CN112480283A - 一种从黄精中制备中性低聚多糖的方法 - Google Patents
一种从黄精中制备中性低聚多糖的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112480283A CN112480283A CN202011581739.8A CN202011581739A CN112480283A CN 112480283 A CN112480283 A CN 112480283A CN 202011581739 A CN202011581739 A CN 202011581739A CN 112480283 A CN112480283 A CN 112480283A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- membrane
- cross
- solution
- aperture
- polysaccharide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及植物多糖提取领域，公开了一种从黄精中制备中性低聚多糖的方法。所述方法包括以下步骤：(1)将黄精原料浸提并固液分离，得到浸提液，将浸提液进行浓缩、冷冻、融解和固液分离，收集清液；(2)将清液经酶柱层析后依次过大孔径膜和小孔径膜，分别收集截留液；(3)将小孔径膜截留液过离子交换树脂，然后调节pH至6‑7，再进行浓缩、醇沉和干燥。该方法工艺条件柔和，连续性强，对设备要求低，可操作性强，环境友好，适宜于规模化生产；黄精中性低聚多糖的得率不低于为10％，总糖纯度不低于80％，其中中性多糖占比不低于80％。
Description
技术领域
本发明涉及植物多糖提取领域，具体涉及一种从黄精中制备中性低聚多糖的方法。
背景技术
黄精为百合科黄精属草本植物，根茎横走，圆柱状，结节膨大，叶轮生，无柄，目前已知的黄精药材种类有3种：黄精、滇黄精和多花黄精。黄精是我国传统的中药，属于药食同源性中草药，其始载于《名医别录》。黄精具有延缓衰老、增强免疫功能、降血糖、降血脂抗炎、抗菌、抗病毒。抗肿瘤等功效。黄精含有多糖、皂苷、蒽醌类化合物、生物碱、强心苷、木质素、维生素等多种对人体有益的活性成分。
多糖是生物体中广泛存在的物质，是一类由醛糖或酮糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，它是生物体内重要的生物大分子，是维持生命活动正常运转的基本物质之一。多糖具有抗癌、提高免疫力、抗病毒、抗炎、降血糖、降血脂、抗氧化和促进骨折愈合等多种生物活性，无论是在食品、保健品甚至医药领域中，都具有广泛的应用前景。常见的具有活性的多糖比如灵芝多糖、枸杞多糖、香菇多糖、黑木耳多糖、海带多糖、松花粉多糖等，具有双向调节人体生理节奏的功能。
中国专利CN110655591A公开了一种黄精多糖的提取方法，通过原料粉碎、水浸提、浓缩、醇沉、离心、乙醇洗涤、干燥，而得的黄精多糖。该方法未进行脱蛋白和脱色处理，含量较低；同时制得多糖为中性、酸性及碱性多糖的混合物。
中国专利CN110563854A公开了一种提取黄精多糖的方法，通过粉碎、石油醚回流、高度乙醇回流、超声辅助水提、氯仿-正丁醇萃取、活性炭脱色、高度乙醇和乙醚洗涤、干燥后即得黄精多糖，该方法需要使用大量的有毒有害化学试剂；如氯仿、乙醚等，同时反复使用大量的高度乙醇，成本较高；同时制得多糖为中性、酸性及碱性多糖的混合物。
中国专利CN101293070B公开了从黄精中提取增强免疫功能作用的黄精低聚糖，通过粉碎、乙醇回流、浓缩、稀释、大孔树脂吸附、水洗、浓缩、干燥即得。该方法未对多糖进行针对性的脱色处理，故而得到褐色产品，品相较差；且该工艺对多糖未进行任何的化学修饰，即其聚合度未发生针对性的改变，故而所述的低聚糖的表述可能不太适合。
中国专利CN102408492A公开了一种黄精含硒多糖的提取方法，通过晾干、切片、粉碎、微粉碎、石油醚脱脂、超声水提、离心、浓缩、氯仿-丁醇脱蛋白、高度乙醇醇沉、干燥即得。该方法为典型的传统多糖制备工艺，其使用了有毒有害石油醚和氯仿，对环境不友好，还可能产品有残留。
现有技术中在大多使用有毒有害的石油醚进行脱脂、使用氯仿-醇进行萃取脱蛋白、活性炭脱色、大孔吸附树脂或DE系列树脂纯化或者脱色、高度乙醇进行多次醇沉和梯度解吸等工艺以力求制得黄精多糖。但是同时也难免引入譬如石油醚、氯仿、Tris、丙酮、乙醚等有毒有害物质，这些物质一方面可能残留在产品中导致人体安全问题，另一方面可能导致环境污染，对环境不友好。高度乙醇醇沉是传统经典的多糖纯化方式之一，其快速简单，但是其需要大量的高度乙醇，生产成本相对较高；活性炭具有一定的脱色效果，但是脱色效果较差，且对多糖也具有一定的吸附效果，对收率有一定的影响；DE系列树脂在多糖精制中使用较多，但是其由于处理量极其有限，且处理速度慢，难以实现工业化；大孔吸附树脂由于其极大的表面积而具有极大的吸附量，工业化能力强，同时其吸附范围较广，针对性相对较差，需要不断的筛选合适的树脂型号及其工艺参数。
同时，目前的文献中都未将黄精多糖进行结构剪切，所得到的多糖分子量分布范围极广(从几千到几十万)，且得到的多糖为酸性、中性及碱性多糖的混合物，未针对性的进行分离。所以采用无毒无害的技术，将高聚态大分子量的多糖剪切为小分子低聚态多糖，并对分子量范围较窄的低聚多糖或某一性质的多糖进行针对性的有效分离，对未来该方面多糖性质及活性研究，以及实现产业化生产，具有极其重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种从黄精中制备中性低聚多糖的方法。具体的技术方案如下：
一种从黄精中制备中性低聚多糖的方法，包括以下步骤：
