FI102388B - Menetelmä vankomysiinin valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä vankomysiinin valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI102388B FI102388B FI913586A FI913586A FI102388B FI 102388 B FI102388 B FI 102388B FI 913586 A FI913586 A FI 913586A FI 913586 A FI913586 A FI 913586A FI 102388 B FI102388 B FI 102388B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- fermentation
- vancomycin
- ncaim
- culture medium
- pct
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K9/006—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure
- C07K9/008—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence being part of a ring structure directly attached to a hetero atom of the saccharide radical, e.g. actaplanin, avoparcin, ristomycin, vancomycin
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/803—Physical recovery methods, e.g. chromatography, grinding
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/867—Micromonospora
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Diaphragms For Electromechanical Transducers (AREA)
- Paper (AREA)
Description
102388
Menetelmä vankomysiinin valmistamiseksi
Keksinnön kohteena on menetelmä vankomysiini-antibiootin valmistamiseksi mikrobiologisesti aerobisen fermentoinnin (käyttämisen) avulla käyttämällä Mlcropolyspora orlentalis-lajiin kuuluvan kannan aminoglykosidi-resistenttiä mutanttia viljelyalustalla, joka sisältää assimiloituvaa hiili- ja typpilähdettä samoin kuin mineraalisuoloja.
Vankomysiini on glykopeptidi-tyyppinen antibiootti, jota tuottavat Mlcropolyspora orientalis-lajiin kuuluvat kannat. Aikaisemmissa systemaattisissa luokitteluissa nämä kannat on mainittu nimillä Streptomyces orientalls ja vast. Nocardia orlentalis [M. Goodfellow et ai.: The Biology of Actinomyce-tes, Academic Press Inc. Ltd., Lontoo, s. 129 (1984)]. Tämä molempien yllä mainittujen kantojen ominaisuus on esitetty ensimmäisen kerran US-patenttijulkaisussa 3.067.099.
Vankomysiinin valmistamiseksi teollisuusmittakaavassa Micro-polyspora orlentalis-mlkro-orqanismla kasvatetaan viljely-alustalla, joka sisältää assimiloituvaa hiili- ja typpilähdettä samoin kuin mineraalisuoloja, aerobisissa olosuhteissa, sitten fermentoinnin avulla tuotettu antibiootti erotetaan fermentointiliemestä (ks. esim. US-patenttijulkaisut 4.400.753 ja 4.667.024).
On tunnettua, että vankomysiini-antibiootti koostuu rakenteellisesti kahdesta olennaisesta osasta: sokeriyksiköstä, kemiallisesti a-0-vankosamiini-3-0-glykosyylistä, ja hepta-peptidiyksiköstä, joka on niin kutsuttu pseudopeptidi eikä genuiinipeptidi (oikea peptidi). Tämä ero on tärkeä, koska mikro-organismisssa genuiinipeptidit ja -proteiinit syntetisoidaan niin kutsuttujen ribosomien pinnalla, proteiinin syntetisointijärjestelmässä, joka on käytännöllisesti katsoen samanlainen kaikissa elävissä organismeissa, kun taas pseudopeptidi-tyyppisiä sekundäärisiä metaboliittituotteita ei valmistu yllä mainitussa järjestelmässä, vaan kompleksien entsyymien pinnoilla, jotka ovat riippumattomia ribosomeis- 2 102388 ta. Ribosomit, s.o. solujen "normaalit" proteiinin synteti-sointijärjestelmät muodostuvat ribosomaalisista ribonukleii-nihapoista ja proteiineista. On myös tunnettua, että amino-glykosidi-tyyppiset antibiootit, kuten esim. streptomysiini, kanamysiini, neomysiini ja gentamysiini vaikuttavat niiden suhteen herkkiin mikro-organismeihin siten, että niiden ollessa sitoutuneina ribosomaalisten ribonukleiinihappojen spesifisiin paikkoihin ne estävät ribosomien kehittymisen, joilla on "normaaliin" proteiinisynteesiin tarvittava rakenne. Mikro-organismeissa, jotka ovat resistenttejä aminogly-kosidi-antibioottien suhteen, ribosomit muodostavien ribosomaalisten ribonukleiinihappojen rakenteet muuttuvat siten, että aminoglykosidien sitoutuminen inhiboidaan, jolloin ne eivät voi vaikuttaa ribosomaaliseen rakenteeseen ja siten niistä tulee inaktiivisia.
Koska pseudopeptidi-tyyppisiä sekundaarisia metabolisia tuotteita ei syntetisoida ribosomeissa, vaan kompleksien entsyymien pinnoilla, jotka ovat riippumattomia ribosomeista eivätkä sisällä ribosomaalisia ribonukleiinihappoja, amino-glykosidi-tyyppisillä antibiooteilla ei ole olennaisesti mitään vaikutusta näihin entsyymeihin. Itse asiassa kirjallisuudessa ei ole esitetty mitään arvoja tai havaintoja, jotka osoittaisivat ei-ribosomaalisen peptidi- tai pseudopeptidi-synteesin aminoglykosidi-indusoidun muutoksen.
