 4, 60 (2011)).

아세틸 자일란 에스터라아제 (Axe)는 다양한 셀룰로오스 분해성 및 헤미셀룰로오스 분해성 유기체에 의해 생산된다. Axe를 코딩하는 많은 유전자들이 클로닝되었고, 대장균 (Escherichia coli)에서는 오르피노마이세스 속 (Orpinomyces sp.), 트리코데르마 리세이 (Trichoderma reesei), 네오칼리마스틱스 파트리시아룸 (Neocallimastix patriciarum) 유래의 유전자가 (Pai et al ., Appl . Microbiol . Biotechnol., 85, 1451-1462 (2010)), 그리고 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)에서는 써모비피다 푸스카 (Thermobifida fusca), 아스퍼질러스 피쿰 (Aspergillus ficuum), 아스퍼질러스 아와모리 (A. awamori), 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae) 유래의 유전자가 각각 발현되었다 (Yang et al., Int. J. Mol. Sci., 11, 5143-5151 (2010)).

백색 부후균 파네로캐테 크리소스포리움 (Phanerochaete chrysosporium)은 효소적 과정에 의해 목질 바이오매스를 분해할 수 있다. 상기 균에 의한 바이오매스 분해는 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제 및 리그니나아제의 복합적 혼합물을 통해 이루어진다. 게놈 서열은 이의 추정 자일란-분해 시스템이 자일라나아제, 아세틸 자일란 에스터라아제, α-L-아라비노퓨라노시다아제 및 글루쿠로노일 에스터라아제 (α-D-글루쿠로니다아제)에 관여한다는 것을 보여준다 (Martinez et al ., Nat . Biotechnol., 22, 695-700 (2004)). 상기 효소는 또한 백색 부후균 (P. chrysosporium)이 셀룰로오스-생장 배지에서 배양될 때 세포외 단백질 매트릭스 (matrix)에서도 발견된다.

한편, 한국공개특허 제2013-0002311호에는 '백색 부후균 유래의 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 대량 생산을 위한 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 엔도-1,4-베타 자일라나제 A 대량 생산 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0502393호에는 '베타 자일로시다아제를 발현하는 재조합 바실러스 균주 및 그 제조 방법'이 개시되어 있다. 그러나 본 발명에서와 같이, 백색 부후균 유래의 탄수화물 결합 부위를 갖는 재조합 아세틸 자일란 에스터라아제 다기능 효소의 고생산 방법 및 이의 용도에 대해서는 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 백색 부후균 (Phanerochate chrysosporium) BKM-F-1767의 cDNA 유전자 라이브러리로부터 분리한 아세틸 자일란 에스터라아제 (acetyl xylan esterase) 추정 유전자의 N-말단 영역에 탄수화물 결합 모듈 (carbohydrate binding module; CBM)이 존재하는 것을 확인하였고, 상기 아세틸 자일란 에스터라아제 유전자를 분리하여 효모 형질전환용 재조합 벡터를 제작한 후, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 효모에서 발현된 재조합 단백질이 아세틸 자일란 에스터라아제 활성뿐만 아니라, 자일라나아제 활성 및 리그닌 분해 활성을 갖는다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 백색 부후균 (Phanerochate chrysosporium) 유래의 탄수화물 결합 모듈 (carbohydrate binding module)을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제 (acetyl xylan esterase) 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 백색 부후균 유래의 탄수화물 결합 모듈을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환되어 탄수화물 결합 모듈을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제를 생산하는 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 탄수화물 결합 모듈을 갖는 재조합 아세틸 자일란 에스터라아제를 대량 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 탄수화물 결합 모듈을 갖는 재조합 아세틸 자일란 에스터라아제 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 탄수화물 결합 모듈을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제 단백질을 유효성분으로 포함하는 자일란 또는 리그닌 분해 증진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 탄수화물 결합 모듈을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제 단백질에 대한 항체를 제공한다.

본 발명에 따르면, 백색 부후균 유래의 탄수화물 결합 모듈 (CBM)을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제 유전자로 형질전환된 효모에서 생산된 아세틸 자일란 에스터라아제는 자일란 백본 (backbone)의 아세틸기를 제거하고 자일란 및 리그닌을 분해하는 활성을 가질 뿐만 아니라, 자일라나아제와 동시에 사용했을 때 바이오매스 분해 활성을 증가시킨다. 따라서 본 발명의 아세틸 자일란 에스터라아제는 리그노셀룰로오스계 바이오매스의 분해에 유용하게 이용할 수 있으며, 사료 첨가제, 종이 제조, 세제 및 바이오 에너지 생산 등을 위한 산업적 효소로서 이용 가치가 클 것으로 기대된다.

도 1은 백색 부후균 아세틸 자일란 에스터라아제 2 (PcAxe2) 및 아스퍼질러스 피쿰 (A. ficuum)(AF331757), 아스퍼질러스 나이거 (A. niger)(XP_001395572), 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae)(XM_001826277), 탈라로마이세스 에메르소니 (Talaromyces emersonii)(HQ185193) 및 아스퍼질러스 가와치 (A. kawachii) (GAA86514) 유래의 다른 Axe의 추정 아미노산 서열의 정렬을 나타낸다. 균류의 탄수화물 결합 모듈 (CBM) 서열은 밑줄로 표시하였다. 활성 부위 세린 효소의 일치 모티프 (Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly) 및 보존된 촉매 잔기 Asp294 및 His351은 별표로 표시하였다. 2개의 N-글리코실화 부위 (Asn-Xaa-Ser/Thr)는 박스로 표시하였다.
도 2는 정제된 재조합 아세틸 자일란 에스터라아제 2 (rPcAxe2)의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 레인 M: 분자량 마커, 레인 1: 정제된 rPcAxe2, 레인 2: 펩티드-N-글리코시다아제 F-처리 rPcAxe2, 레인 3: 엔도글리코시다아제 H-처리 rPcAxe2.
도 3은 재조합 아세틸 자일란 에스터라아제 2 (rPcAxe2)의 에스터라아제 활성에 대한 온도 (A), 열 안정성 (B) 및 pH (C)의 영향을 나타낸다.
도 4는 재조합 아세틸 자일란 에스터라아제 2 (rPcAxe2)의 에스터라아제 활성에 대한 금속 이온들의 영향을 나타낸다. 효소 반응은 5 mM의 각 이온, 1 mM의 PMSF 및 0.5%의 SDS 및 계면활성제의 존재 하에 수행되었다.
도 5는 재조합 아세틸 자일란 에스터라아제 2 (rPcAxe2)의 자일라나아제 활성을 나타낸다. (A) 온도의 영향; (B) pH의 영향; (C) 자일로-올리고머 가수분해. 자일로-올리고머 가수분해는 자일로비오스, 자일로트리오스 및 자일로펜타오스를 이용하여 수행되었다. 레인 1 및 9: 자일로-올리고머, 레인 2, 3, 5 및 7은 각각 자일로오스 (X1), 자일로비오스 (X2), 자일로트리오스 (X3) 및 자일로펜타오스 (X5)를 나타냄, 레인 4, 6, 8은 각각 rPcAxe2에 의한 자일로비오스, 자일로트리오스 및 자일로펜타오스 분해를 나타냄.
도 6은 자작나무 자일란 (birchwood xylan), 너도밤나무 자일란 (beechwood xylan) 및 아라비노자일란 (arabinoxylan)에 대한 재조합 아세틸 자일란 에스터라아제 2 (rPcAxe2) 및 재조합 엔도-자일라나아제 C (rPcXynC)의 상승적 작용을 나타낸다. 검은색 컬럼은 rPcAxe2로 37℃에서 30분 동안 전처리하고, 70℃에서 rPcXynC와 30분간 조합시킨 후 방출된 환원당을 나타낸다. 회색 컬럼은 rPcAxe2 및 rPcXynC를 70℃에서 10분 동안 조합시켜 방출된 환원당을 나타낸다. 흰색 컬럼은 rPcXynC에 의해 70℃에서 10분 동안 방출된 환원당을 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 백색 부후균 (Phanerochate chrysosporium) 유래의 탄수화물 결합 모듈 (carbohydrate binding module)을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제 (acetyl xylan esterase) 단백질을 제공한다. 상기 백색 부후균은 바람직하게는 파네로캐테 크리소스포리움 (Phanerochate chrysosporium) BKM-F-1767 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 탄수화물 결합 모듈을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제 단백질의 범위는 백색 부후균으로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 아세틸 자일란 에스터라아제 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 백색 부후균 유래의 탄수화물 결합 모듈을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 탄수화물 결합 모듈을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 탄수화물 결합 모듈을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제 단백질 코딩 유전자는 1,104개의 뉴클레오티드로 구성되어 있으며, 17개 잔기의 예측 신호 펩티드를 포함하는 총 367개의 아미노산을 암호화하고 있다.

