CN109251925A - 一种离子交换树脂固定化转氨酶的制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种离子交换树脂固定化转氨酶及其应用。具体地,本发明公开了一种固定化转氨酶,所述的固定化转氨酶含有组分(a):季铵盐型阴离子交换树脂和组分(b):固定于所述阴离子交换树脂上的转氨酶;其中,所述的组分(a)通过离子交换作用吸附于所述的组分(b)上。本发明还提供了涉及该固定化转氨酶的反应体系、制备方法和应用。本发明的固定化转氨酶可重复使用,将其用于催化制备西他列汀,酶活损失少,酶的利用率高,生产成本降低。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学领域,更具体地涉及一种离子交换树脂固定化转氨酶的制备及其应用。
背景技术
糖尿病是由于胰岛素分泌改变,导致胰岛素缺乏及作用减弱,或者胰岛素活性降低,或者在两者共同影响下,出现的代谢性疾病,以高血糖为特征,并同时伴有蛋白质、糖及脂肪的代谢紊乱。糖尿病及其并发症对人类健康的危害程度居心血管疾病、肿瘤之后的第三位,成为危害人类健康的重要疾病。国际糖尿病联合会预计,到2030年,患病总人数将超过4.35亿人。而我国已成为世界糖尿病患病率增长速度最快的国家之一,目前约有4000万糖尿病患者,人数仅次于印度,居世界第二位。在糖尿病的四种类型中,II型糖尿病占90%以上,多见于30岁以上的中老年人,病因主要是由于机体对胰岛素不敏感。在临床上治疗II型糖尿病的药物中,磺酰脲类胰岛素分泌促进剂、双胍类胰岛素敏感性增强剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂、非磺酰脲类胰岛素分泌促进剂等虽然降糖作用较为理想,但均有一定的副作用影响患者坚持用药,达不到较好的血糖控制效果。
西他列汀磷酸盐(Sitagliptin phosphate)是2006年FDA批准上市的第一个二肽基酶-IV(DPP-4)抑制剂,用于治疗II型糖尿病,其单用或与二甲双胍、吡格列酮合用都有明显的降血糖作用,且服用安全,耐受性好,不良反应少。它主要通过抑制DPP-4对胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和糖依赖性胰岛素释放肽(GIP)的降解以达到治疗的目的,轻度增加GLP-1含量并减弱GLP-1代谢物的拮抗作用,所以在有效发挥降糖作用的同时不会引起因GLP-1含量过高而引起的恶心呕吐等副作用;同时,GIP促进胰岛素分泌具有血糖依赖性,故能大大降低口服降糖药导致的低血糖副作用的发生率。西他列汀磷酸盐由默克公司开发,于2006年8月及10月分别被墨西哥卫生部及美国FDA批准为治疗II型糖尿病的药物,商品名为捷诺维(Januvia),目前已经在全世界60多个国家批准使用,2012年销售额已达40.86亿美元,同比增长23%。因此,西他列汀磷酸盐是属于国际最新且附加值极高的“重磅炸弹”。
西他列汀制备中的关键步骤是手性氨基中间体的构建。传统的西他列汀制备方法存在成本高、污染重、循环利用差等问题。本领域迫切需要开发新的、高效率的西他列汀制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种离子交换树脂固定化转氨酶的制备及其应用。
在本发明的第一方面,提供了一种固定化转氨酶,所述的固定化转氨酶含有:
组分(a):阴离子交换树脂;和
组分(b):固定于所述阴离子交换树脂上的转氨酶;
其中,所述的组分(a)通过离子交换作用吸附于所述的组分(b)上;
并且,所述的阴离子交换树脂以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)为骨架。
在另一优选例中,所述的阴离子交换树脂选自下组:季铵盐型阴离子交换树脂、伯胺盐型阴离子交换树脂、仲胺盐型阴离子交换树脂、和叔胺盐型阴离子交换树脂。
在另一优选例中,所述的阴离子交换树脂为季铵盐型阴离子交换树脂。
在另一优选例中,所述的季铵盐型阴离子交换树脂选自下组:三甲基取代的季铵盐型阴离子交换树脂、三乙基取代的季铵盐型阴离子交换树脂、甲基和乙基共同取代的季铵盐型阴离子交换树脂。