Tunnettujen vankomysiinin valmistusmenetelmien saannot ovat melko alhaisia.
Siten keksinnön tehtävänä on kehittää menetelmä, joka saa aikaan paremman tuottavuuden verrattuna aikaisempiin menetelmiin, ja eristää uusia kantoja tätä tarkoitusta varten.
Tutkimuksissamme vankomysiini-antibioottia tuottava Mlcropo-lyspora orientalis NCAIM 001091-kanta alistettiin mutageeni-seen käsittelyyn, sitten eristettiin aminoglykosidi-resis-tentit mutantit. Mutagenisointi suoritettiin kirjallisuuden mukaisesti käyttämällä N-metyyli-N'-nitro-N-nitrosoguanidii- 3 102388 nia tai UV-säteilytystä mutageenisinä aineina. Samoin voidaan käyttää muita tunnettuja mutageenisiä aineita, esim. radioaktiivista säteilytystä tai typpisinappeja jne.
Yllättävästi havaittiin, että mutageenisen käsittelyn jälkeen streptomysiini- ja kanamysiini-resistenteissä kolonioissa, jotka kasvatettiin selektiivisillä, streptomysiiniä ja kanamysiiniä sisältävillä viljelyalustoilla, havaittiin suuri määrä kolonioita, joilla oli merkittävästi parempi vankomysiinin tuotantokyky verrattuna alkuperäiseen kantaan. Kaksi lisääntymiskantaa, joilla oli edullisimmat ominaisuudet teollisen fermentoinnin kannalta, talletettiin Maanviljelys- ja teollisuusmikro-organismien kansalliseen kokoelmaan (National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, tunnustettu Budapestin sopimuksen mukaisena kansainvälisenä tallettajaviranomaisena) numeroilla NCAIM 001092 ja vastaavasti NCAIM 001093.
Havaintomme on esitetty seuraavassa taulukossa.
4 102338
Eristettyjen Lähtökannan vankomysiini- kolonioiden tuottavuus, %_ määrä 70 - 80 - 120 - yli _80 % 120 % 150 % 150 %
Mutageeninen käsittely, sitten jako streptomysiiniä sisältävälle alustalle 361 48 293 18 2
Mutageeninen käsittely, sitten jako kanamysii-niä sisältävälle alustalle 295 54 224 16 1
Mutageeninen käsittely , s itten jako ei-selek-tiiviselle alustalle_321_59_261_1_
Selektiivisen viljelyalustan (merkki: VS-1) koostumus on seuraava: liukenevaa tärkkelystä 10 g glukoosia 5 g
Tripcasinia (valmistaja: Institute for Serobacteriological Production and Research HUMAN, Unkari) 3 g
Difco-hiivauutetta 4 g kalsiumkarbonaattia 1 g agaria 15 g :· tislattua vettä ad 1000 ml pH-arvo säädetään arvoon 7,0 lisäämällä rikkihappoa ennen autoklaavikäsittelyä.
Streptomysiiniä ja kanamysiiniä käytetään 1000 Mg/l:n kon-sentraatiossa viljelyalustalla.
5 102388 VS-l-alustan sijasta voidaan käyttää myös yleisesti tunnettua ja tavanomaista Czapek-Dox-viljelyalustaa.
NCAIM 001092- ja NCAIM 001093-kantojen ja niiden lisäänty-miskantojen eräs edullinen ominaisuus on se, että ne käyttävät hyvin hyväksi hiililähteinä käytettäviä teollisuuden raaka-aineita, kuten maissi-, vehnä- ja perunatärkkelystä, dekstriiniä, sakkaroosia, glukoosia, glyserolia, kalsiumglu-konaattia ja amylaasilla nestemäiseksi tehtyä maissi-, peruna- ja vehnätärkkelystä samalla, kun ne käyttävät typpiläh-teinä soijajauhoa, maissin liotusnestettä, proteiinihydroly-saatteja, kuten lihauutetta, kaseiinihydrolysaattia ja hii-vauutteita samoin kuin ammonium- ja nitraattisuoloja.
Siten käytetään edullisesti esim. seuraavan koostumuksen omaavaa fermentointialustaa (merkki: VF-2): glyserolia 60 g soijajauhoa 20 g kalsiumglukonaattia 12 g kaliumdivetyfosfaattia 0,2 g magnesiumkloridia 0,2 g kalsiumkarbonaattia 0,2 g vesijohtovettä ad 1000 ml
Laboratoriofermentointia varten 50 ml VF-2-viljelyalustaa käytetään 500 ml:n pullossa.
