KR960014591B1 - 천연형 인간 성장 호르몬의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

천연형 인간 성장 호르몬의 제조 방법

제1도는 100mM 트리스 완충 용액(pH 8.0)하에서 염화나트륨 농도변화에 따른 아미노펩티다제의 활성도 변화를 나타낸 것이고,

제2(a) 및 2(b)도는 각각 아미노펩티다제와의 반응에 의해 N-말단의 메티오닌이 제거되기 전 및 후에 N-말단 서열 분석한 결과를 나타낸 것이고,

제3도는 최종 제조된 천연형 인간 성장 호르몬을 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)하여 나타낸 것이고,

제4도는 천연형 인간 성장 호르몬의 등전점(pI)을 나타낸 것이다.

본 발명은 유전자 재조할 방식에 의해 만들어진 메티오닐 인간 성장 호르몬(methionyl-human growth hormone)을 아미노펩티다제를 이용하여 천연형과 동일한 N-말단의 아미노산을 갖는 재조할 인간성장 호르몬을 제조하는 방법에관한 것으로, 보다 상세하게는 메티오닐 인간 성장 호르몬을 스트렙토미세스 그리세우스 아종(Streptomyces griseus subsp.) IFO 13689 또는 그의 동일 균주인 KCCM 1200배의 배양액으로부터 얻은 아미노펩티나제로 처리하여 N-말단의 메티오닌을 제거함으로서 천연형의 제조합 인간 성장 호르몬을 제조하는 방법에 관한 것이다.

인간 성장 호르몬을 사람의 뇌하수체에서 생성되는 191개의 아미노산으로 구성된 분자량 약 21,500의 펩타이드 호르몬으로서 주로 왜소증 치료에 이용되어 왔다[Raben, M. S., J. Clin, Endocr. 18,901(1958)].

종래에는 죽은 사람의 뇌하수체에서 추출 및 정제한 인간 성장 호르몬을 사용하여 왔으나 그 양의 크게 제한되어 모든 환자에게 공급되지 못하였다. 또한 최근의 보고에서 뇌하수체 유래의 인간 성장 호르몬을 접종 받은 어린이 중 4명이 바이러스에 감염되어 사망했다고 밝혀짐으로써 미국 식품 의약국에서 이의 사용을 금지시켰다(Science 234, 22(1986)).

따라서 최근에는 유전공학 기술을 이용하여 대장균 및 효모에서 인간 성장 호르몬을 발현 및 분리 정제하여 임상에 이용하고 있다(대장균 : 대한민국 특허공고 제 89-1244호 및 제87-701호와 특허공개 제87-2258호 및 84-8695호, 효모 : 대한민국 특허공고 제92-99호와 특허공개 제90-9973호 및 90-9976호).

그러나 상기와 같이 대장균 또는 효모를 이용하는 방법으로 재조합 인간 성장 호르몬을 생산할 경우, 인간 성장 호르몬이 191개의 아미노산기 이외에 N-말단에 아미노산 합성시작코돈(codon)인 메티오닌(methionine)이 하나 더 첨가된 192개의 아미노산기로 이루어진 메티오닐 인간 성장호르몬으로 생산된다. 메티오닐 인간 성장 호르몬은 생물학적 역가면에서 천연형 인간 성장호르몬과 같은 성질을 보여 주었으며(Moore, J. A. Endocrinology 122, 2920-2926(1988)), 또한 메티오닌이 첨가되어서 일어나는 부작용등이 보고된 바는 없으나, 첨가된 메티오닌으로 인하여 간혹 항테가 생성될 수가 있으며 체내에서의 항체 생성율이 천연형보다 약간 높다는 보고가 있었다(Lancet, March 29,697(1986)).

따라서 재조합 인간 성장 호르몬의 제조과정에서 N-말단의 메티오닌이 없는 천연형의 인간 성장 호르몬을 제조하고자 하는 많은 시도가 있었다.

예컨데, 인간 성장 호르몬의 N-말단과 다른 단백질의 C-말단을 융합 발현시킨 후 특수한 프로테아제(protease)를 이용하여 절단하는 방법(WO 89/12678; EP 20290; 321940), 성장 호르몬이 세포내에서 발현된후 숙주세포 밖으로 분비되면서 메티오닌이 잘려 나가도록 하여 배지로부터 천연형의 인간 성장 호르몬을 얻는 방법등이 제시되었다(EP 088632 A2, USP 4755466, JP 01273591, EP 306673, 대한민국 특허출원 제 92-10932호).

그러나, 상기의 방법들은 새로이 벡터를 만들거나 숙주 세포를 형질전환하는 등의 번거로운 조작과 발효조건을 최적화시키는 노력이 부가적으로 필요하다는 단점이 있다. 이러한 부가적인 노력없이, 기존에 정제된 N-말단 메티오닐 인간 성장 호르몬을 N-말단에 존재하는 메티오닌만을 선택적으로 제거할 수 있는 특후한 아미노펩티다제(amonopeptidase)로 처리하여 천연형의 인간 성장 호르몬을 제조하는 방법이 개시되어 있다(WO 86/04609; WO 86/204527 A1).