또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열 (추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제 (즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 탄수화물 결합 모듈을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 대장균 발현 벡터 또는 효모 발현 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 대장균 발현 벡터로는 pET28a 벡터를 예로 들수 있으며, 효모 발현 벡터로는 pPICZA, pPICZαA, pPICZC 또는 pPICZαC 벡터를 예로 들 수 있으나, 해당 숙주에서 탄수화물 결합 모듈을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제 단백질의 발현에 적합한 벡터라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 효모 발현 벡터는 바람직하게는 5'에서 3' 방향으로

(a) 메탄올에 의해 조절되는 AOXI 프로모터를 코딩하는 핵산 서열;

(b) 효모 유래의 α-분비 인자 (α-secretion factor)를 코딩하는 핵산 서열; 및

(c) 백색 부후균 유래의 분비 신호 서열 (secretion signal sequence)을 포함하지 않는 탄수화물 결합 모듈을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제를 코딩하는 핵산 서열이 작동 가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용된 상기 AOXI (alcohol oxydase I) 프로모터는 피키아 파스토리스에서 유래하는 프로모터로서 메탄올의 존재하에서 형질전환체의 단백질 발현 효율을 극대화시키는 역할을 수행한다. 메탄올 자화를 통해 성장하는 피키아 파스토리스는 메탄올을 분해하기 위해 알코올 옥시다아제 (alcohol oxydase)를 균주 자체 중량 대비 30%까지 생산하는데, 이 효소의 생산을 위한 프로모터가 AOXI (Gene bank 등록번호: U96967)이며, 메탄올에 의해 발현이 크게 유도되는 특성을 가지고 있다. 본 발명에서는 바람직하게는 피키아 파스토리스 유래의 AOXI 프로모터를 사용할 수 있으며, 상기 AOXI 프로모터는 Invitrogen에서 상업적으로 판매하고 있는 pPICZA, pPICZαA, pPICZC 및 pPICZαC 벡터에 포함되어 있다.

본 발명에서 사용된 효모 유래의 α-분비 인자 (α-secretion factor)를 코딩하는 핵산 서열은 바람직하게는 효모 사카로마이세스 세레비지애 (Scccharomyces cerevisiae) 유래의 α-분비 인자 (Genbank 등록번호: NP_015137)를 일부 또는 전부 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 a-분비 인자는 목적 단백질을 세포 외부로 분비시키는 역할을 수행한다.

본 발명에서 사용된 백색 부후균 유래의 분비 신호 서열 (secretion signal sequence)을 포함하지 않는, 탄수화물 결합 모듈을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제를 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열 중 1번에서 17번까지의 분비 신호 서열을 포함하지 않는 아미노산 서열, 즉 서열번호 2의 아미노산 서열 중 18번에서 367번까지의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 의미한다.

본 발명의 아세틸 자일란 에스터라아제의 N-말단에 존재하는 탄수화물 결합 모듈 (carbohydrate binding module)은 다당류를 인식하고 결합하여 불용성 및 가용성 기질에 대한 효소의 가수분해 활성을 증가시키는 역할을 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 탄수화물 결합 모듈을 코딩하는 핵산 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열 중 18번에서 53번까지의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 의미한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들면, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보솜 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균 (E. coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ 프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들면, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터) 또는 효모 유래의 프로모터 (예를 들면, 피키아 파스토리스의 AOXI 프로모터)가 이용될 수 있으며, 바람직하게는 본 발명의 숙주 세포가 효모인 경우에 AOXI 프로모터를 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 일반적으로 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pPICZ 시리즈, pPICZα 시리즈, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으며, 바람직하게는 pPICZC 또는 pPICZαC 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 앰피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환되어 탄수화물 결합 모듈을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제를 생산하는 숙주세포를 제공한다. 상기 숙주세포는 바람직하게는 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 한세뉼라 폴리모파 (Hansenula polymorpha), 야로위아 (Yarrowia), 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주 (예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스 (K. lactis), 클루이베로마이세스 프라길리스 (K. fragilis), 클루이베로마이세스 불가리쿠스 (K. bulgaricus), 클루이베로마이세스 위커라미 (K. wickeramii), 클루이베로마이세스 왈티 (K. waltii), 클루이베로마이세스 드로소필라룸 (K. drosophilarum), 클루이베로마이세스 써모톨레란스 (K. thermotolerans) 및 클루이베로마이세스 마르시아누스 (K. marxianus))와 같은 효모일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및/또는 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli Top10, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스, 다양한 슈도모나스 종 균주 또는 효모 등의 균주가 있다. 본 발명에서 클로닝을 위한 숙주세포로는 E. coli Top10, 발현을 위한 숙주 세포로는 효모 피키아 파스토리스를 이용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 형질전환 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol . Biol ., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 (Dower, W.J. et al ., Nucleic . Acids Res ., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al ., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al ., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol . Cell Biol ., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

또한, 본 발명은

(a) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환하는 단계; 및

(b) 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 탄수화물 결합 모듈을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제의 발현을 유도한 후 분리 정제하는 단계를 포함하는 탄수화물 결합 모듈을 갖는 재조합 아세틸 자일란 에스터라아제 단백질의 대량 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 숙주세포는 바람직하게는 효모일 수 있으며, 상기 효모는 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 형질전환된 효모의 배양은 공지된 기술을 이용하여 재조합 단백질의 생산에 적합한 배지에서 이루어질 수 있다. 적합한 배양 배지는 상업적으로 입수하거나 예를 들면, American Type Culture Collection의 카탈로그와 같은 간행물에 기재된 성분 및 조성비에 따라 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 AOXI 프로모터에 의해 조절된다. 따라서 상기 형질전환된 효모를 메탄올이 포함된 배양 배지에서 배양하여 탄수화물 결합 모듈을 갖는 재조합 아세틸 자일란 에스터라아제의 분비를 유도할 수 있다. 재조합 아세틸 자일란 에스터라아제를 생산하기 위해 배지 내에 포함되는 메탄올의 농도는 바람직하게는 배지 중량 대비 0.1~1%일 수 있으며, 배양 중 추가로 메탄올을 첨가하는 것이 가능하다.

