一种新金分枝杆菌及其在制备9-羟基黄体酮中的应用
技术领域
本发明属于生物工程领域,涉及一种新金分枝杆菌及其在制备甾体化合物中间体9-羟基黄体酮中的用途。
背景技术
甾体类药物是仅次于抗生素的全球第二大药物,生理活性多种多样、在现实生活中应用十分广泛。全球每年对甾体类药物有巨大需求量,可见对甾体类药物合成的研究可以产生巨大的经济效益。早年对甾体药物的合成多采用化学方法,但工艺复杂、成本高、产量低且污染大;近年来大多采用反应专一且高效、成本低、反应条件温和、污染小的微生物转化法获得所需的甾体药物。
微生物可以选择性地修饰或改造甾体化合物分子结构,这是通过微生物产生的酶催化进行的。1952年,美国普强药厂的生物化学家D.H.彼得森和微生物学家H.C.默里发现少根根霉能使孕酮的11碳位羟基化,生成11α-羟基孕酮,科学家们又相继发现细菌、真菌、放线菌中的某些种,可以使一定结构的甾体化合物在一定的部位上发生分子结构的改变。这种酶促反应具有严格的底物特异性,一般能使底物分子上1个或2个基团起反应。至今已发现微生物转化甾体化合物的反应类型几乎包括任何已知的微生物酶促反应和已经发现的化学反应,如氧化、还原、水解、缩合、异构化、新的碳碳键的形成以及杂基团的导入等。通常,一个酶促反应可以代替几个化学反应步骤,这就使甾体药物的合成工艺变得更有效并更经济。9-羟基黄体酮为一重要的甾体中间体,可进一步用以生产甾体类药物,如可的松、强的松等皮质激素类药物。
能够降解甾体物质的微生物在我们生活的环境中大量存在,但是其中的许多种类的微生物可将甾体物质如黄体酮完全降解为CO2和水。然而,当前并没有直接利用微生物将黄体酮转化为9-羟基黄体酮的相关报道。
发明内容
基于此,本发明的目的是提供一种新金分枝杆菌的突变株,本发明提供的新金分枝杆菌的突变株丧失了完全降解黄体酮的能力,但还保留其对甾体化合物的修饰能力,如C9位的羟基化,因此能够以黄体酮为发酵底物,发酵产生9-羟基黄体酮及其类似物,HPLC结果显示9-羟基黄体酮产率可达52-62%。本发明还提供了基于该新金分枝杆菌的突变株制备9-羟基黄体酮的方法,本发明的方法有助于9-羟基黄体酮的微生物转化生产,以满足当前市场对9-羟基黄体酮的需求。
一方面,本发明提供了一种用于将黄体酮转化为9-羟基黄体酮的新金分枝杆菌MN-ZX1,该新金分枝杆菌的保藏编号为CGMCC No.13901。
该新金分枝杆菌MN-ZX1的分类命名为新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum),目前该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC),保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏编号为CGMCCNo.13901,保藏日期为2017年3月20日。
该菌株具有下述性质:
1、菌落形态学特征:
将本发明的菌株于28℃下,在营养固体培养基上培养生长,3-5天后,得到直径约为3~10mm的金黄色菌落,菌落呈圆形,表面光滑。
2、菌株形态学特征:
本发明的菌株显微镜下呈现圆杆状,与分枝杆菌属镜下形态一致。
3、生理与生化特性:
本发明的菌株培养温度为28-32℃,最适生长温度为32℃,并且在pH为6.0-8.0的条件下生长较好。
4、营养特征:
本发明的菌株无需特殊营养素,使用基础培养基培养,专性需氧。
其中,所述基础培养基为营养肉汤培养基:
另一方面,本发明提供了所述菌株的制备方法,所述方法包括使用亚硝基胍诱变新金分枝杆菌。
优选地,所述方法包括以下步骤:
1)首先将新金分枝杆菌制成浓度在108-9个/mL的菌悬液,将5mL菌悬液与1mL的6mg/mL亚硝基胍(NTG)溶液混合;
优选地,所述亚硝基胍溶液通过以下方法制备:
称取6mg亚硝基胍(简称NTG,购自Sigma)于无菌离心管中,再加0.05mL丙酮助溶,加入0.2mM的pH6.0的磷酸缓冲液1mL使其完全溶解,于30℃水浴中保温;
2)将步骤1)得到的混合液立即置于30℃水浴振荡处理10min-1h;
3)离心收集菌体,用5mL的磷酸缓冲液离心洗涤2次,以终止NTG的诱变作用;