Tutkimuksissamme on havaittu, että NCAIM 001092- ja NCAIM 001093-kantojen ja niiden lisääntymiskantojen eräs toinen edullinen ominaisuus on se, että vankomysiinin tuotanto kasvaa huomattavasti fermentoinneissa, jotka suoritetaan vilje-lyalustalla, joka sisältää typpilähteenä soijajauhoa, kun viljelyalustaan lisätään nitraattisuoloja fermentoinnin alussa. Siten esim. lisäämällä natriumnitraatti- tai kalium-nitraattisuoloja 0,1 - 2,5 %, edullisesti 0,6 - 1,0 % VF-2-viljelyalustaan yllä esitettyjen komponenttien lisäksi, vankomysiinin tuotanto on fermentoinnin lopussa 30 - 40 % suurempi verrattuna siihen, mitä saadaan viljelyalustassa, jossa on sama koostumus, mutta joka ei sisällä nitraattia.
6 102388
Siten keksinnön mukaisesti vankomysiini-antibiootti valmistetaan siten, että Micropolyspora orlentalis-lajiin kuuluvan NCAIM 001091-kannan aminoglykosidi-resistenttejä mutantteja, edullisesti NCAIM 001092- ja NCAIM 001093-kantoja kasvatetaan viljelyalustalla, joka sisältää assimiloituvaa hiili-lähdettä, kuten maissi-, peruna-, vehnätärkkelystä ja/tai amylaasilla nestemäiseksi tehtyä maissi-, peruna-, vehnä-tärkkelystä ja/tai glyserolia ja/tai glukoosia ja/tai deks-triiniä ja/tai sakkaroosia ja/tai kalsiumglukonaattia sekä assimiloituvaa typpilähdettä, esim. soijajauhoa ja/tai maissin liotusnestettä ja/tai proteiinihydrolysaattia, kuten li-hauutetta, hiivauutteita, kaseiinihydrolysaattia sekä mine-raalisuoloja, edullisesti nitraattisuoloja, aerobisissa olosuhteissa 20 - 40eC:n, etenkin 30*C:n lämpötilassa ja sitten antibiootti erotetaan fermentointiliemestä tunnetulla tavalla.
Käyttämällä keksinnön mukaista menetelmää saadaan aikaan 3600 - 3800 yg/ml:n antibioottipitoisuus fermentointiliemes-sä fermentoinnin päätyttyä.
Nämä arvot ovat merkittävästi korkeampia kuin tulokset, joita saadaan käyttämällä kirjallisuudessa tähän asti esitettyjä menetelmiä. Esim. US-patenttijulkaisun 3.067.099 mukaisesti saadaan aikaan ainoastaan 180 yg/ml:n vankomysiini-pitoisuus laboratoriofermentoinnissa ja fermentointiliemen aktiivisen aineen pitoisuus on korkeintaan 200 yg/ml jopa 1,5 m3:n fermentoinneissa sekoitetussa ja ilmastetussa laitteessa fermentoinnin päätyttyä.
Käyttämällä erästä toista fermentointimenetelmää laboratorio-olosuhteissa saavutetaan 950 yg/ml:n vankomysiinipitoi-suus fermentointiliemessä (eurooppalainen patenttihakemus n:o 85020435 ja US-patenttijulkaisu 4.667.024). Eräässä toisessa menetelmässä 2140 yg/ml on korkein arvo, joka saavutetaan teollisuusmittakaavassa 120 l:n sekoitetussa ja ilmastetussa fermentointilaitteessa fermentoinnin päätyttyä.
7 102388
Fermentointiliemen ja lopullisen tuotteen antibioottipitoi-suuden kvantitatiivinen määritys suoritettiin käyttämällä agar-diffuusiomenetelmää USP XXII:n ohjeiden mukaisesti ATCC 6633 Bacillus subtilis-kannassa. Vankomysiinin tehokkuusar-vot suhteutettiin kaupallisesti saatavaan USP-vertailustan-dardiin.
HPLC-menetelmää käytettiin lopullisen vankomysiinituotteen kvalitatiiviseen analyysiin [Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 27/4, 503 (1985); ja Code of Federal Register, USA, pykälä 455.85 (1988)].
Fermentoinnit, jotka suoritettiin käyttämällä Micropolyspora orientalis-lajiin kuuluvia NCAIM 001092- ja NCAIM 001093-kantoja, on esitetty yksityiskohtaisesti seuraavissa ei-ra-joittavissa esimerkeissä.
Esimerkki 1
Laboratoriosiemenviljelyalusta, jonka koostumus on esitetty alla, inokuloitiin Micropolyspora orientalisin NCAIM 001092-kannan vegetatiivisella viljelmällä, jota oli varastoitu jäädytetyssä tilassa -20 - -30eC:ssa.
glukoosia 10 g sakkaroosia 6 g liukenevaa tärkkelystä 20 g maissin liotusnestettä 10 g soijajauhoa 14 g kaliumdivetyfosfaattia 3 g kalsiumkarbonaattia 2 g mineraalisuolojen liuosta 10 ml tislattua vettä ad 1000 ml pH-arvo on steriloinnin jälkeen 7,2.
500 ml:n erlenmeyer-pullossa 100 ml:aan viljelyalustaa lisätään 2 ml vegetatiivista viljelmää.
