JP6915908B2 - Ｂｉｐ断片を含む組換えベクターおよび前記ベクターを利用した組換えタンパク質の製造方法 - Google Patents

Ｂｉｐ断片を含む組換えベクターおよび前記ベクターを利用した組換えタンパク質の製造方法 Download PDF

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Description

本発明は、新規のＢｉＰ断片を含む組換えベクターおよび前記ベクターを利用した組換えタンパク質の製造方法などに関する。
バイオ医薬品（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）とは、生体内に存在する物質を医薬品として使用することを指し、より広い意味としては、先端バイオ技術である遺伝子組換え、細胞融合、細胞培養など生物工学技術を基盤として生産された医薬品と定義することができる。このようなバイオ医薬品は、タンパク質医薬品、治療用抗体、ワクチン、遺伝子治療剤、細胞治療剤などに分類される。このうち、タンパク質医薬品、治療用抗体などは、一般的に酵母、バクテリア、動物細胞、昆虫細胞などの宿主を利用して生産されており、最近には、このような医薬品の利用度が増加している傾向にある。したがって、効率的な生産のためには、組換えタンパク質の生産量を増加させると同時に、分離が容易であり、組換えタンパク質の安定性を増加させることができる方法の開発が持続的に要求されているのが現状である。
一方、分子生物学と遺伝工学技術のまぶしい発達は、植物分野にも適用されて、植物体から有用な生理活性物質を生産しようとする努力が着実に続いている。植物から有用物質を生産することは、生産コストを顕著に減少させることができ、従来、大衆的方法（動物細胞または微生物でタンパク質を合成して分離精製する方法）で発生しうる様々な汚染源（ウイルス、癌遺伝子、腸毒素など）を根本的に排除することができると共に、商品化段階でも動物細胞や微生物とは異なって種子として種苗（ｓｅｅｄ ｓｔｏｃｋ）の管理が可能であるという点から有利な利点を有している（特許文献１：韓国特許登録１０−１８４８０８２号公報）。
したがって、植物体においても使用可能であり、組換えタンパク質の生産量を顕著に増加させることができると共に、組換えタンパク質の製造時に追加される異種ペプチド配列を最小化して組換えタンパク質の使用安定性を増加させることができる組換えタンパク質の生産システムが開発されると、多様な分野において必要とする組換えタンパク質の高効率生産が可能なものと期待される。
韓国特許登録１０−１８４８０８２号公報
本発明は、前記のような従来技術上の問題点を解決するために案出されたものであって、新規のＢｉＰ断片および目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子コンストラクト、前記遺伝子コンストラクトを含む組換えベクター、および前記ベクターを利用した組換えタンパク質の製造方法などを提供することをその目的とする。
しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に明確に理解され得る。
本発明は、配列番号６で表されるＢｉＰ遺伝子断片および目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドが作動可能に順次に連結された遺伝子コンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を提供する。前記順次に連結されるというのは、ＢｉＰ遺伝子断片のＮ末端または／およびＣ末端に目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドが連結された形態であり得るが、ＢｉＰ遺伝子と目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドが連結された形態であれば、これに制限されない。
また、本発明は、プロモーター遺伝子、配列番号６で表されるＢｉＰ遺伝子断片および目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドが作動可能に順次に連結された遺伝子コンストラクトを含む組換えベクターを提供する。
本発明の一具体例において、前記遺伝子コンストラクトは、目的タンパク質の生産において追加される異種ペプチド（ｆｏｒｅｉｇｎ ｐｅｐｔｉｄｅ）を最小化したり、目的タンパク質の発現量を増加させることを特徴とする。
本発明の他の具体例において、前記プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）由来３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）由来１９Ｓ ＲＮＡプロモーター、植物のアクチンタンパク質プロモーター、ユビキチンタンパク質プロモーター、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０）プロモーター、ＲＳＶ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＥＦ−１α（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ−１ ａｌｐｈａ）プロモーター、ｐＥＭＵプロモーター、ＭＡＳプロモーター、ヒストンプロモーター、Ｃｌｐプロモーターなどや、組換えベクターに使用可能であると知られているプロモーターであれば、これに制限されない。
本発明のさらに他の具体例において、前記目的タンパク質は、抗原、抗体、抗体の断片、構造タンパク質、調節タンパク質、転写因子、毒素タンパク質、ホルモン、ホルモン類似体、サイトカイン、酵素、酵素の断片、酵素阻害剤、輸送タンパク質、受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、受容体の断片、生体防御誘導物質、貯蔵タンパク質、移動タンパク質（ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、エクスプロイティブタンパク質（ｅｘｐｌｏｉｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、レポータタンパク質などであり得るが、本発明の組換え発現ベクターによって製造され得るタンパク質であれば、これに制限されない。
