CN1982445A - 用于制备固定化酶或固定化细胞的载体以及使用该载体的固定化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种开孔有机泡沫材料作为固定化酶/固定化细胞的载体以及相关的固定化酶/固定化细胞的制备技术。本发明采用凝絮交联的方法将酶蛋白/固定化细胞固定在开孔有机泡沫材料上，制成的固定化产品比表面积大，比活性高，并可制成形态多样的产品。

Description

用于制备固定化酶或固定化细胞的载体以及使用该载体的固定化方法

技术领域

本发明涉及涉及固定化酶/固定化细胞技术领域，特别是采用合成有机材料作为载体的固定化酶/固定化细胞技术。

背景技术

随着生物技术的发展，酶或含酶的细胞常常以固定化的形态应用于工业和其它领域，因为固定化酶/固定化细胞易于与产品分离并可回收重复使用，也往往比游离酶更为稳定。酶或细胞的固定化方法很多，如物理吸附、亲和联结、共价交联、凝絮包埋等等。

固定化酶/固定化细胞通常以比活力(单位重量的固定化酶/固定化细胞的活性)的高低来评估固定化技术的水平。比活力的高低与固定化方法有关，也与单位重量的固定化酶/固定化细胞的表面积(比表面积)有关。一般而言比表面积越大，比活性也就越高。因此，各种固定化方法都致力于提高酶颗粒的比表面积。目前，提高颗粒比表面积的方法一般是采用多孔、小颗粒的载体，用预制的含毛细孔的小颗粒载体来吸附或结合细胞或酶分子。

然而，现有技术在提高固定化酶/固定化细胞的比表面积方面存在很大的局限。现有的有机或无机载体因为多用硬质材料做成，其多孔性一般只体现在颗粒表面，因为如果内部孔隙过多则载体脆而易裂。因此，比表面积大且不易破碎的固定化载体一直是本领域科学家努力的目标。

发明内容

针对现有技术中各种载体的比表面积不足够大，一种载体往往只适用于某种或某几种酶的固定，且大多不适用于细胞的固定化，并且载体大多价格昂贵等问题，本发明的目的是找到一种比表面积大且不易破碎的既适用于固定化酶又适用于固定化细胞的合适的固定化载体。本发明还要解决的技术问题是如何有效地将所述的载体用于固定化酶或表达酶的细胞。

为了提高固定化酶/固定化细胞的比活力，本发明以开孔的多孔有机泡沫材料为载体。该载体的内部也具有开放的孔，即所述的孔不是封闭的，在该载体的内部具有至少两个互为连通的孔。利用这样的载体可以使所形成的固定化产品也具有开孔的三维网格结构，反应液可以贯穿流动在固定相的内部。这一方面显著提高了产品的比表面积，一方面也消除了传统粒状产品表里反应速率之差异。同时，与现有的颗粒状或片状的产品不同，本发明所述的固定化酶/细胞可视需要制成大小任意的颗粒、块状、片状及其它形态的结构而基本不影响其比表面积。

本发明所述的载体为开孔的吸水性的有机多孔泡沫材料。载体的开孔特性便于固定化时酶液进入载体内部，便于酶反应时底物充分有效地与载体上的酶分子接触反应，以及便于酶反应后产物的传质。本发明载体的吸水特性使得酶蛋白或细胞等亲水性组分可以均匀地分布、良好地附着并固定于载体的多孔表面。多孔材料的吸水性越强，其表现出来的水自然湿润速率就越大。本发明人发现有机多孔材料在水中自然湿润的快慢与其是否适用于作为固定化载体有相关性；水自然湿润速率高于0.2mm/s、优选高于0.4mm/s的材料适用于作为固定化载体，水自然湿润速率低于0.2mm/s的材料则不适用于作为固定化载体。大部分常见的合成材料(如各种聚氨酯海绵)的水自然湿润速率低，本发明优选的载体包括PVA海绵、木浆海绵、三聚氰胺海绵等。

本发明还提供一种用于固定化酶或固定化细胞的制备方法，其包括如下步骤：

(i)采用开孔的多孔有机泡沫材料作为固定载体；和

(ii)利用凝絮交联技术将所述酶或细胞固定在所述的载体上。

与现有技术比较，本发明具备诸多优势。其一，采用开孔的多孔有机泡沫材料作为固定酶或细胞的载体，可大幅度地提高固定化酶和固定化细胞的比表面积，从而显著提高固定化酶/固定化细胞的比活力。其二，本发明所涉及的方法在应用酶学领域具有广泛的适用性，理论上适用于几乎所有类型的酶和细胞的固定化。其三，本发明所使用的载体为通用惰性材料，价格低廉，因而降低了制造成本。其四，本发明所述的载体柔韧，即使在剧烈搅拌下也不易破碎。其五，本发明可以在不改变比表面积的同时根据需要制备各种外形、尺寸的大体积整体产品，尤其适合于大工业生产。

附图的简要说明

图1显示的是卷轴状固定化细胞柱体的制备过程。图中a为内芯，b为固定化细胞圆柱，c为橡胶带，d为接口装置，e为硅胶管，f为聚氨酯保温材料。

具体实施方式

如上文所述，本发明的载体是一种开孔的多孔有机泡沫材料，该载体具有至少为0.2mm/s的水自然湿润速率。该自然湿润速率是如下测定的：将待测的干燥的有机多孔材料切割成边长为5cm的立方体，轻轻置于水深为20cm的蒸馏水面并立即开始计时。该测试在整块受试材料完全被湿润或在测试开始后10分钟时结束。在此条件下，有机多孔材料被润湿的部分(包括沉入水中的部分)垂直于水面的高度(毫米)与其被润湿所花费的时间(秒)的比值被定义为该材料的水自然湿润速率。

本发明人认为，可能在聚合物的主链或支链上具有亲水性基团例如羟基、氨基、氰基等的那些多孔有机泡沫材料是比较合适的载体。在目前市场上可购得的一些开孔的多孔有机泡沫材料中，经测定聚乙烯醇海绵、木浆海绵和三聚氰胺海绵是较为合适的载体材料。这些材料制成的载体可以各种形状，例如颗粒状、条带状、片状、柱状或块状。

本发明的另一方面提供了将酶或细胞固定化于本发明载体上的方法。该方法是如下具体实现的：先将本发明所述的载体切割成薄片状或颗粒状，随后用水或缓冲液将酶液或细胞悬液配成适当浓度，再按如下步骤进行酶或细胞的固定化：a)将酶液或细胞悬液加入载体中，挤压载体使液体在载体中分布均匀并除去载体中未被吸附的液体；b)将适量蛋白凝絮剂溶液加入吸附有酶液的载体中，挤压数次使酶或细胞凝絮沉积于载体的孔壁上，挤压除去未被吸附的液体；c)将适量交联剂溶液加入载体中，交联固定凝絮的蛋白或细胞，然后挤压除去交联剂溶液；d)视需要重复步骤a至c数次，以增加酶或细胞在载体上的载量。最后以清水洗涤载体数次，干燥以除去水分。

