CN111662348B - 一种从芍药中提取芍药苷和芍药内酯苷的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开的一种从芍药中提取芍药苷和芍药内酯苷的提取方法，包括以下步骤：1)将芍药药材经液氮低温粉碎、过筛，得到芍药粉末；2)将芍药粉末进行高压脉冲电场和酶解提取得到目标提取液；3)用超滤膜滤过,取超滤液；4)将超滤液用极性大孔树脂柱脱色；5)脱色液用层析树脂进行吸附，梯度洗脱，分部收集洗脱液，选择性合并洗脱液中含有芍药苷的流份以及含有芍药内酯苷流份，分别浓缩、干燥，得到芍药苷或芍药内酯苷。本发明提供的提取方法可得到高纯度高收率的芍药苷或芍药内酯苷，且方法简单，耗能低，操作工艺条件易于控制，易于实现工业化生产。

Description

一种从芍药中提取芍药苷和芍药内酯苷的提取方法

技术领域

本发明涉及天然产物有效成份的提取领域，更具体地，涉及一种从芍药中提取芍药苷和芍药内酯苷的提取方法。

背景技术

芍药(学名：Paeonia lactiflora Pall)，别名别离草、花中宰相，属芍药科芍药属的多年生草本植物，常用其干燥根入药。

目前，现有技术中已公开的芍药苷或芍药内酯苷制备方法的方法很多，如申请号为CN 02133298.3的专利公开了一种芍药苷和芍药内酯苷的组合物及其制备方法，其制备工艺主要通过经过水提取得水溶液，再通过吸附树脂用乙醇水洗脱得洗脱液，再经浓缩和氧化铝柱层析和硅胶柱层析制得。申请号为CN 200510041212.5专利中介绍了一种芍药苷提取物的制备方法，包括粉碎，用乙醇水溶液热回流提取，离心处理，上大孔吸附树脂柱，先用水洗脱杂质，再用10-90％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩后上聚酰胺柱，水洗脱，浓缩干燥后得白色粉末，得含量90％以上芍药苷。公开号为CN 103180334A的专利公开了一种制备芍药内酯苷和芍药苷的方法，对芍药采用渗漉或加热回流提取得到芍药提取液，然后将芍药提取液依次进行大孔树脂、氧化铝柱和硅胶柱层析，即得到高纯度的芍药苷和芍药内酯苷。

以上方案大多涉及到硅胶柱精制，虽然制备的产品纯度高，但总体存在溶剂消耗量大、残留大、流程长，硅胶柱用于工业化生产存在制备工艺流程复杂，柱效低、制备周期长、检测操作复杂等各种弊端，难以实现工业化生产的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种从芍药中提取芍药苷和芍药内酯苷的提取方法，该制备工艺方法简单，耗能低，操作工艺条件易于控制，易于实现工业化生产。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种从芍药中提取芍药苷和芍药内酯苷的提取方法，包括以下步骤：

1)前处理：将芍药药材经液氮低温粉碎、过筛，得到芍药粉末；

2)提取：将步骤1)所得芍药粉末与水混合，置于高压脉冲电场中在0～4℃条件下进行低温提取，过滤，得到初次提取液和滤渣，所述高压脉冲电场的强度为15～25kV/cm；在滤渣中加入水和纤维素酶，酶解，过滤，得到二次提取液，将初次提取液与二次提取液混合，减压浓缩，离心，得到目标提取液；

3)超滤：将步骤2)所得目标提取液经超滤膜过滤，得到超滤液；

4)脱色：将步骤3)所得超滤液用极性大孔树脂脱色，得到脱色液；

5)纯化：将步骤4)所得脱色液用层析树脂进行吸附，然后梯度洗脱，分部收集洗脱液，选择性合并洗脱液中含有芍药苷的流份以及含有芍药内酯苷流份，分别浓缩、干燥，得到芍药苷或芍药内酯苷。

