JPS586474B2 - ３，４−ジメトキシトロポロンおよびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は式Ｉ で表わされる３，４−ジメトキシトロポロンおよびその
製造法に関する。

本発明は、さらに詳しくはストレプトパーティシリウム
（ Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ；以下
Ｓｔｒ．と略す）属に属し、３，４−ジメトキシトロボ
ロンを生産する能力を有する菌株を栄養培地にて培養し
て、培養中に３．４−ジメトキシトロポロンを生成蓄積
せしめ、ついでこれを採取することを特徴とする３，４
−ジメトキシトロボロンの製造法に関する。

３，４−ジメトキシトロポロンは新規な抗生物質である
。

本発明者らは種々の微生物を用いて、抗生物質の生産性
について種々検討した。

その結果、神奈川県秦野市郊外の畑の土壌から分離した
菌株ＭＫ一１００およびＭＫ−１０４の培養物中に抗生
物質が蓄積することを見い出した。

培養物から該抗生物質を精製、単離し、同定したところ
ＭＫ−１００株が生産する抗生物質は既知物質である、
３−メトキーシトロポロンで、ＭＫ−１０４株が生産す
る抗生物質は３，４−ジメトキシトロポロンであること
が判明した。

またＭＫ−１００株およびＭＫ−１０４株はともにスト
レブトバーティシリウム属に属する菌株であることが判
明した。

そこで本発明者らはこれらの知見をもとにさらに研究し
てＭＫ−１００株に関しては３−メトキシトロボロンの
製造法の発明、およびＭＫ−１０４株に関しては３．４
−ジメトキシトロボロンおよびその製造法の発明を完成
した。

本発明はこのうち３，４−ジメトキシトロポロンおよび
そのＭＫ−１０４株からの製造法に関するものである（
なお、前記ＭＫ−１００株による３一メトキシトロポロ
ンの製造法については特願昭５２−４８５１８号（特開
昭５３−１３６５８８号）：出願日：昭和５２年４月２
８８？こ詳細に説明されている）。

従来トロポロン系化合物は合成か、植物からの抽出によ
ってつくられており、発酵法による生産は知られていな
い。

次に本発明をさらに詳しく説明する。

本発明化合物の理化学的性状は次の通りである。

本発明化合物は淡黄色の鱗片状結晶で７８．５〜７９．
５°Ｃに融点を示す。

メタノールやエタノールなどのアルコール類やアセトン
、酢酸エチル、クロロフォルム、四塩化炭素や水に可溶
である。

さらに本発明化合物の呈色反応は塩化第二鉄反応が陽性
でニンヒドリン反応が陰性である。

本発明化合物の紫外部吸収曲線は第１図に示した通りで
、メタノール溶液では２６２ｎｍ３３５ｎｍに吸収極大
を示し、２８０ｎｍに肩を示す。

０．１Ｎ塩酸メタノール溶液（本発明化合物をメタノー
ルに溶解し、０．１Ｎ塩酸で酸性にしたもの）では２６
５ｎｍおよび３３５ｎｍに吸収極大を示す。

さらに０．１Ｎ苛性カリ・メタノール溶液（本発明化合
物をメタノールに溶解し、０．ＩＮ苛性カリでアルカリ
性にしたもの）では２６２ｎｍおよび３３５ｎｍに吸収
極大を示し、２６８ｎｍおよび２７９ｎｍに肩を示した
。

マススペクトルで測定した結果、本発明化合物の分子量
は１８２０５７９で分子式Ｃ９Ｈ１０Ｏ４が与えられる
。

また、本発明化合物の臭化カリ錠での赤外吸収スペクト
ラムは第２図に示す通りで、３１６０、１５８０、１５
２６、１３９７、１３０２、１２５１、１１４２、１０
４２、７８７、４３０ｃｒｒＬ−１に吸収を示した。