在酶或细胞的固定化过程中，载体的挤压操作可以手工进行，也可以用专门的器械或机器完成；上述缓冲液的pH值应兼顾酶的最佳活性及保证酶蛋白与凝絮剂分子的表面电荷相反；一般而言，所用酶蛋白浓度为0.3-30％(W/V)或细胞浓度为1-50％(V/V)，凝絮剂的浓度为0.01％-30％(V/V)，交联剂的浓度为0.01％-30％(V/V)。凝絮剂一般为阳离子大分子，如壳聚糖、聚乙烯亚胺(PEI)、羧甲基聚乙烯亚胺(CMPEI)等；交联剂一般为多元醛化合物(如戊二醛、双醛淀粉、双醛葡聚糖等)。不同的絮凝剂或交联剂可单独使用，也可混合使用。为了节约酶的用量并提高酶的活力回收，可在酶液中添加非酶蛋白，如血清蛋白、卵清单白、乳清蛋白、奶酪蛋白等。此外，根据不同产品的具体需要，在酶或细胞的固定化过程中可以添加其它成分或增加有关步骤以改善产品的性能，如活性、稳定性、通透性、特异性及外观特征等。

本发明所制备的颗粒状固定化酶/固定化细胞可用于悬浮搅拌反应，也可用于填充式反应柱；本发明所制备的片状产品可卷绕成为圆柱形卷轴结构，直接构成反应柱。这种卷轴结构的产品可以作为模块上下堆积安装在生化反应器内，也可直接包裹后单独或相互拼接组合而成直径和长度可以调节的柱子用于工业生产。

本发明所制备的片状产品在卷绕的过程中，依借卷绕动作本身所产生的张力和持续外加的压轴挤压力导致多孔材料适当被压缩。因而此一卷绕的过程既是圆柱状结构的形成过程，也是压缩多孔材料的过程。根据应用需要，通过改变压轴的作用压力可以改变卷轴结构的松紧程度；通过改变卷绕的圈数或卷绕材料的厚度可以控制卷轴结构的直径；通过改变卷绕材料的宽度或直接对卷轴结构进行裁切可以控制卷轴圆柱体的高度。

本发明所述的圆柱形卷轴结构的柱状面可以用适当的包裹材料密封固定，以防止卷绕结构松脱。在产品用于填充反应柱套时，如果固定化酶产品本身不具备吸水膨胀的特性，此包裹材料应具备吸水膨胀的特性，如干的PVA海绵及木浆海绵，以便于在反应床充水后消除模块的柱面与柱子的壳体内壁之间可能存在的间隙，该间隙也可用颗粒材料填实。圆柱形卷轴结构在无柱套的条件下单独或相互拼接而直接构成实体柱子应用时，其包裹材料应具防水和保温特性，如聚氨酯泡沫塑料，以减少能耗。另一方面，如果圆柱形卷轴结构在灌流应用的过程中会发生收缩而体积变小，则要求作为床壁的包裹材料具有持续的收缩抱紧功能，如橡胶或含橡胶的材料，以免柱子在运行的过程中会逐渐形成床壁间隙。

圆柱形卷轴结构直接或拼接应用时，柱体的两端应配有用于连接柱体和管路的接口装置。该接口装置可以具有液体过滤功能，并能有效地将液体向柱体输入和输出。圆柱形卷轴结构拼接应用时，为防止液体自模块之间的连接处渗出，模块之间应有防止液体渗漏的密封胶带。

以下用具体的实例对本发明作进一步的说明。

实施例1.有机多孔材料的水自然湿润速率

将干燥的有机多孔材料切割成边长为5cm的立方体，轻轻置于水深为20cm的蒸馏水面并立即开始计时。测试在10分钟或整块受试材料完全被湿润后结束。在此条件下，有机多孔材料被润湿的部分(包括沉入水中的部分)垂直于水面的高度(毫米)与其被润湿所花费的时间(秒)的比值被定义为该材料的水自然湿润速率。本实施例测试了大量有机多孔材料，部分结果列于下表1。

表1

名称	型号	来源	比重(g/cm3)	润湿速率(mm/s)	能否均匀固定细胞
						聚酯海绵聚氨酯海绵聚氨酯海绵聚氨酯海绵聚氨酯海绵	ST33DL68L338A230	深圳联达海绵厂深圳联达海绵厂深圳联达海绵厂深圳联达海绵厂美国Stepan公司	0.05010.03140.02130.01860.0250	＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01	否否否否否

聚氨酯海绵涤纶纤维丝PVA海绵木浆海绵三聚氰胺海绵

----_

新加坡益展工业有限公司深圳联达海绵厂深圳俊鸿实业有限公司香港3M公司珠海天虹特殊海绵厂

0.03650.03510.11910.08300.0080

＜0.010.0440.4831.7512.50

否否能能能

实施例2.表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞颗粒的制备1

根据pGEMT-Easy(Promega)的序列设计PCR引物，具体为：

上游引物RBS-NdeI：

5’-CATATGTATATCTCCTTCTTGTGTGAAATTG-3’；

下游引物RBS-AlwNI：

5’-CAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTC-3，

以pGEMT-Easy(Promega)为模板，用上述引物进行PCR，扩增得到一755bp产物。PCR条件为：50ng pGEMT-Easy(Promega)，0.4μMRBS-NdeI，0.4μM RBS-AlwNI，50μM dATP，50μM dTTP，50μMdCTP，50μM dGTP，20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，2.5U Pfu DNA聚合酶(Promega)，用无菌水调反应体积至50μL。PCR扩增反应程序为：94℃，5分钟；94℃，1分钟，50℃，1分钟，72℃，4分钟，循环35次；72℃，10分钟。该PCR产物(755bp)在5’端含有NdeI酶切位点和核蛋白体结合位点及在3’端含有AlwNI酶切位点。用0.8％琼脂糖电泳提纯，NdeI和AlwNI酶切后，与经NdeI和AlwNI酶切的pRSETA(Invitrogen)连接，得pRSET-lac。用AlwNI和EcoRI酶切pRSET-lac和pRSET-kan(中国专利申请公布号：CN1680558A)，用0.8％琼脂糖电泳提纯各DNA片段并连接，得pRSET-lac-kan。

按照中国专利申请公开号：CN1702172所公开的制备葡萄糖异构酶突变体的方法，以pGEMT-MGI-4为模板，分别以T1和87LR、87LF和217GR、217GF和260AR、260AF和T2为引物对(均见表2)，进行PCR合成，得到编码含有F87L、W139F、R182A、F187S、V217G、D260A和T299Q共七个点突变的葡萄糖异构酶突变体的基因MGI4-35。用NdeI和EcoRI酶切MGI4-35后，与经NdeI和EcoRI酶切的pRSET-lac-kan连接，得到pRSET-lac-MGI4-35-kan。所得载体pRSET-lac-MGI4-35-kan的完整序列列于序列表的序列1。