在另一优选例中,所述的季铵盐型阴离子交换树脂为三甲基取代的季铵盐型阴离子交换树脂。
在另一优选例中,所述的转氨酶来源于Arthrobacter sp.Knk168。
在另一优选例中,所述的转氨酶的分子量36kD。
在另一优选例中,所述的转氨酶最适pH为7-10。
在另一优选例中,所述转氨酶的序列如SEQ ID NO.:1所示。
在另一优选例中,所述的组分(a)和组分(b)的重量之和占固定化转氨酶重量的30-80wt%,较佳地50-70wt%。
在另一优选例中,所述的固定化转氨酶用于制备(3R)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。
在另一优选例中,所述固定化转氨酶为干粉型固定化转氨酶。
在另一优选例中,所述固定化转氨酶还含有组分(c)水。
在另一优选例中,所述的组分(c)的重量占固定化转氨酶重量的20-70%,较佳地为30-50%。
在另一优选例中,所述的固定化转氨酶可以重复使用。
在另一优选例中,所述固定化转氨酶的酶活1000U/g。
在本发明的第二方面,提供了一种反应体系,所述的反应体系包含:(a)本发明第一方面所述的固定化转氨酶,(b)有机溶剂,和(c)氨基供体。
在另一优选例中,所述的有机溶剂选自下组:甲基叔丁基醚(MTBE)、甲苯、异丙醇、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯、或其组合。
在另一优选例中,所述的有机溶剂为甲基叔丁基醚(MTBE)。
在另一优选例中,所述的氨基供体为异丙胺。
在另一优选例中,所述的反应体系中固定化转氨酶的含量为50-500g/L,较佳地为100-300g/L。
在另一优选例中,所述的反应体系中甲基叔丁基醚的体积百分比为100%。
在另一优选例中,所述的反应体系中异丙胺的浓度为底物(西塔双酮)浓度的1-5倍,优选2-4倍。
在另一优选例中,所述的反应体系中还包含1-(3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1,3-二酮(西塔双酮)。
在另一优选例中,所述的反应体系中1-(3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1,3-二酮的浓度为50-500mmol/L,较佳地为100-300mmol/L。
在另一优选例中,所述的反应体系用于制备(3R)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。
在本发明的第三方面,提供了一种制备本发明第一方面所述的固定化转氨酶的方法,所述的方法包括步骤:
(i)提供包含转氨酶的第一溶液;
(ii)向所述的第一溶液中加入阴离子交换树脂,进行固定化反应,从而形成本发明第一方面所述的固定化转氨酶;
并且,所述的阴离子交换树脂以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)为骨架。
在另一优选例中,所述的阴离子交换树脂为季铵盐型阴离子交换树脂。
在另一优选例中,所述的固定化反应在搅拌的条件下进行。
在另一优选例中,所述搅拌的转速为50-500转/分钟,较佳地为100-200转/分钟。
在另一优选例中,所述固定化反应的时间为2-48h,较佳地为10-24h。
在另一优选例中,所述固定化反应的温度为4-30℃,较佳地为10-20℃。
在另一优选例中,在步骤(ii)中,加入的阴离子交换树脂的质量与第一溶液的体积之比为1:(1-10),较佳地为1:(3-8)。
在另一优选例中,所述的方法还包括步骤:
(iii)对上一步骤中形成的固定化转氨酶进行分离;
(iv)任选地对上一步骤的固定化转氨酶进行洗涤;和
(v)任选地对上一步骤的固定化转氨酶进行干燥。
在另一优选例中,在步骤(iii)中,所述的分离为过滤分离,较佳地为利用目数为400-600目的滤布进行分离。
在另一优选例中,在步骤(iv)中,洗涤的次数为2-5次。
在另一优选例中,在步骤(iv)中,利用磷酸盐缓冲液进行洗涤。
在另一优选例中,所述磷酸盐缓冲液的浓度为40-100mmol/L。
在另一优选例中,所述磷酸盐缓冲液的pH为7-8。
在另一优选例中,所述的干燥包括初步干燥和二次干燥。
在另一优选例中,所述的初步干燥是利用真空抽滤进行干燥。