메티오닐 인간 성장 호르몬의 N-말단 아미노산 서열이 Met-Phe-Pro-Thr-Ile으로 시작되므로 N-말단 메티오닌만을 선택적으로 제거하기 위해 사용될 수 있는 아미노펩티다제는, X-Pro를 인지하여 절단반응이 X앞에서 정지되는 특성을 지니고 있는 효소이어야 하며, 이러한 성질을 지니는 효소가 자연계로부터 분리되었어도 효소 자체의 내재활성도가 월등히 높은 것이 산업적으로 이용하는데 유리하다.

현재까지 알려진 다양한 아미노펩티다제중 천연형 인간 성장 호르몬의 제조에 이용되는 아미노펩티다제는 비브리오 프로테올리티커스(Vibrio proteolyticus)에서 정제한 아미노펩티다제(WO 86/01229), 돼지 신장에서 정제한 아미노펩티다제(WO 86/204527 A1)등이 있다.

본 출원인도 스프렙토미세스 그리세우스 아종(Streptomyces griseus subsp.) IFO 13689 또는 KCCM 12400에서 으로부터 상기 천연형 인간 성장 호르몬의 제조에 유용한 아미노펩티다제를 분리한바 있다(본원과 동일자 특허출원 제92-25909호, 명칭 : 신규한 아미노펩티다제 및 그의 분리 방법).

일반적으로 효소의 활성은 완충용액의 조건에 따라 가변적일 수 있기 때문에 새로운 효소를 사용하기 위해서는 완충용액의 최적화 결정이 필요하다.

본 발명자들이 상기에 언급한 스트렙토미세스 그리세우스 아종(Streptomyces griseus subsp.) IFO 13689 또는 KCCM 12400에서 분리한 아미노펩티다제를 천연형 인간 성장 호르몬의 제조에 이용하기 위하여 완충 용액의 최적 조건을 찾던 중, 특정 pH 범위에서 효소 활성이 최대로 나타나며, 완충용액에 염화나트륨이 첨가될 경우 첨가되지 않은 경우보다 상대적으로 효소의 활성이 증가됨을 발견하게 되어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 메티오닐 인간 성장 호르몬을 반응 완충 용액하에서 스트렙토미세스 그리세우스 아종 IFO 13689, KCCM 12400에서 분리된 아미노펩티다제로 처리하고, 양이온 교환 크로마토그래피하는 단계를 포함하는 천연형 인간 성장 호르몬의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 메티오닐 인간 성장 호르몬으로는 통상의 정제 방법으로 얻어진 모든 메티오닐 인간 성장 호르몬을 사용할 수 있으며, 메티오닐 인간 성장 호르몬 1mg당 0.2 내지 20단위(unit)의 아미노펩티다제를 처리하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면, 반응 완충 용액의 pH는 7.5 내지 8.5가 바람직하며, 염화나트륨을 첨가할 수 있다. 첨가되는 염화나트륨은 최종 농도에 제한이 없으나, 바람직하게는 최종 농도가 100 내지 150mM 되게 하는 것이 좋다.

양이온 교환 크로마토그래피 과정에서 아미노펩티다제는 컬럼에 흡착되기 때문에 순수하게 천연형 인간 성장 호르몬을 분리할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 실시예에서 사용되는 메티오닐 인간 성장 호르몬으로는 대한민국 특허출원 제 90-3465에 개시된 방법으로 정제된 것이 사용되고, 아미노펩티다제로는 본 출원인에 의해 본원과 동일자로 출원된 대한민국 특허출언 제 92-25909호(명칭 : 신규한 아미노펩티다제 및 그의 분리방법)에 명시된 스트렙토미세스 그리세우스 아종 IFO 13865, KCCM 12400에서 분리된 아미노펩티다제가 사용되었다. 아미노펩티다제의 unit 정의는 100mM 트리스(pH 8.0)에 용해된 루이신-파라 니트로아닐리드(Leucine-PNA)를 기질로 한 완충용액(1ml)에 아미노펩티다제를 가하여 37℃에서 반응시켰을때 405nm에서 분당 O.D.를 1변화시키는 효소의 양을 말한다. 하기의 실시예의 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시된 것일 뿐이고 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니다.

참조예 :

반응 완충 용액의 최적 조건 조사

기질로서 루이신-파라니트로아닐리드(Leucine-PNA)를 포함하는 완충용액을 각 pH별로 준비하되, pH 4와 5는 100mM 초산나트륨, pH 6과 7은 인산나트륨, pH 8은 트리스, pH 9와 10은 글리신, pH 11은 인산-NaOH의 완충 용액으로 만든 후, 각 완충용액 1ml에 동량의 아미노펩티다제를 처리하여 그 결과를 다음의 표 1에 나타내었다.

이에 의하면 pH 8의 완충 용액에서 처리했을때가 다른 완충 용액에서보다 월등히 좋은 효과를 활성을 나타냄을 알 수 있었다.