表2

引物对
	T1：5’AGCCTAGGTTAATTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAATAAATATTTTGAGA 3’87LR：5’AAAAACTCCAGTGCTGCTTCTACCCTTGCTTTC3’
87LF：5’GAAGCAGCACTGGAGTTTTTTGATAAGATAA3’217GR：5’GCATAGTCGCCAGCCATGTGCAAAAATCTT3’
	217GF：5’ACATGGCTGGCGACTATGCAAAGGAAATCG3’260AR：5’AAATATTTCGCAAGGTCGTATTTTCTCAAG3’
260AF：5’ACGACCTTGCGAAATATTTCAAAGTAAATA3’T2：5’ATAAGCTCAGCGGCGCGCCTTATTCTGCAAACAAATAC3’

然后将pRSET-lac-MGI4-35-kan转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。按1％比例接种至70L LB液体培养基(含50mg/L卡那霉素)中，37℃培养该含葡萄糖异构酶突变体MGI4-35的大肠杆菌36小时。离心得湿菌体670g，并悬浮于一倍菌体重量的纯水中。

将干燥的PVA海绵(购自浙江省宁海县好帮手日用品有限公司)切成约15mm³的颗粒，取PVA海绵颗粒6g置尼龙纱网袋中，再将网袋置塑料袋中，加菌液40ml于海绵颗粒中，反复挤压混合至少3分钟使菌液在颗粒上分布均匀；加0.5％(w/v)pH7.0的PEI(购于SigmaChemicals，St.Luis，USA)溶液40ml，反复挤压混合至少3分钟；加0.5％(v/v)的戊二醛(购于广东汕头市西陇化工厂)溶液40ml，反复挤压混合至少5分钟，然后将网袋从塑料袋取出，挤压除去液体，以水挤压洗涤3次，除去未被吸附的液体后，流动空气干燥5-10小时，得表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞颗粒11g。

基本参照文献(Dische et al.，1951，J.Biol.Chem，192：583-587；Nakamura，1968，Agr.Biol.Chem.32：701-706)所报道的酶活力测定方法，测定实施例2制得的固定化细胞的比活力。具体为，精密称取0.5-2mg按上述方法制备的表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞颗粒，加36％(w/v)葡萄糖溶液(含0.25mM氯化钴，5mM氯化镁，20mM磷酸盐，pH6.5)1ml，75℃振摇反应10分钟，置冰浴终止反应。在此条件下每分钟催化1微摩尔的葡萄糖转化为果糖所需的酶量被定义为一个葡萄糖异构酶活力单位。经测定实施例2制得的固定化细胞的比活力为2,540U/g。

实施例3.表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞颗粒的制备2

按实施例2制备菌液40ml，加0.25mM氯化钴溶液6ml，混匀。将木浆海绵(香港3M公司)洗净，除去可能含有的表面活性剂，将海绵切成约15mm³的颗粒，干燥后取海绵颗粒4g置尼龙纱网袋中，再将网袋置塑料袋中，加含氯化钴的菌液46ml于海绵颗粒中，反复挤压混合至少3分钟使菌液在颗粒上分布均匀；加2.5％的PEI溶液(pH7.0)10ml，反复挤压混合至少3分钟；加2.5％的戊二醛溶液10ml，反复挤压混合至少5分钟，然后将网袋从塑料袋取出，挤压除去液体，以水挤压洗涤3次，除去未被吸附的液体后，流动空气干燥5-10小时，得表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞颗粒9g。

葡萄糖异构酶的活力测定方法参照实施例2。结果，实施例3制得的固定化细胞的比活力为4,442U/g

实施例4.表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞颗粒的制备3

按实施例2制备菌液。开孔的三聚氰胺海绵来自珠海天虹特种海绵厂，开孔率＞95％。将三聚氰胺海绵切成约15mm³的颗粒，干燥后取海绵颗粒2.67g置尼龙纱网袋中，再将网袋置塑料袋中，加菌液80ml于海绵颗粒中反复混合至少3分钟使菌液在颗粒上分布均匀；加0.5％的PEI溶液(pH7.0)160ml，反复挤压混合至少3分钟，挤压除去未被吸附的液体；加0.5％的戊二醛溶液160ml，反复挤压混合至少3分钟，然后将网袋从塑料袋取出，挤压除去液体，以水挤压洗涤3次，除去未被吸附的液体后，流动空气干燥5-10小时，得表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞颗粒13g。

葡萄糖异构酶的活力测定方法参照实施例2。结果，实施例4制得的固定化细胞的比活力为5,544U/g。

实施例5.表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞颗粒的制备4

按实施例2制备菌体细胞，将细胞悬浮于5倍菌体重量的纯水中。

将三聚氰胺海绵切成约15mm³的颗粒，取海绵颗粒10g置尼龙纱网袋中，按以下顺序操作：a)将海绵颗粒浸泡于1000ml菌液中至少3分钟后取出，挤压海绵除去未被吸附的液体；b)加0.1％的PEI溶液(pH7.0)100ml，反复挤压混合至少3分钟，挤压除去未被吸附的液体；c)加0.1％的戊二醛溶液100ml，反复挤压混合，静置3分钟后，挤压除去未被吸附的液体；d)重复步骤a至c5次，然后以水挤压洗涤3次，挤压除去未被吸附液体后，流动空气干燥5-10小时，得表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞颗粒56g。

葡萄糖异构酶的活力测定方法参照实施例2。结果，实施例5制得的固定化细胞的比活力为6,150U/g。

实施例6.表达戊二酰7-氨基头孢烷酸酰化酶固定化大肠杆菌细胞颗粒的制备1

pT7-kan-ACY的构建：根据已知的假单孢菌SE83戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶DNA序列(Matsuda，A.et al.，1987，J.Bacteriol.169，5821-5826)，设计PCR上游引物NdeI-ACY：5’-CATATGAACGCTCCCGTCCCCGTCCC-3’，和PCR下游引物BglII-ACY：5’-AGATCTTCAGATGGTGAAGCGGGCAC-3’。

以假单孢菌SE83 DNA为模板，用上述引物进行PCR，扩增得到一1,676bp产物。PCR条件为：50ng假单孢菌SE83 DNA，0.4μMNdeI-ACY，0.4μM BglII-ACY，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，2.5 U Pfu DNA聚合酶(Promega)，用无菌水调反应体积至50μL。

PCR扩增反应程序为：95℃，5分钟；94℃，1分钟，50℃，1分钟，72℃，3分钟，循环35次；72℃，10分钟。该PCR产物(1,676bp)在5’和3’端分别含有NdeI和BglII酶切位点。PCR产物经0.8％琼脂糖电泳提纯，NdeI和BglII酶切后，与经NdeI和BglII酶切的pRSET-kan连接，得pT7-kan-ACY，具体序列示于序列2。将pT7-kan-ACY转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)，得菌株BL-T7K-ACY。

以含卡那霉素(50mg/L)的20L LB液体培养基，在37 ℃培养大肠杆菌BL-T7K-ACY24小时，离心收集菌体，得湿菌体细胞235g，将细胞悬浮于5倍菌体重量的纯水中。