(1)将黄精原料(滇黄精、黄精或多花黄精的干燥根茎)进行浸提处理并固液分离I，得到浸提液，将所述浸提液进行浓缩I、冷冻、融解和固液分离II后，收集清液；
(2)将所述清液经酶柱层析得到流出液I；
(3)将所述流出液I先过大孔径膜，收集大孔径膜截留液和大孔径膜透过液，然后将所述大孔径膜透过液过小孔径膜，收集小孔径膜截留液；
(4)将所述小孔径膜截留液过离子交换树脂得到流出液II，将所述流出液II调节pH得到中和液，将所述中和液进行浓缩II、醇沉和干燥。
优选地，所述中性低聚多糖的平均分子量为1000-10000Da。
优选地，步骤(1)中，所述浓缩I的过程包括：将所述浸提液经膜浓缩或者减压真空浓缩，浓缩至可溶性固形物含量为10-20°brix。更优选地，所述膜浓缩采用孔径为1-2nm的错流膜。
优选地，步骤(1)中，所述固液分离I选自布袋离心、板框压滤、卧螺离心、蝶式离心、挤压过滤和管式离心中的至少一种。
优选地，步骤(1)中，所述固液分离II采用错流膜分离，所述错流膜的孔径为0.22-0.45μm。
优选地，步骤(1)中，所述冷冻至少满足以下条件：冷冻温度为-10-0℃，冷冻时间为12-48h。
优选地，步骤(1)中，所述融解至少满足以下条件：温度为0-20℃。
优选地，步骤(2)中，所述酶柱层析采用含有多糖降解酶的固相酶柱，所述固相酶柱的制备方法包括：将多糖降解酶与交联剂溶液混合交联反应得到交联反应液，将所述交联反应液上柱于大孔吸附树脂层析柱进行吸附固定。
更优选地，酶柱层析中的大孔吸附树脂为苯乙酸、二乙烯苯或丙酸脂与致孔剂聚合而成的小球状聚合物。
更优选地，酶柱层析中的交联剂溶液为含有交联剂的缓冲液溶液，所述交联剂选自栀子苷元、戊二醛和顺丁烯二酸酐中的至少一种，所述缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，所述交联剂与所述缓冲液的体积比为1:100-1000。
更优选地，酶柱层析中的多糖降解酶选自纤维素酶、β-葡聚糖酶和甘露寡糖酶中的至少一种。
优选地，步骤(3)中，所述大孔径膜为5-10nm孔径的错流膜，所述小孔径膜为1-2nm孔径的错流膜。
优选地，该方法还包括：将步骤(3)所述大孔径膜截留液返回步骤(2)进行酶柱层析。
优选地，步骤(4)中，所述离子交换树脂选自D941、LSA-960、LSA-900E、LX-T5、LXD-762和LX-94中的至少一种。
优选地，步骤(4)中，所述浓缩II为膜浓缩或者减压真空浓缩，所述浓缩II的过程包括：将所述中和液浓缩至可溶性固形物含量为20-40°brix。
优选地，步骤(4)中，所述醇沉的过程包括：将所述浓缩II得到的浓缩液与有机醇按照体积比1:1-5混合后，经过滤得到中性低聚多糖沉淀。
优选地，步骤(4)中，所述中和液的pH为6-7。
本发明的有益效果如下：
本发明摒弃化学脱多糖蛋白、活性炭脱色及及多糖分子量不加以剪切的传统工艺，采用冻融脱蛋白、酶柱层析修饰多糖及离子交换树脂脱色的方法来制备经过剪切的中性低聚黄精多糖。该方法制得的中性低聚多糖为中性，颜色极浅(为白色)，分子量小(平均分子量只有1000-10000Da)，得率不低于为10％；其总糖纯度不低于80％，中性多糖占总糖的比例不低于80wt％。
本发明的方法，连续重复使用固相酶柱，酶利用率高，可以实现连续化作业；而且工艺条件柔和，未采用氯仿等有毒有害物质，大幅减少了醇沉及高浓度乙醇用量，快速，简单，连续性强，对设备要求低，可操作性强，环境友好，适宜于规模化生产。
本发明的方法，对分子量范围较窄的低聚多糖或某一性质的多糖进行针对性的有效分离，对未来该方面多糖性质及活性研究，以及产业化，具有极其重要的意义。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明第一方面提供了从黄精中制备中性低聚多糖的方法，包括以下步骤：
(1)将黄精原料(滇黄精、黄精或多花黄精的干燥根茎)进行浸提处理并固液分离I，得到浸提液，将所述浸提液进行浓缩I、冷冻、融解和固液分离II后，收集清液(澄清透过液)；(对应于以下实施例中的步骤(1)-(4))
(2)将所述清液经酶柱层析得到流出液I；(对应于以下实施例中的步骤(5))
(3)将所述流出液I先过大孔径膜，收集大孔径膜截留液和大孔径膜透过液，然后将所述大孔径膜透过液过小孔径膜，收集小孔径膜截留液；(对应于以下实施例中的步骤(6))
(4)将所述小孔径膜截留液过离子交换树脂得到流出液II，将所述流出液II调节pH得到中和液，将所述中和液进行浓缩II、醇沉和干燥。(对应于以下实施例中的步骤(7)-(9))
优选地，所述中性低聚多糖的平均分子量为1000-10000Da。
优选地，步骤(1)中将黄精原料在浸提前采用研磨、粉碎机、捣碎等方法粉碎至粒度为2～30目；以提高原料表面积，进而提高其与热水的接触面积，有利于有效成分的溶出；同时避免粉碎过细不利于后续固液分离的实现。
优选地，步骤(1)中所述浸提的方式采用连续逆流提取、罐式提取或夹层锅提取；更优选地，采用热水浸提，热水的加入量为黄精原料重量的10～20倍，温度为80～100℃，所述浸提的次数为1～5次，每次浸提1～3h。
优选地，步骤(1)所述浓缩I为膜浓缩或者减压真空浓缩，浓缩至可溶性固形物含量为10-20°brix；更优选地，所述膜浓缩采用孔径为1-2nm的错流膜。错流膜浓缩可以大大避免如常规死端膜过滤由于膜孔堵塞而导致的过滤效率低下的风险，其连续性强，且浓缩效果好。减压真空浓缩选用单/多效蒸发浓缩、减压降膜浓缩或旋转蒸发浓缩中的一种；进一步优选地，采用多效蒸发浓缩。
优选地，步骤(1)中所述固液分离I为实现初步的固液分离为目的，选自布袋离心、板框压滤、卧螺离心、蝶式离心、挤压过滤和管式离心中的至少一种；更优选地，固液分离I采用板框压滤。
优选地，步骤(1)中所述的固液分离II为错流膜分离，错流膜孔径为0.22-0.45μm。