从目前现有技术中公开的方案来看，为得到高纯度的芍药苷或芍药内酯苷，大多涉及到采用硅胶柱进行精制，然而发明人发现，将硅胶柱精制用于工业化生产存在以下困难：①硅胶柱采用不同极性流动相洗脱，回收的溶剂难以再次利用；②不利于再生处理，有机溶剂挥发可导致易燃、易爆、污染等危害。而采用白芍总苷提取物加适量乙醇溶解，加入硅胶干燥后装柱(俗称拌样上柱或干法上柱)，缺点有：①白芍总苷提取物含有较多杂质，洗脱芍药内酯苷、芍药苷后，杂质吸附在硅胶上难以去除，硅胶柱不能重复使用，需拆除后重新装柱，因柱内含有易燃、有毒的化学试剂，操作困难而且危险；②白芍总苷提取物加入硅胶干燥后装柱，吸附能力强，虽然制备的产品纯度较高，但洗脱过程缓慢(洗脱过程1～2天)消耗溶剂量大，且芍药内酯苷、芍药苷有1/3吸附在硅胶上难以洗脱，使得产品收率低。

因此，本发明结合芍药材料的特有组分，创造性的提出了上述一种从芍药中提取芍药苷和芍药内酯苷的提取方法，通过依次将芍药药材冷冻粉碎过筛、低温高压脉冲电场提取结合酶解提取、超滤膜滤过、极性大孔树脂柱脱色、层析纯化等步骤，可以在同一工艺流程中，制备得到高纯度的芍药苷和芍药内酯苷，药材资源利用充分；且避免了硅胶柱精制的步骤，整体制备工艺方法简单，精制效率高，耗能低，操作工艺条件易于控制，易于实现工业化生产。

需要说明的是，本发明在对芍药药材进行粉碎处理时，使用液氮冷冻粉碎一方面可避免常温下对物料进行粉碎时易产生较高温度，另一方面又可得到超细微粉，在利用低温保护有效成分的同时，提高破壁率、有效脱水，从而便于后续的提取工作，提高提取后芍药苷的纯度，以获得高品质芍药苷和芍药内酯苷。

高压脉冲电场(Pulseelectric field，简称PEF)提取技术的原理是：高压直流电源将220V交流电通过变压器变成几十千伏的交流电，然后经过整流变成高压直流电，可使细胞壁瞬间破裂，致使细胞内容物快速溶出，高压脉冲电场技术具有传输均匀、时间极短对其成分和色泽影响很小、尤其是在处理过程中不产生热量，对于本发明芍药中提取芍药苷和芍药内酯苷极为有利。

本发明中采用冷水为芍药苷和芍药内酯苷的提取液，低温冷水提可保护有效成分不被破坏，若采用温度较高水提取时，芍药中的淀粉可被糊化，而增加过滤的困难，故含淀粉量多的芍药，不宜磨成细粉后加水煎煮。发明人发现，加温虽然可以增大芍药中芍药苷和芍药内酯苷成分的溶解度，但也会使得水中产生大量果胶、淀粉、黏液质及其他水溶性物质，同时还可能有与其他成分产生“助溶”现象，增加了一些水中溶解度小的、亲脂性强的成分的溶解度，给后续操作带来很大的困难，且长时间提取加热会导致有效成分被破坏，冷水既可以避免这些问题，又能降低提取成本且节约能源。另外，如果应用大量水煎煮，还会增加蒸发浓缩时的困难，且会溶出大量杂质，给进一步分离提纯带来麻烦。煎煮法的水提取液中还含有皂甙及粘液质类成分，在减压浓缩时，还会产生大量泡沫，造成浓缩的困难。因此，本发明创新性的将提取温度设置为0～4℃的低温进行提取，同时结合高压脉冲电场处理和后续的纤维素酶解提取等步骤，不仅可有效避免上述问题，同时还可提高最终产品的纯度，其提取收率也能得以保障。

进一步的，本发明中使用超滤膜可以有效保留活性物质的同时除去蛋白质、多糖、胶团或大分子颗粒,从而达到精制纯化的目的。用极性大孔树脂柱进行脱色避免了常规离子交换树脂脱色会破坏芍药苷结构的降低收率的问题，使用60-80目的层析树脂来分离纯化芍药苷和芍药内酯苷，不需要像制备液相一样使用相当高的压强，对设备的要求不苛刻，操作方便，分离效果明显。