Mineraalisuolaliuoksen komponentit: 8 102388 mangaanisulfaattia (MnS04*H20) 1,0 g kuparisulfaattia (CuS04*5H20) 0,1 g sinkkisulfaattia (ZnS04*7H20) 2,8 g rauta-ammoniumsitraattia 2,8 g kobolttikloridia (CoCl2*H20) 0,1 g natriumperboraattia (Νβ2Β4θ7Ή2Ο) 0,1 g natriummolybdaattia (Na2Mo04Ή2Ο) 0,04 g tislattua vettä ad 1000 ml
Laboratoriosiemenviljelmän valmistus suoritetaan viljelemällä 20 - 24 tunnin ajan 30öC:ssa kiertosekoittimessa 180 rpmrssä iskun pituuden ollessa 2,5 cm. 500 ml:n erlenmeyer-pullossa 50 ml alla esitetyn koostumuksen omaavaa fermen-tointialustaa inokuloidaan 1 ml:11a yllä saatua viljelmää.
glyserolia 60 g soijajauhoa 20 g kalsiumglukonaattia 12 g kaliumdivetyfosfaattia 0,2 g magnesiumkloridia 0,2 g kalsiumkarbonaattia 3,0 g vesijohtovettä ad 1000 ml
Steriloinnin jälkeen pH-arvo on 7,2 - 7,4.
Fermentoidaan 120 tunnin ajan 30eC:ssa kiertosekoittimessa 180 rpm:ssä iskun pituuden ollessa 2,5 cm. Fermentoinnin lo- ----- pussa fermentointiliemen vankomysiinipitoisuus on 2800 yg/ml.
Esimerkki 2
Esimerkissä 1 esitetty laboratoriosiemenviljelyalusta inokuloidaan Micropolyspora orientalisin NCAIM 001093-kannan ve-getatiivisella viljelmällä, jota oli varastoitu -25 --30eC:ssa, minkä jälkeen siemenviljelmän valmistus ja fer-mentointi suoritetaan esimerkissä 1 esitetyllä tavalla.
Fermentoinnin lopussa fermentointiliemen vankomysiinipitoisuus on 2340 yg/ml.
9 102388
Esimerkki 3
Esimerkissä 1 esitetty fermentointiviljelyalusta inokuloi-daan käyttämällä esimerkin 1 menetelmää esimerkin 1 mukaisesti valmistetulla Mlcropolyspora orientalisin NCAIM 001092-kannan inokulaatilla, minkä jälkeen fermentointivil-jelyalustaan lisätään natriumnitraattia tai kaliumnitraattia 0,6 %:n loppukonsentraatiossa ennen sterilointia. Viljellään esimerkissä 1 esitetyllä tavalla, jolloin fermentointiliemen vankomysiinipitoisuus on 3720 yg/ml fermentoinnin lopussa.
Esimerkki 4 8 1 esimerkissä 1 esitettyä inokulointiviljelyalustaa, joka on laitettu 12 l:n lasiseen fermentointilaitteeseen, inoku-loidaan 1 ml:11a esimerkin 1 mukaisesti valmistettua Micro-polyspora orientalisin NCAIM 001092-kannan laboratoriosie-menviljelmää. Viljely suoritetaan 30eC:ssa ilmastamalla 6 1/min. sekoittaen 500 rpmrssä 17 - 20 tunnin kuluessa. 8 1 steriiliä fermentointiviljelyalustaa, joka on sijoitettu 12 l:n lasiseen fermentointilaitteeseen ja jolla on esimerkissä 3 esitetty koostumus, inokuloidaan 800 ml:11a saatua viljelmää. Fermentoidaan 120 tunnin ajan 30*C:ssa ilmastamalla 6 1/min. sekoittaen 600 rpm:ssä. Fermentointiliemen vankomysiinipitoisuus on 3820 yg/ml fermentoinnin lopussa.
Esimerkki 5
Valmistetaan inokulointiviljelmä Micropolyspora orientalisin NCAIM 001092-kannasta esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. 100 ml yllä saatua viljelmää inokuloidaan 1 m3:iin steriiliä, alla esitetyn koostumuksen omaavaa viljelyalustaa 1,5 m3:n esifermentointilaitteessa: • · maissitärkkelystä 10 kg soijajauhoa 10 kg sakkaroosia 10 kg kalsiumkarbonaattia 2 kg soijaöljyä 4 kg 10 102388 polypropyleeniglykolia 0,5 kg vesijohtovettä ad 1000 1
Viljelyalustan pH-arvo säädetään rikkihapolla siten, että PH on steriloinnin jälkeen 5,5 - 6,0. Esifermentointi suoritetaan 17-20 tunnin kuluessa 30*C:ssa ilmastamalla 0,5 1/1/min. 0,4 - 0,5 baarin sisäisessä ylipaineessa sekoittaen 100 rpm:ssä. Näin valmistettu inokulaatti lisätään 2 m3:iin steriiliä, alla esitetyn koostumuksen omaavaa fermentointi-alustaa, joka on valmistettu 3 m3:n fermentointilaitteessa: glyserolia 120 kg soijajauhoa 40 kg kalsiumglukonaattia 24 kg natriumnitraattia 20 kg kalsiumkarbonaattia Θ kg magnesiumkloridia 0,4 kg kaliumdivetyfosfaattia 0,4 kg vesijohtovettä ad 2000 1
Viljelyalustan pH-arvo säädetään lisäämällä natriumhydroksi-dia siten, että se on steriloinnin jälkeen 7,0 - 7,2. 2 m3:n steriili fermentointiviljelyalusta inokuloidaan 100 1:11a kehitettyä teollista siemenviljelmää ja fermentoidaan 96 -120 tunnin ajan seuraavilla parametreillä:
- lämpötila 30eC
- ilmastus 0. - 17. tunti 0,5 1/1/min.