优选地，步骤(1)所述冷冻的温度为-10-0℃，冷冻的时间为12-48h(即在冷冻温度下静置12-48h)，以实现全部形成冰块；更优选地，冷冻的温度为-6～-4℃，冷冻的时间为24-36h。
优选地，步骤(1)所述融解的温度为0-20℃，以实现冰块全部融化。更优选地，融解的温度为4-10℃。
优选地，步骤(2)所述酶柱层析采用固相酶柱(酶柱的径高比为1:4-10)，所述固相酶柱通过将多糖降解酶与交联剂溶液混合交联反应(25-45℃条件下，保持搅拌1-3h)，而后将交联反应液上柱于大孔吸附树脂层析柱进行吸附固定，并形成内循环上柱，最后用纯化水进行洗柱后获得(以1-2BV/h流速的去离子水洗柱)。采用了交联剂的固相酶柱，其性质更稳定。
更优选地，所述酶柱层析中的大孔吸附树脂为苯乙酸、二乙烯苯或丙酸脂与致孔剂聚合而成的小球状聚合物；交联剂溶液为由缓冲液溶解了交联剂的溶液(交联剂溶液的体积与大孔吸附树脂树脂体积的比例为2-4:1)，其中交联剂选自栀子苷元、戊二醛和顺丁烯二酸酐中的至少一种，缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH为5.0-6.0)，交联剂与缓冲液的体积比为1:100-1000；所述多糖降解酶选自纤维素酶、β-葡聚糖酶和甘露寡糖酶中的至少一种，多糖降解酶的比活力为3万-10万U/g。
进一步优选地，多糖降解酶为纤维素酶、β-葡聚糖酶和甘露寡糖酶的混合物，纤维素酶、β-葡聚糖酶和甘露寡糖酶的酶活力比为1:0.2-0.7:0.1-0.5。
优选地，在步骤(2)中进行酶柱层析时，上酶柱至少满足以下条件：上酶柱方式为正向或反向上柱、流速为0.5-2BV/h、柱温度为20-50℃(上酶柱过程中柱子、上柱液及流出液温度为20-50℃)。更优选地，上柱的时间为2-10h。所述上酶柱为将清液以0.5-2BV/h流速直接上柱于处理好的固相酶柱。
优选地，步骤(3)中，大孔径膜为5-10nm孔径的错流膜，小孔径膜为1-2nm孔径的错流膜。
优选地，该方法还包括：在步骤(3)中，先将大孔径膜截留液返回步骤(2)进行酶柱层析(大孔径膜截留液可以与固液分离II所得清液一起进行酶柱层析，也可以分开进行酶柱层析)，如此循环至少1次(更优选地，如此循环3次以上)，然后再将大孔径膜透过液过小孔径膜，收集小孔径膜截留液。大孔径膜截留液为未被酶降解的大分子多糖成分，其返回酶柱是为了再次通过酶柱降解，得到小分子低聚多糖，进而实现能通过大孔径膜。而大孔径膜透过液过小孔径膜是为了将低聚多糖与小分子杂质(离子、氨基酸、单/多糖)等进行分离，实现低聚多糖的纯化。
优选地，步骤(4)中所述的离子交换树脂选自D941、LSA-960、LSA-900E、LX-T5、LXD-762和LX-94中的至少一种。离子交换树脂一方面可以吸附色素而起到脱色的作用，同时酸性多糖成分也会被离子交换树脂吸附而被分离，中性多糖由于未被吸附而随流出液排出而得以实现分离。
优选地，步骤(4)中所述调节pH是用浓度为5-10％的盐酸将pH调整至6-7。
优选地，步骤(4)中所述的浓缩II为膜浓缩或者减压真空浓缩，所述浓缩II的过程包括：将所述中和液浓缩至可溶性固形物含量为20-40°brix；减压真空浓缩选自单/多效蒸发浓缩、减压降膜浓缩、旋转蒸发浓缩中的任一种。更优选地，浓缩II采用膜浓缩，或者多效蒸发浓缩。
优选地，步骤(4)中所述的醇沉为：将浓缩II得到的浓缩液与有机醇(乙醇、甲醇或异丙醇)按照体积比1:1-5混合后(有机醇占液体体系总体积的体积百分比大约为50-85％)，过滤得到中性低聚多糖沉淀。
优选地，步骤(4)中所述的干燥为真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥或微波干燥中的任意一种。
以下实施例和对比例中使用的原料来源、规格/型号等如下：
滇黄精(Polygonatum kingianum Coll.etHemsl.)：购于湖南新汇制药股份有限公司。
多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)：购于桃江福源生态农业综合开发有限公司。
黄精(Polygonatum sibiricum Red.)：购于湖南新汇制药股份有限公司。
错流膜组件：购于南京福林德环保科技有限公司，型号是FSYS-50。
纤维素酶：购于广东溢多利生物科技股份有限公司，酶活9万U/g。
β-葡聚糖酶：购于广东溢多利生物科技股份有限公司，酶活5万U/g。
甘露寡糖酶：购于广东溢多利生物科技股份有限公司公司，酶活3万U/g。
大孔径膜：购于南京福林德环保科技有限公司，型号是FLD2020-10000D。
小孔径膜：购于南京福林德环保科技有限公司，型号是FLD2020-300D。
盐酸、乙醇均为市售分析纯制剂；柠檬酸-柠檬酸钠溶液、栀子苷元、戊二醛、顺丁烯二酸酐、D941等离子交换树脂均为市售标准品。
本发明实施例中中性多糖含量的检测方法如下：
(1)试剂和药品：十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、浓硫酸、苯酚、乙醇、丙酮、乙醚、葡萄糖(均购于国药有限公司)；
(2)试验仪器：恒温水浴锅(HH-6，江苏金坛市宏华仪器厂)、紫外分光光度计(UV-2550，日本岛津公司)、分析天平(万分之一精度，日本岛津公司)；
(3)测试方法：准确称取样品并用水配置为含量0.25％的溶液，5000r/min离心20min后，除去不溶性物质取清上液，加入10％(w/v)CTAB溶液，室温条件下静置过夜后离心(5000r/min)30min，得到上清液和沉淀，向上清液依次用5倍体积的乙醇、丙酮和乙醚进行沉淀，沉淀70℃真空干燥12h后即得中性多糖，将得到的中性多糖利用硫酸-苯酚法进行测定。