本発明のさらに他の具体例において、前記組換えベクターは、ＨＤＥＬ（Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ）ペプチドをコードする遺伝子、Ｍ１７の５’ ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ）部位遺伝子、目的タンパク質の高発現のためのタグ遺伝子、目的タンパク質の容易な分離のためのタグ遺伝子などをさらに含むことができる。
また、本発明は、前記組換えベクターで形質転換された形質転換体を提供する。
本発明の一具体例において、前記形質転換体は、大腸菌、バシルス、サルモネラ、酵母等のような微生物、昆虫細胞、ヒトを含む動物細胞、マウス、ラット、犬、猿、豚、馬、牛等のような動物、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、植物などであり得、前記植物は、稲、小麦、麦、とうもろこし、豆、ジャガイモ、小麦、小豆、燕麦、およびモロコシを含む食糧作物類；シロイヌナズナ、ハクサイ、ダイコン、唐辛子、イチゴ、トマト、スイカ、キュウリ、キャベツ、マクワウリ、カボチャ、ネギ、タマネギ、およびニンジンを含む野菜作物類；高麗人参、タバコ、木花、ゴマ、サトウキビ、テンサイ、エゴマ、ピーナッツ、およびアブラナを含む特用作物類；およびリンゴの木、梨の木、ナツメ、桃、ブドウ、ミカン、柿、スモモ、あんず、およびバナナを含む果樹類；およびバラ、カーネーション、菊、ユリ、およびチューリップを含む草花類などであり得るが、本発明の組換え発現ベクターで形質転換され得る生命体であれば、これに制限されない。
また、本発明は、（ａ）前記形質転換体を培養する段階；および（ｂ）前記形質転換体または培養液から目的タンパク質を分離および精製する段階を含む、目的タンパク質の生産方法を提供する。前記形質転換体は、好ましくは細胞そのもの、または細胞を含む培養物であり得、前記培養液は、好ましくは細胞を培養した後、細胞を除去した培養液であり得るが、本発明の組換えタンパク質を含んでいると、これに制限されない。
本発明の一具体例において、前記目的タンパク質を分離する段階は、好ましくはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、イミダゾール（Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）およびＮａＣｌ（塩化ナトリウム）が添加されたリン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液を利用することができ、好ましくは前記Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００は、０．０５〜０．５重量％、イミダゾール（Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）は、１０〜１００ｍＭ、ＮａＣｌは、１００〜５００ｍＭが添加された１０〜１００ｍＭのリン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液（ｐＨ７．１〜７．５）や、一般的にタンパク質を分離するのに使用される抽出用緩衝溶液（ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）であれば、これに制限されない。
また、本発明は、配列番号７で表されるＢｉＰ断片、リンカー配列および目的タンパク質が順次に連結された組換えタンパク質を提供する。
本発明による新規のＢｉＰ断片を含む組換えベクターは、多様な目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを前記ＢｉＰ断片に連結させることによって、目的タンパク質を製造するときに追加される異種ペプチド配列を最小化して、組換えタンパク質の使用安定性を増加させることができると共に、同時に目的タンパク質の生産量を増加させることができるので、多様な活性を有する目的タンパク質に幅広く適用して、多様な分野の組換えタンパク質の高効率生産を可能にするものと期待される。
本発明の一実施例によるタンパク質配列分析装置を利用して組換えタンパク質のアミノ酸配列を確認した結果を示す図である。 本発明の一実施例による新規ＢｉＰ断片が結合されたＲＶＧｅタンパク質の生産量および溶解性をウェスタンブロットで確認した結果を示す図である。
本発明では、従来組換えタンパク質を小胞体に移動させるために使用されたＢｉＰ配列のうち組換えタンパク質を生産後に組換えタンパク質に残っている（融合している）残基配列を確認し、前記残基配列のうち一部の配列を除去して組換えタンパク質に残っている残基配列、すなわち異種のペプチド配列を最小化して、組換えタンパク質の使用安定性を増加させたと共に、組換えタンパク質の発現量が増加することを確認し、前記新規のＢｉＰ遺伝子を含む組換えベクターおよび前記組換えベクターを利用した組換えタンパク質の生産方法を提供することを目的とする。
本明細書において、「新規ＢｉＰ（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、従来組換えタンパク質の製造時に、発現した組換えタンパク質を小胞体に移動させるために使用されたＢｉＰ配列のうち一部であって、最も好ましくは配列番号６で表される遺伝子であるが、好ましくは配列番号６の塩基配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むことができる。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、最適に配列された配列と比較領域を比較することによって確認され、比較領域でポリヌクレオチド配列の一部は、さらに配列の最適配列に対する参考配列（追加または削除を含まない）に比べて追加または削除（すなわちギャップ）を含むことができる。
本明細書において、「異種ペプチド（ｆｏｒｅｉｇｎ ｐｅｐｔｉｄｅ）」とは、組換えタンパク質の製造時に追加されたまたは融合した目的タンパク質のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列であって、前記異種ペプチドの種類は、目的タンパク質以外のペプチドであれば、制限がない。