본 발명의 피키아 파스토리스로부터 분비된 탄수화물 결합 모듈을 갖는 재조합 아세틸 자일란 에스터라아제는 통상의 분리 정제 방법을 통해 최종 생산될 수 있다. 예를 들어 단백질은 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발 또는 침전을 포함하는 통상적인 방법에 의해서 배지로부터 분리될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 더 나아가 단백질은 크로마토그래피 (예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별 용해 (예를 들면 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하는 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단백질의 아세틸 자일란 에스터라아제 최적 활성 온도 및 pH는 각각 25~35℃, pH 6.5~7.5, 바람직하게는 30℃, pH 7.0일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 단백질의 자일라나아제 최적 활성 온도 및 pH는 각각 78~82℃, pH 4.8~5.4, 바람직하게는 80℃, pH 5.0일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 탄수화물 결합 모듈을 갖는 재조합 아세틸 자일란 에스터라아제 단백질은 셀룰로오스 결합 활성 및 자일란 분해 활성을 갖는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 탄수화물 결합 모듈을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제 단백질을 유효성분으로 포함하는 자일란 (xylan) 분해 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 자일란 분해 증진용 조성물은 자일라나아제 단백질을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 탄수화물 결합 모듈을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제 단백질 및 자일라나아제 단백질을 동시에 유효성분으로 포함하는 자일란 분해 증진용 조성물을 자일란 기질에 처리하거나, 탄수화물 결합 모듈을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물로 전처리된 자일란 기질에 자일라나아제 단백질을 유효성분으로 포함하는 조성물을 처리하면, 두 효소 단백질의 상승 작용 (synergistic action)으로 인하여 자일란의 분해 효율을 높이고, 환원당 생성을 향상시킬 수 있다. 즉, 유효성분으로 자일라나아제 또는 아세틸 자일란 에스터라아제를 단독으로 포함하는 조성물에 비하여 자일란 분해 효율 및 환원당 생성이 향상된다.

또한, 본 발명은 상기 탄수화물 결합 모듈을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제 단백질을 유효성분으로 포함하는 리그닌 (lignin) 분해 증진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 탄수화물 결합 모듈을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제 단백질은 과산화수소의 존재하에서 에틸아세테이트 (ethyl acetate)를 과아세트산 (peracetic acid; PAA)로 전환하는 능력을 갖는다. 본 발명의 아세틸 자일란 에스터라아제 단백질에 의해 생성된 과아세트산은 β-아릴 에테르 결합 및 방향족 고리에 연결된 탄소-탄소 및 탄소-산소 결합 두 가지 모두를 절단하여 리그닌을 가용성 절편으로 변환시킬 뿐만 아니라, O-메틸기의 탈알킬화 (dealkylation), 방향족 고리로 히드록실기의 도입 및 방향족 고리의 뮤콘산 (muconic acid)으로의 절단에 의해 리그닌의 가용성을 증대시킬 수 있다. 즉, 본 발명의 아세틸 자일란 에스터라아제는 자일란 및 자일로올리고당으로부터 아세테이트 방출에 기여하고, 리그닌을 분해함으로써 자일라나아제에 의한 자일란 분해 효율을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 탄수화물 결합 모듈을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제 단백질을 유효성분으로 포함하는 자일란 또는 리그닌 분해 증진용 조성물은 사료 첨가제, 세제 첨가제, 헤미셀룰로오스 당화용 첨가제, 리그노셀룰로오스 분해용 첨가제, 펄프제지 가공 및 생산용 첨가제, 자일리톨 생산용 첨가제, 삼베나 린넨 섬유 연화용 첨가제, 식품 가공용 첨가제, 바이오에너지 생산을 위한 바이오매스 전처리용 첨가제로 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 아세틸 자일란 에스터라아제 단백질을 헤미셀룰로오스 유래의 자일란에 처리하여 자일란 백본 (backbone) 내의 아세틸기 (acetyl group)를 제거하고 자일로오스를 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 탄수화물 결합 모듈을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제 단백질에 대한 항체를 제공한다. 본 발명의 항체는 본 발명의 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현 벡터에 클로닝하여 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 다클론 항체, 단클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 균주, 플라스미드 및 배지 배양

백색 부후균인 P. chrysosporium BKM-F-1767은 한국 생명공학연구원 유전자은행에서 입수하였고, Tien에 의해 기재된 것과 같은 배지에서 유지하였다 (Meth . Enzymol., 161, 238-249 (1988)). 대장균 (Escherichia coli) Top10은 일반적인 클로닝을 위해서는 50 ㎍/ml 앰피실린을 포함하고 IPTG 및 X-Gal이 첨가된 LB 아가 배지에서 배양했고, 발현 벡터로 구축된 PcAxe2 유전자를 위해서는 25 ㎍/ml의 제오신 (zeocin)을 포함하는 저염 LB 배지에서 배양했다. 이종성 (heterologous) 발현 숙주 피키아 파스토리스 X33 (야생형), GS115 (his4) 및 SMD1168 (his4 , pep4)은 Invitrogen으로부터 공급받았다. 원 배양액 (stock culture)은 YPD 아가 배지 (1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 덱스트로오스 및 1.5% 아가) 상에서 30℃로 밤새 배양하여 제조했다. rPcAxe2 발현은 100 mM 소듐 포스페이트 (pH 6) 및 1% 메탄올을 포함하는 YP 배지 (1% 효모 추출물 및 2% 펩톤)에 재조합 피키아 파스토리스를 접종하여 수행하였다.

pGEM-T Easy Vector (Promega)는 유전자 서열분석을 위해 PcAxe2 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 산물을 이용해 구축되었다. 벡터 pPICZC 및 pPICZαC (Invitrogen)는 피키아 파스토리스에서의 발현을 위해 이용되었다. 두 벡터에서 삽입물의 발현은 메탄올-유도성 AOX1 프로모터에 의해 제어된다. pPICZα는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 유래의 α-분비 인자의 신호 펩티드를 포함하며, pPICZ는 분비 신호를 포함하지 않는다.

2. 전체 cDNA 합성

총 mRNA는 Oligotex mRNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)을 이용하여 백색 부후균으로부터 추출했다. 총 cDNA는 SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit를 이용하여 제조사 (Clontech)의 권장 사항에 따라 합성하였다.