硫酸-苯酚法：依照《NY/T 1676-2008食用菌中粗多糖含量的测定》的方法进行测定。
中性多糖的占比＝(中性多糖质量/总糖质量)×100％。
总糖含量的检测方法为：硫酸-苯酚法。
平均分子量的检测方法：乌氏粘度计法。
实施例1
(1)浸提：将50kg滇黄精的干燥根茎粉碎后(粒度为30目)，分三次共加入750kg、80℃热水浸提，每次浸提1.5h，浸提5次，而后依次卧螺离心(离心转速3000r/min)和蝶式离心(离心转速4000r/min，排渣周期200S)后得到浸提液。
(2)浓缩：将浸提液在温度为70℃，真空度为-0.08MPa条件下真空浓缩(多效蒸发浓缩)至可溶性固形物含量为13.2°brix，得到浓缩液。
(3)冷冻：将浓缩液置于-4℃条件保持冷冻状态24h，得到冷冻冰晶。
(4)固液分离：将冷冻冰晶在10℃融解，并在10℃条件下利用错流膜(孔径为0.22μm)进行分离，收集清液。
(5)酶柱层析：将清液以1bv/h的流速上柱于径高比为1:6的固相酶柱，收集流出液。
酶柱制备工艺为：将10g纤维素酶(酶的比活力为90000U/g)、20gβ-葡聚糖酶(酶的比活力为50000U/g)及6g甘露寡糖酶(酶的比活力为30000U/g)加入到26L、1％(V/V)的交联剂溶液(交联剂为栀子苷元，缓冲液为pH＝5.4的柠檬酸-柠檬酸钠溶液，交联剂与缓冲液的体积比为1:500，交联剂溶液的体积与大孔吸附树脂体积的比例为3:1)中，在30℃条件下搅拌交联2h后，连续循环上柱于20L的D101层析柱，柱温保持30℃，上柱流速为2BV/h，循环上柱10h后，用1.5BV/h流速的去离子水洗柱。
(6)膜分离：将上一步得到的流出液先过大孔径膜(孔径为8nm的错流膜)，将大孔径膜截留液返回步骤(5)循环上柱层析(酶柱层析-过大孔径膜，如此循环3次)，而将大孔径膜透过液过小孔径膜(孔径为2nm的错流膜)，收集小孔径膜截留液。
(7)脱色：将小孔径膜截留液以1BV/h流速上柱于D941离子交换树脂，收集流出液。
(8)中和：将上一步收集的流出液用浓度为9％的盐酸将pH调整至7，得到中和液。
(9)浓缩、醇沉、干燥：将中和液通过膜浓缩法浓缩至可溶性固形物含量为34.2°brix后，加入浓度95％的乙醇至体系乙醇的体积百分含量为70％时，至于4℃冷藏静置12h后，过滤取沉淀物，将沉淀物真空冷冻干燥至恒重，即得7.89kg白色中性黄精低聚多糖。
实施例2
(1)浸提：将50kg多花黄精的干燥根茎粉碎后(粒度为20目)，分三次共加入500kg、100℃热水浸提，进行连续逆流提取，每次浸提3h，浸提1次，而后挤压过滤后得到浸提液。
(2)浓缩：将浸提液在温度为80℃，真空度为-0.08MPa条件下真空浓缩(多效蒸发浓缩)至可溶性固形物含量为18.4°brix，得到浓缩液。
(3)冷冻：将浓缩液置于-4℃条件保持冷冻状态48h，得到冷冻冰晶。
(4)固液分离：将冷冻冰晶在4℃融解，并在4℃条件下利用错流膜(孔径为0.22μm)进行分离，收集清液。
(5)酶柱层析：将清液以1.5bv/h的流速上柱于径高比为1:8的固相酶柱，收集流出液。
酶柱制备工艺为：将10g纤维素酶(酶的比活力为90000U/g)、20gβ-葡聚糖酶(酶的比活力为50000U/g)及34g甘露寡糖酶(酶的比活力为30000U/g)加入到26L、1％(V/V)的交联剂溶液(交联剂为栀子苷元，缓冲液为pH＝5.6的柠檬酸-柠檬酸钠溶液，交联剂与缓冲液的体积比为1:800，交联剂溶液的体积与大孔吸附树脂体积的比例为3:1)中，在45℃条件下搅拌交联1.5h后，连续循环上柱于20L的D101层析柱，柱温保持40℃，上柱流速为2BV/h，循环上柱10h后，用1.5BV/h流速的去离子水洗柱。
(6)膜分离：将上一步得到的流出液先过大孔径膜(孔径为10nm的错流膜)，大孔径膜截留液返回步骤(5)上柱层析，循环3次，将大孔径膜透过液过小孔径膜(孔径为2nm的错流膜)，收集小孔径膜截留液。
(7)脱色：将小孔径膜截留液以1BV/h流速上柱于LSA-960离子交换树脂，收集流出液。
(8)中和：将上一步收集的流出液用浓度为10％的盐酸将pH调整至7，得到中和液。
(9)浓缩、醇沉、干燥：将中和液通过膜浓缩法浓缩至可溶性固形物含量为33.2°brix后，加入浓度95％的乙醇至体系乙醇的体积百分含量为80％时，至于4℃冷藏静置12h后，过滤取沉淀物，将沉淀物真空冷冻干燥至恒重，即得7.63kg白色中性黄精低聚多糖。
实施例3
(1)浸提：将50kg滇黄精的干燥根茎粉碎后(粒度为10目)，分三次共加入750kg、80℃热水浸提，每次浸提1h，浸提5次，而后板框压滤后得到浸提液。
(2)浓缩：将浸提液在温度为70℃，真空度为-0.08MPa条件下真空浓缩(减压降膜浓缩)至可溶性固形物含量为12.2°brix，得到浓缩液。
(3)冷冻：将浓缩液置于-6℃条件保持冷冻状态36h，得到冷冻冰晶。
(4)固液分离：将冷冻冰晶在20℃融解，并在2℃条件下利用错流膜(孔径为0.30μm)进行分离，收集清液。
(5)酶柱层析：将清液以2bv/h的流速上柱于径高比为1:4的固相酶柱，收集流出液。
酶柱制备工艺为：将15g纤维素酶(酶的比活力为90000U/g)、15gβ-葡聚糖酶(酶的比活力为50000U/g)及17g甘露寡糖酶(酶的比活力为30000U/g)加入到26L、1％(V/V)的交联剂溶液(交联剂为戊二醛，缓冲液为pH＝5.6的柠檬酸-柠檬酸钠溶液，交联剂与缓冲液的体积比为1:100，交联剂溶液的体积与大孔吸附树脂体积的比例为3:1)中，在45℃条件下搅拌交联1h后，连续循环上柱于20L的D101层析柱，柱温保持50℃，上柱流速为2BV/h，循环上柱6h后，用1.5BV/h流速的去离子水洗柱。