在另一优选例中,所述的二次干燥是利用沸腾床干燥机进行干燥。
在另一优选例中,所述沸腾床干燥机的进风温度为20-40℃,出风温度小于等于30℃。
在另一优选例中,所述的二次干燥的装料量小于等于1/3。
在本发明的第四方面,提供了一种制备(3R)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的方法,其包括步骤:
(1)在有机溶剂中,在本发明第一方面所述的固定化转氨酶存在下,将1-(3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1,3-二酮与氨基供体进行转氨反应,从而形成(3R)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。
在另一优选例中,所述的有机溶剂为甲基叔丁基醚(MTBE)。
在另一优选例中,所述的氨基供体为异丙胺。
在另一优选例中,所述1-(3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1,3-二酮的浓度为50-500mmol/L,较佳地为100-300mmol/L。
在另一优选例中,所述的反应在搅拌的条件下进行。
在另一优选例中,所述反应的温度为40-60℃。
在另一优选例中,所述反应的时间为2-48h,较佳地为10-24h。
在另一优选例中,所述的方法还包括步骤:
(2)对上一步骤中形成的(3R)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮进行分离;
(3)任选地对上一步骤的(3R)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮进行干燥。
在另一优选例中,在步骤(2)中,所述的分离为萃取分离,较佳地为利用乙酸乙酯进行萃取分离。
在另一优选例中,在步骤(3)中,所述的干燥是利用无水硫酸钠进行干燥。
在另一优选例中,所述的方法还包括步骤:
(4)对步骤(1)中,有机溶剂中的固定化转氨酶进行分离;
(5)任选地对上一步骤的固定化转氨酶进行洗涤和分离操作。
在另一优选例中,在步骤(4)中,所述的分离为过滤分离。
在另一优选例中,在步骤(5)中,所述的洗涤是利用乙醇进行洗涤。
在另一优选例中,步骤(4)或步骤(5)得到的固定化转氨酶可以再次用于(3R)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的制备。
在另一优选例中,所述的方法制备得到的(3R)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的ee值可达99%以上。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究,首次意外地发现一种新的离子交换树脂固定化转氨酶及其应用。实验表明,通过控制固定化工艺,以季铵盐型阴离子交换树脂作为固定化酶的载体进行转氨酶的固定化,即可制备得到可重复使用的固定化转氨酶,将这种固定化转氨酶用于催化制备西他列汀,酶活损失少,酶的利用率高,生产成本降低。在此基础上,完成了本发明。
具体地,本发明涉及一种离子交换树脂固定的固定化转氨酶的制备及其应用,包括固定化工艺和固定化之后的干燥工艺。按比例加入一定量的转氨酶和固定化酶载体树脂,在一定的反应条件下进行固定化反应,固定化反应结束后收集树脂,即得到固定化酶。固定化酶再经过常温沸腾床干燥处理,即得到所需的干粉型固定化酶。将这种干粉型固定化转氨酶用于催化制备西他列汀,酶活损失少,酶的利用率高,生产成本降低。
术语
西他列汀
如本文所用,术语“西他列汀”(Sitagliptin)是一种二肽基酶-IV(DPP-4)抑制剂,可用于治疗II型糖尿病,服用安全,耐受性好,不良反应少。西他列汀的化学式为“(3R)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮”,分子式为C16H15F6N5O,结构式如下所示。
西塔双酮
如本文所用,术语“西塔双酮”是制备西他列汀的底物,化学式为“1-(3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基)-4-(2,4,5-三氟苯5基)丁-1,3-二酮”,结构式如下所示。