3. 재조합 플라스미드의 구축 및 형질전환

백색 부후균 PcAxe2의 뉴클레오티드 서열은 DOE Joint Genome Institute 웹사이트 (http://genome.jgi-psf.org/Phchr1)의 백색 부후균 유전체 데이터베이스에서 얻었다. 신호 펩티드를 포함하는 PcAxe2의 cDNA는 정방향 프라이머 (5'-CTCGAGATGTTCAAGCTCGCAGTC-3': 서열번호 3) 및 역방향 프라이머 (5'-TACGTACGCGATGCCGAGGAAC-3': 서열번호 4)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. PCR 증폭은 Pfu DNA 중합효소를 이용하여 94℃에서 1분, 30회 반복의 94℃에서 30초, 51℃에서 30초 및 72℃에서 2분의 조건으로 수행되었다. PCR 산물은 Taq DNA 중합효소를 이용하여 72℃에서 30분 동안 A-테일을 형성했고, pGEM-T Easy Vector에 클로닝하였다. 목적 PCR 산물을 보유한 형질전환체는 상기 언급된 특이적 프라이머를 이용한 콜로니 PCR로 스크리닝했다. 3가지 재조합 플라스미드를 무작위로 분리하고 서열을 분석했다. PcAxe2 유전자는 XhoI 및 SnaBI를 이용해 절단하였고, 이어서 0.8% 아가로스 겔 상에서 분리한 후 정제했다. 정제된 PcAxe2 유전자는 pPICZC 벡터로 삽입하였고, 결과물로 PICZC-PcAxe2를 얻었다. PcAxe2 α cDNA의 PCR 증폭은 pPICZαC로의 클로닝을 위해 정방향 프라이머 (5'-ATCGATACAAGTGCCCGTTTGGGG-3': 서열번호 5) 및 역방향 프라이머 (5'-TCTAGATACGCGATGCCGAGGAAC-3': 서열번호 6)를 이용하여 수행하였다. 정방향 프라이머는 증폭된 영역 내에 백색 부후균 PcAxe2 분비 신호를 포함하지 않는데, 이는 사카로마이세스 세레비지애의 분비 서열이 pPICZαC에 존재하기 때문이다. 사용된 PCR 조건은 PcAxe2 cDNA에 대해 상기 기재된 것과 동일했다. 결과물로 수득한 PCR 산물인 PcAxe2α는 pGEM-T Easy Vector에 클로닝하였고, ClaI 및 XbaI를 이용해 절단한 후 아가로스 겔 상에서 정제하고, pPICZαC에 삽입하여 결과물로 pPICZαC-PcAxe2 α를 얻었다. 대장균으로의 형질전환 및 플라스미드 DNA의 분리 후, 삽입물의 존재는 PCR 및 제한 효소 절단 후 아가로스-겔 전기영동에 의해 측정되었다. 서열 분석은 pPICZC-PcAxe2 및 pPICZαC-PcAxe2 α에 대해 수행되었다.

효모 균주를 형질전환하기 위해, 10 ㎍의 플라스미드는 PmeI을 이용하여 직선화하였고, 제조사 (Bio-Rad)에서 제시한 전기천공법을 이용하여 피키아 파스토리스에 형질전환하였다. 형질전환된 세포는 콜로니가 관찰될 때까지 (2 내지 3일), 100 ㎍/ml 제오신 (zeocin) 및 1 M 솔비톨을 포함하는 YPD 아가 플레이트 상에서 30℃로 배양하여 선별하였다. 재조합 피키아 파스토리스 클론은 AOX1 정방향 프라이머 (5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3': 서열번호 7) 및 역방향 프라이머 (5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3': 서열번호 8)를 이용한 PCR로 확인하였다.

4. 재조합 PcAxe2 ( rPcAxe2 )의 발현 및 생산

10개의 피키아 파스토리스 형질전환체는 효소 분석으로 세포외 효소 활성을 측정하기 위해 1% 메탄올을 포함하는 50 ml YP 배지에서 배양하였다. rPcAxe2 발현을 측정하기 위해, 단일 콜로니를 30℃ 및 200 rpm으로 5 ml YPD 배지에서 밤새 배양하였다. 이어서, 5 ml의 배양액을 1% 글리세롤을 포함하는 50 ml의 새로운 YP 배지에 옮겨 1일 동안 30℃ 및 150 rpm의 교반 배양기에서 배양하였다. 세포 펠렛은 2000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 수집하였고, 세포 펠렛을 10 ml YP 배지에 다시 현탁시켰다. 이어서, 현탁액은 광학 밀도 1에 도달할 때까지, 110 mM 소듐 포스페이트 (pH 6)가 첨가된 새로운 YP 배지 90 ml에 서서히 첨가했다. 최종적으로, 새로운 YP 배지를 첨가하여 최종 부피를 100 ml로 만들었다. rPcAxe2를 유도하기 위해, 1 ml의 100% 메탄올은 25℃에서 배양 7일 동안 최종 농도 1%까지 매 24시간마다 첨가되었다. 1 ml의 미정제 여과액을 매 24시간마다 수집하였고, 15,000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후, 효소 활성을 측정했다.

5. 효소 정제

rPcAxe2의 정제를 위해, 배양 2일째에 세포가 없는 상층액을 2,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 수집하고, 0.45 ㎛ 필터로 여과했다. 전체 90 ml의 여과된 상층액은 10 ml의 10×결합 버퍼 (20 mM 소듐 포스페이트, 0.5 M NaCl, 및 20 mM 이미다졸; pH 7.4)와 혼합했다. 혼합물은 AKTA 고속 단백질 액체 크로마토그래피 정제 시스템을 이용하여 Ni² ⁺ His-태그 컬럼 (Histrap-GE Healthcare)에 적용했다. 단백질은 용출 버퍼 (20 mM 소듐 포스페이트, 0.5 M NaCl 및 500 mM 이미다졸; pH 7.4)를 이용하여 용출시켰고, 15 ml 분획으로 수집했다. 정제된 효소를 포함하는 모든 분획은 염 및 이미다졸을 제거하기 위해 4℃에서 증류수로 밤새 투석했다.

6. rPcAxe2 에 의한 셀룰로오스 및 자일란 결합

rPcAxe2 (10 U)는 100 mM 소듐 포스페이트 (pH 7.0)에서 100 mg의 미세결정성 셀룰로오스 또는 자작나무 자일란 (Sigma)과 함께 약하게 교반하면서 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 샘플은 Poly-Prep® 컬럼 (Bio-Rad) 상에 적용하였고, 3배 컬럼 부피의 버퍼로 세척했다. 비특이적 결합을 제거하기 위해, 컬럼은 0.25% BSA (bovine serum albumin)을 포함하는 3배 컬럼 부피의 버퍼로 세척했다. 결합된 효소의 용출은 1.3% 셀로비오스 또는 자일로비오스를 각각 포함하는 유사한 부피의 버퍼로 세척하여 수행했다. 모든 분획 내의 Axe 활성은 하기에 기재된 바와 같이 측정했다.

7. 탈글리코실화 ( deglycosylation ) 및 전기영동

rPcAxe2 글리코실화는 엔도글리코시다아제 H 및 펩티드-N-글리코시다아제 F를 이용하여 분석했다. 약 2 ㎍의 정제된 rPcAxe2는 500 유닛 (unit)의 효소와 함께 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 효소 반응 후, 탈글리코실화된 rPcAxe2는 Sambrook 등에 의해 기재된 바와 같이 SDS-PAGE를 수행하였다 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed, Cold Spring Harbor, New York (2003)).