- ilmastus 17. tunnista loppuun 1,0 1/1/min.
- sisäinen paine 0,4 - 0,5 baaria - sekoittaminen 0. - 17. tunti 50 rpm - sekoittaminen 17. tunnista loppuun 100 rpm
Fermentoinnin päätyttyä fermentointiliemi sisältää 3700 : pg/ml vankomysiiniä, joka eristetään fermentointiliemestä seuraavalla tavalla. 1 m3:n fermentointiliemi jäähdytetään 15eC:seen, laimennetaan 25 tilavuus-%:lla vesijohtovettä (laskettu fermentoin- U 102388 tiliemen määrän suhteen) ja sitten lisätään natriumkloridia 20 g/1 (laskettuna sen alkuperäisen määrän suhteen) jatkuvasti sekoittaen ja jäähdyttäen 15eC:seen. Natriumkloridin liukenemisen jälkeen pH säädetään arvoon 8,4 - 8,6 lisäämällä natriumhydroksidia, sitten lisätään 0,4 % perliittisuoda-tusapuainetta ja sekoittamista jatketaan 15eC:ssa 2 tunnin ajan. Sitten näin käsitelty fermentointiliemi suodatetaan esikerrostetun rumpusuodattimen läpi, jonka pinta-ala on 2 m1, alennetussa paineessa ja suodatettu fermentaatioliemi kerätään jäähdytettävään, sekoittimella varustettuun astiaan.
Fermentointiliemestä vankomysiini sidotaan Amberlite IRC 50-(H+-muoto) ioninvaihtohartsiin, jota täytetään 300 1 2 pylvääseen, jotka on kytketty rinnakkain (400 mm x 2000 mm). Sitoutumisen lineaarinen virtausnopeus on 2 - 3 m/tunti. Adsorption jälkeen pylväät pestään 1500 - 2000 1:11a deionoi-tua vettä samalla lineaarisella virtausnopeudella kuin sitominen. Vankomysiini eluoidaan pylväistä 0,5 N NH40H-liuok-sella lineaarisen virtausnopeuden ollessa 0,5 - 1,0 m/tunti. Eluoinnin aikana kerätään 100 l:n fraktioita, joissa vanko-mysiinin määrää ja puhtautta valvotaan HPLC:llä. Sopivan puhtauden omaavat fraktiot yhdistetään, jolloin saadaan 400 - 600 1 pääfraktiota. Yhdistetyn pääfraktion pH säädetään arvoon 8,0 1 N kloorivetyhapolla, liuos konsentroidaan 8 - . 12 %:n vankomysiinikonsentraatioon käänteisosmoosilaittees- sa. Konsentroinnin aikana liuoksen pH säädetään asteittain arvoon 5,4 - 5,6.
Liuoksessa läsnä olevien epäorgaanisten suolojen poistamiseksi suoritetaan niin kutsuttu diasuodatus konsentroinnin jälkeen, s.o. konsentroitu liuos laimennetaan jälleen deio-r* noidulla vedellä ja konsentroidaan jälleen. Konsentroinnin päättyessä liuoksen määrä on 23 - 40 1 ja sen pH-arvo on 5,2 - 5,4. Liuoksen pH säädetään arvoon 2,5 - 2,8 lisäämällä 10%:ista kloorivetyhappoa, sitten konsentraatti selkeytetään aktivoidulla hiilellä (Carbo C Extra-hiili). Jokaista selkeytystä varten käytetään 2 % hiiltä laskettuna vankomysii- 1J 102388 nipitoisuuden suhteen (määritetty HLPC:llä). Jos liuoksen väri, mitattuna spektrofotometrisesti 1 cm:n kyvetissä 380 nm:ssä, on suurempi kuin A = 0,4, selkeytys toistetaan yllä esitetyllä tavalla.