将三聚氰胺海绵切成约15mm³的颗粒，取海绵颗粒10g置尼龙纱网袋中，按以下顺序操作：a)将海绵颗粒浸泡于1000ml菌液中至少3分钟后取出，挤压海绵除去未被吸附的液体；b)加0.1％的PEI溶液(pH7.0)100ml，反复挤压混合至少3分钟，挤压除去未被吸附的的液体；c)加0.1％的戊二醛溶液100ml，反复挤压混合，静置5分钟后，挤压除去未被吸附的的液体；d)5次重复步骤a至c，以水挤压洗涤后，挤压除去未被吸附的液体后，流动空气干燥5-10小时，得表达GL-7-ACA酰化酶固定化大肠杆菌细胞颗粒50g。

检测基本按Binder，R.et al.，(1994，Appl.Environ.Microbiol.60，1805-1809)所述的方法，来测定固定化表达GL-7-ACA酰化酶大肠杆菌细胞的比活力。具体为，取18g制备的固定化GL-7-ACA酰化酶细胞颗粒悬浮于600ml75mM戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸溶液(含25mM磷酸钠，pH8.0)中(戊二酰-7-氨基头孢霉烷的制备方法参见Shibuya，Y.etal.，(1981，Agric.Biol.Chem.45，1561-1567)，在37℃下搅拌反应(搅拌速度为450转每分钟)，并用5N氢氧化钠维持pH在8.0。反应开始后在不同时间(0，10，20分钟)抽取60μL样本，与30μL 10％三氯醋酸混匀以终止反应。离心(10,000g，3分钟)，取10μL上清液混合990μL HPLC流动相(50mM磷酸钾，pH7；5％乙腈)。用HPLC检测酶反应。HPLC条件如下：HPLC色谱柱：Diamonsil^TMC18，250×4.6mm(迪马公司，北京)；柱温度：30℃；流速：1mL每分钟；检测：260nm。一单位戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸酰化酶活性定义为在上述条件每分钟转化一微摩尔戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸至7-氨基头孢霉烷酸的酶量。经测定，实施例6制得的固定化细胞在初始10分钟内的比活力为140.8U/g。

实施例7.表达腺苷蛋氨酸合成酶固定化大肠杆菌细胞颗粒的制备

根据GENBANK NC_000909设计引物：SAM-F(5’AGCCTAGGTTAATTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAGAAACATAATTGTAA3’)和SAM-R(5’ATAAGCTCAGCGGCGCGCCTTAGAATGTAGTTACTTTTCCTTCA3’)。利用引物对SAM-F和SAM-R从Methanococcus jannaschii JAL-1ATCC 43067(购自ATCC，USA)中扩增S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因。扩增条件为：20mM Tris-HCl(PH8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，0.1％Triton X-100，50uM dATP，50uM dTTP，50uM dCTP，50uM dGTP，400nM SAM-F，400uM SAM-R，4.5U Taq DNA聚合酶(购自Promega，USA)，再用无菌水把反应体积调至50μl。PCR扩增反应程序为：95℃3分钟，40圈循环(95℃50秒、50℃30秒和72℃1分钟。)，最后72℃10分钟。将扩增的产物(长约1.3KB)克隆至载体pRSET-lac-kan，将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS并于LB(含50mg/L卡那霉素)平板培养过夜，挑出单个克隆。

按1％接种量在50L LB液体培养基(含50mg/L卡那霉素)37℃培养上述表达M.jannaschii S-腺苷甲硫氨酸合成酶的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS 40小时后，离心得湿菌体480g，将菌体悬浮在于5倍菌体重量的纯水中。

将三聚氰胺海绵切成约15mm³的颗粒，取海绵颗粒10g置尼龙纱网袋中，以下按顺序操作：a)将海绵颗粒浸泡于1000ml菌液中3分钟后取出，挤压海绵除去未被吸附的液体；b)加0.1％的PEI溶液(pH7.0)100ml，反复挤压混合至少3分钟，挤压除去未被吸附的液体；c)加0.1％的戊二醛溶液100ml，反复挤压混合，静置5分钟后，挤压除去未被吸附的液体；d)重复步骤a至c3次，以水挤压洗涤后，70C热水处理30分钟，挤压除去未被吸附的液体后，流动空气干燥5-10小时，得表达腺苷蛋氨酸合成酶固定化大肠杆菌细胞颗粒50g。

酶活力之测定参照George D.Markham et al，(1980，Journal ofBiological Chemistry，255，9082-9092)所述的方法。具体为，在500μl反应液(2mM ATP，8mM L-甲硫氨酸，20mM MgCl₂，100mM KCl，100mMTris-Cl pH8.3)中，加入15mg固定化细胞，在58℃下震荡反应反应20分钟后，加入300μl之10％三氯醋酸终止反应，离心除去沉淀，收集上清用HPLC测定其中之SAM含量。HPLC测定参照US Patent No.US6881837(色谱柱：C18，4.6mm×250mm，Beckman Coulter，USA；缓冲液：0.02M柠檬酸，0.01M磷酸二氢钠；流动相：a.含有0.4％SDS的缓冲液；b乙腈，a与b的比例为56∶44；流速：1.5ml/分钟；检测波长：260nm)。经测定，实施例7制备的固定化细胞的比活力为0.6U/g。

实施例8固定化D-氨基酸氧化酶颗粒的制备

按下列方法制备BL-HS-GHA[含有重组D-氨基酸氧化酶GHA的E.coli BL21(DE3)pLysS]菌体。

BL-HS-GHA的来源：

根据已知的Thermoanaerobacterium saccharolyticum glucoseisomerase DNA序列(GenBank L09699)，设计PCR引物，具体为：

上游引物：

5’-AGCCTAGGTTAATTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAATAAATATTTTGAGA

下游引物：

5’-ATAAGCTCAGCGGCGCGCCTTATTCTGCAAACAAATAC

以Thermoanaerobacterium saccharolyticum(购自ATCC，USA)DNA为模板，用上述引物进行PCR，扩增得到一1,376bp产物。PCR条件为：50ng T.saccharolyticum DNA，0.4μM GI-NdeI，0.4μM GI-EcoRI，50μMdATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％Triton X-100，2.5U Platinum Taq High Fidelity DNA聚合酶(Invitrogen)，用无菌水调反应体积至50μL。PCR扩增反应程序为：95℃，5分钟；94℃，1分钟，50℃，1分钟，72℃，3分钟，循环35次；72℃，10分钟。PCR产物经0.8％琼脂糖电泳提纯，利用TA克隆方法，与pGEMT-Easy(Promega)连接，得pGEMT-Easy-GI。用NdeI和EcoRI酶切pGEMT-Easy-GI，经0.8％琼脂糖电泳提纯，与经NdeI和EcoRI酶切的pRSET-lac-kan连接，得pRSET-lac-GI-kan。根据已知hok/sok基因片段序列(GenBank X05813)设计10条引物(见表3)。PCR基因构造根据Kikuchi，M.et a1.，1999，Gene236：159-167所述，唯具体步骤有变更。PCR条件为：20ng各个引物，50μM dATP，50μM dTTP，50μM dCTP，50μM dGTP，20mM Tris-HCl(pH8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％TritonX-100，2.5U Pfu DNA聚合酶(Promega)，用无菌水调反应体积至50μL。PCR扩增反应程序为：95℃，4分钟；94℃，1.5分钟，50℃，1.5分钟，72℃，5分钟，循环30次；72℃，10分钟。取PCR扩增反应混合物5μL作模板，引物1和10，依上述条件再次PCR扩增，得一PCR产物长580bp，在其5’和3’端分别含有AscI及EcoRI酶切位点。PCR产物经0.8％琼脂糖电泳提纯，AscI及EcoRI酶切后，与经AscI及EcoRI酶切的pRSET-lac-GI-kan连接，得pRSET-lac-GI-hok/sok-kan。