本明細書において、「目的タンパク質（ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）」とは、本発明による遺伝工学的方法で生産しようとするタンパク質を言うものであり、好ましくは商業的用途に用いられている大量で生産される必要があるタンパク質であり、より好ましくは抗原、抗体、抗体の断片、構造タンパク質、調節タンパク質、転写因子、毒素タンパク質、ホルモン、ホルモン類似体、サイトカイン、酵素、酵素の断片、酵素阻害剤、輸送タンパク質、受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、受容体の断片、生体防御誘導物質、貯蔵タンパク質、移動タンパク質（ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、エクスプロイティブタンパク質（ｅｘｐｌｏｉｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、レポータタンパク質などであるが、本発明の組換えベクターで製造され得るタンパク質であれば、これに制限されない。
本明細書において、「使用安定性」とは、目的タンパク質を組換えベクターを利用して製造するときに追加される異種のペプチドによって、目的タンパク質の使用時に予測しなかった副作用、危険性、効果の相異などを減少させて、目的タンパク質を使用するに際して本来の効果を最大限維持するようにすることを意味する。
本明細書において、「組換えベクター（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒ）」とは、ベクター内に挿入された異種の核酸によりコードされるペプチドまたはタンパク質を発現できるベクターを指すものであって、好ましくは新規ＢｉＰ遺伝子断片を含むように製造されたベクターを意味する。前記「ベクター」は、試験管内、生体外または生体内で宿主細胞へ塩基の導入および／または転移のための任意の媒介物を言い、他のＤＮＡ断片が結合して結合した断片の複製をもたらすことができる複製単位（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）であり得、「複製単位」とは、生体内でＤＮＡ複製の自家ユニットとして機能する、すなわち自らの調節により複製可能な、任意の遺伝的単位（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルスなど）を言う。本発明の組換え発現ベクターは、好ましくはＲＮＡ重合酵素が結合する転写開始因子であるプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列と転写および解読の終結を調節する配列、ターミネータなどを含むことができ、より好ましくはタンパク質の合成量を増加させるためのＭ１７の５’ ＵＴＲ部位遺伝子、タンパク質が小胞体内で安定的に維持され得るようにタンパク質の分解を最小化するためのＨＤＥＬ遺伝子などをさらに含むことができ、より好ましくは組換えタンパク質の生産量を増加させるためのタグ用遺伝子、組換えタンパク質の構造的安定性を維持するためのタグ用遺伝子、組換えタンパク質を容易に分離するためのタグ用遺伝子、形質転換体を選別するための抗生剤耐性遺伝子などの選別用マーカー遺伝子などをさらに含むことができ、容易な分離のためのタグとしては、代表的にＡｖｉタグ、Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎタグ、ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍａｔｅタグ、Ｅタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、ＩｇＧ−Ｆｃタグ、ＣＴＢタグ、Ｓｏｆｔａｇ １タグ、Ｓｏｆｔａｇ ３タグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＴＣタグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグなどが含まれ得、前記選別用マーカー遺伝子には、代表的にグリホサート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）またはホスフィノスリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）のような除草剤抵抗性遺伝子、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、Ｇ４１８、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）のような抗生剤耐性遺伝子、ａａｄＡ遺伝子などが含まれ得、前記プロモーターには、代表的にｐＥＭＵプロモーター、ＭＡＳプロモーター、ヒストンプロモーター、Ｃｌｐプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）由来３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）由来１９Ｓ ＲＮＡプロモーター、植物のアクチンタンパク質プロモーター、ユビキチンタンパク質プロモーター、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０）プロモーター、ＲＳＶ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＥＦ−１α（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ−１ ａｌｐｈａ）プロモーターなどが含まれ得、前記ターミネータは、代表的にノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、稲アミラーゼＲＡｍｙ１ Ａターミネータ、パセオリンターミネータ、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのオクトパイン（Ｏｃｔｏｐｉｎｅ）遺伝子のターミネータ、大腸菌のｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネータなどであるが、前記追加される遺伝子の種類は、従来組換えタンパク質の製造に使用されている種類であれば、制限がない。
