CN108866035A - 三维蜜胺海绵络合Fe3+用于酶的固定的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种三维蜜胺海绵络合Fe³⁺用于酶的固定的方法。本方法以廉价的市售的蜜胺海绵作为载体，通过海绵上固有的伯胺与直接与Fe³⁺络合从而固定酶。这种新型酶载体优点在于它安全简单快速并且无污染，将酶进行固定后，酶活性和稳定性大大提高，海绵具有弹性，镊子挤压就能分离和实现重复使用。固定化酶应用于染料行业降解去除染料废水的脱色，是一种环境友好型的高效催化剂，并且，在复杂生物样品的前处理和医学领域有着广泛的应用于前景。

Description

三维蜜胺海绵络合Fe3+用于酶的固定的方法

技术领域

本发明涉及一种固定酶的新型整体材料，属功能材料制备技术领域。

背景技术

对于现代工业来说，游离酶不是一种理想的催化剂。游离酶存活的温度、pH值范围都比较窄，酶容易变性和失活。对热、酸、碱、有机溶剂均不稳定在催化反应方面有难以克服的缺点：（1）容易发生微生物降解或聚集而失活；（2）在均相催化体系中，酶难以与产物分离，导致产物不纯，影响产物质量；（3）不能实现连续操作。（4）游离酶不易回收，难以重复使用，成本昂贵。为了克服游离酶的缺点，人们探索将水溶性酶进行固定，使之保留酶的催化活性，提高它的稳定性。固定后的酶容易分离固液分离，实现酶的重复使用。蜜胺海绵是一种具有三维网状结构的环保型市售海绵材料，该海绵具有优良的稳定性、吸声性、隔热性、弹性以及无毒性，所以通常这种海绵被用作管道系统的绝缘隔音隔热和用于厨房的清洁物件。根据海绵具有的特性，本发明应用蜜胺海绵上固有的伯胺与Fe³⁺络合来固定酶。

发明内容

鉴于蜜胺海绵具有的特性，本发明的目的在于提供一种三维蜜胺海绵络合Fe³⁺用于酶的固定的方法，利用蜜胺海绵上固有的伯胺与Fe³⁺络合固定酶。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

一种三维蜜胺海绵络合Fe³⁺用于酶的固定的方法，其步骤是：

a材料（MS@Fe³⁺）的制备

市场购买的蜜胺海绵不经过任何处理，直接用打孔器打出孔径为d=1.2cm，厚度h=1cm的圆柱状，保证海绵的的质量为10mg，将称好的海绵放到的FeCl₃溶液中浸泡10min后，用镊子取出来挤压数次，用滤纸将海绵中的水吸干，在60℃真空干燥箱里干燥12h，就得到了络合了Fe³⁺的材料（MS@Fe³⁺）；

a.酶的固定

纯化酶，称取漆酶溶于水中，在4℃下，在转速为12000 rpm冷冻离心机离心15 min，取上清液冻干，放在4℃备用；称取纯化的漆酶溶于20ml、 pH=2-9,50 mM、50 mM的磷酸的缓冲液中，取缓冲液20ml，加入步骤a得到了络合材料（MS@Fe³⁺），并在摇床中25℃下过夜，酶的上载量通过Beford法检测为每毫克固体颗粒能够固定180微克的漆酶，镊子挤压回收该固定化酶，并用pH=4，50 mM磷酸的缓冲液洗涤材料数次,以除去材料上物理吸附的酶和溶液中未固定的游离酶。