表3

序号	引物序列
		1	5’-ttggcgcgccttaagatatcaacaaactccgggaggcagcgtgatgcggcaacaatcacacggatttcccgtgaa-3’
2	5’-catatacctgcacgctgaccacactcactttccctgaaaataatccgctcattcagaccgttcacgggaaatccgtgtga-3’
		3	5’-ggtcagcgtgcaggtatatgggctatgatgtgcccggcgcttgaggctttctgcctcatgacgtgaaggtggtttgttgc-3’
4	5’-cgtggtggttaatgaaaattaacttactacggggctatcttctttctgccacacaacacggcaacaaaccaccttcacgt-3’
		5	5’-aattttcattaaccaccacgaggcatccctatgtctagtccacatcaggatagcctcttaccgcgctttgcgcaaggaga-3’
6	5’-tgagacacacgatcaacacacaccagacaagggaacttcg

	tggtagtttcatggccttcttctccttgcgcaaagcgcgg-3’
		7	5’-tgtgttgatcgtgtgtctcacactgttgatattcacttatctgacacgaaaatcgctgtgcgagattcgttacagagacg-3’
8	5’-cgcctccaggttgctacttaccggattcgtaagccatgaaagccgccacctccctgtgtccgtctctgtaacgaatctcg-3’
		9	5’-taagtagcaacctggaggcgggcgcaggcccgccttttcaggactgatgctggtctgactactgaagcgcctttataaag-3’
10	5’-cggaattcacaacatcagcaaggagaaaggggctaccggcgaaccagcagcccctttataaaggcgcttcagt-3’

用NdeI和BglII酶切质粒pRSET-kan-DAOGHA(中国专利申请公开号：CN1680558A)，得一1,074bp基因片段(内含D-氨基酸氧化酶突变体GHA基因)，经0.8％琼脂糖电泳提纯，与经NdeI和BgllI酶切的pRSET-lac-GI-hok/sok-kan得到的长片断连接，得pHS-GHA(序列3)。将pHS-GHA转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS(Novagen)，得菌株BL-HS-GHA，

制备BL-HS-GHA[含有重组D-氨基酸氧化酶GHA的E.coli BL21(DE3)pLysS]菌体的方法

从卡那霉素(50μg/mL)LB琼脂平板上挑取单菌落大肠杆菌BL-HS-GHA，接种到2×5mL含卡那霉素(50μg/mL)的液体LB培养基，在37℃培养8小时(摇床转速为250转每分钟)，再接种至2×50mL种子培养基含卡那霉素(100g/mL)和氯霉素(40μg/mL)，在30℃培养16小时(摇床转速为400转每分钟)。

玉米浆1之制备：

将300g玉米浆(购自华北制药康欣有限公司)溶于300mL蒸馏水，搅拌后离心(5,000g，8分钟)，上清液即为玉米浆1。沉淀物留用。

玉米浆2之制备：

将上述沉淀物再溶于600mL蒸馏水，搅拌后离心(5,000g，8分钟)，上清液即为玉米浆2。

50mL种子培养基中各成分重量如下：

玉米浆1      4mL

玉米浆2      4mL

酵母浸膏     0.2g

硫酸铵       0.075g

磷酸氢二钠   0.25g

磷酸二氢钾   0.04g

氯化钠       0.075g

将各成分溶于50mL蒸馏水，以10N氢氧化钠调pH值至7.15，高温消毒。

种子过夜发酵后，将全部100mL之种子接种至2L发酵罐(BIOENGINEERING，Benchtop Fermentor，KLF2000)含卡那霉素(50μg/mL)。

2L发酵培养基中各成分重量如下：

玉米浆1       160mL

玉米浆2       160mL

酵母浸膏      8g

硫酸铵        3g

磷酸氢二钠    10g

磷酸二氢钾    1g

氯化钠        3g

将各成分溶于1.9L蒸馏水，以10N氢氧化钠调pH值至7.15，于2L发酵罐(BIOENGINEERING，Benchtop Fermentor，KLF2000)高温消毒。

将12.5g葡萄糖溶于50mL蒸馏水，高温消毒；将1.25g硫酸镁溶于50mL蒸馏水，高温消毒。

发酵前把已消毒的葡萄糖和硫酸镁放进2L发酵罐。

补料之制备：

将250mL玉米浆1和250mL玉米浆2混合，以10N氢氧化钠调pH值至7.25，高温消毒。

将2.25g硫酸铵，7.56g磷酸氢二钠，1.2g磷酸二氢钾，2.25g氯化钠溶于60mL蒸馏水，高温消毒。

将15g酵母浸膏溶于100mL蒸馏水，高温消毒。

将70g葡萄糖溶于140mL蒸馏水，高温消毒。

将30mL甘油混合10mL蒸馏水，高温消毒。

将20g硫酸镁溶于30mL蒸馏水，高温消毒。

将所有溶液混合，加入卡那霉素至浓度为50μg/mL，加入2mL消泡剂。

在35℃生长，在初始的6小时，pH值由6.9自然上升至7.2，开始补料(50mL/小时)。在平衡条件下(以5N氢氧化钾将pH值维持在7.2，溶氧水平pO2不大于0.5％)，继续生长26小时。

在发酵罐发酵后，细菌在4℃经离心机分离(5,000g，8分钟)，弃上清液，得沉淀198g，将沉淀重悬于600mL磷酸钠缓冲液(50mM，pH7.5)。用珠磨法裂解细菌，以50mL每分钟之速度把细菌重悬液送进珠磨机(DYNO-MILL TYP KDL，0.2mm直径玻璃珠，WA Bachofen)内，最后再以800mL磷酸钠缓冲液(50mM，pH7.5)把细菌残留冲洗出来。将细菌裂解液在55℃水浴中浸泡30分钟，以高速离心(10,000g，30分钟)，取上清液，即为粗纯之重组D-氨基酸氧化酶GHA。D-氨基酸氧化酶的纯化基本按Alonso，J.，Barredo，J.L.，Diez，B.，Mellado，E.，Salto，F.，Garcia，J.L.，Cortes，E.(1998，Microbiology 144：1095-1101)所述。提取之粗纯重组D-氨基酸氧化酶GHA，加入甘油至最终浓度为10％，用5N氢氧化钠调pH值至8，离心(13,000g，30分钟)，取上清液。按产品供货商所述制备法制备DEAE-纤维素离子交换树脂(Sigma，D-0909)。按每1mL粗纯酶混合0.5mL DEAE-纤维素离子交换树脂，在4℃搅拌5小时(100转每分钟)，用滤斗(Buchner filter funnel，120mm P1)将酶液滤去。以3倍DEAE-纤维素离子交换树脂体积之40mM磷酸二氢钠缓冲液(含10％甘油)冲洗DEAE-纤维素离子交换树脂，再用2倍DEAE-纤维素离子交换树脂体积之400mM磷酸二氢钠缓冲液将重组D-氨基酸氧化酶GHA洗脱出来。按每1L洗脱之重组D-氨基酸氧化酶GHA，加入262g硫酸铵，在室温搅拌15分钟(100转每分钟)。离心(13,000g，15分钟)，弃上清液，保留沉淀物。将沉淀物溶于20mM磷酸二氢钠缓冲液(pH7.5)后以Millipore YM30滤膜超滤除去剩余硫酸铵，将酶液浓缩至25mg/ml。用SDS-PAGE检测蛋白质的纯度。取酶液25mg/ml的D-氨基酸氧化酶溶液25ml，加牛血清白蛋白(卵清蛋白)3.75g，加水112.5ml，搅拌均匀，得稀释酶液。