转氨酶
转氨酶,又叫氨基转移酶,是催化氨基化合物和羰基化合物之间氨基可逆转移的一类酶。
固定化转氨酶
如本文所用,术语“固定化转氨酶”“固定化酶”可互换使用,是如本发明第一方面所述的固定化酶,其以阴离子交换树脂作为固定化酶的载体进行转氨酶的固定化,其中,所述的阴离子交换树脂以PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)为骨架,优选季铵盐类的离子交换树脂,其可应用于西他列汀生产。本发明的固定化转氨酶固定化更加牢固,且树脂可以重复回收利用,降低了生产成本,提高了资源利用率。
反应体系
本发明还提供了一种制备西他列汀的反应体系,该反应体系包含本发明第一方面所述的固定化转氨酶,有机溶剂(优选甲基叔丁基醚(MTBE))和氨基供体异丙胺。
实验表明,以甲基叔丁基醚(MTBE)为溶剂,将本发明的反应体系应用于西他列汀的制备,可显著提高西他列汀的转化率。
固定化转氨酶的制备
本发明还提供了一种制备本发明第一方面所述固定化转氨酶的方法,所述的方法包括步骤:
(i)提供包含转氨酶的第一溶液;
(ii)向所述的第一溶液中加入阴离子交换树脂,进行固定化反应,从而形成所述的固定化转氨酶;
并且,所述的阴离子交换树脂以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)为骨架。
在一优选例中,本发明的制备固定化转氨酶的方法包括以下步骤:
(1)酶固定化
优选地,所述的固定化转氨酶所用的固定化树脂为:季铵盐型阴离子交换树脂
优选地,固定化酶载体树脂的添加与酶液的投料比为1:5(w/v)
优选地,搅拌转速在100-200转/分钟之间,以能够将树脂悬浮起来为宜。
优选地,反应温度控制在16℃为宜。
优选地,固定化时间在16h为宜。
优选地,固定化反应后需要静置,静置时间在4h为宜。
(2)固定化酶过滤收集得到含水的固定化酶。
优选地,所用滤布目数为500目。
优选地,树脂洗涤时先用自来水冲洗干净,然后用磷酸盐缓冲液洗涤2-3次。
优选地,所用磷酸盐缓冲液浓度为100mmol/L,pH为7.5。
(3)固定化酶脱水得到所需的干粉型固定化酶。
优选地,初步脱水采用真空抽滤,脱水后水分含量以不超过70%为宜。
优选地,沸腾床进风温度为20℃-40℃之间的常温,出风温度不宜超过30℃。
优选地,为了提高沸腾床的干燥效率,装料量不宜超过1/3,同时需要摸索装料量与干燥时间对水分含量的影响,以确定最佳组合。
优选地,干燥后固定化酶水分含量在45%左右。
西他列汀的制备
本发明还提供了一种制备西他列汀的方法,其是以本发明第一方面所述的固定化转氨酶为催化剂,催化底物西塔双酮进行转氨基反应,从而制得西他列汀。发明人意外地发现,以甲基叔丁基醚(MTBE)为溶剂,异丙胺为氨基供体能够显著提高西他列汀的转化率。
在一优选例中,本发明的制备(3R)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮(西他列汀)的方法,其包括步骤:
(1)溶解反应底物1-(3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1,3-二酮(即化合物II)于反应溶剂中
(2)在MTBE溶剂中,将本发明第一方面所述的固定化转氨酶,氨基供体,与反应底物接触,进行催化反应,制得产物(3R)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮(即化合物I)。
本发明的主要优点包括:
(a)本发明的固定化转氨酶制备方法简便,酶活损失少。
(b)本发明的固定化转氨酶用于催化制备西他列汀,可重复使用,酶的利用率高,生产成本降低。
(c)本发明用于固定的树脂可以重复回收利用,提高了资源利用率。
(d)本发明所用溶剂MTBE,沸点低,易回收,成本低。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
实施例1
转氨酶基因的表达以及酶活的测定