(6)膜分离：将上一步得到的流出液先过大孔径膜(孔径为8nm的错流膜)，大孔径膜截留液返回步骤(5)上柱层析，循环3次，大孔径膜透过液过小孔径膜(孔径为2nm的错流膜)，收集小孔径膜截留液。
(7)脱色：将小孔径膜截留液以1BV/h流速上柱于LX-T5离子交换树脂，收集流出液。
(8)中和：将上一步收集的流出液用浓度为5％的盐酸将pH调整至7，得到中和液。
(9)浓缩、醇沉、干燥：将中和液通过膜浓缩法浓缩至可溶性固形物含量为36.5°brix后，加入浓度95％的乙醇至体系乙醇的体积百分含量为70％时，至于4℃冷藏静置12h后，过滤取沉淀物，将沉淀物真空冷冻干燥至恒重，即得7.92kg白色中性黄精低聚多糖。
实施例4
(1)浸提：将50kg黄精的干燥根茎粉碎后(粒度为5目)，分三次共加入1000kg、100℃热水浸提，每次浸提3h，浸提2次，而后挤压过滤后得到浸提液。
(2)浓缩：将浸提液在温度为70℃，真空度为-0.08MPa条件下真空浓缩(旋转蒸发浓缩)至可溶性固形物含量为17.4°brix，得到浓缩液。
(3)冷冻：将浓缩液置于-10℃条件保持冷冻状态12h，得到冷冻冰晶。
(4)固液分离：将冷冻冰晶在10℃融解，并在4℃条件下利用错流膜(孔径为0.45μm)进行分离，收集清液。
(5)酶柱层析：将清液以0.5bv/h的流速上柱于径高比为1:10的固相酶柱，收集流出液。
酶柱制备工艺为：将40gβ-葡聚糖酶(酶的比活力为50000U/g)加入到26L、1％(V/V)的交联剂溶液(交联剂为顺丁烯二酸酐，缓冲液为pH＝5的柠檬酸-柠檬酸钠溶液，交联剂与缓冲液的体积比为1:1000，交联剂溶液的体积与大孔吸附树脂体积的比例为3:1)中，在25℃条件下搅拌交联3h后，连续循环上柱于20L的D101层析柱，柱温保持20℃，上柱流速为2BV/h，循环上柱2h后，用1.5BV/h流速的去离子水洗柱。
(6)膜分离：将上一步得到的流出液先过大孔径膜(孔径为5nm的错流膜)，大孔径膜截留液返回步骤(5)上柱层析，循环2次，大孔径膜透过液过小孔径膜(孔径为1nm的错流膜)，收集小孔径膜截留液。
(7)脱色：将小孔径膜截留液以1BV/h流速上柱于LX-94离子交换树脂，收集流出液。
(8)中和：将上一步收集的流出液用浓度为5％的盐酸将pH调整至6，得到中和液。
(9)浓缩、醇沉、干燥：将中和液通过膜浓缩法浓缩至可溶性固形物含量为25.2°brix后，加入浓度为95％的异丙醇至体系异丙醇的体积百分含量为65％时，至于4℃冷藏静置12h后，过滤取沉淀物，将沉淀物真空冷冻干燥至恒重，即得7.42kg白色中性黄精低聚多糖。
对比例1
(1)浸提：将50kg滇黄精的干燥根茎粉碎后(粒度为30目)，分三次共加入750kg、80℃热水浸提，每次浸提1.5h，浸提5次，而后依次卧螺离心和蝶式离心后得到浸提液。
(2)浓缩：将浸提液在温度为70℃，真空度为-0.08MPa条件下真空浓缩(多效蒸发浓缩)至可溶性固形物含量为13.2°brix，得到浓缩液。
(3)酶柱层析：将浓缩液以1bv/h的流速上柱于径高比为1:6的固相酶柱，收集流出液。
酶柱制备工艺为：将10g纤维素酶(酶的比活力为90000U/g)、20gβ-葡聚糖酶(酶的比活力为50000U/g)及6g甘露寡糖酶(酶的比活力为30000U/g)加入到26L、1％(V/V)的交联剂溶液(交联剂为栀子苷元，缓冲液为pH＝5.4的柠檬酸-柠檬酸钠溶液，交联剂与缓冲液的体积比为1:500，交联剂溶液的体积与大孔吸附树脂体积的比例为3:1)中，在30℃条件下搅拌交联2h后，连续循环上柱于20L的D101层析柱，柱温保持30℃，上柱流速为2BV/h，循环上柱10h后，用1.5BV/h流速的去离子水洗柱。
(4)膜分离：将上一步得到的流出液先过大孔径膜(孔径为8nm的错流膜)，大孔径膜截留液返回步骤(3)上柱层析，循环3次，大孔径膜透过液过小孔径膜(孔径为2nm)，收集小孔径膜截留液。
(5)脱色：将小孔径膜截留液以1BV/h流速上柱于D941离子交换树脂，收集流出液。
(6)中和：将上一步收集的流出液用浓度为9％的盐酸将pH调整至7，得到中和液。
(7)浓缩、醇沉、干燥：将中和液通过膜浓缩法浓缩至可溶性固形物含量为34.2°brix后，加入浓度95％的乙醇至体系乙醇的体积百分含量为70％时，至于4℃冷藏静置12h后，过滤取沉淀物，将沉淀物真空冷冻干燥至恒重，即得7.48kg灰白色中性黄精多糖。
对比例2
(1)浸提：将50kg滇黄精的干燥根茎粉碎后(粒度为30目)，分三次共加入750kg、80℃热水浸提，每次浸提1.5h，浸提5次，而后依次卧螺离心和蝶式离心后得到浸提液。
(2)浓缩：将浸提液在温度为70℃，真空度为-0.08MPa条件下真空浓缩(多效蒸发浓缩)至可溶性固形物含量为17.3°brix，得到浓缩液。
(3)冷冻：将浓缩液置于-4℃条件保持冷冻状态24h，得到冷冻冰晶。
(4)固液分离：将冷冻冰晶在10℃融解，并在10℃条件下利用错流膜(孔径为0.22μm)进行分离，收集清液。
(5)膜分离：将上一步得到的清液先过大孔径膜(孔径为8nm的错流膜)，然后将大孔径膜透过液过小孔径膜(孔径为2nm的错流膜)，收集小孔径膜截留液。
(6)脱色：将小孔径膜截留液以1BV/h流速上柱于D941离子交换树脂，收集流出液。
(7)中和：将上一步收集的流出液用浓度为9％的盐酸将pH调整至7，得到中和液。
(8)浓缩、醇沉、干燥：将中和液通过膜浓缩法浓缩至可溶性固形物含量为26.3°brix后，加入浓度95％的乙醇至体系乙醇的体积百分含量为70％时，至于4℃冷藏静置12h后，过滤取沉淀物，将沉淀物真空冷冻干燥至恒重，即得6.72kg灰白色中性黄精多糖。
对比例3
(1)浸提：将50kg滇黄精的干燥根茎粉碎后(粒度为30目)，分三次共加入750kg、80℃热水浸提，每次浸提1.5h，浸提5次，而后依次卧螺离心和蝶式离心后得到浸提液。