さらに、重クロロフォルム中での核磁気共鳴の結果、δ
３．９６に３プロトンのシングレット、δ４．００に３
プロトンのシングレット、δ６．６〜７．５に互いに隣
接した３プロトンのマルチプレット、δ８．４〜６．５
に１プロトンのブロードなシングレットのシグナルを示
した。

本発明化合物の各種展開剤によるペーバークロマトグラ
フイーのＲｆ値は表１に示すとおりである。

表１ 上昇式ペーバークロマトグラフイ一本発明化合物
の分子量、分子式、赤外線吸収スペクトル、紫外線吸収
スペクトル、核磁気共鳴スペクトル、融点などの物理化
学的性質から式Ｉに示す構造を有する物質すなわち、３
，４−ジメトキシトロポロンであることが明らかとなっ
た。

つぎに３．４−ジメトキシトロポロンの寒天希釈法（ｐ
Ｈ７．０）による各種微生物に対する抗菌スペクトルを
示すと表２のとおりである。

表２ 寒天希釈法による最少阻止濃度 ３．４−ジメトキトロポロンのマウスに対するＬＤ５０
は１４１．７ｍｇ／ｋｇである。

本発明化合物、３，４−ジメトキシトロポロンは実験室
のガラス器具類や外科用の器具類を清潔にしたり殺菌す
るのに有用である。

また衛生のために用いられる種々の洗剤と一緒にして病
院の病室や厨房を清潔にし、かつ衛生的にするために用
いることができる。

次に本発明化合物、３，４−ジメトキシトロポロン製造
法について述べる。

本発明の使用菌株はストレブトバーティシリウム属に属
し、３，４−ジメトキシトロポロンを生産する能力を有
する菌株であればいずれの菌株でもよい。

その代表的なものは、ストレブトバーティシリウム・ス
ペーシーズＭＫ−１０４株で、下記のごとき菌学的性質
を有する。

■ 形態的特徴 本菌株は、スターチ無機塩寒天培地およびオートミール
寒天培地上で良好な生育を示し、その基生菌糸の色は褐
色を呈する。

また可溶性色素の生成は数種類の培地で認められ、薄茶
色ないし薄紫色を呈する。

一方、気中菌糸の着生は殆ど認められず、分枝法などに
ついては、不明である。

■ 各種培地上での生育状態 基生菌糸の表面および裏面の色は、それぞれの培地上で
すべて同じであり、気中菌糸はほとんど着生不能であっ
た。

１．ツアペック寒天培地 生 育：不良 基生菌糸の色：ダステイオレンジ（４ｌｃ）可溶性色素
：な し ２．クルコース・アスパラギン寒天培地 生 育：不良 基生菌糸の色：ゴールド（２ｌｃ） 可溶性色素：な し ３．グリセロール・アスパラギン寒天培地生 育：
不良 基生菌糸の色：ゴールド（２ｌｃ） 可溶性色素：な し ４．スターチ無機塩寒天培地 生 育：良好 基生菌糸の色：ココアブラウン（５ｌｇ）可溶性色素：
薄紫色 ５．チロシン寒天培地 生 育：普通 基生菌糸の色：イエローメーブル（３ｎｇ）可溶性色素
：な し ６．栄養寒天培地 生 育：普通 基生菌糸の色：コロニアルイエロ−（２ｇａ）可溶性色
素：な し ７．イースト麦芽寒天培地 生 育：晋通 基生菌糸の色：ハニーゴールド（２ｉｃ）可溶性色素：
な し ８．オートミール寒天培地 生 育：良好 基生菌糸の色：ココアブラウン（５ｎｉ）可溶性色素：
薄紫茶色 ９．ベネット寒天培地 生 育：普通 基生菌糸の色：マスタードゴールド（２ｎｅ）可溶性色
素：薄茶色 １０．エマーソン寒天培地 生 育：普通 基生菌糸の色：無色〜ブライトゴールド （２ｎｃ） 可溶性色素：茶色 １１．ペブトン・イースト鉄寒天培地 生 育：普通 基生菌糸の色：ディープブラン（５ｐｌ）〜チョコレー
トブラウン（５ｐｍ） 可溶性色素：濃茶紫色 以上は、３０℃、２週間後の観察結果を示し、色の表示
は、Ｃｏｌｏｒ Ｈｏｒｍｏｎｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏ
ｎｔａｉｎｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍ
ｅｒｉｃａ）による色の分類に従ったものである。

