KR100690230B1

KR100690230B1 - 단백질의 가용성 발현을 위한 고효율 발현벡터 시스템

Info

Publication number: KR100690230B1
Application number: KR1020050051893A
Authority: KR
Inventors: 김경규; 정진희
Original assignee: 학교법인 성균관대학
Priority date: 2005-06-16
Filing date: 2005-06-16
Publication date: 2007-03-12
Also published as: KR20060131445A

Abstract

본 발명은 목적단백질의 발현율 및 가용성을 최대로 달성하기 위한 발현 벡터 및 이를 이용한 최적 발현시스템의 구축방법에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는, 목적단백질의 발현이 가능하도록 연결된, a) 프로모터, b) 히스티딘 Taq이 결합된, 목적 단백질의 수용성을 높이는 융합 파트너, c) TEV (Tobacco Etch Virus) 단백질 분해효소 인식서열, d) 아미노산 2 내지 10개로 이루어지는 링커, 및 e) 다중 클로닝 자리 (multicloning site)를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 본 발명은 다양한 융합 파트너 결합을 통한 목적 단백질의 가용성 증가 여부를 빠른 시간에 확인할 수 있으며, 최적의 발현 효율 및 가용성을 보이는 재조합체를 선택할 수 있고, 융합 파트너와 목적단백질간의 절단 효율 및 정확성이 높은 말단을 제공한다.

목적 단백질, 융합 파트너, 가용성 발현, 다중 클로닝 자리

Description

단백질의 가용성 발현을 위한 고효율 발현벡터 시스템{VECTOR SYSTEM FOR EXPRESSING SOLUBLE PROTEIN WITH HIGH EFFICIENCY}

도 1은 pVFT1L 벡터의 모식도이다. T7 프로모터, Ribosome 결합 자리 (RBS), 6x(his), TEV 단백질 분해효소 인식 자리, 그리고 멀티 클로닝 자리 (MCS)를 표시하였으며, pVFT2L ~ pVFT6L의 모체로 사용되었다.

도 2는 pVFT1S 벡터의 모식도이다. pVFT1L 벡터와 동일한 MCS를 가짐으로써 목적 유전자를 동시에 클로닝 할 수 있도록 하였으며, pVFT2S ~ pVFT6S의 모체로 사용되었다.

도 3은 NusA-HP0534 융합 단백질을 TEV 단백질 분해효소로 처리하여 목적 단백질 HP0534만을 분리할 수 있음을 보인다.

도 4는 PP1R11 단백질의 여러 가지 융합체 발현의 결과로 융합 파트너의 종류에 따라 발현 단백질의 가용성이 달라짐을 보여준다.

도 5는 Twa1 단백질의 다양한 융합체 발현 결과를 조사한 것이다. 모든 융합체 경우에서 높은 효율의 가용성 발현을 볼 수 있다.

도 6은 6x(his) tag을 가지는 재조합 Twa1 단백질로부터 6x(his) tag를 제거하기 위하여 TEV 단백질 분해효소를 처리하였을 때 매우 효율적으로 목적 단백질 Twa1만이 분리됨을 보인다.

도 7은 RHAMM 단백질의 다양한 융합체 발현 결과이다.

도 8은 단백질 삼차구조 해석을 위하여 얻어진 (a) Twa1과 (b) RHAMM 단백질의 결정 사진이다.

본 발명은 목적단백질의 발현율 및 가용성을 최대로 달성하기 위한 발현 벡터 및 이를 이용한 최적 융합 파트너의 선택방법에 관한 것으로서, 다양한 융합 파트너 결합을 통한 목적 단백질의 가용성 증가 여부를 빠른 시간에 확인할 수 있으며, 최적의 발현 효율 및 가용성을 보이는 재조합체를 선택할 수 있는 목적 단백질의 발현벡터 및 이를 이용한 목적 단백질의 발현 시스템 구축방법에 관한 것이다.

많은 수의 단백질들에 대하여 구조 연구, 항체 생산, 및 활성 측정 등의 연구를 대량으로 수행하여 이들의 기능 및 상호 연관 관계를 연구하는 단백질체학 (proteomics) 연구를 위해서는 고효율 (High throughput) 단백질 발현 시스템의 개발이 요구된다. 이러한 단백질 발현 시스템은 첫째, 빠른 시간 안에 많은 단백질을 대상으로 적용시킬 수 있어야 하며, 둘째, 재조합 단백질의 가용성 (solubility) 및 발현 효율 면에서 기존의 시스템보다 우월하여야 하며, 아울러 정제의 편이성을 갖추어야 한다.

대장균은 현재까지 재조합 단백질 생산에 가장 널리 사용되고 있는 발현 시스템이지만, 목적 단백질의 발현이 성공적으로 이루어지지 못하는 경우가 상당히 높은 비율을 차지한다. 가장 큰 문제로 지적되어 온 것은 단백질의 비가용성 발현으로, 특히, 사람을 비롯한 고등동물 유래의 단백질의 경우, 비가용성의 내포체(inclusion body)가 형성되는 비율이 30~40 %에 이른다. 재조합 단백질의 가용성을 증가시켜 내포체 형성을 피하기 위해서는 몇 가지의 실험적 시도가 가능한데, 그 중 대표적인 방법이 다양한 펩타이드 혹은 단백질과의 결합을 통한 융합체 발현이다.