8. 효소 분석

Axe 활성은 Chung 등에 의해 기재된 바와 같이 분광계로 측정했다 (Enzyme Microb.Technol., 31, 384-391 (2002)). 10 ㎕의 상층액은 30℃에서 980 ㎕의 100 mM 소듐 포스페이트 버퍼 (pH 7)와 혼합했다. 반응은 10 ㎕의 10 mmol p-니트로페닐 아세테이트를 첨가하여 개시했고, 혼합물은 30℃에서 5분 동안 반응시켰다. 방출된 p-니트로페놀은 TCC-240A UV 분광계 (Shimadzu)를 이용하여 410 nm의 파장에서 측정했다. 1 유닛의 Axe 활성은 37℃에서 분 당 1 mmol의 p-니트로페놀 방출에 필요한 효소의 양으로 정의된다. 단백질 농도는 표준 물질로 혈청 알부민을 사용하여 Thermo Scientific Protein Assay 키트 (Rockford)를 이용한 Bradford 방법으로 추산했다.

자일라나아제 활성은 DNSA (3,5-dinitrosalicylic acid)를 이용해서 자작나무 자일란 (Sigma) 유래의 환원당 생성을 측정하여 분석했다. 1 유닛의 효소는 1 μmol/min의 자일로오스 방출로 정의되었다.

9. 아세틸 자일란 에스터라아제 활성에 대한 pH , 온도, 금속 이온, 세제 및 계면활성제의 영향

rPcAxe2에 대한 pH의 영향은 4.5 내지 8.5 범위의 다양한 pH 수준의 100 mM 소듐 포스페이트 버퍼를 이용하여 35℃에서의 효소 활성을 분석하여 측정했다. 최적 온도는 최적 pH로 10 내지 50℃ 범위에서 조사했다. rPcAxe2의 열 안정성은 적절한 온도 (10 내지 50℃)에서 1시간 동안 효소 용액을 배양하여 결정했다.

rPcAxe2 활성에 대한 금속 이온들 (Mn² ⁺, K⁺, Ca² ⁺, Co² ⁺,Fe² ⁺, Fe³ ⁺, Cu² ⁺, Mg²⁺, Zn² ⁺ 및 Ni² ⁺), 저해제 PMFS (phenylmethane sulfonyl fluoride) 및 계면활성제 (Tween20, Tween80, Triton X-100 및 SDS)의 영향은 효소의 특성을 더 규명하기 위해 조사되었다. rPcAxe2는 상기 언급한 화학물질들과 35℃에서 1시간 동안 전배양되었고, 잔류 활성은 표준 Axe 분석을 이용하여 측정했다. 사용한 각 금속 이온 및 PMSF의 최종 농도는 각각 5 mM 및 1 mM이었으며, SDS 및 계면활성제의 농도는 0.5%였다.

10. 자일라나아제 활성 및 자일로- 올리고머 가수분해에 대한 온도 및 pH 의 영향

자일라나아제 활성의 최적 온도는 40 내지 90℃의 온도에서 상기 기재된 것처럼 자일라나아제 분석을 수행하여 결정했으며, 3.0 내지 8.0의 pH 범위가 최적 pH 결정에 이용되었다.

각각 5 mM, 3.3 mM 또는 2 mM 농도의 자일로비오스, 자일로트리오스 또는 자일로펜타오스 (Sigma)를 100 ㎕의 50 mM 소듐 아세테이트 버퍼 (pH 5.0)에서 1 U의 rPcAxe2와 함께 30분 동안 80℃로 반응시켰다. 반응은 100℃로 5분 동안 가열하여 종결시켰고, 이어서 1 ㎕의 반응 산물을 취하여 클로로포름/아세트산/H₂O (6:7:1)를 이동상으로 사용한 실리카 겔 상의 박층 크로마토그래피 (TLC)를 이용하여 분석했다.

반응 산물은 TLC 플레이트에 1 mg/ml의 오르시놀 (orcinol)을 포함하는 황산/에탄올 (5:95, v/v)을 분사한 후, 110℃에서 5분 동안 베이킹 (baking)하여 가시화되었다. 자일로오스, 자일로비오스, 자일로트리오스 및 자일로펜타오스는 표준물질로 사용되었다.

11. 과아세트산 ( peracetic acid ) 생합성

rPcAxe2의 과가수분해 (perhydrolysis) 활성은 Park의 문헌에 기재된 바와 같이 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 이용하여 술폭시드 (sulfoxide) 함량을 추정하여 정량적으로 측정했다 (J. Biosci . Bioeng ., 112, 473-475 (2011)). 4 유닛의 rPcAxe2는 500 mM 에틸 아세테이트 및 1 M 과산화수소를 포함하는 1 ml의 100 mM 소듐 포스페이트 버퍼 (pH 7.0)와 함께 35℃에서 30분 동안 반응시켰다. 이어서, 0.1 ml의 반응 용액을 0.1 ml의 20 mM 메틸 p-톨릴 설파이드 (MTS) 및 0.8 ml의 60% 아세토니트릴과 혼합하였고, 35℃에서 60분 동안 다시 반응시켰다. 10 mg의 이산화망간을 용액에 첨가하고, 15,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. MTS 및 메틸 p-톨릴 술폭시드 및 메틸 p-톨릴 술폰과 같은 산화 유도체의 양은 HPLC (Shimadzu)로 분석하였다.

12. rPcXynC 와의 상승적 작용

자일란 (자작나무 자일란, 너도밤나무 자일란 및 아라비노자일란) 분해에 대한 rPcAxe2의 상승적 작용은 rPcXynC를 이용하여 조사되었다 (Huy et al ., J. Biosci. Bioeng ., 111, 654-657 (2011)). 총 200 ㎕의 반응 부피에서 50 mM 소듐 아세테이트 (pH 5.0) 중의 약 1 mg의 자일란 기질이 모든 작용을 조사하기 위해 사용되었다. 자일란은 100 mU의 rPcAxe2로 30분 동안 37℃에서 전처리한 후 200 mU의 rPcXynC로 70℃에서 10분 동안 처리되거나, 또는 100 mU의 rPcAxe2 및 200 mU rPcXynC로 70℃에서 10분 동안 동시에 처리되었다. 200 mU의 rPcXynC를 이용한 70℃에서 10분간의 자일란 가수분해가 대조구로 수행되었다. 방출된 전체 환원당은 상기 기재된 것처럼 DNSA 방법으로 측정하였다.

실시예 1. PcAxe 2 의 클로닝 및 서열분석

백색 부후균 RP78 Axe1 및 Axe2 유전자의 예측된 뉴클레오티드 서열을 근거로 하여 백색 부후균 BKM-F-1767의 총 cDNA로부터 Axe 유전자를 증폭하기 위해 특이적 프라이머가 고안되었다. 예측된 Axe2 유전자의 PCR 산물을 수득하였고, PcAxe2로 명명했다. 상기 cDNA 산물의 뉴클레오티드 서열은 그것이 1,104개의 뉴클레오티드로 구성되고, 버전 1.0의 백색 부후균 RP78 게놈 서열의 단백질 모델 지정번호 63763 (또는 Axe 2)이 있는 유전자 모델에 해당한다는 것을 보여주었다.