또한 염화나트륨의 최종 농도가 각각 0, 10, 50, 150, 200되게 첨가된 100mM 트리스 완충 용액(pH 8.0)에서 상기 기질과 효소를 처리하고, 그 결과를 제1도에 나타내었다. 제1도에 나타난 바와 같이 염화나트륨이 첨가되지 않은 것보다는 첨가된 것이 효소 활성도가 상대적으로 높고 최종 농도 100 내지 150mM에서 가장 높은 효소 활성도를 나타냄을 알 수 있다.

실시예 1

천연형 인간 성장 호르몬의 제조

메티오닐 인간 성장 호르몬 약 7mg에 아미노펩티다제 70unit를 첨가하고 반응 완충용액(50mM 트리스, pH 8.0, 100mM NaCl, 1mM PHSF, 0.02% 아지드화나트륨)으로 충분히 투석시켜준 다음, 2ml 용량의 센트리콘(centricon, Amicon사)을 이용하여 부피를 1ml까지 조절한 후 37℃ 물 중탕기에 24시간 동안 담가놓았다. 약 20시간이 경과한 후 동일의 반응 완충용액으로 재투석하였다.

상기 반응이 완료된 다음 이 반응액을 20mM 초산나트륨(pH 55)의 완충용액에 충분히 투석시키고 동일 완충용액으로 미리 평형시킨 S-세파로즈 컬럼(2.5×10cm, Bio-Rad)에 적용하고 동일 완충용액으로 세척하였다.

실시예 2

천연형 인간 성장 호르몬의 특성조사

상기 실시예 1에서 분리된 인간 성장 호르몬을 N-말단 서열 분석기(Applied Biosystems 471A Protein Sequencer)를 통해 메티오닐기가 제거된 정도를 확인하고, 그 결과를 제2도에 나타내었다. 아미노펩티다제를 처리하기 전의 경우인 제2(a)도에서는 인간 성장 호르몬의 첫 아미노산이 메티오닌으로 나타난 반면, 상기 실시예2에서 따라 얻어진 인간 성장 호르몬 제2(b)도에서 보는 바와 같이 첫 아미노산은 페닐알라닌으로 나타났으며 메티오닌 위치에는 거의 피크가 보이지 않았다.

따라서, 상기의 처리에 의해서 N-말단의 메티오닌이 거의 100% 제거되었음을 확인하였으며, 또한, N-말단의 메티오닌만이 선택적으로 절단되고 더 이상의 아미노산은 절단되지 않음을 보여주었다.

N-말단의 메티오닌이 제거된 천연형 인간 성장 호르몬의 순도 측정은 SDS-PAGE를 이용해 수행하였으며 그 결과를 제3도에 나타내었다. 제1열은 표준 분자량 마커로서 위로부터 97.4, 66.2, 42.7, 31, 21.5 및 14.4kd을 나타내며, 제2열 및 3열은 실시예 1에서 얻어진 인간 성장 호르몬을 나타내는 것이다.

최종적으로 정제된 천연형 인간 성장 호르몬의 역가를 방사 수용체 분석법(radio receptor assay)(대한내분비학회지 제5권 제3호(1990))으로 측정한 결과, 세계보건기구(WHO)에서 공급하는 뇌하수체 유래 인간 성장 호르몬(NBSB 80/5050)의 역가 2.5IU/mg과 같은 값으로 보여지는 2.71U/mg임을 확인하였다.

N-말단의 메티오닌이 제거된 천연형 인간 성장 호르몬의 등전점을 서버(SERVA사)에서 구입한 pH3 내지 10범위의 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)로 측정하여 제4도에 나타내었다. 그 결과 등전점이 5.1임을 확인하였는바, 이는 문헌에 보고된 뇌하수체 유래 인간 성장 호르몬의 등전점(Li, C. H., Fed. Proc. 16, 775-783(1957))과 비교하면 거의 일치하는 것으로 것으로 나났다.

따라서 본 발명자들에 의해 고안된 메티오닐 인간 성장 호르몬과 아미노펩티다제와의 반응조건은 천연형 인간 성장 호르몬의 물리화학적 성질을 그대로 유지시키면서 N-말단의 메티오닌만을 선택적으로 제거하는 최적의 반응 조건임이 입증되었다.

Claims (4)

1. 메티오닐-인간 성장 호르몬의 N-말단 메티오닌을 제거함으로써 천연형 인간 성장 호르몬으로 제조하는데 있어서, N-말단 메티오닐 인간 성장 호르몬을 염화나트륨이 첨가된 반응 완충 용액에서 스트렙토미세스 그리세우스 아종 IFO 13689 또는 KCCM 12400의 배양액으로부터 분리한 아미노펩티다제와 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 천연형 인간 성장 호르몬의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 아미노펩티다제 반응 단계는 pH 7.5 내지 8.5의 범위의 반응 완충 용액에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 첨가된 염화나트륨의 최종 농도가 100 내지 150mM인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 메티오닐-인간 성장 호르몬 1mg당 0.2 내지 20단위의 아미노펩티다제와 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.