목적 단백질의 융합체 발현은 재조합 단백질의 발현율과 가용성을 증가시키고 아울러 탐지와 정제를 돕기 위한 목적으로 시도되고 있다. 목적 단백질과 융합시켰을 때 목적 단백질의 가용성을 높인다고 알려진 융합 파트너(fusion partner) 단백질로는 대장균의 티오레독신(thioredoxin, Trx), N-utilization substance protein A (NusA). 말토즈 결합 단백질 (maltose binding protein, MBP), Schistosoma japonicum의 글루타티온-S-트랜스퍼라제(glutathione-S-transferase,GST) 등이 알려져 있으며, 이들을 이용한 여러 가지 발현 벡터가 사용되고 있다. 상기 융합 파트너를 목적 단백질과 융합시켜 발현시킬 경우에, 목적단백질의 가용성 및 수율이 높아질 뿐만 아니라, 발현 후 이들 융합 파트너 자체 혹은 이와 결합해 있는 폴리히스티딘(polyhistidine) tag을 이용한 친화성 크로마토그래피를 통하여 목적 단백질을 용이하게 정제할 수 있다. 융합 파트너가 특정 리간드에 대한 친화성을 가지는 경우에는 융합 파트너 자체를 이용한 친화성 크로마토그래피가 가능하며, 그렇지 않은 경우에는 융합 파트너에 폴리히스티딘 tag을 결합시켜 이를 이용할 수 있다.

하지만 특정 단백질의 가용성 발현에 있어서 어떠한 융합 파트너가 가장 효과적인지를 예측하는 것은 불가능하며, 최적의 융합 파트너는 실험을 통해서만 결정할 수 있다. 이러한 이유로, 현재 사용되고 있는 다양한 융합 파트너 발현 벡터 가운데 적합한 시스템을 선택하기 위해서는 개별적으로 여러 가지 벡터에 클로닝하여 가용성 발현을 조사해 보아야 한다. 이렇게 여러 가지 벡터를 사용하게 되면, 각기 다른 벡터의 제한효소 자리(MCS) 에 맞추어 목적 유전자를 중합효소 연쇄반응으로 증폭하고 클로닝하는 단계를 거쳐야 한다. 이는 여러 가지 단백질 발현을 동시에 시도할 때 많은 실험 단계와 시간을 필요로 하게 되고, 따라서 이와 같은 기존의 방법은 고효율 단백질 발현 시스템의 조건을 충족시키지 못하고 있다.

단백질체학 연구를 위한 고효율 단백질 생산의 또 다른 걸림돌은 융합 파트너의 제거에 있다. 융합 파트너 혹은 이와 결합한 친화성 tag은 목적 단백질의 가용성 증가와 정제 용이성을 위한 것이지만, 목적 단백질의 성질 혹은 기능에 영향을 미칠 수 있으므로 대부분의 후속 연구에서는 궁극적으로는 제거되는 것이 바람직하다. 이들 단백질 혹은 펩타이드의 제거는 혈액응고인자 factor Xa, 트롬빈, 또는 엔터로키나제(enterokinase)와 같은 부위 특이적 단백질 분해효소에 의해 이루어지고 있다. 이러한 단백질 분해효소의 선택에 있어서 가장 중요한 기준은 목적단백질과 융합 파트너의 사이만을 잘라내는 높은 절단 특이성이다. 융합 파트너 혹은 목적 단백질 내부에서 분해효소가 작용하는 경우 정제의 어려움 뿐 아니라, 목적단백질의 기능 상실 혹은 특성 변화 등을 초래할 수 있다.

따라서 융합 파트너와 목적 단백질의 내부에는 분해효소의 작용 위치가 존재 하지 않는 것이 바람직하며, 단백질 분해효소는 매우 선택적인 기질 특이성을 가져야 한다. 현재 융합 파트너의 제거를 목적으로 가장 널리 쓰이고 있는 단백질 분해효소는 트롬빈이다. 하지만 이는 NusA 등 현재 사용되고 있는 융합 파트너를 여러 조각으로 자르기 때문에 보다 높은 작용 특이성을 가지는 분해효소에 대한 필요성이 대두되었다.

본 발명은 다양한 융합 파트너 결합을 통한 목적 단백질의 가용성 증가 여부를 빠른 시간에 확인할 수 있으며, 최적의 발현 효율 및 가용성을 보이는 재조합체를 선택할 수 있고, 융합 파트너와 목적단백질간의 절단 효율 및 정확성이 높은 말단을 제공하는 목적 단백질의 발현벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 발현 벡터를 이용하여 목적 단백질의 최적 발현 효율 및 가용성을 갖는 최적 융합 파트너를 선택하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하고자, 본 발명은

목적단백질의 발현이 가능하도록 연결된,

a) 프로모터,

b) 히스티딘 Taq이 결합된, 목적 단백질의 수용성을 높이는 융합 파트너,

c) TEV (Tobacco Etch Virus) 단백질 분해효소 인식서열,

d) 아미노산 2 내지 10개로 이루어지는 링커, 및

e) 다중 클로닝 자리 (multicloning site)를 포함하는 발현 벡터에 관한 것 이다.