取三聚氰胺海绵切成约15mm³的颗粒，取海绵颗粒5g置尼龙纱网袋中，按以下顺序操作：a)加稀释酶液50ml于海绵颗粒中充分挤压混合均匀；b)加0.05％的PEI溶液(pH7.0)400ml，反复挤压混合至少5分钟，挤压除去未被吸附的液体；c)加0.05％的戊二醛溶液400ml，反复挤压混合，静置5分钟后，挤压除去未被吸附的液体；d)重复步骤a至c3次，然后以水挤压洗涤3次，挤压除去未被吸附液体后，流动空气干燥5-10小时，得表达D-氨基酸氧化酶固定化大肠杆菌颗粒30g。

D-氨基酸氧化酶的活力测定基本参照文献Isogai，T.，Ono，H.，Ishitani，Y.，Kojo，H.，Ueda，Y.，Kohsaka，M.(1990，J Biochem[Tokyo].108，1063-1069)所述，具体步骤略有变更。具体为，取表达D-氨基酸氧化酶固定化大肠杆菌颗粒5克悬浮在75mM头孢菌素C钠盐水溶液中，加氧在22℃振荡反应60分钟。反应开始后在不同时间(0、15、30分钟)抽取100μl反应液与10μl 3％过氧化氢混匀，再加入50μl10％三氯醋酸，混匀以终止反应。将终止反应液离心(10,000g，3分钟)，取10μl上清液和990μl HPLC流动相混合，上HPLC柱检测。HPLC色谱柱：Diamonsil^TM C18，250×4.6mm(迪马公司，北京)；流动相：50mM K₂HPO₄/KH₂PO₄(pH7.0)，5％乙腈；柱温度：30℃；流速：1ml/min；检测：260nm UV。一单位酶活性定义为在上述条件每分钟转化一微摩尔头孢菌素C为戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸的酶量。经测定，实施例8制备的固定化酶在初始15分钟内酶比活力为156U/g。

实施例9.表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞片带的制备

按实施例2制备菌体细胞，将细胞悬浮于5倍体积的纯水中。

将三聚氰胺海绵切割成0.5×10×120cm的片带(4.8g)。以下按顺序操作：a)将海绵片带浸入细胞悬液中，挤压海绵使菌液在海绵中均匀分布，将海绵通过对滚轴挤压除去海绵上未被吸附的菌液，调节两挤压轴的间隙使海绵上所粘附的菌液约为200g；B)向海绵加入500ml 0.1％PEI(pH7.0)溶液，挤压海绵使PEI分布均匀，海绵再次通过对滚轴以除去未被吸附的液体；c)向海绵加入500ml 0.1％戊二醛溶液，挤压使戊二醛分布均匀并除去未被吸附的液体，静置5分钟。d)重复步骤a至c5次，每次重复步骤a时，调节两对滚轴间的间隙使海绵再次携带的菌液量约为100g，然后以水挤压洗涤1次，挤压除去未被吸附的液体后，流动空气干燥5-10小时，得表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞片带24g。从所制备的表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞片带上剪取少量样品参照实施例2的方法测定活力，测定酶比活力为6,608U/g。

实施例10.表达葡萄糖异构酶固定化大肠杆菌细胞卷轴状圆柱的制备

将实施例9制得的固定化细胞片带之一部分(3.5g)在一圆柱形实体内芯(附图1，a)上卷绕成直径1.8cm、高9.6cm的圆柱(附图1，b)。卷绕前将海绵片带的两末端削切成斜面，使卷绕的始末两端与内芯或外壁不形成间隙。其柱面以宽约4cm的橡胶带缠绕(附图1，c)。两个接口装置(附图1，d)被橡胶带缠绕固定于柱体的两端。两端涂以密封用的玻璃胶，接上硅胶管(附图1，e)后，整个柱体用聚氨酯保温材料(附图1，f)封裹。

向上述固定化细胞柱通入75℃的50％(w/v)的葡萄糖浆(含2.5mM磷酸盐、0.5mM MgCl₂，0.05mM CoCl₂，pH6.5)，初始流速为1.62ml/min，流出物的果糖含量为总糖量的51.6％；144小时后流速为1.63ml/min时，流出物的果糖含量为总糖量的45.6％。

按本发明制备的圆柱形卷轴结构的产品用于填充柱子时，其装卸过程比颗粒状的固定化酶简单高效，这一优势在大规模生产时尤其显得突出。卷轴结构的无柱套应用对节约固定成本投资也是显而易见的。而且，由卷轴结构单独构成的反应柱子可以随意并联或串联，或由卷轴结构拼接而成的反应柱子的长度和数目可以随意调节，使得生产规模可以很方便地根据需要扩大或缩小。其次，反应柱子在使用过程中，柱子内的酶分子会逐渐失去活力，越靠近底物进口端位置的酶分子失活越快，因而柱子在使用一段时间之后，其两端的活力会有显着的差异。本发明可以很方便地用新的高活力的反应柱置换失活严重端的反应柱。如此可有效调节整个柱子的使用寿命和生产效率。这一点，现有的颗粒状固定化酶产品就无法做到。

本专利申请中引用的各种文献的全部公开内容，无论是专利文献还是非专利文献，全部以引用方式并入本文。另外，本发明不受上述具体实施例描述的限制。本发明可在权利要求书所概括的范围内做各种改变，这些改变也在本发明的范围之内。