优选的，步骤1)中，所述过筛的目数为80-100目。

优选的，步骤2)中，高压脉冲电场提取时，先将所述芍药粉末置于高压脉冲电场中，然后通过蠕动泵按照70～90m L/min的速率将水加入至高压脉冲电场中与所述芍药粉末混匀，进行高压脉冲电场提取，提取时间为0.5～1.5h；芍药粉末与水的重量比为1：5～15。

优选的，步骤2)中，酶解提取时，所述纤维素酶为低温纤维素酶，所述酶解的温度为10～20℃，pH4.5～6.5，所述纤维素酶的加入量为芍药粉末的0.01～0.03％，所述纤维素酶的酶活度不小于100000U/g，所述低温纤维素由γ-变形菌纲、硬壁菌门、放线菌门、拟杆菌门、以及β-变形菌纲类群中任意一种菌种表达得到，其中γ-变形菌纲类群的细菌属于最优势菌，硬壁菌门类群的细菌属于第二优势菌；减压浓缩时，温度为50～65℃，时间为30～60min，真空度为0.07MPa～0.09MPa。

优选的，步骤3)中，所述超滤膜的截留分子量为3～5万道尔顿；所述超滤膜的材料为纤维素及其衍生物、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚偏氟乙烯、聚砜、聚丙烯腈、聚酰胺、聚砜酰胺、磺化聚砜、交链的聚乙烯醇、改性丙烯酸聚合物中的任一种。

优选的，步骤3)中，操作压力为0.4～0.7MPa；温度为10～30℃；所述超滤膜过滤的方式为错流过滤。

优选的，步骤4)中，流速为1～3bv/h；所述极性大孔树脂为ADS-7或XAD-761。

优选的，步骤5)中，所述层析树脂为60～80目的HP-20SS或SP825。

优选的，步骤5)中，所述梯度洗脱具体为：先用水洗至流出液无色且糖色反应为阴性，再依次用1％～10％、10％～20％、20％～30％、30％～40％乙醇水溶液进行梯度洗脱，洗脱流速为2～5bv/h。

优选的，步骤5)中，所述干燥为喷雾干燥或真空冷冻干燥。

本发明的有益效果为：

本发明通过依次将芍药药材液氮低温粉碎过筛、低温高压脉冲电场提取结合酶解提取、超滤膜过滤、极性大孔树脂柱脱色、层析纯化等步骤，可以在同一工艺流程中，制备得到高纯度高收率的芍药苷和芍药内酯苷，药材资源利用充分；且避免了硅胶柱精制的步骤，整体制备工艺方法简单，耗能低，操作工艺条件易于控制，易于实现工业化生产。

具体实施方式

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例1

一种从芍药中提取芍药苷和芍药内酯苷的提取方法，包括以下步骤：

(1)前处理：选取150g干燥的白芍经液氮低温粉碎，过100目筛，得到白芍粉末；

(2)提取：将白芍粉末置于高压脉冲电场中，通过蠕动泵将溶剂纯化水按照70m L/min的速率加入与白芍粉末混合，设置温度2℃，电场强度20k V/cm，料液比为1：8，进行初次提取，提取时间为1h；然后将提取液过滤得到初次提取液和滤渣，在滤渣中加入水和低温纤维素酶进行酶解，低温纤维素酶的加入量为白芍粉末重量的0.01％，酶活为120000U/g，酶解时间为40min，温度为10℃，pH为5.5，该低温纤维素酶由菌株为噬胞菌属细菌表达得到，过滤，得到二次提取液，将初次提取液与二次提取液混合，减压浓缩，离心，得到目标提取液；浓缩温度设置为55℃，浓缩时间为60min，压力设置为0.07MPa；