将转氨酶基因(序列如SEQ ID NO.:1所示)酶连pET28a,酶切位点NdeI&HindIII,将酶连好的载体,转化宿主大肠杆菌BL21感受态细胞。将构建好的菌种接种TB培养基,200rpm摇床,30℃,IPTG浓度0.1mM诱导过夜,收菌。用磷酸盐缓冲液(100mmol/L,pH7.5)重悬细胞,均质破碎,SDS-PAGE分析表达效果。将粗酶液离心得到上清液,测定酶活为150U/mL。
其中,酶活的测定方式如下:
在10mlDMSO-磷酸钠-异丙胺溶液中(DMSO浓度为50%(v/v),磷酸钠和异丙胺均为100mmol/L,pH 7.5)中加入0.1ml酶液,加入终浓度为5g/L的1-(3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1,3-二酮以及终浓度为1mmol/L的磷酸吡哆醛,50℃磁力搅拌下反应20min。取0.05mL反应液加入0.450mL乙腈,混匀,离心,取20μL用HPLC检测产物峰面积,根据峰面积计算出产物浓度,乘以10即为酶活力。
实施例2
酶的固定化
用100mmol/L磷酸盐缓冲液pH=7.5配置转氨酶溶液,浓度10-100mg/ml,加入终浓度为1mmol/L的磷酸吡哆醛,将以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)为骨架的伯胺、仲胺、叔胺、季铵树脂,以及以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)为骨架的羧酸阳离子树脂分别与实施例1获得的转氨酶按1:5(w/v)的比例投料,进行固定化反应。固定化条件为16℃,120转/分钟,搅拌16h,静置4h。收集固定化酶和滤液,分别测定固定化酶和滤液中的残余酶活。
酶活的测定方式如下:
在10mlDMSO-磷酸钠-异丙胺溶液中(DMSO浓度为50%(v/v),磷酸钠和异丙胺均为100mmol/L,pH 7.5)中加入0.1ml固定化酶滤液,或1g固定化酶,加入终浓度为5g/L的1-(3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1,3-二酮以及终浓度为1mmol/L的磷酸吡哆醛,50℃磁力搅拌下反应20min。取0.05mL反应液加入0.450mL乙腈,混匀,离心,取20μL用HPLC检测产物峰面积,根据峰面积计算出产物浓度,乘以10即为酶活力。挂载率%=(酶液酶活-固定化酶滤液残余酶活)/酶液酶活×100%。酶活回收率=固定化酶酶活/酶液酶活×100%
结果如表1所示,其中季铵盐型阴离子交换树脂的酶活最高,相应挂载率也最高。此外,与三乙基取代的季铵盐型阴离子交换树脂相比三甲基取代的季铵盐型阴离子交换树脂的酶活和挂载率更高。而羧酸阳离子树脂不能起到固定化作用。
表1:固定化酶的酶活力
实施例3
不同溶剂下固定化酶制备西他列汀
按照实施例2中的方法制备固定化酶,用三甲基取代季铵离子交换树脂进行固定化,得到的固定化酶用自来水和100mmol/L,pH 7.5的磷酸盐缓冲液洗涤去除树脂表面杂质以及吸附较弱的酶。真空抽滤后分别取样测水分,测得水分含量为70%,取1kg进一步用沸腾床干燥,沸腾床进风口温度为40℃,出风口温度为25℃,干燥时间15min,测得水分含量为40%。固定化酶的含水量测定由卡尔费休水分测定仪测定。
在100ml不同溶剂(详见表2)-中,加入终浓度为700mmol/L的异丙胺,20g三甲基取代季铵盐离子树脂制备的固定化转氨酶,终浓度为200mmol/L的1-(3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1,3-二酮,在50℃密闭搅拌下反应。反应过程中用HPLC测定转化率或反应24小时后停止反应。反应结束后用纱布进行过滤,滤渣用10mL 80%的乙醇洗涤三次,过滤,滤渣回收即得固定化酶,测定残余活性并用于下一批次反应。滤液合并,溶剂旋干,甲醇溶解后测定底物转化率。
结果如表2所示,使用MTBE为溶剂,固定化酶制备西他列汀的转化率最高。结果表明,选择极性较低的溶剂效果更好,如甲基叔丁基醚(MTBE)、甲苯、异丙醇、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯的转化率都比较好,而极性较高的甲醇的转化率只有50%。
表2:不同溶剂下固定化酶制备西他列汀