序列表

<110>百瑞全球有限公司

<120>用于制备固定化酶或固定化细胞的载体以及使用该载体的固定化方法

<130>Fl-050593-59

<160>3

<170>Patentln version 3.2

<210>1

<211>4124

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>表达载体pRSET-lac-MGI4-35-kan

<400>1

caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat      60

aacaatttca cacaagaagg agatatacat atgaataaat attttgagaa cgtatctaaa     120

ataaaatatg aaggaccaaa atcaaataat ccttattcct ttaaatttta caatccagag     180

gaagtaatcg atggcaagac gatggaggag catctccgct tttctatagc ttattggcac     240

acttttactg ctgatggaac agatcaattt ggcaaggcta ctatgcaaag accatggaac     300

cactacacag atcctatgga tatagcgaaa gcaagggtag aagcagcatt agagtttttt     360

gataagataa atgcaccttt cttctgcttc catgataggg atattgcccc tgaaggagat     420

actcttagag agacaaacaa aaacttagat acaatagttg ctatgataaa ggattactta     480

aagaccagca agacaaaagt tttgtttggt accgcaaatc ttttctccaa tccgagattt     540

gtacatggtg catcaacatc ctgcaatgct gacgtttttg catattctgc agcgcaagtc     600

aaaaaagccc ttgagattac taaggagctt ggcgcggaaa actacgtatc ttggggtgga     660

agagaagggt acgagacgct tctcaataca gatatggagt tagagcttga taactttgca     720

agatttttgc acatggctgg tgactatgca aaggaaatcg gctttgaagg tcagttcttg     780

attgagccga agccaaagga gcctacaaaa catcaatacg actttgacgt ggcaaatgta     840

ttggcattct tgagaaaata cgaccttgcc aaatatttca aagtaaatat cgaagcaaac     900

catgcgacat tggcattcca cgacttccaa catgagctaa gatacgccag aataaacggt     960

gtattaggat caattgacgc aaatcaaggc gacatgcttt tgggatggga tacggaccag    1020

ttccctacag atatacgcat gacaacgctt gctatgtatg aagtcataaa gatgggtgga    1080

tttgacaaag gtggccttaa ctttgatgca aaagtaagac gtgcttcatt tgagccagaa    1140

gatcttttct taggtcacat agcaggaatg gatgcttttg caaaaggctt taaagttgct     1200

tacaagcttg tgaaagatgg cgtatttgac aagttcatcg aagaaagata cgcaagctac     1260

aaagaaggca ttggcgctga tattgtaagc ggtaaagctg acttcaagag ccttgaaaag     1320

tatgcattag agcacagcca gattgtaaac aaatcaggca gacaagagct attagaatca     1380

atcctaaatc agtatttgtt tgcagaataa ggcgcgccgc tgagcttatc gaattcgaag     1440

cttgatccgg ctgctaacaa agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag     1500

caataactag cataacccct tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttgctgaaa     1560

ggaggaacta tatccggatc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc     1620

aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggg acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg     1680

cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc     1740

ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa     1800

atcgggggct ccctttaggg ttccgattta gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac     1860

ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc catcgccctg atagacggtt tttcgccctt     1920

tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg gactcttgtt ccaaactgga acaacactca     1980

accctatcgc ggtctattct tttgatttat aagggatttt gccgatttcg gcctattggt     2040

taaaaaatga gctgatttaa caaatattta acgcgaattt taacaaaata ttaacgctta     2100

caatttaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta     2160

aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata     2220

ttgaaaaagg aagagtatga gtcatattca acgggaaacg tcttgctcta ggccgcgatt     2280

aaattccaac atggatgctg atttatatgg gtataaatgg gctcgcgata atgtcgggca     2340

atcaggtgcg acaatctatc gattgtatgg gaagcccgat gcgccagagt tgtttctgaa     2400

acatggcaaa ggtagcgttg ccaatgatgt tacagatgag atggtcagac taaactggct     2460

gacggaattt atgcctcttc cgaccatcaa gcattttatc cgtactcctg atgatgcatg     2520

gttactcacc actgcgatcc ccgggaaaac agcattccag gtattagaag aatatcctga     2580

ttcaggtgaa aatattgttg atgcgctggc agtgttcctg cgccggttgc attcgattcc     2640

tgtttgtaat tgtcctttta acagcgatcg cgtatttcgt ctcgctcagg cgcaatcacg     2700

aatgaataac ggtttggttg atgcgagtga ttttgatgac gagcgtaatg gctggcctgt     2760

tgaacaagtc tggaaagaaa tgcataaact tttgccattc tcaccggatt cagtcgtcac     2820

tcatggtgat ttctcacttg ataaccttat ttttgacgag gggaaattaa taggttgtat     2880

tgatgttgga cgagtcggaa tcgcagaccg ataccaggat cttgccatcc tatggaactg     2940

cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa acggcttttt caaaaatatg gtattgataa     3000

tcctgatatg aataaattgc agtttcattt gatgctcgat gagtttttct aactgtcaga     3060

ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat     3120

ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt     3180

ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct     3240

gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc     3300

ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc     3360

aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc     3420

gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc     3480

gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg     3540

aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata     3600

cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta     3660

tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc     3720

ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg     3780

atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt     3840

cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt     3900

ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga     3960

gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc     4020

cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg     4080

cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat tagg                      4124