本明細書において、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」とは、注入されたＤＮＡにより生物の遺伝的な性質が変わることを総称し、「形質転換体（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｏｒｇａｎｉｓｍ）」とは、分子遺伝学的方法に外部の遺伝子を注入して製造された生命体であって、好ましくは本発明の組換え発現ベクターにより形質転換された生命体であり、前記生命体は、微生物、真核細胞、昆虫、動物、植物など生命がある生物であれば、制限がなく、好ましくは大腸菌、サルモネラ、バシルス、酵母、動物細胞、マウス、ラット、犬、猿、豚、馬、牛、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、植物などであるが、これに制限されない。前記形質転換体は、形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）−媒介形質転換方法、パーティクルガン衝撃法（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｇｕｎ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、超音波処理法（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＰＥＧ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎ ｇｌｙｃｏｌ）−媒介形質転換方法などの方法で製造され得るが、本発明のベクターを注入できる方法であれば、制限がない。
本明細書において、「溶解性（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）」とは、目的タンパク質またはペプチドが人体に投与するのに適した溶媒に溶解することができる程度を意味する。具体的には、特定の温度で与えられた溶媒に対して溶質が飽和した程度を示すものであり得る。溶解性は、溶質の飽和濃度を決定することによって測定することができ、例えば溶媒に溶質を過量に添加し、これを撹拌し、濾過した後、濃度をＵＶ分光器またはＨＰＬＣなどを使用して測定することができるが、これに制限されるものではなく、高い溶解性は、組換えタンパク質の分離精製に有利であり、組換えタンパク質の凝集が抑制されて、組換えタンパク質の生理活性または薬理的な活性を維持するのに長所を有する。
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるわけではない。
［実施例］
実施例１：組換えタンパク質の製造時にＢｉＰペプチドの残基の確認
組換えタンパク質の製造時に、組換えタンパク質を小胞体に移動させるために使用されているＢｉＰペプチド配列は、小胞体に移動すると、信号ペプチド加水分解酵素（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）により除去されるものと予測されているが、これに関する研究は進行されたことがない。本発明者らは、製造された組換えタンパク質にＢｉＰペプチドの残基（ｒｅｓｉｄｕｅ）が存在するかを確認するために実験を進めた。
１．１．セルロース結合ドメインが融合した豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質の製造
ＢｉＰペプチドの残基を確認するために、一次的にセルロース結合ドメイン（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ；ＣＢＤ）が融合した豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質を製造するための組換えベクターを製造した。より詳しくは、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターのＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター遺伝子とＮＯＳターミネータ（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）との間にＭ１７の５’ ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ）部位遺伝子（配列番号１）、ＢｉＰ（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号２）、豚コレラ抗原Ｅ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号３）；セルロース結合ドメインをコードするポリヌクレオチド（配列番号４）；およびＨＤＥＬ（Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを順にクローニングして、組換えベクターを製作した。そして、組換えベクターをアグロバクテリウム−媒介形質転換方法（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）でシロイヌナズナに形質転換させ、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）に対する耐性を有するシロイヌナズナを選別し、世代促進を通じてセルロース結合ドメインが融合したＥ２組換えタンパク質の発現が安定したホモ種子を最終確保して、形質転換植物体を製造した。そして、タンパク質の抽出に普遍的に使用されるタンパク質抽出バッファーと非結晶セルロース（ａｍｏｒｐｈｏｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；ＡＭＣ）を使用して形質転換植物体５ｇから組換えタンパク質を分離した。そして、分離した組換えタンパク質は、リン酸化緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）を利用して透析後に遠心フィルターチューブ（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ ｔｕｂｅ）を使用して濃縮した。
１．２．ＢｉＰペプチドの残基の確認
ＢｉＰペプチドの残基を確認するために、韓国基礎科学支援研究院（ＫＢＳＩ）のタンパク質配列分析システム（Ｐｒｏｃｉｏｓｅ４９１／ＰＰＳＱ）を利用して組換えタンパク質のＮ−末端配列を分析した。配列分析のために、実施例１．１と同じ方法で準備したセルロース結合ドメインが融合したＥ２タンパク質を０．４ｍｇ／ｍＬの濃度になるように１％セロビオース（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ）が添加されたリン酸塩緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）に添加し、配列分析システムのプロトコルによってアミノ酸配列分析を実施した。