또한, 본 발명은

목적 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 중합효소 연쇄반응으로 증폭하고,

상기 증폭된 산물을 상이한 융합파트너 및 동일한 다중 클로닝 자리를 포함하는 2 이상의 발현벡터의 다중 클로닝 자리에 도입하고,

상기 발현벡터를 숙주세포를 형질전환시켜 상기 목적단백질을 발현시키고,

상기 목적 단백질의 발현율과 가용성을 측정하여 목적 단백질의 최적 융합 파트너를 선택하는 것을 포함하는 목적 단백질의 최적 융합 파트너를 선택하는 방법으로서,

상기 발현벡터는 목적단백질를 암호화하는 유전자의 발현이 가능하도록 연결된, a) 프로모터, b) 히스티딘 Taq-목적 단백질의 수용성을 높이는 융합 파트너, c) TEV (Tobacco Etch Virus) 단백질 분해효소 인식서열, d) 아미노산 2 내지 10개로 이루어지는 링커, 및 e) 다중 클로닝 자리 (multicloning site)를 포함하는 것인 목적 단백질의 최적 발현 시스템을 구축하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 융합 파트너는 목적 단백질의 수용성(solubility)를 증가시키는 융합 파트너를 모두 사용할 수 있으며, 그 예로는 티오레독신(thioredoxin, Trx), N-utilization substance protein A (NusA). 말토즈 결합 단백질 (maltose binding protein, MBP), 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (glutathione-S-transferase,GST)을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서는 단백질체학 연구를 위해 필요한 다수의 단백질 생산에 적합한 고효율 단백질 발현 벡터 시스템을 개발하였다. 이 시스템은 특정 단백질의 가용성 발현에 적합한 발현 벡터를 선택할 수 있도록 각각 다른 종류의 융합파트너를 포함하는 2 이상의 발현 벡터로 구성되며, 이들은 동일한 MCS를 가지므로 목적 유전자를 동시에 클로닝할 수 있다. 또한 친화 크로마토그래피를 이용한 단일 정제 단계, TEV 단백질 분해효소를 이용한 융합 파트너 제거를 통해 순수 분리된 단백질을 얻을 수 있도록 한다. 따라서 본 발명에서 제안하는 시스템은 다수의 순수 단백질을 대량생산하기에 적합한 고효율 발현 벡터 시스템이다. 이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명의 벡터는 pVFT (plasmid Various Fusion with a TEV protease recognition site) 라 명명하고 링크의 길이와 융합 파트너의 종류에 따라 이름을 달리한다. 본 발명의 벡터 시스템은 다음 16개의 벡터를 포함한다; pVFT1S, pVFT2S, pVFT3S, pVFT4S, pVFT5S, pVFT6S, pVFT1L, pVFT2L, pVFT3L, pVFT4L, pVFT5L, pVFT6L.

본 발명의 발현 시스템은 아래와 같은 특징을 가지고 있다.

(a) 목적단백질의 가용성 발현을 증가시킨다고 알려져 있으며, 널리 사용되고 있는 융합 파트너들을 사용하였으며 친화성 크로마토그래피에 의한 정제가 가능하도록 polyhistidine (6(his)) tag 을 결합시켜 가용성 및 정제 용이성을 확보하였다. 또한 기존의 NusA와 Trx 융합 벡터들의 경우 발현 단백질들의 금속에 대한 친화성이 낮은 것으로 나타나는데, 이를 보완하기 위하여 6(his) tag을 융합 파트 너의 아미노 말단에 존재하도록 제작하였다. 각 벡터에 존재하는 융합 파트너는 다음과 같다.

pVFT1: 6(his)-TEV 절단 부위

pVFT2: 6(his)-GST (Glutathione-S-transferase)-TEV 절단 부위

pVFT3: 6(his)-Trx (Thioredoxin)-TEV 절단 부위

pVFT4: 6(his)-MBP (periplasmic 신호 서열이 존재하지 않는 maltose-binding protein)-TEV 절단 부위

pVFT5: 6(his)-MBP (periplasmic 신호 서열이 존재하는 maltose-binding protein)-TEV 절단 부위

pVFT6: 6(his)-NusA (N-utilization substance protein A)-TEV 절단 부위

다양한 융합 파트너 결합을 통한 목적 단백질의 가용성 증가 여부를 빠른 시간에 확인할 수 있도록 하기 위해서 모든 벡터의 MCS를 동일하게 고안하였다. 따라서 한 번의 중합효소 연쇄반응으로 얻어진 DNA 산물을 각 벡터에 동시에 클로닝할 수 있으며, 이로부터 최적의 발현 효율 및 가용성을 보이는 재조합체를 선택할 수 있다.

융합 파트너와 목적 단백질 사이에 TEV (Tobacco Etch Virus) 단백질 분해효소의 인식서열이 존재하도록 하였다. TEV 단백질 분해효소는 7개의 아미노산 서열, 즉, Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly 을 인식하여 작용하며 (Daugherty, W. G. 1988), 기존에 사용되고 있는 thrombin 등의 단백질 분해효소보다 특이성이 훨씬 높아서 융합 파트너 또는 목적 단백질 내부에 작용할 가능성이 매우 낮다. 특히, Glu, Tyr, Gln, 과 Gly이 효율적인 절단에 요구되며, 절단은 Gln과 Gly 사이에서 일어난다. TEV 단백질 분해효소는 대장균을 이용한 발현 정제가 용이하다.