■ 生理的諸性質 ■．炭素源の資化性 Ｄ−グルコースおよびｉ−イノシトールを資化するが、
Ｄ−ラフィノース、Ｄ−アラヒノース、Ｄ−マンニトー
ル、Ｌ−ラムノースＤ−キシロースは資化しない。

また、Ｄ−フラクトースおよびシュークロースは、非常
に貧弱にしか資化しない。

２，ゲラチンの液化作用 ：あ り ３．スターチの加水分解作用：あ り ４．脱脂乳のペプトン化 ：あ り ５，脱脂乳の凝固 ：非常に弱い６．メラニン
様色素の生成 ：あり（チロシン寒天培地および ペブトン・イー スト鉄寒天培地 ７、至適生育温度 ：２７°Ｃ〜３７°Ｃ以上
は、３０℃、２週間後の観察結果であるが、温度は５日
後、脱脂乳に対する作用については、３週間後の結果で
ある。

■ 同定 以上のごとく、本菌株ＭＫ−１０４は、寒天培地上では
ほとんどあるいは全く真性気中菌糸を形成しない。

しかし、その細胞壁構成アミノ酸にＬ，Ｌ−ジアミノピ
メリン酸およびグリシンを含むことから、ストレブトミ
セス属あるいはストレブトバーティシリウム属に属する
菌株と考えられる。

一方、ＭＫ−１０４株はＭＫ−１０４株とともに分離さ
れたＭＫ−１００株と酷似する。

ＭＫ−１００株は、既知のストレブトバーティシリウム
属のいかなる菌種にも属さず、これを新菌種とし、その
採取地に因んで、本発明者らは、ストレブトバーティシ
リウム・ハダノネンセＭＫ−１ ０ ０ （Ｓｔｒ．ｈ
ａｄａｎｏｎｅｎｓｅ ＭＫ−１００）と命名した（前
記特願昭５ ２−４８５１８号）。

ＭＫ−１０４株はＭＫ−１００株よりさらに気中菌糸の
形成が悪く、脱脂乳に対する作用に若干の相違はあるも
のの、他の生理的諸性質は全く一致している。

また各種寒天培地上での生育をみても、ＭＫ−１０４株
の方が全般にＭＫ−１００株よりやや明るい色調を呈す
ること以外、相違を見い出すことは困難である。

さらにＭＫ−１０４株もＭＫ−１００株もトロポロン系
化合物を生産する。

上述のことからＭＫ−１０４株をストレブトバーティシ
リウム・ハダノネンセの亜種とし、ストレブトバーティ
シリウム・ハダノネンセ・サブスペーシズ・トロポロニ
ウム（Ｓｔｒ．ｈａ−一ａｎｏｎｅｎｓｅ ｓｕｂｓ．
ｔｒｏｐｏｌｏｎｉｕｍ）と命名した。

該菌は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され、微
工研菌寄第４０２６号が与えられている。

ＭＫ−１０４菌株は、他の放線菌の場合にも見られるご
とく、例えば紫外線、Ｃｏ６０照射、エックス線、種々
の変異誘起薬品などを用いる人工的変異手段で変異し得
るものであり、このような変異株であっても３，４−ジ
メトキシトロポロン生産能をもつ株はすべて本発明にお
いて使用できるものである。

