CN113061594B - 转氨酶突变体、固定化转氨酶及用于制备西他列汀的用途 - Google Patents

转氨酶突变体、固定化转氨酶及用于制备西他列汀的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种固定化转氨酶在制备西他列汀和/或(R)‑3‑氨基‑1‑吗啉‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)‑1‑丁酮中的用途；所述固定化转氨酶包括树脂和转氨酶突变体，所述转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.7所示。本发明还提供了一种固定化转氨酶、一种转氨酶突变体及其制备方法和用途。本发明的转氨酶突变体催化酮酰胺底物时酶活很高，将其制备成固定化转氨酶后酶活依旧很高，将其用于催化酮酰胺底物以生产西他列汀或其中间体时结合筛选好的溶剂反应体系，固定化转氨酶的转化率高且立体选择性好、稳定性好、可重复使用率提高、操作更简单，进而降低了生产成本，有利于工业化生产。

Description

转氨酶突变体、固定化转氨酶及用于制备西他列汀的用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种转氨酶突变体、固定化转氨酶，以及该固定化转氨酶在制备西他列汀或其中间体中的应用，本发明还涉及一种西他列汀的制备方法。
背景技术
糖尿病是由于胰岛素分泌改变，导致胰岛素缺乏及作用减弱，或者胰岛素活性降低，或者在两者共同影响下，出现的代谢性疾病，以高血糖为特征，并同时伴有蛋白质、糖及脂肪的代谢紊乱。糖尿病及其并发症对人类健康的危害程度居心血管疾病、肿瘤之后的第三位，成为危害人类健康的重要疾病。在糖尿病的四种类型中，II型糖尿病占90％以上，多见于30岁以上的中老年人，病因主要是由于机体对胰岛素不敏感。
西他列汀磷酸盐(Sitagliptin phosphate)是2006年FDA批准上市的第一个二肽基酶-IV(DPP-4)抑制剂，用于治疗II型糖尿病。其单用或与二甲双胍、吡格列酮合用都有明显的降血糖作用，且服用安全，耐受性好，不良反应少。
美国专利US8293507公开了Codexis公司用对节杆菌来源的转氨酶进行改造得到的转氨酶催化4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮得到西他列汀((2R)-4-氧-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-胺)，西他列汀进一步磷酸化得到西他列汀磷酸盐。经改造的转氨酶能够在2g/L酮酰胺底物，0.5M异丙胺，22℃，5％DMSO，100μM吡哆醛磷酸(PLP)和20mg/mL转氨酶多肽的条件下，将底物4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮(在本发明中简称为西他双酮)转化成西他列汀到HPLC-UV在210nm可检测的水平。其中效果最好的突变体(SEQ ID NO:110)的催化转化率可达90-95％。
US9617573继续对US8293507中SEQ ID NO:110进行改造，所获突变体能够在50g/L酮酰胺底物，1.5M异丙胺(isopropylamine)，55℃，50％DMSO(v/v)，1mM吡哆醛磷酸的条件下，以至少1.2倍于SEQ ID NO:110的活性将4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮转化成西他列汀。其中效果最好的突变体(SEQ ID NO:130)的催化转化率可达90-95％。
但是这些转氨酶突变体在100％有机溶剂中都是不稳定的，因此将液体酶进行固定，得到固定化酶，以提高转氨酶在有机溶剂中的稳定性。如US9587229公开了将US8293507中的SEQ ID NO:110固定在SEPABEADS EXE120树脂上，结果显示SEQ ID NO:110的SEPABEADS EXE120固定化酶在水饱和的IPAc(乙酸异丙酯)溶剂中，能催化100g/L的4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮的底物至西他列汀，ee值99.9％以上。但是US9587229中并没有研究固定化酶的可重复使用率(套用批次数)，且反应溶剂为水饱和的IPAc(乙酸异丙酯)溶剂，采用此溶剂用于生产时，需要事先将IPAc进行水饱和，操作更繁琐，如果用于多批次套用反应，其反应体系中含水量也不好控制，影响固定化酶的水活度，使固定化酶容易失活变性。
WO2019011236A1报道了1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮(本发明中又简称为吗啉双酮)可以经转氨酶催化制得(R)-3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮，再经多步反应制得西他列汀，但是反应中采用液体酶，含一定量的DMSO的水溶剂体系，底物浓度不高，液体酶不能重复利用，应用于生产时成本较高、效率较低。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中转氨酶的酶活不高、将其制备成固定化酶时酶活不高、稳定性差进而用于催化酮酰胺底物以生产西他列汀或其中间体时转化率高不能重复利用等缺陷，提供了一种转氨酶突变体、固定化转氨酶及其用于制备西他列汀或其中间体的用途。本发明的转氨酶突变体催化酮酰胺底物时酶活很高，将其制备成固定化转氨酶后酶活依旧很高，将其用于催化酮酰胺底物以生产西他列汀或其中间体时结合筛选好的溶剂反应体系，固定化转氨酶的转化率高且立体选择性好、稳定性好、可重复使用率提高、操作更简单，进而降低了生产成本，有利于工业化生产。
本发明人对现有技术中的转氨酶进行了大量研究，发现进行某些具体位点的突变时，转氨酶突变体的酶活大大提升。并且继续对这些转氨酶突变体进行固定化研究后，结合筛选出的特定树脂，以及筛选出特定的溶剂反应体系，使得将所得固定化酶用于催化酮酰胺底物时稳定性更高且转化率更高，将其用于西他列汀的生产时成本更低。
为了解决上述技术问题，本发明第一方面提供了一种固定化转氨酶在制备西他列汀和/或(R)-3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮中的用途；
其中，所述固定化转氨酶包括树脂和转氨酶突变体，所述转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.7所示。
较佳地，所述转氨酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.8所示。
较佳地，所述的转氨酶突变体与所述树脂通过共价键合作用连接。