实施例4
MTBE为溶剂,检测套用批次
在100ml MTBE中加入异丙胺,终浓度为700mmol/L,加入20g三甲基取代季铵盐离子树脂制备的固定化转氨酶,加入终浓度为200mmol/L的1-(3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1,3-二酮,在50℃搅拌下反应。反应过程中用HPLC测定转化率或反应24小时后停止反应。反应结束后用纱布进行过滤,固定化酶用10mL 80%的乙醇洗涤三次,过滤,滤渣回收即得固定化酶,测定残余活性并用于下一批次反应。滤液合并,溶剂旋干,甲醇溶解后测定底物转化率。
结果如表3所示,固定化酶经多次套用后仍然具有较高的酶活,固定化酶可多次利用,极大地降低了生产成本。
表3:不同批次固定化酶催化不对称转氨转化率与残余酶活
批次 | 反应时间(h) | 转化率 | 残余酶活 | 含水量 | 补水量 |
1 | 24 | 99% | 98% | 40% | |
10 | 24 | 95% | 90% | 15% | 5g |
11 | 24 | 90% | 83% | 37% | |
20 | 24 | 81% | 68% | 10% | 6g |
21 | 24 | 80% | 65% | 36% |
注:表中批次是指固定化酶重复使用的次数,补水量指当前批次结束后向反应体系中补入的水量。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种固定化转氨酶,其特征在于,所述的固定化转氨酶含有:
组分(a):阴离子交换树脂;和
组分(b):固定于所述阴离子交换树脂上的转氨酶;
其中,所述的组分(a)通过离子交换作用吸附于所述的组分(b)上;
并且,所述的阴离子交换树脂以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)为骨架。
2.如权利要求1所述的固定化转氨酶,其特征在于,所述的阴离子交换树脂选自下组:季铵盐型阴离子交换树脂、伯胺盐型阴离子交换树脂、仲胺盐型阴离子交换树脂、和叔胺盐型阴离子交换树脂。
3.如权利要求2所述的固定化转氨酶,其特征在于,所述的季铵盐型阴离子交换树脂选自下组:三甲基取代的季铵盐型阴离子交换树脂、三乙基取代的季铵盐型阴离子交换树脂、甲基和乙基共同取代的季铵盐型阴离子交换树脂。
4.如权利要求1所述的固定化转氨酶,其特征在于,所述的组分(a)和组分(b)的重量之和占固定化转氨酶重量的30-80wt%,较佳地50-70wt%。
5.如权利要求1所述的固定化转氨酶,其特征在于,所述固定化转氨酶还含有组分(c)水。
6.一种反应体系,其特征在于,所述的反应体系包含:(a)权利要求1所述的固定化转氨酶,(b)有机溶剂,和(c)氨基供体。
7.如权利要求6所述的反应体系,其特征在于,所述的有机溶剂选自下组:甲基叔丁基醚(MTBE)、甲苯、异丙醇、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯、或其组合。
8.如权利要求6所述的反应体系,其特征在于,所述的氨基供体为异丙胺。
9.一种制备权利要求1所述的固定化转氨酶的方法,其特征在于,所述的方法包括步骤:
(i)提供包含转氨酶的第一溶液;
(ii)向所述的第一溶液中加入阴离子交换树脂,进行固定化反应,从而形成权利要求1所述的固定化转氨酶;
并且,所述的阴离子交换树脂以聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)为骨架。
10.一种制备(3R)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮的方法,其特征在于,其包括步骤:
(1)在有机溶剂中,在权利要求1所述的固定化转氨酶存在下,将1-(3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1,3-二酮与氨基供体进行转氨反应,从而形成(3R)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。
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