本発明の培養においては通常の放線菌の培養法が一般に
用いられる。

培養のための栄養源としてはいろいろのものが用いられ
る。

炭素源としてはブドウ糖、殿粉、グリセリン、マンノー
ス、フラクトース、イノシトール、シュークロース、糖
蜜などが単独または組み合わせて用いられる。

さらに、菌の資化性によっては炭化水素、アルコール類
、有機酸なども用いうる。

無機および有機窒素源としては塩化アンモン、硫酸アン
モン、尿素、硝酸アンモン、硝酸ソーダなどがまた天然
窒素源としてはペブトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥
酵母、コーン・スチーブ・リカー、大豆粉、カザミノ酸
、ソリュブル・ベジタブル・プロテインなどが単独また
は組み合わせて用いられる。

そのほか必要に応じて食塩、塩化カリ、炭酸カルシウム
、燐酸塩などの無機塩類を加えるほか、本菌の生育や３
，４−ジメトキシトロポロンの生産を促進する有機物や
無機物を適当に添加することができる。

培養法としては、液体培養法、とくに深部攪拌培養法が
もつとも適している。

培養温度は２０〜４０℃、ｐＨは中性付近で培養を行う
ことが望ましい。

液体培養で通常１日ないし５日間培養を行うと、本抗生
物質が培養液中に生成蓄積される。

培養液中の生成量が最大に達したときに培養を停止し、
菌体を沢別して得られる培養液中より目的物を精製単離
する。

培養ろ液から本物質の精製単離には、微生物代謝生産物
を、その培養液から単離するためにふつう用いられる分
離、精製の方法が利用される。

３，４−ジメトキシトロボロンはアルコール類や酢酸エ
チルなどの有機溶媒に溶けるので、その性質を用いた方
法で採取することができる。

すなわち、本物質の精製法としてはブタノールや酢酸エ
チルなどの非水溶性有機溶媒による抽出法、あるいはア
ンバーライトＸＡＤ（ロームアンド・ハース会社製、米
国）やダイヤイオンＨＰ−１０（三菱化成社製）などの
樹脂を用いた吸脱着法、シリカゲルやセファデツクスＬ
Ｈ−２０、セファデツクスＧ−１５（ファーマシア・フ
ァイン・ケミカルズ・インコーポレーション製、米国）
などを用いたカラム・クロマトグラフイーなどの方法を
適当に組み合わせて行なう精製法を挙げることができる
。

例えば、培養ろ液をｐＨ７付近に調整し、ダイヤイオン
ＨＰ−１０を充填したカラムに通塔する。

３，４−ジメトキシトロポロンはダイヤイオンＨＰ−１
０に吸着するので水洗した後、８０％メタノール水溶液
で溶出する。

溶出された３．４−ジメトキシトロポロン区分を濃縮し
、メタノールを除去した後、濃縮液を鉱酸でｐＨ２に調
整し、酢酸エチルで抽出する。

酢酸エチル層を濃縮乾固することにより３．４−ジメト
キシトロボロンの粗粉末を得る。

この粗粉末をシリカゲルカラムにのせ、酢酸エチルで溶
出し、溶出してきた３，４−ジメトキシトロポロンの区
分を減圧下で濃縮し、冷室（０℃）に放置することによ
り３，４−ジメトキシトロボロンの淡赤色の結晶を得る
ことができる。

以下、本発明の実施例を示す。

これは単なる一例示であって何等本発明を限定するもの
でない。

実施例 １ （Ａ）二種菌としてストレブトバーティシリウム・ハダ
ノネンセ・サブスペーシズ・トロボロニウムＭＫ−１０
４（微工研菌寄番号第４０２６号）を用い、第１種培地
としてグルコース１ｇ／ｄｌ、可溶性でんぷん１ｇ／ｄ
ｌ、酵母エキス０．１ｇ／ｄｌ、ペブトン０．５ｇ／ｄ
ｌ、ＣａＣＯ３０．１ｇ／ｄｌ（殺菌前ｐＨ ７． ２
）の培地を用いた。