TEV 단백질 분해효소 작용 부위와 목적 단백질사이의 링커를 넣어 높은 절단 효율를 나타내도록 하였다. 링커는 그 서열을 구성하는 아미노산의 종류에는 무관하며 그 크기는 2 내지 10 개의 아미노산으로 이루어지며, 바람직하게는 2 내지 5 개의 아미노산으로 이루어진다. 목적 단백질의 구조적 특성으로 인하여 N-말단의 절단 부위가 노출되지 않는 경우 단백질 분해효소를 처리하여도 효율적인 절단 작용이 일어나지 않을 수 있는데, 이 때 링커가 삽입된 벡터는 절단 효율을 높일 수 있다. 그러나 링커의 길이가 길어지면 절단 효율은 높아지는 반면, flexibility 가 증가하여 목적 단백질의 결정화를 저해하는 등 후속 연구에 영향을 줄 수 있다. 따라서 링커의 길이를 달리하는 (L, 5개 아미노산; S, 2개 아미노산) 벡터들을 제작하였으며, 이에 따라 pVFT(X)L 및 pVFT(X)S라고 명명하였다 ("X", 는 융합 파트너에 따른 번호).

본 발명에서 사용가능한 숙주세포는 각종 원핵세포를 모두 포함하는 의도이나, 바람직한 예는 E.coli를 들 수 있다. 상기 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하는 방법은 본 기술분야에서 널리 알려진 기술을 모두 적용할 수 있다.

하기 예시적인 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.

실시예 1 : pVFT1L ~ pVFT6L 벡터 제작

1-1: pVEFT1L-pVEFT2L 벡터의 제작

먼저 TEV 절단 부위를 포함하는 프라이머 쌍을 합성하였다. 정방향 프라이머를 P1 (SEQ ID NO:1 )와 역방향 프라이머 P2(SEQ ID NO:2)를 다음과 같이 표시하였다.

P1:　5‘-CTA GCG GTA CCA CGG AAA ACC TGT ATT TTC AGG GTG CCA TGG-3'(SEQ ID NO:1 ) 및

P2: 5'-GAT CCC ATG GCA CCC TGA AAA TAC AGG TTT TCC GTG GTA CCG-3' (SEQ ID NO:2).

T4 뉴클레오티드 키나제를 이용하여 상기 프라이머쌍를 인산화 시킨 다음 annealing 하여, N 말단에는 NheI, C 말단에는 BamHI 의 접착성 말단 (cohesive ends)을 노출시켰다. pET28a(Novagen 사, 미국)를 NheI과 BamHI 제한효소로 처리하고, 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 삽입체를 pET28a와 연결시켜 폴리히스티딘 taq (polyhistidine tag)을 가지는 벡터 (pVFT1L) 를 만들었다. 상기 pVFT1L 은 pVFT3L~6L 벡터의 모체로 사용되었다.

또한 pET41a(Novagen 사, 미국)를 SpeI과 BamHI으로 개환하고 상기 인산화된 P1 및 P2 삽입체를 연결시켜 pVFT2L 벡터를 제작하였다.

1-2: 융합 파트너 및 pVFT3L-5L의 제조

pVFT3L~5L 벡터의 각 융합 파트너에 해당하는 DNA 단편을 얻기 위하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. Trx 와 MBP, signal-MBP 유전자는 각각 pET32a (Novagen 사, 미국), pMAL-c2X 및 pMAL-p2X 벡터로부터 증폭하였으며 (New Enbland Biolab 사, 미국), 이 때 사용된 프라이머의 염기서열은 다음과 같다. 얻어진 DNA 단편은 NdeI과 NheI로 처리하여 같은 효소로 개환한 pVFT1L 벡터와 연결하였다.

벡터	융합 파트너	프라이머	SEQ ID NO
pVFT3L	Trx	P 3: 5'-gga gat ata cat atg agc gat aaa att att cac ctg-3'	3
pVFT3L	Trx	P 4: 5'-aga acc gct agc ggc cag gtt agc-3'	4
pVFT4L	MBP	P 5: 5'-gcc tcg gct cat atg aaa atc gaa gaa ggt aaa ctg-3'	5
pVFT4L	MBP	P 6: 5'-cga gct gct agc agt ctg cgc gtc ttt-3'	6
pVFT5L	signal-MBP	P 7: 5'-gga cca tag cat atg aaa ata aaa aca ggt gca cgc-3'	7
pVFT5L	signal-MBP	P 6: 5'-cga gct gct agc agt ctg cgc gtc ttt-3'	6

또한 pVFT6L 에 포함된 NusA 유전자를 얻기 위하여 pET43.1a (Novagen 사, 미국)벡터를 NdeI과 SpeI 효소로 처리한 다음, 1.5 kb 크기의 DNA 단편을 agarose 젤부터 분리하였다. pVFT1L 벡터를 NdeI과 NheI로 효소로 처리하여 개환하고, 얻어진 NusA 유전자와 ligation 하였다.