较佳地，所述的树脂优选为环氧树脂，优选EC HFA、ReliZymeTMHFA403、ReliZymeTM EP113、ReliZymeTM EP403和/或EC EP，例如为EC HFA。
更佳地，所述的制备中使用的反应溶剂为异丙醇水溶液，优选所述异丙醇水溶液中水的体积含量(水占整个溶液的体积比)为2％～20％，更优选所述制备的反应体系中还包括转氨酶的辅助因子例如吡哆醛磷酸，其浓度优选为0.5～5mg/mL。
为了解决上述技术问题，本发明第二方面提供了一种固定化转氨酶，其包括树脂和转氨酶突变体，所述转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.7所示。
较佳地，所述转氨酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.8所示。
较佳地，所述的转氨酶突变体与所述树脂通过共价键合作用连接。
较佳地，所述的树脂优选为环氧树脂，优选EC HFA、ReliZymeTMHFA403、ReliZymeTM EP113、ReliZymeTM EP403和/或EC EP，例如为EC HFA。
为了解决上述技术问题，本发明第三方面提供了一种制备固定化转氨酶的方法，其包括：
1)使转氨酶突变体的溶液和树脂接触以形成固定化转氨酶，所述转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.7所示，
2)过滤和冲洗所述固定化转氨酶。
较佳地，所述转氨酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.8所示。
较佳地，所述的转氨酶突变体与所述树脂通过共价键合作用连接。
较佳地，所述的树脂优选为环氧树脂，优选EC HFA、ReliZymeTMHFA403、ReliZymeTM EP113、ReliZymeTM EP403和/或EC EP，例如为EC HFA。
为了解决上述技术问题，本发明第四方面提供了一种制备西他列汀和/或(R)-3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮的方法，其包括在氨基供体存在时，在反应溶剂中用固定化转氨酶催化酮酰胺底物得西他列汀和/或(R)-3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮的步骤；
其中，所述固定化转氨酶如本发明第二方面所述，和/或，所述反应溶剂为异丙醇水溶液。
较佳地，所述酮酰胺底物为4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮和/或1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮。
较佳地，所述氨基供体为异丙胺。
较佳地，所述氨基供体与底物的摩尔比为1:1～5:1。
较佳地，当所述反应溶剂为异丙醇水溶液时，水的体积含量(水占整个溶液的体积比)为2％～20％。
较佳地，所述酮酰胺底物的浓度为20g/L～200g/L。
较佳地，所述固定化转氨酶与底物的质量比为1:1～6:1。
较佳地，所述制备的反应体系中还包括转氨酶的辅助因子例如吡哆醛磷酸，其浓度优选为0.5～5mg/mL。
较佳地，所述反应的温度为30-60℃，优选45℃。
为了解决上述技术问题，本发明第五方面提供了一种转氨酶突变体，所述转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.7所示。
较佳地，所述转氨酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.8所示。
为了解决上述技术问题，本发明第六方面提供了一种多核苷酸，其编码如本发明第五方面所述的转氨酶突变体。
为了解决上述技术问题，本发明第七方面提供了一种重组表达载体，其包括如本发明第六方面所述的多核苷酸。
较佳地，所述重组表达载体的骨架为质粒pET28a。
为了解决上述技术问题，本发明第八方面提供了一种转化体，其为在宿主中导入如本发明第六方面所述的多核苷酸或者如本发明第七方面所述的重组表达载体。
较佳地，所述宿主为大肠杆菌；优选大肠杆菌BL21。
为了解决上述技术问题，本发明第九方面提供了一种如本发明第五方面所述的转氨酶突变体在制备西他列汀和/或(R)-3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮中的用途。
为了解决上述技术问题，本发明第十方面提供了一种反应溶剂在制备西他列汀和/或(R)-3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮中的用途，所述反应溶剂为异丙醇水溶液。
较佳地，所述用途包括在氨基供体存在时，在异丙醇水溶液中用转氨酶催化酮酰胺底物得所述西他列汀和/或(R)-3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮的步骤。
更佳地，所述转氨酶为如本发明第二方面所述的固定化转氨酶和/或如本发明第五方面所述的转氨酶突变体。
更佳地，所述酮酰胺底物为4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮和/或1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮。
更佳地，所述氨基供体为异丙胺。
更佳地，所述氨基供体与底物的摩尔比为1:1～5:1。
更佳地，当所述反应溶剂为异丙醇水溶液时，水的体积含量(水占整个溶液的体积比)为2％～20％。
更佳地，所述酮酰胺底物的浓度为20g/L～200g/L。
更佳地，所述固定化转氨酶与底物的质量比为1:1～6:1。
更佳地，所述制备的反应体系中还包括转氨酶的辅助因子例如吡哆醛磷酸，其浓度优选为0.5～5mg/mL。
更佳地，所述反应的温度为30-60℃，优选45℃。
本发明中，所述异丙醇水溶液中异丙醇的量能让底物全部溶解即可。异丙醇水溶液中水的体积含量(水占整个溶液的体积比)可以为2％～20％，水太少会让固定化酶失活，水太多则底物溶解不彻底。
本发明某一方面还提供了一种西他列汀磷酸盐的制备方法，所述制备方法包括下述步骤：
(1)按照如本发明第四方面所述的制备方法，制得西他列汀和/或(R)-3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮；
(2)将步骤(1)制得的西他列汀和/或(R)-3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮进行反应，得到西他列汀磷酸盐。
较佳地，所述西他列汀磷酸盐为西他列汀磷酸盐一水合物。
本发明中，所述“酮酰胺底物1(本发明中又简称为西他双酮)”的全称为：4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮，具体结构式如下：