웹사이트 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 상에서 이용가능한 신호 펩티드 검출 도구를 이용하여 17개 아미노산의 신호 펩티드가 동정되었다. 활성 부위 세린 효소의 일치 모티프 (Gly-Thr-Ser-Ser-Gly) 및 2개의 N-글리코실화 부위 (Asn-Val-Thr 및 Asn-Ala-Thr)가 또한 PcAxe2에서 발견되었다 (도 1). PcAxe2 아미노산 서열은 BLAST를 이용해서 검색했고, ClustalW 버전 2.0 소프트웨어 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)로 정렬했다. 도 1에 나타낸 것처럼, PcAxe2는 아스퍼질러스 피쿰 (A. ficuum)(51%), 아스퍼질러스 나이거 (A. niger)(52%), 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae)(51%), 탈라로마이세스 에메르소니 (Talaromyces emersonii)(53%) 및 아스퍼질러스 가와치 (A. kawachii)(50%) 유래의 Axe와 눈에 띄는 수준의 동일성을 나타냈다. PcAxe2의 Asp294 및 His351은 Axe에서 고도로 보존된 잔기이며, 이는 촉매에 중요한 것으로 예상된다 (12). PcAxe2의 N-말단 영역의 균류 탄수화물 결합 모듈 (CBM)은 Scanprosite 도구 (http://prosite.expasy.org/scanprosite/)를 이용해서 밝혔으며 (도 1A), 대부분의 Axe는 N-말단에 CBM을 포함하지 않으므로, 이는 PcAxe2가 다른 Axe와 상이할 수 있다는 것을 제시한다. NCBI 사이트 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)에서 Conserved Domain Search의 결과에 따르면 PcAxe2의 CBM은 CBM1 패밀리에 속하는데, 이는 백색 부후균 유래의 엔도-1,4-β-자일라나아제 A (GenBank: AAG44992.1), 디코미투스 스쿠알렌스 (Dichomitus squalens) 유래의 셀로비오히드롤라아제 II (GenBank: EJF66131.1) 및 카보하이드레이트 에스터라아제 패밀리에서 분류된 다른 균류 에스터라아제와 유의한 동일성 (81 내지 67%)을 보여준다 (도 1B).

실시예 2. rPcAxe2 의 발현 및 생산

메틸영양체 (methylotrophic) 효모 피키아 파스토리스는 기본적인 실험실 연구 및 산업용 목적 두 가지 모두에 대해 mg에서 g 수준 양의 단백질을 발현하기 위한 유용한 시스템이다. 피키아 파스토리스는 분비 신호 서열 인식에 낮은 수준의 특이성을 필요로 하며, 따라서 많은 재조합 단백질이 본래의 분비 신호 펩티드를 사용하여 피키아 파스토리스에서 발현될 수 있다. 게다가, 피키아 파스토리스의 글리코실화 시스템은 사카로마이세스 세레비지애와 같은 다른 이종성 (heterologous) 발현 시스템의 글리코실화 시스템보다 덜 효율적이어서 본래 재조합 단백질 또는 덜 하이퍼글리코실화 (hyperglycosylate)된 형태의 단백질을 분비한다 (Daly et al ., J. Mol . Recognit ., 18, (2005)). 본 연구에서, 본 발명자는 백색 부후균 PcAxe2 자체의 내재적 분비 신호 및 α-인자 분비 신호 두 가지를 이용하여 피키아 파스토리스 GS115, X33 및 SMD1168 균주에서 rPcAxe2를 발현시켰다. 효소 분석 및 웨스턴 블럿 분석에 의한 결과는 이러한 재조합 피키아 파스토리스 균주들이 내재적 분비 신호를 이용하여 구축되었을 때, 유도 배지 내에 rPcAxe2를 생산하지 않는다는 것을 보여주었다 (데이터 미제시).

본 발명에서, 본 발명자는 프로테이나아제 A-결핍 균주인 피키아 파스토리스 SMD1168에서의 감소된 단백질 분해로 인해 백색 부후균 유래의 수많은 효소들의 발현 수준이 X33 및 GS115와 같은 다른 피키아 파스토리스 균주의 발현 수준보다 더 높다는 것을 증명했다 (데이터 미제시). α-인자 분비 신호를 이용한 rPcAxe2 발현도 피키아 파스토리스 SMD1168 균주에서 더 많았다. rPcAxe2는 1% 메탄올 유도에 의해 1일 후부터 생산되었다. 효소 축적은 4일째까지 극적으로 증가하여, 938 U/l에 도달했고, 얻어진 최대 rPcAxe2 활성은 배양 6일 후에 1,058 U/l였다. rPcAxe2는 세포가 없는 상층액으로부터 정제했다. p-니트로페닐 아세테이트에 대한 특이적 활성은 39.86 U/mg이었으며, K_m 및 V_max 값은 각각 92.2 μmol 및 7.4 μmol/min/ml이었다 (표 1).

백색 부후균 (P. chrysosporium) 및 아스퍼질러스 피쿰 (A. ficcum) 유래의 rAXE의 생화학적 특성 비교

		P. chrysosporium	A. ficcum
rAXE	최적 pH	7.0	7.0
	최적 온도	30-35	35-40
	특이적 활성 (U/mg)	39.86	32.5
	K_m (μmol)	92.2	94.6
	V_max (μmol/min/ml)	7.4	4.5
PAA 생합성 (mM/㎍)		0.145	0.134
자일라나아제 특이적 활성 (U/mg)		2	ND

ND : 검출되지 않음

rAXE 활성은 p-니트로페닐 아세테이트를 기질로 사용하여 분석되었으며, 자일라나아제 활성은 1% 자작나무 자일란을 이용하여 측정되었다.

실시예 3. rPcAxe2 에 의한 셀룰로오스 및 자일란 결합

컬럼으로부터 용출된 모든 분획의 효소 분석에서 자작나무 자일란에 대한 rPcAxe2의 결합이 없는 것으로 나타났으나, 셀룰로오스에 대한 결합 효율은 4.53±0.35%로 관찰되었다.

실시예 4. 탈글리코실화

정제된 rPcAxe2의 분자량은 SDS-PAGE로 측정하였다. 결과는 63 kDa 부근에 단일 밴드를 나타냈다 (도 2). rPcAxe2의 이론적 분자량은 약 37 kDa이지만, 2개의 잠재적인 N-글리코실화 부위가 PcAxe2 서열에서 발견되었다. 또한 백색 부후균 유래의 재조합 자일라나아제, 만난나아제 및 망가니즈 퍼옥시다아제 (manganese peroxidase)는 피키아 파스토리스에서 하이퍼글리코실화된 형태로 발현되었다 (Huy et al ., J. Biosci . Bioeng ., 111, 654-657 (2011)). rPcAxe2는 펩티드-N-글리코시다아제 및 엔도글리코시다아제 H로 처리했고, 그 결과는 rPcAxe2의 분자량이 펩티드-N-글리코시다아제 (도 2의 레인 2) 및 엔도글리코시다아제 H (도 2의 레인 3) 처리에 의해 55 kDa으로 감소하는 것으로 나타났다 (도 2). 따라서, 피키아 파스토리스는 rPcAxe2를 하이퍼글리코실화 단백질로서 생산한다. rPcAxe2의 불완전한 탈글리코실화는 PcAxe2 상에 위치하는 O-글리코실화 부위 때문일 수 있는데, 이는 YinOYang 1.2 도구 (http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOYang/)를 이용한 진핵세포 단백질 서열 결정 동안 O-β-GlcNAc 결합 부위에 의해 발견되었다.