4)培养步骤3)得到的菌悬液,通过10倍稀释法稀释,涂布在营养琼脂平板上,32℃培养4-6天,得到突变株的单菌落。
优选地,在步骤4)中,将得到的突变株单菌落进行黄体酮的转化试验,筛选得到本发明的诱变菌株MN-ZX1。
再一方面,本发明提供了上述新金分枝杆菌MN-ZX1在制备9-羟基黄体酮中的用途。
再另一方面,本发明还提供了使用本发明的新金分枝杆菌MN-ZX1制备9-羟基黄体酮的方法。
优选地,所述方法包括以下步骤:
1)使用本发明的新金分枝杆菌MN-ZX1接种于种子培养基进行培养,得到种子培养物;
优选地,所述种子培养的培养基为BPYG培养基;
优选地,所述BPYG培养基包括以下组分:
牛肉膏0.3g/L,蛋白胨1.0g/L,酵母粉0.3g/L,甘油1.5g/L,调节pH至7.0;
优选地,所述种子培养为振荡培养,更优选地所述培养为在28-32℃下,优选地32℃下,以200-250转/分振荡培养36-60h,优选地48h;
2)在发酵罐中,在黄体酮的存在下,将步骤1)的种子培养物接种于转化培养基发酵培养;
优选地,所述转化培养基包括以下组分:
大豆蛋白胨1~5g/L,酵母提取物0.5~2g/L,葡萄糖0.5~2g/L,柠檬酸0.1~0.3g/L,柠檬酸铁铵0.01~0.05g/L,K2HPO40.5~1.5g/L,MgSO4·7H2O0.01~0.1g/L,NH4NO30.1~0.5g/L,黄体酮0.1~1.5g/L;调节pH至6.5-7.5;
更优选地,所述转化培养基包括以下组分:
大豆蛋白胨3g/L,酵母提取物1g/L,葡萄糖1.0g/L,柠檬酸0.2g/L,柠檬酸铁铵0.01g/L,K2HPO41.0g/L,MgSO4·7H2O 0.05g/L,NH4NO3 0.3g/L,黄体酮1.5g/L;调节pH至7.0;
优选地,所述发酵培养中,种子培养物的体积比例为3-10%;更优选地为4-6%,进一步优选地为5%;
优选地,所述发酵培养为摇瓶振荡培养或发酵罐深层培养;
优选地,所述摇瓶振荡培养为在28-32℃下,优选地32℃下,以200-250转/分摇瓶振荡培养5-10天;
优选地,所述深层发酵培养为通气搅拌培养,温度为28-32℃,优选地32℃,pH为7.0-7.2,发酵时间为7-10天;
优选地,在培养过程中,向转化培养基中添加底物黄体酮,添加的量为每升发酵液加入1-10g黄体酮,添加次数为2次;
3)将步骤2)发酵培养后的发酵液离心,取沉淀溶于甲醇中,离心取上清液,将上清液蒸馏结晶,将结晶水洗后,抽滤、减压干燥,既得。
优选地,称取步骤2)发酵培养后的发酵液,4000-6000rpm离心10min;取沉淀加入3-5倍体积的甲醇,加热至回流10min,然后4000-6000rpm离心10min,将上清液在30℃减压蒸馏使产品结晶,继续蒸馏至蒸出液甲醇含量低于3%,加1倍体积的水,降温至-20℃析晶,保持1-2h,抽滤,滤饼用-5℃甲醇淋洗。45℃减压干燥2h,既得。
优选地,将得到的产物用乙腈溶解,配制1mg/mL的溶液,并通过0.22μm的有机膜过滤除杂,滤液利用高效液相色谱法分析9-羟基黄体酮的含量。
优选地,所述HPLC的条件为高效液相色谱柱为安捷伦ZORBAX SB C18(5μm,4.6×150mm),色谱条件采用梯度洗脱,水为A相,甲醇为B相,流速为1.0mL/min;
洗脱条件如下:
体积比百分数为30-95%的B/A%相甲醇水溶液:0-15.0min;
体积比百分数为95%的B/A%相甲醇水溶液:15.0-20.0min;
平衡时间:5min。
本发明的有益效果包括:
1.本发明首次实现9-羟基黄体酮的生产,9-羟基黄体酮的产率高达62%;
2.本发明的方法为微生物转化法,反应条件温和,对环境没有污染;
3.本发明的菌株新金分枝杆菌,具有高产性状稳定的特点,该菌株经过20代的传代,性能保持稳定。
4.本发明只需使用本发明的菌株进行转化,生产成本低,工艺简单,经济效益可观。
附图说明
以下,结合附图来详细说明本发明的实施方案,其中:
图1为底物黄体酮标准品的液相图谱;
图2为根据本发明的实施例2的方法制备9-羟基黄体酮的HPLC图谱;
图3为根据本发明的实施例2的方法制备的9-羟基黄体酮的碳谱结果(13C NMR,600MHz in CDCl3);