Sitten selkeytetty kirkas liuos ohjataan vahvasti happaman Diaion SK IB- (H+-muoto) ioninvaihtopylvään läpi. Läpimitaltaan 120 mm olevaa pylvästä, joka on täytetty 4 1:11a hartsia, käytetään lineaarisella nopeudella, joka on 8 m/tunti. Vankomysiini pestään tislatulla vedellä pylväästä. Saadun liuoksen pH, joka on 1,8 - 2,0 kationinvaihtovaiheen jälkeen, säädetään arvoon 3,0 - 3,5 ohjaamalla se virtausnopeudella 6 m/tunti 2 1:n pylvään läpi, jonka läpimitta on 120 mm ja joka sisältää heikosti emäksistä anioninvaihtohartsia (OH"-muoto). Pylväs pestään tislatulla vedellä ja vankomy-siiniä sisältävä pesuliuos yhdistetään pääfraktion kanssa. Saatu liuos suodatetaan ultrasuodatuskalvon (Millipore Pel-licon-laite) läpi, jonka nimellismolekyylipainon sulkuraja on 30.000. Ultrasuodatetusta liuoksesta, joka käsittää 30 - 40 litraa, vankomysiini seostetaan 11-kertaisella määrällä steriilisuodatettua asetonia, sitten sitä kuivatetaan 40 -50*C:ssa steriileissä olosuhteissa uunissa alennetussa paineessa 20 tunnin ajan ja lopuksi se jauhetaan. 2 m3:n lähtö-fermentointiliemestä saadaan 2873 g vankomysiinihydroklori-dia, jonka biologinen tehokkuus on yli 968 yg/mg mikrobiologisen määrityksen mukaisesti.
Claims (5)
1. Menetelmä vankomysiini-antibiootin valmistamiseksi mikrobiologisesti aerobisen fermentoinnin avulla, jonka menetelmän mukaan - käytetään Micropolvspora -lajiin kuuluvaa kantaa kasvatusalustalla, joka sisältää assimiloituvaa hiili- ja typpilähdettä sekä mineraalisuoloja, 20...40°C:n lämpötilassa tunnettu siitä, että - mikroorganismina käytetään Micropolvspora orientalis-lajiin kuuluvan NCAIM 001091 -kannan aminoglykosi-di-resistenttiä mutanttikantaa NCAIM 001092 tai NCAIM 001093 tai näiden jälkeläisiä,joilla on olennaisesti samat morfologiset ja biokemialliset ominaisuudet, kasvatusalustalla, joka sisältää mineraali-suolana nitraat-tisuolaa, ja - fermentoinnin jälkeen erotetaan tuotettu antiobiootti sinänsä tunnetulla tavalla.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mineraalisuolana käytetään nitraattisuolaa 0,4 - 1,4 %:n konsentraatiossa kasvatusalustassa.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fermentointi suoritetaan 25... 35 °C:n, edullisesti 29 - 30 °C:n lämpötilassa.
4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, 1 tunnettu siitä, että kasvatusalustana käytetään kasva tusalustaa, joka sisältää edullisesti soijajauhoa, glyserolia, kalsiumglukonaattia, maissitärkkelystä, natrium- ja/tai ka-liumnitraattia.
5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, 14 102388 tunnettu siitä, että ioninvaihtokromatografiaa ja tämän jälkeen käänteisosmoosia käytetään vankomysiini-antibiootin erottamiseksi samoin kuin ultrasuodattimella suoritettavaa ultrasuodatusta, jolloin edullisesti suljetaan pois nimellismolekyylipainot 10.000 - 50.000, vankomysiini-antibiootti-liuoksen puhdistamiseksi. • · 15 102388
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU896184A HU205971B (en) | 1989-11-27 | 1989-11-27 | Process for producing vancomycin |
| HU618489 | 1989-11-27 | ||
| HU9000079 | 1990-11-27 | ||
| PCT/HU1990/000079 WO1991008300A1 (en) | 1989-11-27 | 1990-11-27 | Process for the preparation of vancomycin |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI913586A0 FI913586A0 (fi) | 1991-07-26 |
| FI102388B true FI102388B (fi) | 1998-11-30 |
| FI102388B1 FI102388B1 (fi) | 1998-11-30 |
Family
ID=10971323
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI913586A FI102388B1 (fi) | 1989-11-27 | 1991-07-26 | Menetelmä vankomysiinin valmistamiseksi |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5223413A (fi) |
| EP (1) | EP0455772B1 (fi) |
| JP (1) | JP2577133B2 (fi) |
| KR (1) | KR920701462A (fi) |
| AT (1) | ATE126539T1 (fi) |
| AU (1) | AU647757B2 (fi) |