(3)超滤：将步骤(2)收集的目标提取液进行错流超滤，操作压力为0.5MPa，超滤膜的截留分子量为5万道尔顿，其材料为聚氯乙烯聚合物，得超滤液；

(4)脱色：将步骤(3)的超滤液用极性大孔树脂柱脱色，大孔树脂为ADS-7，流速为2bv/h；

(5)层析纯化：将脱色液用HP-20SS型层析树脂(60-80目)柱进行吸附，然后先用水洗至流出液无色且糖色反应为阴性，再依次用5％、15％、25％、35％乙醇水溶液进行梯度洗脱，流速为2bv/h，分部收集洗脱液，选择性合并洗脱液中含有芍药苷的流份以及含有芍药内酯苷流份，纯化后得到的溶液分别65℃进行真空浓缩干燥，得到得到芍药苷6.25g，芍药内酯苷2.21g。

按照下述步骤对所得芍药苷和芍药内酯苷进行含量测定：

含量测定方法：色谱条件与系统适用性：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：甲醇-0.1％磷酸溶液(加1％氢氧化钠溶液调整PH为4.2)(34：66)为流动相；检测波长为230nm。理论板数按芍药苷峰计算应不低于2500。对照品溶液的制备：精密称取芍药苷、芍药内酯苷对照品加50％乙醇分别制成每lml各含芍药苷、芍药内酯苷0.02mg的溶液，即得。供试品溶液的制备：取本品粉末0.1g，精密称定，置1000ml量瓶中，加50％乙醇950ml超声使溶解，加50％乙醇至刻度，摇匀，即得。测定法：分别精密吸取上述照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。

采用前述的芍药苷和芍药内酯苷含量HPLC检测方法测定：芍药苷纯度为97.0％，芍药内酯苷纯度为93.6％。

实施例2

一种从芍药中提取芍药苷和芍药内酯苷的提取方法，包括以下步骤：

(1)前处理：选取300g干燥的白芍经液氮低温粉碎，过100目筛，得到白芍粉末；

(2)提取：将白芍粉末置于高压脉冲电场中，通过蠕动泵将溶剂纯化水按照90m L/min的速率加入与白芍粉末混合，设置温度3℃，电场强度20k V/cm，料液比为1：9，进行初次提取，提取时间为50min；然后将提取液过滤得到初次提取液和滤渣，在滤渣中加入水和低温纤维素酶进行酶解，低温纤维素酶的加入量为白芍粉末重量的0.02％，酶活为150000U/g，酶解时间为40min，温度为15℃，pH为6.5，该低温纤维素酶由菌株为纤维单胞菌属细菌表达得到，过滤，得到二次提取液，将初次提取液与二次提取液混合，减压浓缩，离心，得到目标提取液；浓缩温度设置为60℃，浓缩时间为50min，压力设置为0.08MPa；

(3)超滤：将步骤(2)收集的目标提取液进行错流超滤，操作压力为0.5MPa，超滤膜的截留分子量为4万道尔顿，其材料为聚酰胺聚合物，得超滤液；

(4)脱色：将步骤(3)的超滤液用极性大孔树脂柱脱色，大孔树脂为XAD-761，流速为2bv/h；

(5)层析纯化：将脱色液用HP-20SS型层析树脂(60-80目)柱进行吸附，然后先用水洗至流出液无色且糖色反应为阴性，再依次用7％、14％、24％、34％乙醇水溶液进行梯度洗脱，流速为3bv/h，分部收集洗脱液，选择性合并洗脱液中含有芍药苷的流份以及含有芍药内酯苷流份，纯化后得到的溶液分别60℃进行真空浓缩干燥，得到得到芍药苷12.71.g，芍药内酯苷4.68g。