その結果、Ｅ２タンパク質配列を除いて「ＩＥＥＡＴＫＬ」のＢｉＰの追加配列とクローニング過程中に追加されたアミノ酸「ＲＩＱ」リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）配列があることを確認した。
実施例２：新規ＢｉＰ配列を利用したＮＳ１組換えタンパク質の製造
組換えタンパク質の生産において重要な要素の一つである目的タンパク質以外の異種ペプチドを最小化して組換えタンパク質の使用安定性を増加させるために、組換えタンパク質に残っているＢｉＰ残基の一部を除去して新規ＢｉＰ（Ｎｅｗ ＢｉＰ；ＮＢ）遺伝子断片を製造するために、実施例１を通じて確認されたＢｉＰ残基のうち、目的タンパク質のＮ末端部位に融合している７個のアミノ酸が除去された新規ＢｉＰ配列（配列番号７）を製造するために実験を進めた。
２．１．新規ＢｉＰ配列を含む組換えベクターの製造および前記ベクターを利用した組換えタンパク質の製造
配列番号６で表される新規ＢｉＰ遺伝子断片を含む組換えベクターを製造するために、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターのＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター遺伝子とＮＯＳターミネータ（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）との間にＭ１７の５’ ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ）部位遺伝子（配列番号１）、新規ＢｉＰ遺伝子断片（配列番号６）、およびジカウイルスのＮＳ１タンパク質（Ｚｉｋａ ＮＳ１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号８）を順にクローニングして、組換えベクターを製作した。そして、前記ベクターで形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）をタバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉に接種する一過性発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）方式でＮＳ１組換えタンパク質を発現させた後に、植物の葉からタンパク質を抽出して遠心分離した。そして、Ｎｉ−ＮＴＡカラムを利用してＩＭＡＣ（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｍｅｔａｌ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を実施してヒスチジン タグ（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｔａｇ）結合された組換えタンパク質を分離した。そして、分離した組換えタンパク質は、リン酸化緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）を利用して透析後に遠心フィルターチューブ（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ ｔｕｂｅ）を使用して濃縮した。
２．２．新規ＢｉＰペプチドの残基の確認
新規ＢｉＰペプチドの残基を確認するために、実施例１．２と同じ方法で組換えタンパク質のＮ−末端配列を分析した。その結果は、図１に示した。
図１に示されたように、ＮＳ１タンパク質配列を除いてＢｉＰ残基配列は存在せず、クローニング過程中に追加されたアミノ酸「ＧＳ」リンカー配列があることを確認した。前記結果を通じて、新規ＢｉＰペプチド配列だけでも小胞体へ正常に移動し、組換えタンパク質も正常に製造されたことを確認した。
実施例３：新規ＢｉＰ配列を利用したＲＶＧｅ組換えタンパク質の製造
３．１．新規ＢｉＰ配列を含む組換えベクターの製造および前記ベクターを利用した組換えタンパク質の製造
配列番号７で表される新規ＢｉＰペプチドおよび狂犬病ウイルス（Ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ）の主な抗原である糖化タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）を含む組換えベクターを製造するために、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターのＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター遺伝子とＮＯＳターミネータ（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）との間にＭ１７の５’ ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ）部位遺伝子（配列番号１）、新規ＢｉＰ遺伝子断片（配列番号６）、および狂犬病ウイルス糖化タンパク質（ＲＶＧｅ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号９）を順にクローニングして、組換えベクターを製作した。対照群としては、新規ＢｉＰ遺伝子の代わりに、従来のＢｉＰ遺伝子を挿入して組換えベクターを製作した。そして、前記ベクターで形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）をタバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉に接種する一過性発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）方式でＮＳ１組換えタンパク質を発現させた後に、植物の葉からタンパク質を抽出して遠心分離した。タンパク質の抽出時には、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２０ｍＭのイミダゾール（Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）（ｐＨ７．５）および３００ｍＭのＮａＣｌが添加された２０ｍＭのリン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ｐＨ７．３）溶液を使用した。
３．２．組換えタンパク質の発現量の確認実験