上述的固定酶的方法同样适用于脂肪酶和胰蛋白酶。

本发明的优点和产生的有益效果：

本发明将廉价易得、稳定性良好的环保型蜜胺海绵作为新型酶载体用于漆酶的固定，本方法对海绵的修饰不采用传统的涂覆、接枝或原位生长，而是直接利用海绵上现有的伯胺与Fe³⁺的络合作用，不需要过多修饰，从而固定漆酶，本方法具有的优点是：（1）非常简便快速，只需浸泡10min就能完成对海绵的修饰；（2）绿色环保，不需要有机溶剂的参与；（3）静电作用对酶的构象影响小；（4）最大程度地保留海绵的框架和弹性使得海绵作为整体材料，具有完整的三维结构和高弹性，回收简便。该材料同样适用于胰蛋白酶和脂肪酶的固定，说明该材料对酶的固定具有普适性。这种三维蜜胺海绵络合Fe³⁺用于酶的固定形成的3D酶反应器相当于无数层膜的组合，像膜一样用于样品前处理、废水处理、有机催化等领域。

附图说明

图1为本发明所合成的MS@Fe³⁺材料并用于漆酶固定的示意图。

图2为本发明中MS、MS@Fe³⁺、MS@Fe³⁺@Laccase的红外谱图。

图3为本发明中，（a）为MS、MS@Fe³⁺、MS@Fe³⁺@Laccase的XPS全谱；（b）为MS、MS@Fe³⁺、MS@Fe³⁺@Laccase的XPS的Fe的精细谱。

图4为本发明中游离酶和固定化酶的动力学曲线和动力学常数。

图5为本发明中游离酶和该固定化酶在不同pH相对酶活。

图6为本发明中游离酶和该固定化酶在60℃下孵化不同时间的相对酶活。

图7为本发明中游离酶和该固定化酶在室温下放置不同时间的相对酶活。

图8为本发明中固定化酶的重复使用性。

图9 为刚果红（a）和孔雀石绿（b）降解前后的紫外对比图。

图10为 10mg的固定化漆酶对不同体积的0.5mM 的的降解率。

具体实施方式

下面结合附图和实施例及实验例对本发明技术方案再做进一步说明：

实施例1

市场购买的蜜胺海绵不经过任何处理，直接用打打出孔径为d=1.2cm，厚度h=1cm的圆柱状，保证海绵的的质量为10mg( ±0.5mg)，将称好的海绵放到浓度80mM的FeCl₃溶液中浸泡10min后，用镊子取出来挤压5-6次，用滤纸将海绵中的水吸干，在真空干燥箱里60℃干燥12h，就得到了络合了Fe³⁺的材料（MS@Fe³⁺）。接着纯化漆酶，称取300mg漆酶溶于水，在冷冻离心机4℃下，转速为12000 rpm离心15 min，取上清液冻干，放在4℃备用。称取冻干的100mg的纯化的漆酶溶于100ml、pH=4,50mM磷酸的缓冲液中，取缓冲液20ml,加入100mg的材料（MS@Fe³⁺），并在摇床中25℃下过夜。漆酶的上载量通过Beford法检测为每毫克固体能够固定180微克的漆酶，镊子挤压回收该固定化酶，并用pH=4,50 mM磷酸的缓冲液洗涤材料3-4次,以除去材料上物理吸附的酶和溶液中未固定的游离酶。

从图2为红外谱图来看，当修饰Fe³⁺后，材料的红外吸收并没有什么明显的变化，只有峰位有非常轻微的位移，这是由于Fe³⁺与海绵的络合造成的；固定酶后，发现材料上多了许多新的峰，其中2421cm^-1应该为漆酶蛋白分子里-SH的伸缩振动，1164cm^-1为C-O的伸缩振动，1035cm^-1为N-H₂的变形振动，939cm^-1和876cm^-1为C-S键的伸缩振动，而507cm^-1为蛋白中二硫键的伸缩振动，而酶中C=O的吸收与材料上的C-N的吸收重合，变化不明显。通过图3为XPS谱图可以看出Fe³⁺与材料的成功结合以及漆酶的成功固定，纯的海绵（MS）是没有Fe³⁺的峰的，通过与FeCl₃作用后，出现了Fe³⁺的峰，说明Fe³⁺确实能够与海绵上的伯胺络合，继续将修饰了Fe³⁺的海绵用于漆酶的固定，发现固定漆酶后，Fe³⁺的峰弱了许多，这是漆酶附着在材料表面覆盖了Fe³⁺的信号，使得漆酶附着在材料表面Fe³⁺的信号饱和了，因此，Fe³⁺的信号减弱了。从这里可以看出合成的MS@Fe³⁺材料并用于漆酶固定是成功的。