상기와 같이 제작된 벡터는 DNA 서열을 분석하여 염기서열을 확인하였다.(COSMA사, 한국; ABI 3730)

실시예 2: pVFT1S ~ pVFT6S 벡터 제작

2-1: pVFT1S-pVFT2S의 제작

pVFT1L 벡터를 주형으로 정방향 프라이머 P8((SEQ ID NO: 8), 및 역방향 프라이머, P9(SEQ ID NO: 9)을 사용하여 상기 실시예 1와 동일한 방법으로 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.

P8: 5'-AGA TAT ACC ATG GGC AGC AGC CAT CAT CAT-3'(SEQ ID NO: 8)

P9: 5’-GAA TTC GGA TCC CTG AAA ATA CAG GTT TTC-3'(SEQ ID NO: 9)

상기 얻어진 DNA 단편을 NcoI과 BamHI으로 처리하여 삽입물을 준비하고 pET28a를 동일한 제한효소로 처리한 후 삽입물과 연결시켜 pVFT1S 벡터를 만들었다. 이는 pVFT3S~ 6S 벡터의 모체로 사용되었다.

상기 pVFT1S 벡터를 NdeI과 NheI 제한효소로 처리하고 pET41a를 NdeI과 SpeI 제한효소 처리하여 얻어진 GST 절편을 삽입하여 6(his) 및 GST 융합 파트너 부위를 포함하는 pVFT2S 벡터를 만들었다.

2-2: 융합 파트너 및 pVFT3S-5S의 제조

pVFT3S~ 5S의 융합 파트너에 해당하는 Trx, MBP DNA 단편, 및 NusA 삽입체는 실시예 1과 동일한 DNA 단편을 사용하였다. pVFT1S 벡터를 NdeI과 NheI 제한효소로 처리하고 준비된 삽입체와 연결하여 pVFT3S~ 6S를 제작하였다.

실시예 3 : 재조합 TEV 단백질 분해효소의 정제

목적단백질과 ℃융합 파트너 절단에 사용될 TEV 단백질 분해효소를 준비하기 위하여 발현 벡터를 제작하였다. TEV 단백질 분해효소를 암호화하는 유전자가 들어 있는 발현 벡터는 ScienceReagents. Inc (Atlanda, USA)에서 구입하였다. 발현된 단백질은 히스티딘-킬레이팅(Histidine-chelating) 컬럼을 이용하여 정제한 다음, 저장 완충액 (50mM Tris, pH7.5, 1mM EDTA, 5mM DTT, 50% glycerol, 0.1% Triton X-100) 으로 최종농도가 1mg/ml 되도록 희석하여 -70 ·℃에 보관하였다. 이러한 방법을 통해 활성을 갖는 재조합 TEV 단백질 분해효소를 다량 확보할 수 있다.

실시예 4 : H.pylori의 HP0534 단백질 발현

헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) 의 HP0534 (cag13) 유전자는 cag pathogenesity island (cag-PAI) 의 구성 유전자 가운데 하나로 196개 아미노산으로 이루어지는 단백질을 암호화한다. 헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) 26695의 genomic DNA 추출물로부터 정방향 프라이머, P10 (SEQ ID NO:10)과 역방향 프라이머, P11 (SEQ ID NO:11)을 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하여 HP0534 유전자를 얻었으며, 이를 BamHI과 XhoI 제한효소로 처리하였다.

P10: 5‘-ggg acc aag gga tcc atg agt aat aac atg-3'(SEQ ID NO:10)

P11: 5'-tcc aca tca ctc gag tta cac tcc ttt ttg-3'(SEQ ID NO:11)

실시예 1에서 얻은 pVFT6L 벡터를 BamHI과 XhoI 제한효소로 개환하고 상기 증폭하여 얻은 HP0534 삽입물과 연결하여 발현벡터를 제작하였다. 이를 E.coli BL21(DE)3 (Novagen 사, 미국)에 형질전환시켜 단일 콜로니를 선별하였다. 이를 kanamycin (30 ug/ml) 이 첨가된 LB 배지에서 배양하다가 흡광도 (600 nm) 0.6 에 도달하였을 때 1 mM IPTG 를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 약 4 시간 후, 세포를 회수하고 HiTrap Chealating HP 컬럼(Amersham-Pharmacia, 미국) 을 이용하여 HP0534 융합 단백질을 정제하였다. 상기 단백질 용액을 상기 실시예 3에 따라 TEV 반응액 (50mM Tris, pH8.0, 0.5mM EDTA, 1mM DTT) 으로 완충용액을 교환하였다. 그런 다음 TEV 단백질 분해효소 : 융합 파트너의 비가 1:400이 되도록 하여 실온에서 16시간 반응시켰다. 상기 반응산물을 전기영동하여 도 3에 나타내었다. 도 3은 TEV 단백질 분해효소에 의한 NusA-HP0534 융합 파트너의 절단 양상을 확인한 결과로서, 매우 효율적인 절단이 있어났으며 NusA가 제거된 23 kDa의 목적 단백질을 얻을 수 있었다.