실시예 5. rPcAxe2 활성에 대한 온도 및 pH 의 영향

정제된 rPcAxe2는 30 내지 35℃에서 최대 활성을 나타냈다 (도 3A). 효소 열 안정성은 반응 혼합물을 다양한 온도에서 1시간 동안 배양하여 시험했다. 도 3B는 효소가 30℃ 이하의 온도에서 배양되었을 때 활성을 잃지 않으나, 그의 잔류 활성은 30℃를 초과했을 때 신속하게 감소하는 것을 나타낸다.

rPcAxe2 효소의 최적 pH는 7.0이었으며, pH가 6.5 미만이거나 또는 7.5를 초과하는 경우에는 신속하게 감소했다 (도 3C).

실시예 6. 금속 이온, 세제 및 계면활성제의 영향

본 발명의 결과는 시험한 대부분의 금속 이온이 rPcAxe2 활성에 대해 저해 효과를 갖는다는 것을 보여주었다. rPcAxe2 활성은 Mn² ⁺, Co² ⁺, Cu² ⁺및 Ni² ⁺의 존재 하에서 50% 미만이었다. 특히, Fe² ⁺는 보유하고 있는 rPcAxe2 활성이 1.6%로 떨어졌을 때 rPcAxe2에 대해 강력한 저해를 나타냈다. Ca² ⁺ 및 Mg² ⁺ 이온은 자극 효과를 가졌으며, 각각 9.6% 및 11.9%로 활성을 증가시켰다 (도 4). Triton X-100 및 SDS는 rPcAxe2 활성을 각각 78.11% 및 61.42%로 저하시켰다. 그러나 PMSF, Tween20 및 Tween80은 rPcAxe2에 대해 강한 효과를 갖지 않았다 (보유 활성 90% 초과).

실시예 7. 자일라나아제 활성

rPcAxe2의 자일란 분해 능력은 1% 자작나무 자일란을 이용해서 시험했다. 그 결과는 rPcAxe2의 자일라나아제 특이적 활성이 2 U/mg인 것으로 나타났다 (표 1). 도 5의 A 및 B가 나타내는 바와 같이, rPcAxe2의 자일란 분해를 위한 최적의 pH 및 온도는 각각 5.0 및 80℃이다. rPcAxe2는 자일로펜타오스를 가수분해하여, 자일로비오스 및 자일로트리오스를 방출했다 (도 5C). 그러나, 가수분해 활성은 매우 낮았다. 글리코실 히드롤라아제 도메인 및 탄수화물 에스터라아제 도메인을 가진 자일라나아제의 이중적 기능이 보고된 바 있다 (Pai et al ., Appl . Microbiol . Biotechnol., 85, 1451-1462 (2010)). 그러나, Axe의 자일라나아제 활성에 대한 보고는 아직 없다. 흥미롭게도, 본 연구의 rPcAxe2는 자일라나아제 및 에스터라아제에 대한 최적의 조건이 완전히 다르다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 PcAxe2가 그것의 관찰된 효과에 대해 2개의 구분되는 촉매 도메인을 갖는다는 것을 제시한다.

실시예 8. 과아세트산 생합성

에틸 아세테이트로부터 rPcAxe2에 의해 인 시투 (in situ) 촉매된 과아세트산 (peracetic acid; PAA) 생합성을 연구했다. 그 결과는 합성된 PAA가 58.34%의 MTS 기질을 산화시킨다는 것을 나타냈다. 아스퍼질러스 피쿰 유래의 재조합 아세틸 자일란 에스터라아제 (rAxe)와 비교했을 때, rPcAxe2에 의해 촉매된 PAA 농도는 아스페르길루스 피쿰의 rAxe보다 낮았으나, 65.9%의 MTS는 두 반응 모두에서 동일한 수의 효소 유닛에 의해 산화되었다. 그러나, rPcAxe2의 특이적 활성은 아스퍼질러스 피쿰 rAxe의 활성보다 더 높았다 (각각 39.86 및 32.5 U/mg). 따라서, PAA 합성을 촉매하는 rPcAxe2의 능력은 동일한 양의 정제된 효소를 사용했을 때 아스퍼질러스 피쿰 rAxe의 능력보다 더 높았다 (표 1). PAA는 리그닌 분해에 대해 선택적인 시약이다. 이것은 β-아릴 에테르 결합 및 방향족 고리에 연결된 탄소-탄소 및 탄소-산소 결합 두 가지 모두를 절단하여 리그닌을 가용성 절편으로 변환시킬 뿐만 아니라, O-메틸기의 탈알킬화 (dealkylation) 및 방향족 고리에 히드록실기의 도입 및 방향족 고리의 뮤콘산 (muconic acid)으로의 절단에 의해 리그닌의 가용성을 증대시킨다 (Yin et al ., Bioresour . Technol ., 102, 5183-5192 (2011)). 따라서, 리그닌 제거 능력을 향상시키는 PAA는 바이오매스의 분해 과정에서 전처리 단계를 위한 훌륭한 후보물질이 될 수 있다.

실시예 9. rPcXynC 와의 상승 작용

바이오매스 분해에 대한 rPcAxe2의 적용성의 관점에서, 본 발명자는 자일란을 기질로 사용하여 rPcAxe2 및 rPcXynC의 상승 효과를 조사했다. 도 6에 도시된 것처럼, rPcXynC는 자작나무 자일란, 너도밤나무 자일란 및 아라비노자일란을 기질로 사용했을 때, 각각 338, 438 및 374 ㎍의 환원당을 생산했다. rPcAxe2 및 rPcXynC의 조합은 환원당의 방출을 각각 19.4%, 11.2% 및 6.3%씩 증가시켰다. 더욱이, 이들 기질의 rPcAxe2에 의한 30분간의 전처리는 환원당 방출을 각각 26.4%, 17.7% 및 15.1% 향상시켰다.

rPcAxe2는 자일라나아제 활성을 나타내지만, 특이적 활성은 rPcXynC와 비교했을 때 매우 낮다. 게다가, 효소 가수분해에 대한 식물 세포벽 저항성 메커니즘에서 에스테르기의 역할은 이미 명백하게 증명되어 있다 (Grohmann et al ., Appl Biochem Biotechnol ., 20-21, 45-61 (1989)). 따라서, rPcAxe2의 작용에 의한 자일란 기질로부터의 환원당의 향상된 방출은 자일란 및 자일로올리고당으로부터의 아세테이트 방출에 기여할 수 있으며, 이는 rPcXynC가 이들 자일란 기질을 빠르게 가수분해되게 한다.