(2)浓缩：将浸提液在温度为70℃，真空度为-0.08MPa条件下真空浓缩(多效蒸发浓缩)至可溶性固形物含量为19.2°brix，得到浓缩液。
(3)膜分离：将上一步得到的浓缩液先过大孔径膜(孔径为8nm的错流膜)，然后将大孔径膜透过液过小孔径膜(孔径为2nm的错流膜)，收集小孔径膜截留液。
(4)脱色：将小孔径膜截留液以1BV/h流速上柱于D941离子交换树脂，收集流出液。
(5)中和：将上一步收集的流出液用浓度为9％的盐酸将pH调整至7，得到中和液。
(6)浓缩、醇沉、干燥：将中和液通过膜浓缩法浓缩至可溶性固形物含量为33.3°brix后，加入浓度95％的乙醇至体系乙醇的体积百分含量为70％时，至于4℃冷藏静置12h后，过滤取沉淀物，将沉淀物真空冷冻干燥至恒重，即得6.19kg灰白色中性黄精多糖。
测试例
对以上实施例和对比例中制备的黄精多糖进行测试，结果如表1所示。
表1
从表1中可知，实施例1-4中，经过了冷冻-融解、酶柱层析之后，所得黄精中性低聚多糖的平均分子量降到了1万Da以下；经过离子交换树脂脱色处理后，黄精中性低聚多糖的颜色全部为白色。并且，总糖和其中的中性低聚多糖的得率都超过了10％；总糖的纯度超过了85％，其中中性低聚多糖占总糖比例超过了80％，甚至接近90％。对比例1相比于实施例1，没有经过冷冻-融解处理，导致很多小蛋白(小肽)留存在清液里，最后作为杂质进入多糖中，影响了平均分子量，降低了总糖的纯度和收率。对比例2相比于实施例1，没有经过酶柱层析处理，导致中性低聚多糖的平均分子量超过了1万Da。对比例3相比于实施例1，没有进行冷冻融解和酶柱层析处理，导致中性低聚多糖的平均分子量超过了2万Da，也大幅降低了总糖纯度和收率等数值。同时，对比例1-3没有经过离子交换树脂的脱色处理，导致颜色是灰白色。
综上所述，实施例1-4的方法，得到了总糖纯度和收率高、平均分子量低的白色中性黄精低聚多糖。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种从黄精中制备中性低聚多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将黄精原料进行浸提处理并固液分离I，得到浸提液，将所述浸提液进行浓缩I、冷冻、融解和固液分离II后，收集清液；
(2)将所述清液经酶柱层析得到流出液I；
(3)将所述流出液I先过大孔径膜，收集大孔径膜截留液和大孔径膜透过液，然后将所述大孔径膜透过液过小孔径膜，收集小孔径膜截留液；
(4)将所述小孔径膜截留液过离子交换树脂得到流出液II，将所述流出液II调节pH得到中和液，将所述中和液进行浓缩II、醇沉和干燥。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中性低聚多糖的平均分子量为1000-10000Da。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述浓缩I的过程包括：将所述浸提液经膜浓缩或者减压真空浓缩，浓缩至可溶性固形物含量为10-20°brix；和/或
所述固液分离I选自布袋离心、板框压滤、卧螺离心、蝶式离心、挤压过滤和管式离心中的至少一种；和/或
所述固液分离II采用错流膜分离，所述错流膜的孔径为0.22-0.45μm；和/或
所述冷冻至少满足以下条件：冷冻温度为-10-0℃，冷冻时间为12-48h；和/或
所述融解至少满足以下条件：温度为0-20℃。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述膜浓缩采用孔径为1-2nm的错流膜。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述酶柱层析采用含有多糖降解酶的固相酶柱，所述固相酶柱的制备方法包括：将多糖降解酶与交联剂溶液混合交联反应得到交联反应液，将所述交联反应液上柱于大孔吸附树脂层析柱进行吸附固定。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂为苯乙酸、二乙烯苯或丙酸脂与致孔剂聚合而成的小球状聚合物；和/或
所述交联剂溶液为含有交联剂的缓冲液溶液，所述交联剂选自栀子苷元、戊二醛和顺丁烯二酸酐中的至少一种，所述缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，所述交联剂与所述缓冲液的体积比为1:100-1000；和/或
所述多糖降解酶选自纤维素酶、β-葡聚糖酶和甘露寡糖酶中的至少一种。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述大孔径膜为5-10nm孔径的错流膜，所述小孔径膜为1-2nm孔径的错流膜；和/或
该方法还包括：将步骤(3)中所述大孔径膜截留液返回步骤(2)进行酶柱层析。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述离子交换树脂选自D941、LSA-960、LSA-900E、LX-T5、LXD-762和LX-94中的至少一种。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述浓缩II为膜浓缩或者减压真空浓缩，所述浓缩II的过程包括：将所述中和液浓缩至可溶性固形物含量为20-40°brix；和/或