실시예 5 : 대장균에서 사람의 단백질 발현 조건 탐색

인간유전체 기능연구 사업단으로부터 위암 또는 간암과 연관성을 보이는 것으로 알려진 사람 유전자들을 제공받아, pVFT 벡터 시스템을 이용한 재조합 단백질 발현을 조사하였다. 각 유전자를 발현벡터에 삽입한 다음, 이를 E.coli BL21(DE)3 (Novagen 사, 미국)에 형질전환시키고, 얻어진 형진전환체를 kanamycin (30 ug/ml) 이 첨가된 LB 배지에서 배양하다가 흡광도 (600 nm) 0.6 에 도달하였을 때 1 mM IPTG 를 첨가하여 단백질 발현을 유도하였다. 약 4 시간 후, 세포를 회수하여 SDS-PAGE를 실행하였다. coomassie blue로 젤을 염색하여, 예상 분자량의 단백질 발현이 유도되었는지 확인하였다. IPTC 첨가 후 37 oC 에서 배양하였을 때 가용성 발현이 일어나지 않는 경우에는 배양온도를 18 oC 이하로 낮추어서 발현 여부를 재차 확인하였다.

총 28 가지 유전자에 대한 단백질 발현을 조사하여 그 결과를 표 2 및 표 3에 요약하였다. 상기 28 가지 가운데 한 가지 유전자를 제외한 모든 경우에서 성공적인 가용성 발현을 확인하였다. 6x(his) tag만을 결합시켰을 때는 약 76% (16/21)의 가용성 발현율을 얻었으며, 다양한 융합체 형태로 발현시켰을 때는 한 가지 유전자를 제외한 모든 경우에서 가용성 발현 조건을 찾을 수 있었다. 또한 융합 파트너의 종류에 따라 가용성의 차이가 나타나는 경우가 상당 수 있는데, 이는 본 발명의 벡터 시스템을 이용한 발현 조건 스크리닝 방법이 매우 유용한 것임을 입증한다. 그 중 PP1R11 (표 2, No 14) 유전자를 Trx, GST 및 NusA 융합 파트너와 연결하여 융합 단백질 발현을 조사한 결과를 도 4에 나타내었다.

K.Bussow 등은( Genome Biology 5: R71.1-R71.8, 2004 ) 대장균에서 10825 가지 단백질의 발현을 조사하여, 히스티딘 tag을 이용하였을 때의 가용성 발현율이 약 17% (1866/10825) 임을 보고하였다. 이와 비교하였을 때 본 발명의 벡터 시스템이 보이는 가용성 발현율은 월등히 높은 것이다.

No.

Unigene

Name

37℃에서의 가용성 발현

저온에서의 가용성 발현

His

Trx

GST

NusA

MBP

His

Trx

GST

NusA

MBP

1

Hs.76153 (KU028314)

Endoglin receptor, intracellular domain

O

2

Hs.76153 (KU028314)

Endoglin receptor, extracellular domain

X

O

3

Hs.76153 (KU028314)

Endoglin extracellular truncated domain I

X

O

4

Hs.76153 (KU028314)

Endoglin extracellular truncated domain II

X

O

5

Hs.276315 (KU035057)

Hyphothetical

O

6

Hs.257697 (KU001163)

Programmed cell death 4

O

7

Hs.257697 (KU001163)

Programmed cell death 4 truncated I

O

8

Hs.257697 (KU001163)

Programmed cell death 4 truncated II

O

9

Hs.103808 (KU005888)

Chromosome 20 open reading frame 11 (Twa1)

O

10

Hs.103808 (KU005888)

Chromosome 20 open reading frame 11 (Twa1)

O

X

O

11

Hs.30026 (KU003363)

HSPC182 protein

O

12

Hs.442658 (KU002282)

Aurora kinase B

_

O

_

X

13

Hs.853354 (KU015738)

Lysyl oxidase-like 2

X

O

14

Hs.82887 (KU008133)

Protein phosphatase 1, regulatory subunit 11

X

O

X

15

Hs.356590 (KU002432)

Protein phosphatase 1, regulatory subunit 8

X

O

16

Hs.313 (Lu014937)

Osteopontin

O

17

Hs.15580 (KU005280)

Leukocyte recetor cluster member 5

X

O

18

Hs.350966 (KU001190)

Pituitary transforming 1

X

O

19

Hs.193989 (KU001958)

TAR DNA binding protein

X

20

Hs.72550 (KU009217)

RHAMM (Hyaluronan -mediated motility receptor)

X

O

X

O

No.

Unigene

Name

37℃에서의 가용성 발현

저온에서의 가용성 발현

His

Trx

GST

NusA

MBP

His

Trx

GST

NusA

MBP

21

Hs.26367 (KU001194)

Autophagy Apg3p/Aut1p-like

O

22

Hs.374491 (KU026008)

Proliferation-associated 2G4

O

23

Hs.369026 (KU001317)

Pituitary tumor-transforming 1 interacting protien

X

O

24

Hs.298229 (KU000521)

Prefoldin 2

O

25

Hs.75873 (KU013781)

Zyxin, Lim domain (1, 2, 3)

O

26

Hs.75873 (KU013781

Zyxin, Lim domain (3)

O

27

Hs.306278 (KU000105)

CD44 cytoplasmic domain

O

28

Hs.306278 (KU000105)

CD44 extracellular domain

O

실시예 6 : Twa1 단백질 발현 정제 및 결정화

Twa1(Two-hybrid associated protein No.a with RanBPM) 유전자는 KUGI 005888 플라스미드 (인간유전체 기능연구 사업단 제공) 로부터 중합효소 연쇄반응에 의하여 얻었으며, 이 때 정방향 프라이머, P12 (SEQ ID NO:12)와 역방항 프라이머, P 13 (SEQ ID NO:13) 을 사용하였다.