本发明中，所述“酮酰胺底物2(本发明中又简称为吗啉双酮)”的全称为：1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮，具体结构式如下：
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的转氨酶突变体催化酮酰胺底物时酶活很高，将其制备成固定化转氨酶后酶活依旧很高。将其用于催化酮酰胺底物以生产西他列汀或其中间体时，结合筛选好的溶剂反应体系，固定化转氨酶的转化率高且立体选择性好、稳定性好、可重复使用率提高、操作更简单，进而降低了生产成本，有利于工业化生产。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参加J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
本发明中的氨基酸简写符号如无特殊说明均为本领域常规，具体简写符号对应的氨基酸如表1所示。
表1
所述氨基酸对应的密码子也为本领域常规，具体氨基酸与密码子的对应关系如表2所示。
表2
Pet28a购买自Novagen公司；NdeI酶、HindIII酶购买自Thermo Fisher公司，BL21感受态细胞购买自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
实施例1一种转氨酶突变体酶液的制备
合成得到SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8的核苷酸序列所示的基因，基因制备公司为苏州金唯智生物科技有限公司(苏州工业园区星湖街218号生物纳米科技园C3楼)。上述基因分别编码序列表中SEQ ID NO.1(即US8293507中的SEQ ID NO:110)、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5(即US9617573中的SEQ ID NO:130)、SEQ ID NO.7所示的转氨酶。
表3
然后合成基因酶连pET28a，酶切位点NdeI&HindIII，将酶连好的载体，转化宿主大肠杆菌BL21感受态细胞。将构建好的菌种接种TB培养基于37℃下，200rpm摇床，IPTG浓度0.1mM诱导过夜，收菌，得到含有转氨酶基因的工程菌。
将含有转氨酶基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％(v/v)接种量转接至150ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡至OD600达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，18℃诱导培养16h。培养结束后，将培养液10,000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-80℃超低温冰箱中保存，待用。
将培养结束后收集到的菌体2g，用50mM pH7.4磷酸缓冲液洗涤菌体两次，之后将菌体重悬于20mLpH7.4的磷酸缓冲液中，超声破碎，破碎液离心去除沉淀，得到的上清液为含转氨酶突变体的粗酶液。将10ml粗酶液用镍柱(博格隆上海生物技术有限公司)纯化制得纯酶液，并使蛋白浓度保持在4.5mg/mL左右。
分别以酮酰胺底物2(吗啉双酮)和酮酰胺底物1(西他双酮)为底物测定酶活，测定方法为：称取0.1g西他双酮或者吗啉双酮，加入2mL无水乙醇、6.4mL 0.1mol/L pH8.5三乙醇胺缓冲液、1.6mL 2mol/L pH8.5异丙胺盐酸盐溶液和0.003g磷酸吡哆醛(PLP)粉末，37℃摇床预热30min，加入纯酶液0.1ml，37℃控温摇床，反应30min，快速加入0.5ml 6N盐酸继续振荡30秒灭活。取样用乙腈稀释，HPLC检测，根据标准曲线计算酶液活力。不同突变体酶活检测结果如下表4所示。
HPLC方法：色谱柱：C18柱4.6×250mm，5μm；检测器：UV268nm；柱温：40℃；流速：0.8mL/min；进样量：20μL；流动相A：水∶乙腈∶甲酸∶氨水＝950∶50∶0.5∶0.5，pH应在3.60～3.80之间，如果pH达不到，10％的氨水或者10％的甲酸调整pH到3.70；也可使用甲酸铵调节pH到3.70；流动相B：水∶乙腈＝20∶80；梯度洗脱：100％A(0.01min)，60％A+40％B(20min)，60％A+40％B(40min)，100％A(50min)，100％A(60min)。
保留时间：吗啉双酮：27.828min；(R)-3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮：14.835min；
保留时间：西他双酮：34.811min；西他列汀：17.489min。
吗啉双酮对照品保留时间：27.820min；
(R)-3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮对照品保留时间：14.856min；
西他双酮对照品保留时间：34.715min；
西他列汀对照品(采购于北京盈祥科技有限公司)保留时间：17.705min。
其中，吗啉双酮底物原料和对照品(R)-3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮由本公司自行合成，合成方法参考WO2019011236A1；3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮消旋体由实验室自行合成，由吗啉双酮进行氨化和催化加氢制得。对照品(R)-3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮构型的确定：(R)-3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮可进一步反应制得(3R)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸(参考WO2019011236A1)，以采购于安徽海康药业有限责任公司(3R)-N-叔丁氧羰基-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸标准品做对照，可以确定为R构型。
构型确定的HPLC方法：
色谱柱：Daicel Chiralpak AD-H(4.6mm*250mm,5μm)；流动相：正己烷：异丙醇＝90:10；检测波长：210nm；流速：1.0ml/min；进样体积：10μl；柱温：25℃；运行时间：40min。
西他双酮底物原料由本实验室自行合成、合成方法参考CN100430397C、西他列汀消旋体由本实验室自行合成，由西他双酮进行氨化和催化加氢制得。
表4
Enz.2 Enz.2-M122F Enz.1 Enz.1-M122Q-P223T
西他双酮为底物酶活(U/mL) 439 812 512 789
吗啉双酮为底物酶活(U/mL) 57 121 75 243
由表4中可知，当以西他双酮或者吗啉双酮为底物时，Enz.2-M122F和Enz.1-M122Q-P223T的酶活均显著增加。其中，Enz.2-M122F的酶活是Enz.2的2倍左右；Enz.1-M122Q-P223T催化西他双酮时，较Enz.1的酶活增加了50％，Enz.1-M122Q-P223T催化吗啉双酮时，其酶活是Enz.1的3倍多。
实施例2固定化转氨酶突变体的制备
取12g转氨酶突变体菌泥，加120mL100mM磷酸缓冲液混匀高压均质破碎细胞、离心收集上清液酶液，加入22gK2HPO4·3H2O、2.2gKH2PO4和0.024gPLP，搅拌溶解，加入10g树脂(树脂型号具体见表5，均采购于苏州汇通色谱分离纯化有限公司)进行固定，25℃、180rpm摇床固定20～25h，抽滤，去离子洗涤，抽滤得到固定化酶。分别以吗啉双酮和西他双酮为底物进行固定化酶的酶活检测，酶活检测方法为：
称取1.2g吗啉双酮或者西他双酮底物于50mL三角瓶，加入19mL异丙醇、0.6mL16mg/mL PLP溶液和0.4mL异丙胺，45℃摇床震荡至其完全溶解，降温至37℃维持30min，称取0.5g待测固定化酶加入预热的底物中，37℃、200rpm摇床反应20min，取样用乙腈稀释，HPLC检测，根据标准品西他列汀(采购于北京盈祥科技有限公司)/标准品西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮(自行合成，合成方法见WO2019011236A1)浓度标准曲线计算产物西他列汀(以吗啉双酮为底物时计算产物为西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮)的浓度，计算固定化酶活力，结果如下表5所示。
HPLC检测方法如实施例1中的HPLC方法。
表5
根据表5中不同树脂的固定化效果，我们选取EC HFA型号树脂制备的固定化酶进行催化反应。
实施例3异丙醇体系中固定化酶(树脂：EC HFA)用于催化吗啉双酮
三角瓶中，加入25mL异丙醇，2.5g吗啉双酮，2mL水，32mgPLP，1.135mL异丙胺，10g实施例2中制得的固定化酶，45℃、200rpm摇床反应。反应24小时取样检测转化率。过滤反应液得固定化酶，继续加入25mL异丙醇，2.5g吗啉双酮，2mL水，32mgPLP，1.135mL异丙胺，45℃、200rpm摇床反应，反应24小时取样检测转化率。按照上述方法固定化酶重复套用。结果如表6所述，表中显示：固定化酶套用10批反应，Enz.1-M122Q-P233T和Enz.2-M122F的转化率仍然保持在85％以上，且ee值>99.9％，固定化酶稳定；Enz.1和Enz.2(套用3次之后效果不好)转化率较低，不适合用来催化吗啉双酮。
其中，HPLC检测转化率的方法同实施例1中HPLC方法。
保留时间：吗啉双酮：27.831min；(R)-3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮：14.811min。
手性HPLC方法检测产物ee值方法如下：
色谱柱：Daicel ChiralpakAD-H柱4.6mm×250mm，5μm；流动相：正己烷:异丙醇:二乙胺＝40:60:0.1；检测器：UV268nm；柱温：25℃；流速：0.8mL/min；进样量：10μL。保留时间：(S)-3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮：10.295min，(R)-3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮：28.091min。
消旋体对照品保留时间：10.290min和28.087min；
(R)-3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮对照品保留时间：28.093min。
表6
*：与Enz.1的转化率比较；#：与Enz.2的转化率比较；/：不适用
以上结果说明，本发明的转氨酶突变在固定化酶催化吗啉双酮的实验中，显示了比现有技术Enz.1和Enz.2用于固定化酶催化时转化率更优异的效果，且该差异有统计学意义(p值均小于0.05，其中p值的计算是用T-Test双尾实验)。
实施例4异丙醇体系中固定化酶用于催化西他双酮
三角瓶中，加入25mL异丙醇，3.75g西他双酮，2mL水，32mg的PLP，1.7mL异丙胺和10g实施例2中制得的固定化酶，45℃、200rpm摇床反应，反应24小时取样检测转化率。过滤反应液得固定化酶，继续加入25mL异丙醇，3.75g西他双酮，2mL 16mg/mL的PLP水溶液，1.7mL异丙胺，45℃、200rpm摇床反应，反应24小时取样检测转化率。按照上述方法固定化酶重复套用，结果显示固定化酶套用10批反应，转化率仍然保持在85％以上，ee值>99.9％，固定化酶比较稳定。具体套用结果见下表7。
其中，HPLC检测转化率的方法同实施例1中HPLC方法。
保留时间：西他双酮：34.827min；西他列汀：17.394min。
手性HPLC方法检测产物ee值方法如下：
色谱柱：Daicel ChiralpakAD-H柱4.6mm×250mm，5μm；流动相：正庚烷:乙醇:二乙胺＝40:60:0.1；检测器：UV268nm；柱温：25℃；流速：0.8mL/min；进样量：10μL。保留时间：(S)-对映异构体：14.181，西他列汀：17.580。
消旋体对照品保留时间：14.172min和17.702min；
西他列汀对照品保留时间：17.665min。
表7
*：与Enz.1的转化率比较；#：与Enz.2的转化率比较；/：不适用
与下述对比例1相比，结合上述实施例3的吗啉双酮催化反应，可以看出本发明的反应溶剂异丙醇比IPAc更适于用来催化西他双酮和/或吗啉双酮(标准差值低，更稳定)。
实施例5西他列汀磷酸盐一水合物的制备
待实施例4反应结束后，过滤，得到固定化酶和滤液，滤液60℃下浓缩拉干得到浓缩物。加入100mL二氯甲烷溶解，加入100mL纯化水，搅拌，用30％浓盐酸调pH至2-3之间，静置分层。水相加入100mL二氯甲烷，搅拌，加入30％氢氧化钠溶液调pH至11，静置分层。水相再次加入100mL二氯甲烷，搅拌萃取，静置分层。合并两次碱萃的有机相。60℃浓缩，浓缩物加入120mL异丙醇，搅拌溶解，加入10.6g的85％磷酸，升温至75℃，搅拌溶清，缓慢降温使西他列汀磷酸盐结晶析出，5℃保温2h，过滤，滤饼放于60℃烘干干燥，得到西他列汀磷酸盐一水合物。
对比例1固定化树脂在IPAc(乙酸异丙酯)体系下催化西他双酮
三角瓶中，加入25mL乙酸异丙酯，1.25g西他双酮，2mL 16mg/mL的PLP水溶液，0.95mL异丙胺和3.75g实施例2中制得的固定化酶，45℃、200rpm摇床反应，反应24小时取样检测转化率。过滤反应液得固定化酶，继续加入25mL乙酸异丙酯，1.25g西他双酮，2mL水，32mg的PLP，0.95mL异丙胺，45℃、200rpm摇床反应，反应24小时取样检测转化率。按照上述方法固定化酶重复套用，结果如表8所示，表中显示：固定化酶套用3批反应，固定化酶稳定性较差(即标准差值高)，转化率较低。
表8
/：不适用
对比例2固定化树脂在IPAc(乙酸异丙酯)体系下催化吗啉双酮
三角瓶中，加入25mL乙酸异丙酯，1.25g吗啉双酮，2mL水，32mg的PLP水溶液，0.95mL异丙胺和5g实施例2中制得的固定化酶，45℃、200rpm摇床反应，反应24小时取样检测转化率。过滤反应液得固定化酶，继续加入25mL乙酸异丙酯，1.25g吗啉双酮，2mL 16mg/mL的PLP水溶液，0.95mL异丙胺，45℃、200rpm摇床反应，反应24小时取样检测转化率。按照上述方法固定化酶重复套用，结果如表9所示。
表9
/：不适用
表8和9中显示：在水饱和的IPAc(乙酸异丙酯)溶剂体系中，不同固定化酶分别催化西他双酮和吗啉双酮，各套用3批反应，固定化酶稳定性较差，转化率较低，且其转化率与本发明的固定化酶的转化率有显著性差异，这说明乙酸异丙酯体系不适合该固定化酶的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海弈柯莱生物医药科技有限公司
<120> 转氨酶突变体、固定化转氨酶及用于制备西他列汀的用途
<130> P19012188C
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.1
<400> 1
Met Ala Phe Ser Ala Asp Thr Pro Glu Ile Val Tyr Thr His Asp Thr
1 5 10 15
Gly Leu Asp Tyr Ile Thr Tyr Ser Asp Tyr Glu Leu Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Leu Ala Gly Gly Ala Ala Trp Ile Glu Gly Ala Phe Val Pro Pro
35 40 45
Ser Glu Ala Arg Ile Ser Ile Phe Asp Gln Gly Phe Tyr Thr Ser Asp
50 55 60
Ala Thr Tyr Thr Thr Phe His Val Trp Asn Gly Asn Ala Phe Arg Leu
65 70 75 80
Gly Asp His Ile Glu Arg Leu Phe Ser Asn Ala Glu Ser Ile Arg Leu
85 90 95
Ile Pro Pro Leu Thr Gln Asp Glu Val Lys Glu Ile Ala Leu Glu Leu
100 105 110
Val Ala Lys Thr Glu Leu Arg Glu Ala Met Val Thr Val Thr Ile Thr
115 120 125
Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Pro Phe Glu Arg Asp Ile Thr Lys His Arg
130 135 140
Pro Gln Val Tyr Met Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Trp Ile Val Pro Phe
145 150 155 160
Asp Arg Ile Arg Asp Gly Val His Leu Met Val Ala Gln Ser Val Arg
165 170 175
Arg Thr Pro Arg Ser Ser Ile Asp Pro Gln Val Lys Asn Phe Gln Trp
180 185 190
Gly Asp Leu Ile Arg Ala Ile Gln Glu Thr His Asp Arg Gly Phe Glu
195 200 205
Leu Pro Leu Leu Leu Asp Cys Asp Asn Leu Leu Ala Glu Gly Pro Gly
210 215 220
Phe Asn Val Val Val Ile Lys Asp Gly Val Val Arg Ser Pro Gly Arg
225 230 235 240
Ala Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Lys Thr Val Leu Glu Ile Ala Glu
245 250 255
Ser Leu Gly His Glu Ala Ile Leu Ala Asp Ile Thr Pro Ala Glu Leu
260 265 270
Tyr Asp Ala Asp Glu Val Leu Gly Cys Ser Thr Gly Gly Gly Val Trp
275 280 285
Pro Phe Val Ser Val Asp Gly Asn Ser Ile Ser Asp Gly Val Pro Gly
290 295 300
Pro Val Thr Gln Ser Ile Ile Arg Arg Tyr Trp Glu Leu Asn Val Glu
305 310 315 320
Pro Ser Ser Leu Leu Thr Pro Val Gln Tyr
325 330
<210> 2
<211> 1035
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.1
<400> 2
atgggcagca gccatcacca tcatcaccac agccaggatc cgatggcatt ctcagcagac 60
acgccggaaa ttgtttacac ccacgatacg ggcctggact acattaccta cagcgactac 120
gaactggacc cggcaaaccc gctggctggc ggtgcagcat ggattgaggg tgcgtttgtg 180
ccgccgagtg aagcccgtat ttccatcttt gatcagggtt tctatacgtc tgacgcaacc 240
tacaccacgt ttcatgtttg gaacggtaat gctttccgtc tgggcgacca cattgaacgc 300
ctgttcagca atgcagaatc tattcgcctg atcccgccgc tgacgcaaga tgaagtcaaa 360
gaaatcgcgc tggaactggt ggccaagacc gaactgcgtg aagccatggt caccgtgacg 420
attacccgcg gctatagctc tacgccgttt gaacgtgata tcaccaaaca tcgcccgcag 480
gtgtatatga gtgcgtgccc gtaccaatgg attgttccgt tcgatcgtat ccgcgacggt 540
gtgcacctga tggttgcaca gagcgtccgt cgcaccccgc gtagttccat tgatccgcag 600
gtgaagaact ttcaatgggg cgacctgatt cgtgcaatcc aagaaaccca tgatcgcggt 660
ttcgaactgc cgctgctgct ggattgtgac aacctgctgg ctgaaggtcc gggctttaat 720
gtggttgtca tcaaagatgg tgtggttcgt agcccgggtc gtgcagctct gccgggtatt 780
acgcgcaaga ccgttctgga aatcgcggaa tctctgggcc acgaagcgat tctggccgat 840
atcacgccgg cagaactgta cgatgctgac gaagttctgg gttgctcaac cggcggtggc 900
gtctggccgt tcgtttcggt cgatggtaat tcaatttcgg acggtgtgcc gggtccggtt 960
acccagagca ttatccgtcg ttactgggaa ctgaatgtgg aaccgtcgtc gctgctgacc 1020
ccggtgcaat actga 1035
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<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 3
Met Ala Phe Ser Ala Asp Thr Pro Glu Ile Val Tyr Thr His Asp Thr
1 5 10 15
Gly Leu Asp Tyr Ile Thr Tyr Ser Asp Tyr Glu Leu Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Leu Ala Gly Gly Ala Ala Trp Ile Glu Gly Ala Phe Val Pro Pro
35 40 45
Ser Glu Ala Arg Ile Ser Ile Phe Asp Gln Gly Phe Tyr Thr Ser Asp
50 55 60
Ala Thr Tyr Thr Thr Phe His Val Trp Asn Gly Asn Ala Phe Arg Leu
65 70 75 80
Gly Asp His Ile Glu Arg Leu Phe Ser Asn Ala Glu Ser Ile Arg Leu
85 90 95
Ile Pro Pro Leu Thr Gln Asp Glu Val Lys Glu Ile Ala Leu Glu Leu
100 105 110
Val Ala Lys Thr Glu Leu Arg Glu Ala Gln Val Thr Val Thr Ile Thr
115 120 125
Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Pro Phe Glu Arg Asp Ile Thr Lys His Arg
130 135 140
Pro Gln Val Tyr Met Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Trp Ile Val Pro Phe
145 150 155 160
Asp Arg Ile Arg Asp Gly Val His Leu Met Val Ala Gln Ser Val Arg
165 170 175
Arg Thr Pro Arg Ser Ser Ile Asp Pro Gln Val Lys Asn Phe Gln Trp
180 185 190
Gly Asp Leu Ile Arg Ala Ile Gln Glu Thr His Asp Arg Gly Phe Glu
195 200 205
Leu Pro Leu Leu Leu Asp Cys Asp Asn Leu Leu Ala Glu Gly Thr Gly
210 215 220
Phe Asn Val Val Val Ile Lys Asp Gly Val Val Arg Ser Pro Gly Arg
225 230 235 240
Ala Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Lys Thr Val Leu Glu Ile Ala Glu
245 250 255
Ser Leu Gly His Glu Ala Ile Leu Ala Asp Ile Thr Pro Ala Glu Leu
260 265 270
Tyr Asp Ala Asp Glu Val Leu Gly Cys Ser Thr Gly Gly Gly Val Trp
275 280 285
Pro Phe Val Ser Val Asp Gly Asn Ser Ile Ser Asp Gly Val Pro Gly
290 295 300
Pro Val Thr Gln Ser Ile Ile Arg Arg Tyr Trp Glu Leu Asn Val Glu
305 310 315 320
Pro Ser Ser Leu Leu Thr Pro Val Gln Tyr
325 330
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gaaggtcctg gctttaacgt ggtggtgatc aaagacggcg ttgttcgcag tccgggtcgt 780
gcagccttac cgggtatcac ccgcaaaacc gtgctggaaa tcgccgaaag cctgggccac 840
gaggccatcc tggccgatat tacccctgcc gaactgtacg atgccgatga ggtgctgggt 900
tgcagcaccg gtggtggtgt gtggccgttc gtgagcgtgg atggtaacag cattagcgat 960
ggtgtgccgg gtccggtgac ccagagcatc attcgtcgct attgggagct gaacgtggaa 1020
ccgagtagtc tgctgacccc ggtgcagtat taa 1053
<210> 7
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.2-M122F
<400> 7
Met Ala Phe Ser Ala Asp Thr Pro Glu Ile Val Tyr Thr His Asp Thr
1 5 10 15
Gly Leu Asp Tyr Ile Thr Tyr Ser Asp Tyr Glu Leu Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Leu Ala Gly Gly Ala Ala Trp Ile Gly Gly Ala Phe Val Pro Pro
35 40 45
Ser Glu Ala Arg Ile Pro Ile Phe Asp Gln Gly Phe Tyr Thr Ser Asp
50 55 60
Ala Thr Tyr Thr Thr Phe His Val Trp Asn Gly Asn Ala Phe Arg Leu
65 70 75 80
Gly Asp His Ile Glu Arg Leu Phe Ser Asn Ala Glu Ser Ile Arg Leu
85 90 95
Ile Pro Pro Leu Thr Gln Asp Glu Val Lys Glu Ile Ala Leu Glu Leu
100 105 110
Val Ala Lys Thr Glu Leu Arg Glu Ala Phe Val Thr Val Thr Ile Thr
115 120 125
Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Pro Phe Glu Arg Asp Ile Thr Lys His Arg
130 135 140
Pro Gln Val Tyr Met Phe Ala Ser Pro Tyr Leu Gln Ile Val Pro Phe
145 150 155 160
Asp Arg Ile Arg Asp Gly Val His Leu Met Val Ala Gln Ser Val Arg
165 170 175
Arg Thr Pro Arg Ser Ser Ile Asp Pro Gln Val Lys Asn Phe Gln Trp
180 185 190
Gly Asp Leu Ile Arg Ala Ile Gln Glu Thr His Asp Arg Gly Phe Glu
195 200 205
Leu Pro Leu Leu Leu Asp Gly Asp Asn Leu Leu Ala Glu Gly Pro Gly
210 215 220
Phe Asn Val Val Val Ile Lys Asp Gly Val Val Arg Ser Pro Gly Arg
225 230 235 240
Ala Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Lys Thr Val Leu Glu Ile Ala Glu
245 250 255
Ser Leu Gly His Glu Ala Ile Leu Ala Asp Ile Thr Pro Ala Glu Leu
260 265 270
Tyr Asp Ala Asp Glu Val Leu Gly Cys Ser Thr Gly Gly Gly Val Trp
275 280 285
Pro Phe Val Ser Val Asp Gly Asn Ser Ile Ser Asp Gly Val Pro Gly
290 295 300
Pro Val Thr Gln Ser Ile Ile Arg Arg Tyr Trp Glu Leu Asn Val Glu
305 310 315 320
Pro Ser Ser Leu Leu Thr Pro Val Gln Tyr
325 330
<210> 8
<211> 993
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Enz.2-M122F
<400> 8
atggcattta gcgccgatac cccggaaatt gtgtacaccc acgacaccgg cctggattac 60
atcacctata gcgactacga actggatcct gccaacccgt tagcaggcgg tgccgcatgg 120
atcggcggtg catttgtgcc tccgagcgaa gcccgcatcc cgatctttga ccagggcttt 180
tacaccagcg acgccaccta taccaccttc catgtgtgga acggtaacgc ctttcgcctg 240
ggtgatcata tcgagcgcct gtttagcaac gccgaaagca ttcgcctgat tccgccgtta 300
acccaggatg aggtgaaaga gatcgccctg gaactggtgg ccaaaacaga actgcgcgaa 360
gccttcgtta ccgttacaat tacacgcggc tatagcagca ccccgtttga acgtgacatc 420
accaaacacc gcccgcaggt gtacatgttt gcaagtccgt acctgcagat cgtgccgttt 480
gaccgcatcc gcgatggtgt tcatctgatg gttgcccaga gtgtgcgccg tacaccgcgc 540
agcagcattg acccgcaggt taagaacttc cagtggggcg acctgattcg cgcaatccag 600
gaaacccacg atcgcggttt tgagctgccg ctgctgctgg atggtgacaa tctgctggcc 660
gaaggtcctg gctttaacgt ggtggtgatc aaagacggcg ttgttcgcag tccgggtcgt 720
gcagccttac cgggtatcac ccgcaaaacc gtgctggaaa tcgccgaaag cctgggccac 780
gaggccatcc tggccgatat tacccctgcc gaactgtacg atgccgatga ggtgctgggt 840
tgcagcaccg gtggtggtgt gtggccgttc gtgagcgtgg atggtaacag cattagcgat 900
ggtgtgccgg gtccggtgac ccagagcatc attcgtcgct attgggagct gaacgtggaa 960
ccgagtagtc tgctgacccc ggtgcagtat taa 993

Claims (26)

1.一种固定化转氨酶在制备西他列汀和/或(R)-3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮中的用途；