본 발명자는 목재-분해균인 백색 부후균 (P. chrysosporium) 유래의 CBM 수퍼패밀리 1을 갖는 신규한 유형의 아세틸 자일란 에스터라아제인 rPcAxe2를 보고했다. rPcAxe2는 아세틸기를 절단할 뿐만 아니라, 자일란 백본 (backbone)을 가수분해하고, 과아세트산 생산을 촉매한다. 게다가, rPcAxe2는 엔도-자일라나아제와의 조합에서 자일란 유래의 전체 환원당 생성을 향상시킨다. 따라서, rPcAxe2는 리그노셀룰로오스계 바이오매스의 분해에 유용한 효소이다.

<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY NBM Co., Ltd <120> Method for high production of recombinant bifunctional acetyl xylan esterase with carbohydrate binding module from Phanerochaete chrysosporium <130> PN13010 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1104 <212> DNA <213> Phanerochaete chrysosporium <400> 1 atgttcaagc tcgcagtcgc cctcgcgtct ttagctacgc tcgctgcggc acaagtgccc 60 gtttggggac agtgtggtgg cattggccac tctggctcaa cagtctgcgc tgccggaaat 120 gtctgcactg agtacagcgc gtactacagc cagtgcatcc cgggcacaaa ctctgcccct 180 cctcctcccg catctccgcc gcccactacc actgtcagcg ttccgacgac ttcgtccgtc 240 acgggtaccg cgcctaccgg cctctcgtcc atcccggcct cgacactgtt ccagttcagc 300 aactttggca cgaacccgaa cggcgtgacg atgtacgtct acaagccgaa gaacgtccag 360 ccgaagccgg ccttgatcgt tgccagccac tactgcagtg gtaccgccca agcgtactac 420 acaggctcca agttcgccca gcttgccgag acatacggct acgtcgtcat ctacccctct 480 tcgccgcact ctggcacctg ctgggatgtc tcgtctgatg agacgctcat gcacaacggc 540 ggaagcgact cgctctcgat cgcgaacgcg gcacgctttg cgatcagcaa ctggggcgtc 600 gacccgaacc gcgtcttcgc cgtcggcacg tcctccggcg cgatgatgac gagcgtgctc 660 gcgggcgcgt accccgacat cttcaaagct ggcatcgtcg actccggcgt cgcgttcggt 720 tgcttcgccg tcccgggaca gcccgacgac agctggaatt cgcagtgctc gcagggccag 780 atgatcctta ctggccaaca atgggcccag aaggtctaca acgcgtatcc cggctacacc 840 ggcgcacgcc ccaagatgca ggtctggcac ggaacaatcg acacgaccct ctacccgcag 900 aacttctggg aggaaatcaa gcagtggacg accgtcttcg gctacccgag caacccgatc 960 tcaaacgtca ccgagtcgta cctgccccgc ggctactcca atgcgaccta cggccccaac 1020 ttccaggcga tcctcgccca gaacgtcggc cacaccgtcc cgctcttcga gcagcagtac 1080 ctgcagttcc tcggcatcgc gtaa 1104 <210> 2 <211> 367 <212> PRT <213> Phanerochaete chrysosporium <400> 2 Met Phe Lys Leu Ala Val Ala Leu Ala Ser Leu Ala Thr Leu Ala Ala 1 5 10 15 Ala Gln Val Pro Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly His Ser Gly 20 25 30 Ser Thr Val Cys Ala Ala Gly Asn Val Cys Thr Glu Tyr Ser Ala Tyr 35 40 45 Tyr Ser Gln Cys Ile Pro Gly Thr Asn Ser Ala Pro Pro Pro Pro Ala 50 55 60 Ser Pro Pro Pro Thr Thr Thr Val Ser Val Pro Thr Thr Ser Ser Val 65 70 75 80 Thr Gly Thr Ala Pro Thr Gly Leu Ser Ser Ile Pro Ala Ser Thr Leu 85 90 95 Phe Gln Phe Ser Asn Phe Gly Thr Asn Pro Asn Gly Val Thr Met Tyr 100 105 110 Val Tyr Lys Pro Lys Asn Val Gln Pro Lys Pro Ala Leu Ile Val Ala 115 120 125 Ser His Tyr Cys Ser Gly Thr Ala Gln Ala Tyr Tyr Thr Gly Ser Lys 130 135 140 Phe Ala Gln Leu Ala Glu Thr Tyr Gly Tyr Val Val Ile Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Ser Pro His Ser Gly Thr Cys Trp Asp Val Ser Ser Asp Glu Thr Leu 165 170 175 Met His Asn Gly Gly Ser Asp Ser Leu Ser Ile Ala Asn Ala Ala Arg 180 185 190 Phe Ala Ile Ser Asn Trp Gly Val Asp Pro Asn Arg Val Phe Ala Val 195 200 205 Gly Thr Ser Ser Gly Ala Met Met Thr Ser Val Leu Ala Gly Ala Tyr 210 215 220 Pro Asp Ile Phe Lys Ala Gly Ile Val Asp Ser Gly Val Ala Phe Gly 225 230 235 240 Cys Phe Ala Val Pro Gly Gln Pro Asp Asp Ser Trp Asn Ser Gln Cys 245 250 255 Ser Gln Gly Gln Met Ile Leu Thr Gly Gln Gln Trp Ala Gln Lys Val 260 265 270 Tyr Asn Ala Tyr Pro Gly Tyr Thr Gly Ala Arg Pro Lys Met Gln Val 275 280 285 Trp His Gly Thr Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Pro Gln Asn Phe Trp Glu 290 295 300 Glu Ile Lys Gln Trp Thr Thr Val Phe Gly Tyr Pro Ser Asn Pro Ile 305 310 315 320 Ser Asn Val Thr Glu Ser Tyr Leu Pro Arg Gly Tyr Ser Asn Ala Thr 325 330 335 Tyr Gly Pro Asn Phe Gln Ala Ile Leu Ala Gln Asn Val Gly His Thr 340 345 350 Val Pro Leu Phe Glu Gln Gln Tyr Leu Gln Phe Leu Gly Ile Ala 355 360 365 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 ctcgagatgt tcaagctcgc agtc 24 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 tacgtacgcg atgccgagga ac 22 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 atcgatacaa gtgcccgttt gggg 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 tctagatacg cgatgccgag gaac 24 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 gactggttcc aattgacaag c 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 gcaaatggca ttctgacatc c 21

Claims

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서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 백색 부후균 (Phanerochate chrysosporium) 유래의 탄수화물 결합 모듈 (carbohydrate binding module)을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제 (acetyl xylan esterase) 단백질을 유효성분으로 포함하는 자일란 (xylan) 분해 증진용 조성물.
제14항에 있어서, 상기 조성물은 자일라나아제 단백질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 자일란 분해 증진용 조성물.
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서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, 백색 부후균 (Phanerochate chrysosporium) 유래의 탄수화물 결합 모듈 (carbohydrate binding module)을 갖는 아세틸 자일란 에스터라아제 (acetyl xylan esterase) 단백질을 헤미셀룰로오스 유래의 자일란에 처리하여 자일란 백본 (backbone) 내의 아세틸기 (acetyl group)를 제거하고 자일로오스를 생산하는 방법.
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