実施例３．１と同じ方法で発現した組換えタンパク質を含んでいる全体タンパク質抽出液を対象としてａｎｔｉ−Ｈｉｓ ａｎｔｉｂｏｄｙを利用してウェスタンブロットを実施した。その結果は、図２に示した。
図２に示されたように、従来のＢｉＰペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを使用した場合（ＢｉＰ）と比較して、新規ＢｉＰペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを使用した場合（ＮＢ）、約二倍以上タンパク質の量が増加したことを確認した。前記結果を通じて、新規ＢｉＰペプチド配列を利用して組換えタンパク質を製造すると、組換えタンパク質の生産量を増加させることができることを確認した。
前記結果を通じて、本発明の新規ＢｉＰ配列を組換えタンパク質の製造に使用する場合、多様な目的タンパク質を利用して組換えタンパク質を製造することができると共に、組換えタンパク質の生産量を顕著に増加させることができることを確認することができた。また、目的タンパク質以外の異種配列の追加を最小化して組換えタンパク質の使用安定性を増加させることができることを確認することができた。したがって、本発明の新規ＢｉＰ配列を利用すると、多様な組換えタンパク質の効率的生産に大きく役に立つことを確認することができた。
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解すべきである。
本発明は、新規ＢｉＰ遺伝子断片を含む組換えベクターに関し、本発明の組換えベクターを利用して目的タンパク質の製造時に、目的タンパク質に残っている異種ペプチド配列を最小化して使用安定性を増加させることができると共に、目的タンパク質の生産量も増加させることができるので、多様な組換えタンパク質の生産に幅広く利用可能なものと期待される。

Claims (11)

  1. 配列番号６で表されるＢｉＰ（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子断片および目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドが作動可能に順次連結された、遺伝子コンストラクトであって、
    該配列番号６で表されるＢｉＰ遺伝子断片の直後の3'末端に、「atagaagag gctacgaagt taa」で表される配列又は「atagaagag gctacgaagt ta」で表される配列のいずれも含まない、遺伝子コンストラクト。
  2. 前記遺伝子コンストラクトは、目的タンパク質の生産において追加される異種ペプチド（ｆｏｒｅｉｇｎ ｐｅｐｔｉｄｅ）を最小化したり、目的タンパク質の発現量を増加させることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子コンストラクト。
  3. プロモーター遺伝子、配列番号６で表されるＢｉＰ遺伝子断片および目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドが作動可能に順次連結された遺伝子コンストラクトを含む、組換えベクターであって、
    該配列番号６で表されるＢｉＰ遺伝子断片の直後の3'末端に、「atagaagag gctacgaagt taa」で表される配列又は「atagaagag gctacgaagt ta」で表される配列のいずれも含まない、組換えベクター。
  4. 前記組換えベクターは、目的タンパク質の生産において追加される異種ペプチド（ｆｏｒｅｉｇｎ ｐｅｐｔｉｄｅ）を最小化したり、目的タンパク質の発現量を増加させることを特徴とする請求項３に記載の組換えベクター。
  5. 前記プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）由来３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）由来１９Ｓ ＲＮＡプロモーター、植物のアクチンタンパク質プロモーター、ユビキチンタンパク質プロモーター、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０）プロモーター、ＲＳＶ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ｐＥＭＵプロモーター、ＭＡＳプロモーター、ヒストンプロモーター、ＣｌｐプロモーターおよびＥＦ−１α（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ−１ ａｌｐｈａ）プロモーターよりなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする請求項３に記載の組換えベクター。
  6. 前記組換えベクターは、ＨＤＥＬ（Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ）ペプチドをコードする遺伝子をさらに含むことを特徴とする請求項３に記載の組換えベクター。
  7. 前記組換えベクターは、Ｍ１７の５′ ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｉｏｎ）部位遺伝子をさらに含むことを特徴とする請求項３に記載の組換えベクター。
  8. 請求項３〜７のいずれかに記載の組換えベクターで形質転換された、形質転換体。
  9. （ａ）請求項８に記載の形質転換体を培養する段階；および
    （ｂ）前記形質転換体または培養液から目的タンパク質を分離および精製する段階を含む、目的タンパク質の生産方法。
  10. 前記目的タンパク質を分離する段階は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、イミダゾール（Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）およびＮａＣｌが添加されたリン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液を利用することを特徴とする請求項９に記載の方法。
  11. 配列番号７で表されるＢｉＰ断片、リンカー配列および目的タンパク質が順次連結された、組換えタンパク質であって、
    該配列番号７で表されるＢｉＰ断片の直後のＣ末端に、「Ile Glu Glu Ala Thr Lys Leu」で表される配列を含まない、組換えタンパク質。
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