图4为根据本发明的实施例2的方法制备的9-羟基黄体酮的氢谱结果(1H NMR,600MHz in CDCl3);
图5为根据本发明的实施例2的方法制备的9-羟基黄体酮的质谱结果;
图6为根据本发明的实施例3的方法制备9-羟基黄体酮的HPLC图谱。
生物材料的保藏
该新金分枝杆菌MN-ZX1,分类命名为新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)已经于2017年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC),保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏编号为CGMCC No.13901。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,根据下述实施例可以更好地理解本发明。然而,本领域技术人员应容易理解的是,实施例所描述的具体物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书所涵盖的本发明的范围。
实施例1:制备本发明的菌株
出发菌株为本实验室保藏的新金分枝杆菌,采用以下方法制备得到本发明的新金分枝杆菌:
1)称取6mg亚硝基胍(简称NTG,购自Sigma)于无菌离心管中,再加0.05mL丙酮助溶,加入0.2mM的pH6.0的磷酸缓冲液1mL使其完全溶解;
将本实验室保藏的新金分枝杆菌制成浓度在108-9个/mL的菌悬液,将5mL菌悬液与上述亚硝基胍溶液混合;
2)将步骤1)得到的混合液立即置于30℃水浴振荡处理10min-1h;
3)通过离心收集菌体,然后使用5mL磷酸缓冲液洗涤菌体两次以大量稀释法终止NTG的诱变作用,最后向离心管中加5mL无菌生理盐水,摇匀;
4)使用营养肉汤培养基培养步骤3)得到的菌悬液;将诱变处理的菌悬液进行10倍稀释后涂营养琼脂平板,培养4-6天得单菌落;
5)挑取单菌落进行以黄体酮为底物的转化试验筛选得到本发明的突变菌株MN-ZX1。
并将该新金分枝杆菌MN-ZX1,分类命名为新金分枝杆菌(Mycobacteriumneoaurum)已经于2017年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC),保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏编号为CGMCC No.13901。
实施例2:分枝杆菌9-羟基黄体酮发酵罐转化实验
1)分别挑取实验菌株及对照菌株(其中,对照菌株为出发菌株,即诱变前菌株),置于250mL三角瓶的75mL种子培养基;
其中,所述种子培养基为BPYG培养基;
其中,所述种子培养基为BPYG培养基,其组分如下:
牛肉膏0.3g/L,蛋白胨1.0g/L,酵母粉0.3g/L,甘油1.5g/L,调节pH至7.0;
以220转/分32℃振荡培养48h后,得到种子培养物。
2)向含15L原位灭菌的转化培养基的30L发酵罐中接种体积浓度为5%的种子培养物。
其中,所述发酵培养基的组分如下:
大豆蛋白胨3g/L,酵母提取物1g/L,葡萄糖1.0g/L,柠檬酸0.2g/L,柠檬酸铁铵0.01g/L,K2HPO4 1.0g/L,MgSO4·7H2O 0.05g/L,NH4NO3 0.3g/L,黄体酮1.5g/L;调节pH至7.0;
32℃通气搅拌培养10天,隔天取样观察实验结果。
在第5天、第7天,向转化培养基中继续添加底物黄体酮,添加的量为每升发酵液加入5g黄体酮,每次添加的时间为4-5h;
3)取步骤2)的发酵液,经离心获得沉淀,离心条件为4000rpm离心10min;
称取上述发酵离心沉淀150g,加入到1L三角瓶,加入甲醇600mL,加热至回流10min。将提取液在4000rpm离心机上离心10min,上清液转入1L蒸馏瓶;
将所得滤液在减压蒸馏使产品结晶,继续蒸馏至蒸出液甲醇含量低于3%,加水至150mL,降温至-20℃析晶,保持1-2h。抽滤,滤饼用-5℃甲醇淋洗。45℃减压干燥2h。