本发明提供了一种直接利用蜜胺海绵上固有的伯胺与Fe³⁺络合固定酶的方法。固定化酶为漆酶、脂肪酶和胰蛋白酶；为了表征固定化酶的特性。本发明进行了以下实验研究：

实验例1

固定化酶的动力学方程研究

通过测量在25℃，pH=4的条件下，不同底物2,2’-联氮基双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）浓度下的反应速率,计算固定化酶和游离酶的米氏方程参数，包括该固定化酶和游离酶的米氏常数Km和最大反应速率Vmax。其中米氏常数Km表示酶与底物的亲和能力，Km越小，亲和能力越强，Vmax表示酶催化反应的最大反应速率，Vmax越大，酶的活性越强。如图4所示，固定化酶和游离酶为不同斜率的两条直线，固定化酶和游离酶的Vmax和Km值比较接近，并且固定酶的Vmax稍大于游离酶，说明静电作用对酶的构象影响很小，酶固定对酶的催化能力有一定的促进，固定化酶的Km小于游离酶，这得益于海绵超大孔的网状结构，使得酶与底物有足够的空间接触反应。

实验例2

固定化酶的稳定性研究

a .pH稳定性

将固定化酶和游离酶分别放置在pH为2-9不同磷酸的缓冲液中，室温，静置12h后，通过测量0.5mM的底物2,2’-联氮基双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐ABTS的氧化产物-ABTS^+·的含量来测定游离酶和固定化酶在不同pH下的活性。ABTS^+·在紫外波长415nm处有最大吸收。由图5可知，固定化酶仍然保留着游离酶的特性，它和游离酶的最适pH值都在3左右，但将酶固定在MS@Fe³⁺材料上后，固定化酶比游离酶更耐受碱性条件。

b.热稳定性

在pH=4，温度为60℃的环境下，随着孵化时间的增加，可以看到游离酶和固定化酶的活性都在逐渐丧失，但由于海绵的三维框架为酶提供了支撑保护作用，使得经过6h的孵化后，从图6中可以看出：固定化酶的活性还保留80%，而游离酶只保留了30%的活性。因此，可以看出MS@Fe³⁺材料的引入加强了酶的热稳定性，使得酶有望于在更广的温度范围内发挥催化活性。

C.时间稳定性

酶进行固定后，本发明考察了该固定化酶在室温下的时间稳定性。首先，将固定化酶和游离酶分散在pH=4磷酸的缓冲液中，在室温条件下，每隔3天分别取出固定化酶和游离酶进行酶活的测定。如图 7所示，固定化酶在室温下放置21天，其活性还保持在90%以上，而游离酶的活性已经降低到30%。从上述可以得出，固定化酶活性比和游离酶活性高，固定化酶能很好地解决酶储存的难题。

实验例3

固定化酶的重复使用性研究

该固定化酶与游离酶相比较的最大优势在于固定化酶能快速从溶液中进行磁性分离，从而实现该催化剂的重复使用，降低经济成本。本发明对固定化酶进行了重复使用性的考察。由图8可以看出，将该固定化酶重复使用10次后，酶的活性还保持在80%左右。因此该固定化酶具有良好的稳定性和重复使用性。若将固定化酶应用于染料行业将会大大降低生产成本。