P12: 5'-acg aaa taa gga tcc atg agt tat gca gaa aaa ccc-3'(SEQ ID NO:12)

P13: 5'-caa gcg ctc gag cta ctt ggg ctc ct-3'(SEQ ID NO:13)

각각의 발현벡터를 BamHI과 XhoI 제한효소로 처리하여 준비하고 역시 같은 제한효소를 처리하여 정제된 Twa1 중합효소 연쇄반응 산물을 연결시켰다. 이를 대장균 BL21(DE)3 에 형질전환시켰다. Twa1 단백질은 지수 성장기에서 최종 농도 1mM IPTG로 섭씨 37도에서 발현시켰으며, SDS-PAGE에 의하여 가용성 발현을 확인하였다. 도 5에서 보이는 바와 같이 모든 융합체로부터 가용성 발현을 확인하였다 (표 2, No.9). 이 가운데 6x(his) tag을 가진 발현벡터를 선택하여 Twa1의 다량 발현을 시도하였다.

6x(his) tag이 융합된 Twa1 단백질은 HiTrap Chealating HP 컬럼(Amersham-Pharmacia, 미국) 을 이용하여 정제하였다. 각 분획에 대하여 SDS-PAGE를 실행하여 목적 단백질을 포함하는 분획들을 모아, 실시예 3의 TEV 반응액 (50mM Tris, pH8.0, 0.5mM EDTA, 1mM DTT) 으로 완충용액을 교환하고 TEV 단백질 분해효소 : Twa1 의 비가 1: 400이 되도록 하여 실온에서 16시간 반응시켰다. 반응산물에 대해서 전기영동을 수행하여 그 결과를 도 6에 나타냈으며, 거의 100% 의 절단 효율을 보였다.

6x(his) tag이 제거된 Twa1 단백질은 다시 HiTrap Q 컬럼 (Amersham Pharmacia) 과 Superdex 75 컬럼 (Amersham Pharmacia)을 이용하여 정제하였다. 순수분리된 Twa1 단백질은 겔 여과 완충액 (20mM Tris, pH7.5, 100mM NaCl, 1mM DTT)에 13.4 mg/ml 의 농도로 하여 -70 ℃에 보관하였다.

Twa1 단백질의 삼차구조 해석을 위해 reservoir solution 1ul와 단백질 1ul을 섞어 Microbatch의 방법으로 결정화를 시도하였다. 초기 결정화 조건은 Crystal Screen I and II (Hampton Research 사, 미국) and Structure Screens I and II (Molecular-Dimension Ltd., 미국) and Crystal Screen Cryo I and II (Hampton Research 사, 미국) 를 사용하여 스크리닝하였으며, 도 8(a)과 같은 결정을 얻었다.

실시예 7 : RHAMM 단백질 발현, 정제 및 결정화

KUGI 009217 플라스미드 (인간유전체 기능연구 사업단 제공) 로부터 사람의 RHAMM (hyaluronan-mediated motility receptor) 유전자 가운데 hyaluronic acid 결합부위 (633-695 아미노산) 를 중합효소 연쇄반응에 의하여 증폭하였다. 이 때 정방향 프라이머, P14 (SEQ ID NO: 14)와 역방향 프라이머, P15 (SEQ ID NO:15) 이 사용되었다.

P14: 5'-cta aat gga tcc aga gat tca tat gct aaa-3'(SEQ ID NO: 14)

P15: 5'-tga agg ctc gag tta ttt gat acc tag aac-3'(SEQ ID NO: 15)

각각의 벡터는 BamHI과 XhoI 제한효소를 처리하여 준비하고 역시 같은 제한효소를 처리하여 정제된 RHAMM 중합효소 연쇄반응 산물을 연결시켰다. 이를 대장균 BL21(DE)3 에 형질전환 시켰다. RHAMM 단백질 발현은 최종 농도 1mM IPTG로 유도하였으며, 37 ℃에서는 비가용성 발현만이 확인되었다. 발현 온도를 낮추어 10 ℃에서 배양하여 가용성 발현을 확인하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다 (표 2, No.20).

6x(his) tag이 융합된 RHAMM 단백질을 실시예 6에서와 같은 방법으로 발현시키고, 6x(his) tag을 제거하였다. RHAMM 단백질은 다시 HiTrap Q 컬럼과 Superdex 75 컬럼 크로마토그래피를 거쳐 정제하였고 최종농도 3.1 mM 로 -70 ℃에 보관하였다.

RHAMM 단백질의 삼차구조 해석을 위해 reservoir solution 1ul와 단백질 1ul을 섞어 microbatch의 방법으로 결정화를 시도하였다. 여러 조건에서 도 8(b)과 같은 결정이 형성되었다.