| BR (1) | BR9007082A (fi) |
| CA (1) | CA2045483A1 (fi) |
| DE (1) | DE69021716T2 (fi) |
| DK (1) | DK0455772T3 (fi) |
| ES (1) | ES2075903T3 (fi) |
| FI (1) | FI102388B1 (fi) |
| GR (1) | GR1000960B (fi) |
| HU (1) | HU205971B (fi) |
| NO (1) | NO180382C (fi) |
| WO (1) | WO1991008300A1 (fi) |
| ZA (1) | ZA909528B (fi) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SI9500039B (sl) * | 1995-02-07 | 2002-02-28 | Lek, | Nov kombiniran postopek čiščenja Vankomicin hidroklorida |
| KR100419707B1 (ko) * | 1995-12-29 | 2004-06-12 | 씨제이 주식회사 | 분취용 역상 고압 액체 크로마토그래피를 이용한반코마이신의 정제방법 |
| KR100385152B1 (ko) * | 2001-03-14 | 2003-05-23 | 씨제이 주식회사 | 카프레오마이신의 정제방법 |
| TWI233932B (en) | 2001-08-24 | 2005-06-11 | Theravance Inc | Process for purifying glycopeptide phosphonate derivatives |
| KR100554481B1 (ko) * | 2004-06-30 | 2006-03-03 | 씨제이 주식회사 | 반코마이신 염산염의 정제방법 |
| DK1805211T3 (da) * | 2004-10-27 | 2009-06-22 | Axellia Pharmaceuticals Aps | Oprensning af glycopeptider |
| EP1798237A1 (en) * | 2005-12-16 | 2007-06-20 | Pharmatex Italia Srl | Process for the purification of macrolide antibiotics |
| GB0814830D0 (en) * | 2008-08-13 | 2008-09-17 | Univ Cardiff | Antimicrobial agent and method for the production thereof |
| KR101101663B1 (ko) * | 2009-01-13 | 2011-12-30 | (주) 제노텍 | 반코마이신 습체의 정제방법 |
| CN104610434B (zh) * | 2013-11-01 | 2019-06-07 | 浙江医药股份有限公司新昌制药厂 | 一种盐酸万古霉素的分离纯化方法 |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3067099A (en) | 1955-09-16 | 1962-12-04 | Lilly Co Eli | Vancomycin and method for its preparation |
| US4400753A (en) | 1981-06-19 | 1983-08-23 | International Business Machines Corporation | Universal magnetic recording disk cartridge |
| JPS58194689A (ja) * | 1982-05-08 | 1983-11-12 | Mitsui Eng & Shipbuild Co Ltd | 船舶用プロペラの製造方法 |
| US4549925A (en) * | 1982-11-22 | 1985-10-29 | King Instrument Corporation | Splicer plunger assembly |
| US4558009A (en) * | 1982-12-20 | 1985-12-10 | Eli Lilly And Company | Process for producing antibiotic A-51568 by fermentation and microorganism |
| ZA839269B (en) * | 1982-12-20 | 1985-07-31 | Lilly Co Eli | Antibiotic a51568 factors a and b |
| US4667024A (en) | 1983-07-13 | 1987-05-19 | Smithkline Beckman Corporation | Process for the preparation of purified vancomycin class antibiotics |
| US4558008A (en) * | 1983-12-13 | 1985-12-10 | Eli Lilly And Company | Process for production of A-51568B antibiotic |
| US4548924A (en) * | 1984-04-16 | 1985-10-22 | Eli Lilly And Company | Antibiotics M43B and M43C, pharmaceutical composition and method of use |
| US4548925A (en) * | 1984-04-16 | 1985-10-22 | Eli Lilly And Company | Antibiotic M43A, pharmaceutical composition and method of use |
| JPH0662674B2 (ja) * | 1985-01-11 | 1994-08-17 | 三共株式会社 | 抗生物質クロロポリスポリンｂまたはｃ |
| JPS61214694A (ja) * | 1985-03-18 | 1986-09-24 | インタ−ナショナル ビジネス マシ−ンズ コ−ポレ−ション | データ伝送のスイッチング装置 |
| GB8600952D0 (en) * | 1986-01-16 | 1986-02-19 | Glaxo Group Ltd | Antibiotic production |
| US4946941A (en) * | 1986-01-24 | 1990-08-07 | Shionogi & Co., Ltd. | Novel glycopeptide antibiotics |
| GB8608798D0 (en) * | 1986-04-11 | 1986-05-14 | Lepetit Spa | Recovery of glycopeptide antibiotics from aqueous solutions |
| EG18377A (en) * | 1986-09-19 | 1993-04-30 | Lilly Co Eli | Process for preparing glycopeptide antibiotics |
| US4845194A (en) * | 1987-02-27 | 1989-07-04 | Eli Lilly And Company | Glycopeptide recovery process |
-
1989
- 1989-11-15 JP JP2500264A patent/JP2577133B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-11-27 HU HU896184A patent/HU205971B/hu not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-11-27 WO PCT/HU1990/000079 patent/WO1991008300A1/en active IP Right Grant
- 1990-11-27 DK DK90917220.7T patent/DK0455772T3/da active