实验例4

将固定了漆酶的海绵用于染料行业降解去除染料废水的脱色。偶氮类和三苯甲烷类都是在工业领域广泛使用的染料，刚果红是典型的偶氮类染料之一，而孔雀石绿则属于有毒的三苯甲烷类染料，可致癌。因此，选择刚果红（VC）和孔雀石绿（MG）作为漆酶作用底物，两种染料降解前后的紫外吸收谱图如图 9（a,b） 所示。本发明分别选择506nm和617nm作为它们的检测波长。用PBS（pH=4,50mM）分别配置0.5mM的刚果红（VC）和孔雀石绿（MG）溶液。加入20mL-80mL、0.5mM的刚果红（VC）和孔雀石绿（MG）染料的玻璃瓶中，再加入介质小分子ABTS（0.05mM）辅助催化,接着加入10mg固定化酶，温度为40℃，静置12h。VC和MG的降解效率分别通过506nm和617nm处的吸光度的减少值来衡量的。计算公式如下图所示:

其中 Rc为染料去除率，A1为降解前的吸光度，A2为降解后的吸光度

结果如图10 所示，10mg的固定化酶能够催化80mL的孔雀石绿和刚果红降解，降解率分别为59%和63%。因此，从上述可以看出，本发明制备的低成本的高效3D酶反应器可用于大规模的染料废水的脱色降解。

实验例5

材料的普适性研究

胰蛋白酶是蛋白水解酶的一种，它能够有效地水解变性蛋白，因此被广泛应用于复杂生物样品的前处理和医学领域，而脂肪酶能够催化许多有机反应，譬如酯化反应、酯水解反应、酯交换反应等。为了探究所合成MS@Fe³⁺材料对酶固定的普适性，本发明将该材料用于胰蛋白酶和脂肪酶的固定。该MS@Fe³⁺材料的制备与固定漆酶的材料一致，制备方法完全相同。经过测定发现材料对胰蛋白酶和脂肪酶也具有固定能力，该固定化酶分别保留了游离酶100%和92%的活性。因此，该MS@Fe³⁺材料可以作为一种酶固定材料并应用于不同酶的固定。

Bradford法：考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后形成蓝色的化合物，在595nm有最大吸收峰，且蓝色的深浅与蛋白浓度成正比。这是一种快速、准确、重复性好的蛋白质定量方法。

漆酶：近年来，脂肪酶因其独特的催化性质受到了大家的广泛关注，漆酶能够催化酚类、芳香性和脂肪性的胺类、羧酸类、甾体类激素、生物色素等生成醌类化合物和羰基化合物，该反应的副产物只有水而没有过氧化氢的产生，因此漆酶是一种环境友好型的高效催化剂。

Claims (2)

1.一种三维蜜胺海绵络合Fe³⁺用于酶的固定的方法，其步骤是：

材料（MS@Fe³⁺）的制备

购买的蜜胺海绵不经过任何处理，直接用打孔器打出孔径为d=1.2cm，厚度h=1cm的圆柱状，保证海绵的的质量为10mg，将称好的海绵放到的FeCl₃溶液中浸泡10min后，用镊子取出来挤压数次，用滤纸将海绵中的水吸干，在60℃真空干燥箱里干燥12h，就得到了络合了Fe³⁺的材料（MS@Fe³⁺）；

酶的固定

纯化酶，称取漆酶溶于水中，在4℃下，在转速为12000 rpm冷冻离心机离心15 min，取上清液冻干，放在4℃备用；称取纯化的漆酶溶于20ml、 pH=2-9,50 mM、50 mM的磷酸的缓冲液中，取缓冲液20ml，加入步骤a得到了络合材料（MS@Fe³⁺），并在摇床中25℃下过夜，酶的上载量通过Beford法检测为每毫克固体颗粒能够固定180微克的漆酶，镊子挤压回收该固定化酶，并用pH=4，50 mM磷酸的缓冲液洗涤材料数次,以除去材料上物理吸附的酶和溶液中未固定的游离酶。

2.如权利要求1所述一种三维蜜胺海绵络合Fe³⁺用于酶的固定的方法，其特征是所述的固定酶的方法同样适用于脂肪酶和胰蛋白酶。