所述醇沉的过程包括：将所述浓缩II得到的浓缩液与有机醇按照体积比1:1-5混合后，经过滤得到中性低聚多糖沉淀。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述中和液的pH为6-7。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011581739.8A CN112480283B (zh) | 2020-12-28 | 2020-12-28 | 一种从黄精中制备中性低聚多糖的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011581739.8A CN112480283B (zh) | 2020-12-28 | 2020-12-28 | 一种从黄精中制备中性低聚多糖的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112480283A true CN112480283A (zh) | 2021-03-12 |
| CN112480283B CN112480283B (zh) | 2023-02-24 |
Family
ID=74915717
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011581739.8A Active CN112480283B (zh) | 2020-12-28 | 2020-12-28 | 一种从黄精中制备中性低聚多糖的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112480283B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117210519A (zh) * | 2023-07-27 | 2023-12-12 | 安徽中医药大学 | 多花黄精多糖寡糖片段及其制备方法和应用 |
Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4840900A (en) * | 1987-04-13 | 1989-06-20 | National Distillers And Chemical Corporation | Continuous process for the preparation of immobilized glucoamylase |
| CN1335402A (zh) * | 2001-08-12 | 2002-02-13 | 广西大学 | 用固定化果糖基转移酶生产蔗果低聚糖的方法 |
| JP2006087390A (ja) * | 2004-09-27 | 2006-04-06 | Sanwa Denpun Kogyo Kk | 酸性オリゴ糖の分離方法 |
| CN101368195A (zh) * | 2008-08-22 | 2009-02-18 | 江门量子高科生物工程有限公司 | 一种高纯度低聚果糖的制备方法 |
| CN102321707A (zh) * | 2011-09-30 | 2012-01-18 | 陕西科技大学 | 一种利用固定化β-葡萄糖苷酶制备龙胆低聚糖的方法 |
| CN103172759A (zh) * | 2013-03-18 | 2013-06-26 | 中国科学院过程工程研究所 | 利用枸杞多糖制备小分子量功能性多糖及寡糖的方法 |
| CN107217080A (zh) * | 2017-07-31 | 2017-09-29 | 寰龙特种糖业有限公司 | 一种利用固定化酶制备菊芋低聚果糖的方法 |
| CN108640953A (zh) * | 2018-04-27 | 2018-10-12 | 中国农业大学 | 采用大孔树脂对南瓜低聚糖的精制方法 |
| CN109134676A (zh) * | 2018-07-25 | 2019-01-04 | 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 | 低聚糖及其制备方法、应用 |
| CN110776580A (zh) * | 2019-11-19 | 2020-02-11 | 湖南华诚生物资源股份有限公司 | 一种从罗汉果上柱流出废液中回收高含量酸性多糖的方法 |
| CN111172145A (zh) * | 2020-01-10 | 2020-05-19 | 量子高科(中国)生物股份有限公司 | 固定化酶及其生产功能性低聚糖的方法 |
-
2020
- 2020-12-28 CN CN202011581739.8A patent/CN112480283B/zh active Active
Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4840900A (en) * | 1987-04-13 | 1989-06-20 | National Distillers And Chemical Corporation | Continuous process for the preparation of immobilized glucoamylase |
| CN1335402A (zh) * | 2001-08-12 | 2002-02-13 | 广西大学 | 用固定化果糖基转移酶生产蔗果低聚糖的方法 |
| JP2006087390A (ja) * | 2004-09-27 | 2006-04-06 | Sanwa Denpun Kogyo Kk | 酸性オリゴ糖の分離方法 |
| CN101368195A (zh) * | 2008-08-22 | 2009-02-18 | 江门量子高科生物工程有限公司 | 一种高纯度低聚果糖的制备方法 |
| CN102321707A (zh) * | 2011-09-30 | 2012-01-18 | 陕西科技大学 | 一种利用固定化β-葡萄糖苷酶制备龙胆低聚糖的方法 |