按照实施例1中的检测方法测定，本实施例中所得芍药苷纯度为97.4％，芍药内酯苷纯度为93.8％。

实施例3

一种从芍药中提取芍药苷和芍药内酯苷的提取方法，包括以下步骤：

(1)前处理：选取400g干燥的白芍经液氮低温粉碎，过80目筛，得到白芍粉末；

(2)提取：将白芍粉末置于高压脉冲电场中，通过蠕动泵将溶剂纯化水按照65m L/min的速率加入与白芍粉末混合，设置温度4℃，电场强度25k V/cm，料液比为1：10，进行初次提取，提取时间为30min；然后将提取液过滤得到初次提取液和滤渣，在滤渣中加入水和低温纤维素酶进行酶解，低温纤维素酶的加入量为白芍粉末重量的0.02％，酶活为150000U/g，酶解时间为30min，温度为20℃，pH为4.5，该低温纤维素酶由菌株为假单胞菌属表达得到，过滤，得到二次提取液，将初次提取液与二次提取液混合，减压浓缩，离心，得到目标提取液；浓缩温度设置为60℃，浓缩时间为40min，压力设置为0.09MPa；

(3)超滤：将步骤(2)收集的目标提取液进行错流超滤，操作压力为0.4MPa，超滤膜的截留分子量为3万道尔顿，其材料为聚砜酰胺，得超滤液；

(4)脱色：将步骤(3)的超滤液用极性大孔树脂柱脱色，大孔树脂为ADS-7，流速为2bv/h；

(5)层析纯化：将脱色液用SP825型层析树脂(60-80目)柱进行吸附，然后先用水洗至流出液无色且糖色反应为阴性，再依次用8％、17％、26％、38％乙醇水溶液进行梯度洗脱，流速为4bv/h，分部收集洗脱液，选择性合并洗脱液中含有芍药苷的流份以及含有芍药内酯苷流份，将收集的芍药苷的流份以及含有芍药内酯苷流份分别进行喷雾干燥(入口风温度180℃,出口风温度100℃)，得到芍药苷16.23g，芍药内酯苷6.77g。

按照实施例1中的检测方法测定，本实施例中所得芍药苷纯度为98.0％，芍药内酯苷纯度为92.8％。

对比实施例1

重复实施例1的步骤，区别在于将步骤(2)中进行高压脉冲电场提取时的温度设置为80℃。

本实施例制备得到芍药苷3.43g，芍药内酯苷1.17g。

同样按照实施例1的中的检测方法测定，本实施例中所得芍药苷纯度为82.1％，芍药内酯苷纯度为80.9％。

对比实施例2

重复实施例2的步骤，区别在于将步骤(2)中进行高压脉冲电场提取时的温度设置为40℃。

本实施例制备得到芍药苷11.21g，芍药内酯苷3.95g。

同样按照实施例1的中的检测方法测定，本实施例中所得芍药苷纯度为83.4％，芍药内酯苷纯度为80.8％。

对比实施例3

重复实施例3的步骤，区别在于将步骤(4)替换为：将(3)的超滤液加入溶液重量0.3％活性炭，搅拌30min后过滤。

本实施例制备得到芍药苷15.17g，芍药内酯苷5.32g。

同样按照实施例1的中的检测方法测定，本实施例中所得芍药苷纯度为81.0％，芍药内酯苷纯度为84.2％。

对比实施例4

重复实施例1的步骤，区别在于步骤(2)中仅进行高压脉冲电场初次提取，将初次提取液直接进行减压浓缩，离心，得到目标提取液。

本实施例制备得到芍药苷3.21g，芍药内酯苷1.12g。

同样按照实施例1的中的检测方法测定，本实施例中所得芍药苷纯度为80.1％，芍药内酯苷纯度为81.4％。

对比实施例5

重复实施例2的步骤，区别在于将步骤(2)中进行高压脉冲电场提取时的温度设置为10℃。

本实施例制备得到芍药苷10.85g，芍药内酯苷3.72g。

同样按照实施例1的中的检测方法测定，本实施例中所得芍药苷纯度为80.5％，芍药内酯苷纯度为82.7％。

综上，通过具体实施例，可以看出，采用本发明提供的提取步骤，可在同一工艺流程中，制备得到高纯度高收率的芍药苷和芍药内酯苷，药材资源利用充分；且避免了硅胶柱精制的步骤，整体制备工艺方法简单，耗能低，操作工艺条件易于控制，易于实现工业化生产。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种从芍药中提取芍药苷和芍药内酯苷的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)前处理：将芍药药材经液氮低温粉碎、过筛，得到芍药粉末；