이상의 실험에서 제작된 벡터 시스템은 대장균을 이용한 단백질 생산의 가장 큰 난관인 가용성 발현 및 정제의 문제점을 극복하고자 개발되었다. 다양한 융합 파트너를 포함하는 모든 벡터가 동일한 클로닝 자리를 가지도록 함으로써 하나의 중합효소 연쇄반응 산물을 각 벡터에 동시에 클로닝하여 최적의 발현율과 가용성을 보이는 재조합체를 선택할 수 있으며, 따라서 다수의 단백질을 연구하기에 적합하도록 고안하였다. 또한 목적 단백질에 결합된 인자를 이용한 친화성 크로마토그래피를 통해 목적 단백질의 순수분리가 가능케 하였다. 발현 벡터시스템에 TEV 단백질 분해효소 인식 자리를 넣어 결합인자를 목적 단백질로부터 떼어 낼 때 단백질 분해효소의 낮은 특이성으로 인해 야기되었던 문제점을 해결함으로써 단백질 관련 연구에 반드시 선행되어야 하는 순수 단백질의 대량생산을 단시간에 가능케 하였다.

본 발명은 다양한 융합 파트너 결합을 통하여 목적 단백질의 가용성 증가여부를 빠른 시간에 확인할 수 있으며, 최적의 발현 효율 및 가용성을 보이는 재조합체를 선택할 수 있고, 융합 파트너와 목적단백질간의 절단 효율 및 정확성이 높은 말단을 제공한다.

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상기 증폭된 산물을 상이한 융합파트너 및 동일한 다중 클로닝 자리를 포함하는 발현벡터인 pVFT1L 내지 pVFT6L 및 발현벡터 pVFT1S 내지 pVFT6S의 12종의 벡터의 각각의 다중 클로닝 자리에 도입하고,

상기 발현벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 상기 목적단백질을 발현시키고,

상기 목적단백질의 발현율과 가용성을 측정하여 목적단백질의 최적 융합 파트너를 선택하는 것을 포함하는 목적단백질의 최적 융합 파트너를 선택하는 방법으로서,

상기 발현벡터인 pVFT1L 내지 pVFT6L 및 발현벡터 pVFT1S 내지 pVFT6S는 각각 목적단백질를 암호화하는 유전자의 발현이 가능하도록 연결된, a) T7 프로모터, 하기 표의 목적단백질의 수용성을 높이는 융합 파트너를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, c) TEV(Tobacco Etch Virus) 단백질 분해효소 인식서열, d)아미노산 2개 또는 5개로 이루어진 링커, 및 e) 다중 클로닝 자리 (multicloning site)를 포함하는 것인 목적단백질의 최적 발현 시스템을 구축하는 방법.

[표 1]

벡터 명 융합 파트너 pVFT1L 히스티딘 Taq-TEV(Tobacco Etch Virus) 절단 부위(pVFT1) pVFT2L 히스티딘 Taq-글루타티온-S-트랜스퍼라제(glutathione-S-transferase,GST)-TEV 절단부위 pVFT3L 히스티딘 Taq-티오레독신(thioredoxin,Trx)-TEV 절단부위 pVFT4L 히스티딘 Taq-periplasmic 신호 서열이 존재하지 않는 말토오스 결합 단백질(maltose binding protein, MBP)-TEV 절단부위 pVFT5L 히스티딘 Taq-periplasmic 신호 서열이 존재하는 말토오스 결합 단백질-TEV 절단부위 pVFT6L 히스티딘 Taq-N-utilization substance protein A(NusA)-TEV 절단부위 pVFT1S 히스티딘 Taq-TEV(Tobacco Etch Virus) 절단 부위(pVFT1) pVFT2S 히스티딘 Taq-글루타티온-S-트랜스퍼라제(glutathione-S-transferase,GST)-TEV 절단부위 pVFT3S 히스티딘 Taq-티오레독신(thioredoxin,Trx)-TEV 절단부위 pVFT4S 히스티딘 Taq-periplasmic 신호 서열이 존재하지 않는 말토오스 결합 단백질(maltose binding protein, MBP)-TEV 절단부위 pVFT5S 히스티딘 Taq-periplasmic 신호 서열이 존재하는 말토오스 결합 단백질-TEV 절단부위 pVFT6S 히스티딘 Taq-N-utilization substance protein A(NusA)-TEV 절단부위

제4항에 있어서,

상기 pVFT1L는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 삽입체를, 제한효소 NheI과 BamHI으로 처리한 pET28a에 삽입하여 제조한 것이고,

상기 pVFT2L는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 삽입체를, 제한효소 SpeI과 BamHI으로 처리한 pET41a에 삽입하여 제조한 것이며,

상기 pVFT1S는 서열번호 8의 서열을 가진 정방향 프라이머 및 서열번호 9의 서열을 가진 역방향 프라이머를 이용하여 pVFT1L를 주형으로 증폭한 후, 상기 증폭산물을 제한효소 NcoI과 BamHI으로 처리한 삽입체를, 제한효소 NcoI과 BamHI으로 처리한 pET28a에 삽입하여 제조한 것이고,

상기 pVFT2S는 pET41a를 제한효소 NdeI과 NheI으로 처리하여 얻어진 글루타티온-S-트랜스퍼라제인 삽입체를, 제한효소 NdeI과 NheI으로 처리한 pVFT1S에 삽입하여 제조한 것인 목적단백질의 최적 발현 시스템을 구축하는 방법.