| CN103172759A (zh) * | 2013-03-18 | 2013-06-26 | 中国科学院过程工程研究所 | 利用枸杞多糖制备小分子量功能性多糖及寡糖的方法 |
| CN107217080A (zh) * | 2017-07-31 | 2017-09-29 | 寰龙特种糖业有限公司 | 一种利用固定化酶制备菊芋低聚果糖的方法 |
| CN108640953A (zh) * | 2018-04-27 | 2018-10-12 | 中国农业大学 | 采用大孔树脂对南瓜低聚糖的精制方法 |
| CN109134676A (zh) * | 2018-07-25 | 2019-01-04 | 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 | 低聚糖及其制备方法、应用 |
| CN110776580A (zh) * | 2019-11-19 | 2020-02-11 | 湖南华诚生物资源股份有限公司 | 一种从罗汉果上柱流出废液中回收高含量酸性多糖的方法 |
| CN111172145A (zh) * | 2020-01-10 | 2020-05-19 | 量子高科(中国)生物股份有限公司 | 固定化酶及其生产功能性低聚糖的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| SACHIO HAYASHI等: "Immobilization of β-fructofuranosidase from Aureobasidium sp.ATCC 20524 on porous silica", 《JOURNAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY》 * |
| 林海蛟等: "基于大孔吸附树脂先交联后吸附法固定化脂肪酶", 《广西师范大学学报( 自然科学版)》 * |
| 王广慧主编: "《食药用真菌中的生物活性物质及其应用研究》", 30 June 2015, 黑龙江大学出版社 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117210519A (zh) * | 2023-07-27 | 2023-12-12 | 安徽中医药大学 | 多花黄精多糖寡糖片段及其制备方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112480283B (zh) | 2023-02-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110330575B (zh) | 一种灵芝提取物的制备方法 | |
| CN101229199B (zh) | 北冬虫夏草菌丝体中多种有效成分的综合提取方法 | |
| US10835552B2 (en) | Method for preparing linseed polysaccharide having antiviral activity and immunological activity, and use of the linseed polysaccharide | |
| CN105175566B (zh) | 聚酰胺柱和大孔树脂柱联柱法去除西洋参多糖提取物中蛋白质和色素的方法 | |
| CN108047343B (zh) | 伊贝母总多糖的制备方法及其应用 | |
| CN111285939A (zh) | 一种具有抗氧化和调节肠道菌群功效的海蒿子多糖及其制备方法与应用 | |
| CN111440218A (zh) | 一种植物多酚的制备方法 | |
| CN112480283B (zh) | 一种从黄精中制备中性低聚多糖的方法 | |
| CN108265092B (zh) | 一种具有优良抗氧化活性的香菇寡糖及制备方法 | |
| CN112870254A (zh) | 一种连续法从青钱柳中分离黄酮、皂苷和多糖的方法 | |
| CN112694541A (zh) | 一种黄蜀葵花多糖的温和脱色方法 | |
| CN114515008A (zh) | 一种管花肉苁蓉提取物及其制备方法 | |
| CN113980153A (zh) | 一种高粘度桃胶多糖的提取方法 | |
| CN111777656B (zh) | 一种从新鲜黄芪中提取黄芪甲苷的方法 | |
| CN110917240B (zh) | 一种从青钱柳中分离多种有效成分的连续化方法 | |
| CN113999327B (zh) | 一种具有显著抗光老化活性的羊栖菜多糖及其应用 | |
| CN102964407B (zh) | 一种从土茯苓中提取落新妇苷的方法及其制成的落新妇苷 | |
| CN111662348B (zh) | 一种从芍药中提取芍药苷和芍药内酯苷的提取方法 | |
| CN112143769B (zh) | 一种使用葛根药渣制备葛根多肽提取物的方法以及由此制得的葛根多肽提取物 | |
| CN112111019B (zh) | 一种含有三七多糖提取物的药物组合物及其制备方法 | |
| CN107936133B (zh) | 一种月见草叶多糖及其制备方法 | |
| CN113813305B (zh) | 一种北五味子果实中活性成分集成提取的方法 | |
| CN110483653B (zh) | 一种具有免疫活性的香菇多糖组分的制备方法及产品和应用 | |
| CN110656144B (zh) | 一种罗汉果产业废弃物资源化利用的方法 | |
| CN115286531B (zh) | 一种石花菜中类菌孢素氨基酸porphyra-334的分离纯化方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |