CN104774830A - 一种转氨酶的固定化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种转氨酶的固定化方法。将聚乙烯醇海绵上的羟基氧化为羰基，加入转氨酶将羰基转化为氨基，絮凝后，再用多元醛交联固定化，得固定化转氨酶。该固定化方法，具有酶活单位为高，可纯化酶等优点。

Description

一种转氨酶的固定化方法
技术领域
本发明涉及一种转氨酶的固定化方法。
背景技术
转氨酶可将化合物中的羰基转化为氨基。可以高效生产手性胺，因其底物相对廉价、产物纯度高、反应条件温和的特点，应用价值巨大。
固定化酶易于与产品分离并可回收重复使用，比游离酶具有更好的稳定性以及更长的操作周期。酶或细胞的固定化方法很多，如物理吸附、亲和联结、共价交联、凝絮包埋等。
CN201280031237使用树脂为载体固定转氨酶，但以树脂为载体，存在树脂价格昂贵，载酶量低的缺点。以该专利实施例1～5为例，1克树脂载体仅能固载0.125克转氨酶，固定化转氨酶酶活单位低；且现有固定化方法无纯化过程，会将游离酶中的杂质蛋白也固定于载体。
聚乙烯醇海绵是由聚乙烯醇缩醛化而得，具有优异的吸水和力学性能，比表面积大，有作为转氨酶固定化载体的潜质，但聚乙烯醇海绵仅含有羟基活性基团，不利于采用化学键固定转氨酶。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种经济可行的，载酶量高、固定化酶酶活高、有纯化作用的转氨酶的固定化方法。
本发明提供了一种转氨酶的固定化方法，其特征包括如下步骤：
a、氧化：取聚乙烯醇海绵，在双氧水溶液中，加入铁盐为催化剂，将聚乙烯醇海绵上部分羟基氧化为羰基；氧化后的聚乙烯醇海绵离心或挤压去除氧化溶液，加水，再离心或挤压脱水。
b、转氨：将脱水海绵与转氨酶水溶液混合，加入辅酶、氨基供体，将海绵上的羰基转化氨基；再离心或挤压去除海绵中溶液。
c、交联固定：加入絮凝剂使酶沉淀于海绵孔壁内，再离心或挤压去除海绵中溶液；再将海绵与多元醛混合交联转氨酶，离心或挤压去除海绵中溶液。
d、视需要重复步骤b至c数次，以增加酶或细胞在载体上的载量。水洗涤固定化酶。
其中，a步骤所述的双氧水溶液体积浓度为0.01～0.1％，双氧水溶液与聚乙烯醇海绵重量比为20～100:1。
其中，a步骤所述的铁盐选自硫酸亚铁、硫酸铁、氯化亚铁、氯化铁的一种或多种。
其中，a步骤所述的氧化反应温度为20℃～70℃，进一步优选为55℃～65℃。
其中，b步骤所述的氨基供体为2-丙胺。
其中，b步骤所述的辅酶为B族维生素，进一步优选为吡哆醛、吡哆胺、磷酸吡哆醇、磷酸吡哆胺、磷酸吡哆醛的一种或多种。
其中，b步骤所述的转氨反应温度为20℃～60℃。
其中，c步骤所述的絮凝剂选自壳聚糖、聚乙烯亚胺(PEI)、羧甲基聚乙烯亚胺(CMPEI)。
其中，c步骤所述的多元醛为戊二醛。
本发明的有益技术效果：
1、使用聚乙烯醇海绵为载体，聚乙烯醇海绵具有孔洞丰富，比较面积大，载酶量大的特点；2、聚乙烯醇海绵中部分羟基氧化为羰基，羰基经转氨酶转化为氨基，氨基通过戊二醛与转氨酶化学交联，化学键连接酶与载体更牢固，酶不易脱落，稳定性好；3、转氨过程中，转氨酶进入海绵孔洞，催化海绵上的羰基转化为氨基，从而转氨酶“富集”于海绵中，加入絮凝剂，转氨酶则沉淀于海绵孔壁内，其他杂质则无该“富集”现象，杂质在“离心或挤压去除海绵中溶液”步骤中随溶液被除去，本发明对转氨酶有纯化作用，可在固定化酶应用过程中消除部分杂酶引起的副反应。
具体实施方式
实施例1
本实施例的转氨酶的固定化方法，包括如下步骤：
a、将聚乙烯醇海绵切成27mm3，取10.0克海绵颗粒加入烧杯中，加入1000ml水，机械搅拌，加入0.010g硫酸亚铁，加入1.00ml 30％双氧水，升温至60℃，反应4小时。将反应液倒入布袋中，将布袋中的海绵颗粒挤压干，在将布袋浸泡于纯化水中5分钟，再将布袋中的海绵颗粒挤压干脱水，得氧化聚乙烯醇海绵。
b、将氧化聚乙烯醇海绵，加入烧杯中，加入1000ml水，机械搅拌，加入10克ATA-113转氨酶加入1克异丙胺盐酸盐，加入0.50克磷酸吡哆醛，用异丙胺调节pH至7.5,加热至40℃反应6小时，将反应液倒入布袋中，将布袋中的海绵颗粒挤压干，得氨基化聚乙烯醇海绵。
c、将氨基化聚乙烯醇海绵倒入烧杯中，加入0.1％壳聚糖溶液100ml，混合10分钟，将反应液倒入布袋中，将布袋中的海绵颗粒挤压干；将所得海绵倒入烧杯中，加入0.1％戊二醛溶液100ml，混合，静置5分钟，将反应液倒入布袋中，将布袋中的海绵颗粒挤压干，得固定化酶。
将所得固定化酶重复步骤b至c5次，以增加酶在载体上的载量。
纯化水浸泡固定化酶，挤压脱水，40℃真空干燥8小时，得31.7克固定化转氨酶。
每1克聚乙烯醇海绵载体固载约2克转氨酶，远远优于CN2012800312371克树脂载体仅能固载0.125克转氨酶的水平；酶活收率高达96％，说明未固载损失的重量为去除的杂质的重量。
实施例2
本实施例的转氨酶的固定化方法，包括如下步骤：
a、将聚乙烯醇海绵切成27mm3。2000升反应釜中，加入1000升水，开启搅拌，加入10.00千克海绵颗粒，加入加入10克硫酸亚铁，加入1.00升30％双氧水，升温至55℃，反应5小时。将反应液使用三足式离心机过滤，加入纯化水洗涤，离心脱水，得氧化聚乙烯醇海绵。
b、2000升反应釜中，加入1000升水，开启搅拌，加入氧化聚乙烯醇海绵，加入20千克ATA-117转氨酶加入2.00千克异丙胺盐酸盐，加入0.75千克磷酸吡哆醛，用异丙胺调节pH至8.0,加热至37℃反应8小时，将反应液离心过滤，脱除溶液，得氨基化聚乙烯醇海绵。
c、将氨基化聚乙烯醇海绵倒入100升0.3％壳聚糖溶液中，混合10分钟，将混合液离心过滤，脱除溶液；将所得海绵倒入烧杯中，加入100升0.2％戊二醛溶液中，混合，静置10分钟，将将混合液离心过滤，脱除溶液，得固定化酶。
将所得固定化酶重复步骤b至c3次，以增加酶在载体上的载量。
纯化水洗涤，离心脱水，40℃真空干燥12小时，得35.32千克固定化转氨酶。
实施例3
本实施例的转氨酶的固定化方法，包括如下步骤：
a、将聚乙烯醇海绵切成27mm3。2000升反应釜中，加入1000升水，开启搅拌，加入10.00千克海绵颗粒，加入加入10克氯化铁和5千克氯化亚铁，加入4.00升10％双氧水，升温至60℃，反应5小时。将反应液使用三足式离心机过滤，加入纯化水洗涤，离心脱水，得氧化聚乙烯醇海绵。
b、2000升反应釜中，加入1000升水，开启搅拌，加入氧化聚乙烯醇海绵，加入5千克ATA-117转氨酶加入2.00千克异丙胺盐酸盐，加入0.5千克磷酸吡哆醇和0.5千克磷酸吡哆胺，用异丙胺调节pH至8.0,加热至30℃反应8小时，将反应液离心过滤，脱除溶液，得氨基化聚乙烯醇海绵。
c、将氨基化聚乙烯醇海绵倒入100升0.4％聚乙烯亚胺溶液中，混合10分钟，将混合液离心过滤，脱除溶液；将所得海绵倒入烧杯中，加入100升0.3％戊二醛溶液中，混合，静置8分钟，将将混合液离心过滤，脱除溶液，得固定化酶。
将所得固定化酶重复步骤b至c 12次，以增加酶在载体上的载量。
纯化水洗涤，离心脱水，40℃真空干燥14小时，得35.87千克固定化转氨酶。

Claims (10)

1.一种转氨酶的固定化方法，其特征包括如下步骤：
a、氧化：取聚乙烯醇海绵，在双氧水溶液中，加入铁盐为催化剂，20℃～70℃反应,将聚乙烯醇海绵上部分羟基氧化为羰基；氧化后的聚乙烯醇海绵离心或挤压去除氧化溶液，加水，再离心或挤压脱水；
b、转氨：将脱水海绵与转氨酶水溶液混合，加入辅酶、氨基供体，将海绵上的羰基转化氨基；再离心或挤压去除海绵中溶液；
c、交联固定：加入絮凝剂使酶沉淀于海绵孔壁内，再离心或挤压去除海绵中溶液；再将海绵与多元醛混合交联转氨酶，离心或挤压去除海绵中溶液；
d、视需要重复步骤b至c步0～20次，以增加酶或细胞在载体上的载量，水洗涤固定化酶。
2.根据权利要求1所述固定化方法，其特征在于：a步骤所述的双氧水溶液体积浓度为0.01～0.1％，双氧水溶液与聚乙烯醇海绵重量比为20～100:1。
3.根据权利要求1所述固定化方法，其特征在于：a步骤所述的铁盐为硫酸亚铁、硫酸铁、氯化亚铁、氯化铁中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述固定化方法，其特征在于：a步骤所述反应温度为55℃～65℃。
5.根据权利要求1所述固定化方法，其特征在于：b步骤所述的氨基供体为2-丙胺。
6.根据权利要求1所述固定化方法，其特征在于：b步骤所述的辅酶为B族维生素。
7.根据权利要求6所述固定化方法，其特征在于：b步骤所述的B族维生素为吡哆醛、吡哆胺、磷酸吡哆醇、磷酸吡哆胺、磷酸吡哆醛中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述固定化方法，其特征在于：b步骤所述的转氨反应温度为20℃～60℃。
9.根据权利要求1所述固定化方法，其特征在于：c步骤所述的絮凝剂选自壳聚糖、聚乙烯亚胺、羧甲基聚乙烯亚胺中的一种或多种。
10.根据权利要求1所述固定化方法，其特征在于：c步骤所述的多元醛为戊二醛。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105062982A (zh) * 2015-07-29 2015-11-18 江南大学 一种以废弃海绵为载体的固定化芽胞漆酶及其制备方法
CN105063010A (zh) * 2015-07-03 2015-11-18 厦门大学 一种聚乙烯亚胺金属配位固定化的多酶体系及其制备方法
CN108866035A (zh) * 2018-07-18 2018-11-23 兰州大学 三维蜜胺海绵络合Fe3+用于酶的固定的方法
CN109251925A (zh) * 2017-07-14 2019-01-22 上海蓝木化工有限公司 一种离子交换树脂固定化转氨酶的制备及其应用
CN110129306A (zh) * 2018-02-08 2019-08-16 广东东阳光药业有限公司 固定化转氨酶及其应用
CN111235140A (zh) * 2020-04-29 2020-06-05 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 固定化酶、其制备方法及其应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1982445A (zh) * 2005-12-16 2007-06-20 百瑞全球有限公司 用于制备固定化酶或固定化细胞的载体以及使用该载体的固定化方法
CN101544971A (zh) * 2009-05-08 2009-09-30 周鑫 一种功能性的固定化载体及其制备方法
CN103450375A (zh) * 2013-07-30 2013-12-18 四川大学 一种氧化聚乙烯醇及其固相改性方法
CN103949116A (zh) * 2014-04-25 2014-07-30 宁波桑尼新材料科技有限公司 一种能够作为微生物载体的凝胶复合过滤绵及制备方法
CN104293763A (zh) * 2014-08-28 2015-01-21 四川大学 脂肪酶固定化载体及其固定脂肪酶的方法
CN104328094A (zh) * 2013-11-26 2015-02-04 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 转氨酶及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1982445A (zh) * 2005-12-16 2007-06-20 百瑞全球有限公司 用于制备固定化酶或固定化细胞的载体以及使用该载体的固定化方法
CN101544971A (zh) * 2009-05-08 2009-09-30 周鑫 一种功能性的固定化载体及其制备方法
CN103450375A (zh) * 2013-07-30 2013-12-18 四川大学 一种氧化聚乙烯醇及其固相改性方法
CN104328094A (zh) * 2013-11-26 2015-02-04 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 转氨酶及其应用
CN103949116A (zh) * 2014-04-25 2014-07-30 宁波桑尼新材料科技有限公司 一种能够作为微生物载体的凝胶复合过滤绵及制备方法
CN104293763A (zh) * 2014-08-28 2015-01-21 四川大学 脂肪酶固定化载体及其固定脂肪酶的方法

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105063010A (zh) * 2015-07-03 2015-11-18 厦门大学 一种聚乙烯亚胺金属配位固定化的多酶体系及其制备方法
CN105062982A (zh) * 2015-07-29 2015-11-18 江南大学 一种以废弃海绵为载体的固定化芽胞漆酶及其制备方法
CN105062982B (zh) * 2015-07-29 2018-10-30 江南大学 一种以废弃海绵为载体的固定化芽胞漆酶及其制备方法
CN109251925A (zh) * 2017-07-14 2019-01-22 上海蓝木化工有限公司 一种离子交换树脂固定化转氨酶的制备及其应用
CN110129306A (zh) * 2018-02-08 2019-08-16 广东东阳光药业有限公司 固定化转氨酶及其应用
CN108866035A (zh) * 2018-07-18 2018-11-23 兰州大学 三维蜜胺海绵络合Fe3+用于酶的固定的方法
CN111235140A (zh) * 2020-04-29 2020-06-05 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 固定化酶、其制备方法及其应用

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