- 1990-11-27 BR BR909007082A patent/BR9007082A/pt not_active Application Discontinuation
- 1990-11-27 DE DE69021716T patent/DE69021716T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-11-27 EP EP90917220A patent/EP0455772B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-27 ES ES90917220T patent/ES2075903T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-27 ZA ZA909528A patent/ZA909528B/xx unknown
- 1990-11-27 GR GR900100826A patent/GR1000960B/el unknown
- 1990-11-27 AT AT90917220T patent/ATE126539T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-11-27 AU AU67549/90A patent/AU647757B2/en not_active Ceased
- 1990-11-27 US US07/768,444 patent/US5223413A/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-11-27 CA CA002045483A patent/CA2045483A1/en not_active Abandoned
-
1991
- 1991-07-19 NO NO912832A patent/NO180382C/no unknown
- 1991-07-26 FI FI913586A patent/FI102388B1/fi active
- 1991-07-27 KR KR1019910700801A patent/KR920701462A/ko not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUT55837A (en) | 1991-06-28 |
| GR900100826A (en) | 1992-04-17 |
| US5223413A (en) | 1993-06-29 |
| BR9007082A (pt) | 1991-12-24 |
| DE69021716D1 (de) | 1995-09-21 |
| ATE126539T1 (de) | 1995-09-15 |
| NO912832L (no) | 1991-09-24 |
| AU647757B2 (en) | 1994-03-31 |
| NO180382C (no) | 1997-04-09 |
| FI102388B1 (fi) | 1998-11-30 |
| NO180382B (no) | 1996-12-30 |
| DE69021716T2 (de) | 1996-02-22 |
| ZA909528B (en) | 1991-10-30 |
| DK0455772T3 (da) | 1995-09-18 |
| FI913586A0 (fi) | 1991-07-26 |
| AU6754990A (en) | 1991-06-26 |
| HU205971B (en) | 1992-07-28 |
| JPH05501358A (ja) | 1993-03-18 |
| ES2075903T3 (es) | 1995-10-16 |
| NO912832D0 (no) | 1991-07-19 |
| EP0455772B1 (en) | 1995-08-16 |
| CA2045483A1 (en) | 1991-05-28 |
| WO1991008300A1 (en) | 1991-06-13 |
| KR920701462A (ko) | 1992-08-11 |
| JP2577133B2 (ja) | 1997-01-29 |
| EP0455772A1 (en) | 1991-11-13 |
| GR1000960B (el) | 1993-03-16 |
| HU896184D0 (en) | 1990-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0573628B1 (en) | New a83543 compounds and process for production thereof | |
| FI102388B (fi) | Menetelmä vankomysiinin valmistamiseksi | |
| WO2010058427A2 (en) | Process for production and purification of polymyxin b sulfate | |
| EP0132118B1 (en) | Antibiotics produced by kibdelosporangium aridum shearer gen. nov., sp. nov. atcc 39323 | |
| IE62075B1 (en) | A new antimicrobial agent, fr109615 and production thereof | |
| JPH0774228B2 (ja) | 新規抗生物質 | |
| EP0194784B1 (en) | Cl-1577-b4 compound, its production and use | |
| KR100536676B1 (ko) | 콜히콘 화합물로부터 효소법에 의한 대응하는 3-글리코실유도체로의 변형방법 | |
| KR0141322B1 (ko) | 항생물질 키모렉신- 에이(kimorexin - a) 및 그 제조법 | |
| US8795986B2 (en) | Microbial method for the biotransformation of colchicinoid compounds | |
| US5165931A (en) | Peptifluorin and neopeptifluorin | |
| JP3192723B2 (ja) | 新規マクロライド抗生物質ｓｆ２７４８ｂ物質、ｓｆ２７４８ｃ１物質、ｓｆ２７４８ｄ物質およびｓｆ２７４８ｅ物質ならびにその製造法 | |
| JP3063804B2 (ja) | 新規マクロライド抗生物質ｓｆ２７４８物質およびその製造法 | |
| EP0413967A1 (en) | Novel antibiotic | |
| JPH04261180A (ja) | １３β−１３−デオキシ−２２，２３−ジヒドロアベルメクチン−Ｂｌａ／Ｂｌｂアグリコンの微生物学的製造 | |
| EP0662145B1 (en) | Process for the selective increase of production of antibiotic ge 2270 factor a | |
| JPH0374677B2 (fi) | ||
| JP3100785B2 (ja) | 新規エバーメクチン誘導体、その製造方法ならびにその生産微生物 | |
| JPH02306992A (ja) | 抗生物質ｒｋ―１０６１ｇ及びｒｋ―１０６１ｈ並びにその製造法 | |
| SU352469A1 (ru) | Способ получения антибиотического комплекса | |
| JPH0625095B2 (ja) | 抗生物質ｓｆ−２４１５物質およびその製造法 | |
| JPS638393A (ja) | 新規抗生物質ｓｆ−２４５７物質及びその製造法 | |
| JPH0420429B2 (fi) | ||
| JPS59173089A (ja) | Ｌ−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸の製造法 | |
| JPS586474B2 (ja) | ３，４−ジメトキシトロポロンおよびその製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| GB | Transfer or assigment of application |
Owner name: CHINOIN GYOGYSZER ES VEGYESZETI TERMEKEK |