2)提取：将步骤1)所得芍药粉末与水混合，置于高压脉冲电场中在0～4℃条件下进行低温提取，过滤，得到初次提取液和滤渣，所述高压脉冲电场的强度为15～25kV/cm；在滤渣中加入水和纤维素酶，酶解，过滤，得到二次提取液，将初次提取液与二次提取液混合，减压浓缩，离心，得到目标提取液；

3)超滤：将步骤2)所得目标提取液经超滤膜过滤，得到超滤液；

4)脱色：将步骤3)所得超滤液用极性大孔树脂脱色，得到脱色液；

5)纯化：将步骤4)所得脱色液用层析树脂进行吸附，然后梯度洗脱，分部收集洗脱液，选择性合并洗脱液中含有芍药苷的流份以及含有芍药内酯苷流份，分别浓缩、干燥，得到芍药苷或芍药内酯苷；

其中，步骤2)中，高压脉冲电场提取时，先将所述芍药粉末置于高压脉冲电场中，然后通过蠕动泵按照70～90m L/min的速率将水加入至高压脉冲电场中与所述芍药粉末混匀，进行高压脉冲电场提取，提取时间为0.5～1.5h；芍药粉末与水的重量比为1：5～15；

酶解提取时，所述纤维素酶为低温纤维素酶，所述低温纤维素酶 由γ-变形菌纲、硬壁菌门、放线菌门、拟杆菌门、以及β-变形菌纲类群中任意一种菌种表达得到，所述酶解的温度为10～20℃，pH4.5～6.5，所述纤维素酶的加入量为芍药粉末的0.01～0.03％，所述纤维素酶的酶活度不小于100000U/g；减压浓缩时，真空度为0.07MPa～0.09MPa，温度为50～65℃，时间为30～60min。

2.根据权利要求1所述的从芍药中提取芍药苷和芍药内酯苷的提取方法，其特征在于，步骤1)中，所述过筛的目数为80-100目。

3.根据权利要求1所述的从芍药中提取芍药苷和芍药内酯苷的提取方法，其特征在于，步骤2)中，减压浓缩时，真空度为0.07MPa～0.09MPa，温度为50～65℃，时间为30～60min。

4.根据权利要求1所述的从芍药中提取芍药苷和芍药内酯苷的提取方法，其特征在于，步骤3)中，所述超滤膜的截留分子量为3～5万道尔顿；所述超滤膜的材料为纤维素及其衍生物、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚偏氟乙烯、聚砜、聚丙烯腈、聚酰胺、聚砜酰胺、磺化聚砜、交链的聚乙烯醇、改性丙烯酸聚合物中的任一种。

5.根据权利要求1所述的从芍药中提取芍药苷和芍药内酯苷的提取方法，其特征在于，步骤3)中，操作压力为0.4～0.7MPa，温度为10～30℃；所述超滤膜过滤的方式为错流过滤。

6.根据权利要求1所述的从芍药中提取芍药苷和芍药内酯苷的提取方法，其特征在于，步骤4)中，流速为1～3bv/h；所述极性大孔树脂为ADS-7或XAD-761。

7.根据权利要求1所述的从芍药中提取芍药苷和芍药内酯苷的提取方法，其特征在于，步骤5)中，所述层析树脂为60～80目的HP-20SS或SP825。

8.根据权利要求1所述的从芍药中提取芍药苷和芍药内酯苷的提取方法，其特征在于，步骤5)中，所述梯度洗脱具体为：先用水洗至流出液无色且糖色反应为阴性，再依次用1％～10％、10％～20％、20％～30％、30％～40％乙醇水溶液进行梯度洗脱，洗脱流速为2～5bv/h。

9.根据权利要求1所述的从芍药中提取芍药苷和芍药内酯苷的提取方法，其特征在于，步骤5)中，所述干燥为喷雾干燥或真空冷冻干燥。