产品检测:称取上述得到的产品,用乙腈溶解,配制1mg/mL的溶液,并通过0.22μm的有机膜过滤除杂,滤液利用高效液相色谱法分析9-羟基黄体酮的含量。
高效液相色谱柱为安捷伦ZORBAX SB C18(5μm,4.6×150mm),色谱条件采用梯度洗脱,水为A相,甲醇为B相,流速为1.0mL/min。30-95%B 0-15.0min;95%B 15.0-20.0min;平衡时间5min。
9-羟基黄体酮的产率公式如下:
9-羟基黄体酮产率(%)=9-羟基黄体酮峰面积/总峰面积*100%
结果如图1-5所示,其中图1为底物黄体酮标准品的液相图谱;图2为9-羟基黄体酮的HPLC图谱;图3为9-羟基黄体酮的碳谱结果;图4为9-羟基黄体酮的氢谱结果;图5为9-羟基黄体酮的质谱结果;
从图中可以得知,根据本申请的方法,9-羟基黄体酮的产率为52%。
产物9-羟基黄体酮的鉴定:将发酵产物利用液相柱进行制备得到主产物纯品后,利用质谱、氢谱和碳谱鉴定产物的结构。MS(EI):m/z 331(M+H);1HNMR(600MHz CDCl3)0.61(3H,s,H-18)1.26(3H,s,H-19)2.06(3H,s,H-21)5.80(1H,s,H-4);13C NMR(600MHz CDCl3):12.4,19.8,22.7,24.1,25.2,26.7,28.4,31.4,31.6,33.9,34.0,37.3,43.6,44,4,49.3,63.1,76.3,126.9,168.3,199.0,209.2。通过与底物黄体酮比对,该产物的分子量多了16,提示羟基的存在;核磁数据中产物的C-9化学位移由53.6ppm(黄体酮)迁移至76.3ppm,提示产物中羟基化位置在9位碳上,所鉴定的产物为9-羟基黄体酮。主产物9-羟基黄体酮的碳谱结果如图3所示,氢谱结果如图4所示,质谱结果如图5所示。
实施例3:分枝杆菌9-羟基黄体酮摇瓶转化实验
1)分别挑取实验菌株及对照菌株(其中,对照菌株为出发菌株,即诱变前菌株),置于250mL三角瓶的75mL种子培养基;
其中,所述种子培养基为BPYG培养基,其组分如下:
牛肉膏0.3g/L,蛋白胨1.0g/L,酵母粉0.3g/L,甘油1.5g/L,调节pH至7.0;
在220转/分上28℃振荡培养48h后,得到种子培养物。
2)向含灭菌的发酵培养基的摇瓶中接种体积浓度为5%的种子培养物。
其中,所述发酵培养基的组分如下:
大豆蛋白胨3g/L,酵母提取物1g/L,葡萄糖1.0g/L,柠檬酸0.2g/L,柠檬酸铁铵0.01g/L,K2HPO4 1.0g/L,MgSO4·7H2O 0.05g/L,NH4NO3 0.3g/L,黄体酮0.5g/L;调节pH至7.0;
32℃振荡培养10天,隔天取样观察实验结果;
在第5天、第7天,向转化培养基中继续添加底物黄体酮,添加的量为每升发酵液加入5g黄体酮,每次添加的时间为4-5h;
3)取步骤2)的发酵液,经离心获得沉淀,离心条件为6000rpm离心10min;
称取上述发酵离心沉淀50g,加入甲醇200mL,加热至回流10min。将提取液在6000rpm离心机上离心10min,上清液转入1L蒸馏瓶;
将所得滤液在减压蒸馏使产品结晶,继续蒸馏至蒸出液甲醇含量低于3%,加水至50mL,降温至-20℃析晶,保持1-2h。抽滤,滤饼用-5℃甲醇淋洗。45℃减压干燥2h。
产品检测:称取上述得到的产品,用乙腈溶解,配制1mg/mL的溶液,并通过0.22μm的有机膜过滤除杂,滤液利用高效液相色谱法分析9-羟基黄体酮的含量。
高效液相色谱柱为安捷伦ZORBAX SB C18(5μm,4.6×150mm),色谱条件采用梯度洗脱,水为A相,甲醇为B相,流速为1.0mL/min。30-95%B 0-15.0min;95%B 15.0-20.0min;平衡时间5min。
9-羟基黄体酮的产率公式如下:
9-羟基黄体酮产率(%)=9-羟基黄体酮峰面积/总峰面积*100%
结果如图6所示,从图中可以得知,根据本申请的方法,9-羟基黄体酮10天摇瓶转化率率为62%。
实施例4:分枝杆菌9-羟基黄体酮发酵罐转化实验
1)分别挑取实验菌株及对照菌株(其中,对照菌株为出发菌株,即诱变前菌株),置于250mL三角瓶的75mL种子培养基;
其中,所述种子培养基为BPYG培养基;
以200转/分32℃振荡培养36h后,得到种子培养物。
2)向含15L原位灭菌的转化培养基的30L发酵罐中接种体积浓度为3%的种子培养物。
其中,所述发酵培养基的组分如下:
大豆蛋白胨1g/L,酵母提取物0.5g/L,葡萄糖0.5g/L,柠檬酸0.1g/L,柠檬酸铁铵0.01g/L,K2HPO40.5g/L,MgSO4·7H2O 0.01g/L,NH4NO3 0.1g/L,黄体酮0.1g/L;调节pH至6.5;
28℃通气搅拌培养10天,隔天取样观察实验结果;
在第3天,向转化培养基中继续添加底物黄体酮,添加的量为每升发酵液加入10g黄体酮,每次添加的时间为4-5h;
3)取步骤2)的发酵液,经离心获得沉淀,离心条件为4000rpm离心10min;
称取上述发酵离心沉淀150g,加入到1L三角瓶,加入甲醇600mL,加热至回流10min。将提取液在4000rpm离心机上离心10min,上清液转入1L蒸馏瓶;
将所得滤液在减压蒸馏使产品结晶,继续蒸馏至蒸出液甲醇含量低于3%,加水至150mL,降温至-20℃析晶,保持1-2h。抽滤,滤饼用-5℃甲醇淋洗。45℃减压干燥2h。
产品检测:称取上述得到的产品,用乙腈溶解,配制1mg/mL的溶液,并通过0.22μm的有机膜过滤除杂,滤液利用高效液相色谱法分析9-羟基黄体酮的含量。
高效液相色谱柱为安捷伦ZORBAX SB C18(5μm,4.6×150mm),色谱条件采用梯度洗脱,水为A相,甲醇为B相,流速为1.0mL/min。30-95%B 0-15.0min;95%B 15.0-20.0min;平衡时间5min。
9-羟基黄体酮的产率公式如下:
9-羟基黄体酮产率(%)=9-羟基黄体酮峰面积/总峰面积*100%
实施例5:分枝杆菌9-羟基黄体酮摇瓶转化实验
1)分别挑取实验菌株及对照菌株(其中,对照菌株为出发菌株,即诱变前菌株),置于250mL三角瓶的75mL种子培养基;
其中,所述种子培养基为BPYG培养基,其组分如下:
牛肉膏0.3g/L,蛋白胨1.0g/L,酵母粉0.3g/L,甘油1.5g/L,调节pH至7.5;
在250转/分上28℃振荡培养60h后,得到种子培养物。
2)向含灭菌的发酵培养基的摇瓶中接种体积浓度为10%的种子培养物。
其中,所述发酵培养基的组分如下:
大豆蛋白胨5g/L,酵母提取物2g/L,葡萄糖2g/L,柠檬酸0.3g/L,柠檬酸铁铵0.05g/L,K2HPO4 1.5g/L,MgSO4·7H2O 0.1g/L,NH4NO3 0.5g/L,黄体酮1.5g/L;调节pH至7.5;
28℃振荡培养7天,隔天取样观察实验结果;
在第3天、第5天,向转化培养基中继续添加底物黄体酮,添加的量为每升发酵液加入1g黄体酮,每次添加的时间为4-5h;
3)取步骤2)的发酵液,经离心获得沉淀,离心条件为6000rpm离心10min;
称取上述发酵离心沉淀50g,加入甲醇250mL,加热至回流10min。将提取液在6000rpm离心机上离心10min,上清液转入1L蒸馏瓶;
将所得滤液在减压蒸馏使产品结晶,继续蒸馏至蒸出液甲醇含量低于3%,加水至50mL,降温至-20℃析晶,保持1-2h。抽滤,滤饼用-5℃甲醇淋洗。45℃减压干燥2h。
产品检测:称取上述得到的产品,用乙腈溶解,配制1mg/mL的溶液,并通过0.22μm的有机膜过滤除杂,滤液利用高效液相色谱法分析9-羟基黄体酮的含量。
高效液相色谱柱为安捷伦ZORBAX SB C18(5μm,4.6×150mm),色谱条件采用梯度洗脱,水为A相,甲醇为B相,流速为1.0mL/min。30-95%B 0-15.0min;95%B 15.0-20.0min;平衡时间5min。
9-羟基黄体酮的产率公式如下:
9-羟基黄体酮产率(%)=9-羟基黄体酮峰面积/总峰面积*100%
综上所述,本发明首次实现9-羟基黄体酮的生产,9-羟基黄体酮的产率高达62%,而且本发明只需使用本发明的菌株进行转化,生产成本低,工艺简单,经济效益可观。
尽管本发明已进行了一定程度的描述,明显地,在不脱离本发明的精神和范围的条件下,可进行各个条件的适当变化。可以理解,本发明不限于所述实施方案,而归于权利要求的范围,其包括所述每个因素的等同替换。