其中，所述固定化转氨酶包括树脂和转氨酶突变体，所述转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.7所示。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述转氨酶突变体的核苷酸序列如SEQ IDNO.4或SEQ ID NO.8所示；和/或，所述的转氨酶突变体与所述树脂通过共价键合作用连接；和/或，所述的树脂为环氧树脂。
3. 如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述树脂为SEPABEADS®EC HFA、ReliZymeTMHFA403、ReliZymeTM EP113、ReliZymeTM EP403和/或SEPABEADS®EC EP。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的制备中使用的反应溶剂为异丙醇水溶液；和/或，所述制备的反应体系还包括转氨酶的辅助因子为吡哆醛磷酸。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述异丙醇水溶液中水的体积含量为2%~20%；和/或，所述吡哆醛磷酸的浓度为0.5~5mg/mL。
6. 一种固定化转氨酶，其特征在于，其包括树脂和转氨酶突变体，所述转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.7所示。
7. 如权利要求6所述的固定化转氨酶，其特征在于，所述转氨酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.8所示；和/或，所述的转氨酶突变体与所述树脂通过共价键合作用连接；和/或，所述的树脂为环氧树脂。
8. 如权利要求7所述的固定化转氨酶，其特征在于，所述树脂为SEPABEADS®EC HFA、ReliZymeTM HFA403、ReliZymeTM EP113、ReliZymeTM EP403和/或SEPABEADS®EC EP。
9.一种制备固定化转氨酶的方法，其特征在于，所述方法包括：
1）使转氨酶突变体的溶液和树脂接触以形成固定化转氨酶，所述转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.7所示；
2）过滤和冲洗所述固定化转氨酶。
10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述转氨酶突变体的核苷酸序列如SEQ IDNO.4或SEQ ID NO.8所示；和/或，所述的转氨酶突变体与所述树脂通过共价键合作用连接；和/或，所述的树脂为环氧树脂。
11. 如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述树脂为SEPABEADS®EC HFA、ReliZymeTM HFA403、ReliZymeTM EP113、ReliZymeTM EP403和/或SEPABEADS®EC EP。
12. 一种制备西他列汀和/或(R)-3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基) -1-丁酮的方法，其特征在于，所述方法包括在氨基供体存在时，在反应溶剂中用固定化转氨酶催化酮酰胺底物得西他列汀和/或(R)-3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基) -1-丁酮的步骤；
其中，所述固定化转氨酶如权利要求6~8中任一项所述。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述反应溶剂为异丙醇水溶液。
14. 如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述酮酰胺底物为4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮和/或1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基) -1,3-丁二酮；
和/或，所述氨基供体为异丙胺；
和/或，所述氨基供体与底物的摩尔比为1:1~5:1；
和/或，当所述反应溶剂为异丙醇水溶液时，水的体积含量为2%~20%；
和/或，所述酮酰胺底物的浓度为20g/L~200g/L；
和/或，所述固定化转氨酶与底物的质量比为1:1~6:1；
和/或，所述制备的反应体系中还包括转氨酶的辅助因子为吡哆醛磷酸；
和/或，所述反应的温度为30-60℃。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述吡哆醛磷酸的浓度为0.5~5mg/mL；和/或，所述反应的温度为45℃。
16. 一种转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.7所示。
17. 如权利要求16所述的转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.8所示。
18.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求16或17所述的转氨酶突变体。
19.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括如权利要求18所述的多核苷酸。
20.如权利要求19所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的骨架为质粒pET28a。
21.一种转化体，其特征在于，所述转化体为在宿主中导入如权利要求17所述的多核苷酸或者如权利要求19或20所述的重组表达载体。
22.如权利要求21所述的转化体，其特征在于，所述宿主为大肠杆菌。
23.如权利要求22所述的转化体，其特征在于，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21。
24. 一种如权利要求16或17所述的转氨酶突变体在制备西他列汀和/或(R)-3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基) -1-丁酮中的用途。
25.一种西他列汀磷酸盐的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括下述步骤：
（1）按照权利要求12~14中任一项所述的方法，制得西他列汀和/或(R)-3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基) -1-丁酮；
（2）将步骤（1）制得的西他列汀和/或(R)-3-氨基-1-吗啉-4-(2,4,5-三氟苯基) -1-丁酮进行反应，得到西他列汀磷酸盐。
26.如权利要求25所述的制备方法，其特征在于，所述西他列汀磷酸盐为西他列汀磷酸盐一水合物。
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