種菌１白金耳を２５０ｍｌエルレン・マイヤーフラスコ
中３０ｍｌの上記第１種培地に植菌し、３０゜Ｃで４８
時間振盪培養した。

第１種培養液３０ｍｌを、２ｌ−バツフルつきエルレン
・マイヤーフラスコ中に入った３００ｍｌの第２種培地
に植菌する。

第２種培地は第１種培地と同じ組成の培地を使用する。

第２種培養も３０℃で４８時間振盪培養を行う。

この第２種培養液１．５ｌを３０ｌ−ステンレス製ジャ
ーファーメンター中の本培地１５ｌに植菌する。

この本培地の培地組成は、グルコース２ｇ／ｄｌ，ビー
・ビ・ラレツクス（動物油：アデカファインケミカル社
製）２ｇ／ｄｌ、大豆粕２ｇ／ｄｌ、肉エキス０． ５
ｇ／ｄｌ、Ｋ２ＨＰ０４０．０５ｇ／ｄｌ、ＭｇＳ０４
０．０５ｇ／ｄｌ、ＫＣｌ０．０３ｇ／ｄｌ、ＣａＣＯ
３０．３ｇ／ｄｌ（殺菌前ｐＨ８．０）である。

このジャーファーメンター培養は３０℃で６０時間通気
攪拌方式（回転数３００ｒｐｍ．通気量１５ｌ／ｍｉｎ
）により行う。

その結果培養液中には約５０γ／ｍｌの３．４−ジメト
キシトロポロンが蓄積する。

（Ｂ）：（Ａ）で得られた培養液を塩酸でｐＨ７．０に
調整し、８００ｇの沢過助剤ラジオライトＮｏ．６００
（昭和化学工業社製）を加え、減圧下でろ過し、１５ｌ
のろ液を得る。

このろ液を１ｌのダイヤイオンＨＰ−１０（三菱化成社
製）を充填したカラムに通塔する。

３，４−ジメトキシトロポロンはこの樹脂に吸着し、水
洗後、８０％メタノール水溶液により溶出される。

この方法で３ｌの３，４−ジメトキシトロポロン活性区
分が得られ、３，４−ジメトキシトロポロンは１００γ
／ｍｌの割合で含まれている。

（Ｃ）：（Ｂ）で得られた活性区分を減圧下で３００ｍ
ｌにまで濃縮し、濃縮液のｐＨを塩酸で２．０に調整し
、１００ｍｌの酢酸エチルで３回抽出する。

３，４−ジメトキシトロポロンは酢酸エチル層に転溶す
る。

酢酸エチル層を減圧下で濃縮乾固し、約３０％の純度の
粗粉末を１．５ｇ得る。

（Ｄ）：（Ｃ）で得られた粗粉末を５００ｍｌのシリカ
ゲル力ラムにのせ、酢酸エチルで展開溶出し、得られた
活性区分を約１ｍｌにまで濃縮し、１晩冷室（０℃）に
放置すると淡赤色の結晶を得る。

この結晶をろ別し、四塩化炭素中で再結すると約１００
■の淡赤色の結晶を得る。

この結晶の理化学的性状は発明の詳細な説明の項に本発
明化合物の理化学的性状として示した通りであり、これ
によりこの結晶は式Ｉで表わされる３，４−ジメトキシ
トロポロンと同定される。

【図面の簡単な説明】

第１図は３．４−ジメトキシトロポロンの紫外部および
可視部の吸収スペクトラムを示す。 実線はメタノール溶液、点線は０．１ＮＨＣｌメタノー
ル溶液、一点鎖線は０．１ＮＫＯＨメタノール溶液を使
用した場合を示す。 第２図は３．４−ジメトキシトロポロンの赤外部吸収ス
ペクトラムを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １式 で表わされる３，４−ジメトキシトロポロン。 ２ ストレブトパーティシリウム属に属し、式で表わさ
   れる３，４−ジメトキシトロポロンを生産する能力を有
   する菌株を栄養培地に培養し、培養液中に３，４−ジメ
   トキシトロポロンを生成蓄積せしめ、ついでこれを採取
   することを特徴とする発酵法による３，４−ジメトキシ
   トロポロンの製造法。