<210>2

<211>4414

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>表达载体pT7-kan-ACY

<400>2

catatgaacg ctcccgtccc cgtcccgcgc gtcgccgatt tcacctgcga gaagaagcct      60

gcgagcggct cgcgcggcat ggtcgtcacc aaccacccgc tcgcctcggc agccggcgcg     120

cagatcctgc tcgccggcgg caatgccatc gacgcggctg tcgcgtcgct cttcgcgctg     180

acggtggccg agccgatgat ggtcggcatc ctcggcgggg gcctgagcca tatccggctc     240

gccgacgggc gtcatgtcgt gatcgacaat ctctcgaccg cgccgggcaa ggcgacggcc     300

gagatgtacg agtgcctgtc cgacgagatc ggcaagcagc gcgacacgcg cgaccgccag     360

aacgtggtcg gagccaaggc ggtcgcggtt cccggcgcgc tcaagggctg gtgcgaggcg     420

ctcgcccgct tcggcacgct gccgctcgcc gaggttctcc agccggcgat cgggctggcg     480

gagcgcggct tcgtggtcac gccctatctc tcgaactgca tcaccgacaa cgcgggcgat     540

ctcgcccgcg accccggcct cgcggcgatg ctgctgccgg gcggaaagcc gctccagccg     600

ggcatgcggc tcgtccagtc cgactatgcc gcgagcctca aactgatcgc ggctgagggg     660

ccggacgcgc tctatggcgg caagctcggc cgggcgctga ccgattacat ggcggccaat     720

ggcggcctga tcgatcaggc cgacctcgcc aattaccgca tcgaactgcg cgagccgatt     780

cgcggctcct atcgcggcta cgagatcatc ggcccgccgc cgccctcgtc atcgggcgtg     840

catatcacgc agatgctcaa cattctcgaa ggctatgata tcggctcgct cggcttcggc     900

tcgacggacg ctgtgcatct gctcgccgaa gccctgaaga tcgccttcgc cgaccgcgcc     960

gtggcgacag ccgatccggc cttcgtcaag gttccggtcg cgcgattgat cgacaaggcc    1020

tatgccgacg agcgccgcgc gctcattgag atggagcagg cgaagagctg gacggccggg    1080

ctctctggcg gcgaatccgc cgacaccact catgtcaccg tcgctgacgc catggggaat    1140

gtcgtcagcg cgacgcagac gatcaacggg ctgttcggcg cctgcgtgca gattccgggc    1200

accggcatga tcgccaacaa ctacatgtac aacttcgatc cgcatcccgg ccgggcgctc    1260

tcgatcgcgc cgggaaagag ggtcttcacc tcgatggcgc cgatgatggc gttgaaggag    1320

ggacggatcg cctttgcgct cggcttgcct ggcgcgctcc gcatcttccc ctcggcgctg    1380

caggcgatcg tcaacctgat cgaccaccgc atgagcctgc aggaggcggt cgaggcgcca    1440

cgcgtctgga cggagggcgg cgtgctcgaa ctcgaggaag cgatccccga ggccgtggca    1500

caagcgctga tcgcgcgcgg ccataaggtg gtgcgctcgc cccgcgtggc cggtggcatg    1560

aacgccatcg ccttcaatcc ggacggtacc ttgaccggtg ccgcctgctg gcgcgccgac    1620

ggcacacccg tcgccatctc cggcgggctc gcccgtgccg gtgcccgctt caccatctga    1680

agatctgcag ctggtaccat ggaattcgaa gcttgatccg gctgctaaca aagcccgaaa    1740

ggaagctgag ttggctgctg ccaccgctga gcaataacta gcataacccc ttggggcctc    1800

taaacgggtc ttgaggggtt ttttgctgaa aggaggaact atatccggat ctggcgtaat    1860

agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg    1920

gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc     1980

gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc     2040

acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt     2100

agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg     2160

ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt     2220

ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta     2280

taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt     2340

aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt acaatttagg tggcactttt cggggaaatg     2400

tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga     2460

gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agtcatattc     2520

aacgggaaac gtcttgctct aggccgcgat taaattccaa catggatgct gatttatatg     2580

ggtataaatg ggctcgcgat aatgtcgggc aatcaggtgc gacaatctat cgattgtatg     2640

ggaagcccga tgcgccagag ttgtttctga aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg     2700

ttacagatga gatggtcaga ctaaactggc tgacggaatt tatgcctctt ccgaccatca     2760

agcattttat ccgtactcct gatgatgcat ggttactcac cactgcgatc cccgggaaaa     2820

cagcattcca ggtattagaa gaatatcctg attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg     2880

cagtgttcct gcgccggttg cattcgattc ctgtttgtaa ttgtcctttt aacagcgatc     2940

gcgtatttcg tctcgctcag gcgcaatcac gaatgaataa cggtttggtt gatgcgagtg     3000

attttgatga cgagcgtaat ggctggcctg ttgaacaagt ctggaaagaa atgcataaac     3060

ttttgccatt ctcaccggat tcagtcgtca ctcatggtga tttctcactt gataacctta     3120

tttttgacga ggggaaatta ataggttgta ttgatgttgg acgagtcgga atcgcagacc     3180

gataccagga tcttgccatc ctatggaact gcctcggtga gttttctcct tcattacaga     3240

aacggctttt tcaaaaatat ggtattgata atcctgatat gaataaattg cagtttcatt     3300

tgatgctcga tgagtttttc taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg     3360

atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca     3420

tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga     3480

tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa     3540

aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga     3600

aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt     3660

taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt     3720

taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat     3780

agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct     3840

tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca     3900

cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag     3960

agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc     4020

gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga     4080

aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca     4140

tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag     4200

ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg     4260

aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagga     4320

tctcgatccc gcgaaattaa tacgactcac tatagggaga ccacaacggt ttccctctag     4380

aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tata                                 4414

<210>3

<211>4723

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>表达载体pHS-GHA

<400>3

catatggcta aaatcgttgt tattggtgcc ggtgttgccg gtttaactac agctcttcaa       60

cttcttcgta aaggacatga ggttacaatt gtgtccgagt ttacgcccgg tgatcttagt      120

atcggatata cctcgccttg ggcaggtgcc aactggctcc cgttttacga tggaggcaag      180

ttagccgact acgatgccgt ctcttatcct atcttgcgag agctggctcg aagcagcccc      240

gaggctggaa ttcgactcat caaccaacgc tcccatgttc tcaagcgtga tcttcctaaa      300

ctggaaggtg ccatgtcggc catctgtcaa cgcaacccct ggttcaaaaa cacagtcgat      360

tctttcgaga ttatcgagga caggtccagg attgtccacg atgatgtggc ttatctagtc      420

gaatttgctt ccgtttgtat ccacaccgga gtctacttga actggctgat gtcccaatgc      480

ttatcgctcg gcgccacggt ggttaaacgt cgagtgaacc atatcaagga tgccaatttt      540

ctacactcct caggatcacg ccccgacgtg attgtcaact gtagtggtct ctttgcccgg      600

ttcttgggag gcgtcgagga caagaagatg taccctattc gaggacaagt cgtccttgtt      660

cgaaactctc ttccttttat ggcctccttt tccagcactc ctgaaaaaga aaatgaagac      720

gaagctctat atatcatgac ccgattcgat ggtacttcta tcattggcgg ttgtttccaa      780

tccaacaact ggtcatccga acccgatcct tctctcaccc atcgaatcct gtctagagcc      840

ctcgaccgat tcccggaact gaccaaagat ggccctcttg acattgtgcg cgaatgcgtt      900

ggccaccgtc ctggtagaga gggcggtccc cgagtagaat tagagaagat ccccggcgtt      960

ggctttgttg tccataacta tggtgccgcc ggtgctggtt accagtcctc ttacggcatg     1020

gctgatgaag ctgtttctta cgtcgaaaga gctcttactc gtccaaacct ttagagatct     1080

tttcttaggt cacatagcag gaatggatgc ttttgcaaaa ggctttaaag ttgcttacaa     1140

gcttgtgaaa gatggcgtat ttgacaagtt catcgaagaa agatacgcaa gctacaaaga     1200

aggcattggc gctgatattg taagcggtaa agctgacttc aagagccttg aaaagtatgc     1260

attagagcac agccagattg taaacaaatc aggcagacaa gagctattag aatcaatcct     1320

aaatcagtat ttgtttgcag aataaggcgc gccttaagat atcaacaaac tccgggaggc     1380

agcgtgatgg ggcaacaatc acacggattt cccgtgaacg gtctgaatga gcggattatt     1440

ttcagggaaa gtgagtgtgg tcagcgtgca ggtatatggg ctatgatgtg cccggcgctt     1500

gaggctttct gcctcatgac gtgaaggtgg tttgtgccgt gttgtgtggc agaaagaaga     1560

tagccccgta gtaagttaat tttcattaac caccacgagg catccctatg tctagtccac     1620

atcaggatag cctcttaccg cgctttgcgc aaggagaaga aggccatgaa actaccacga     1680

agttcccttg tctggtgtgt gttgatcgtg tgtctcacac tgttgatatt cacttatctg     1740

acacgaaaat cgctgtgcga gattcgttac agagacggac acagggaggt ggcggctttc     1800

atggcttacg aatccggtaa gtagctacct ggaggcgggc gcaggcctgc cttttcagga     1860

ctgatgctgg tctgactact gaagcgcctt tataaagggg ctgctggttc gccggtagcc     1920

cctttctcct tgctgatgtt gtgaattcga agcttgatcc ggctgctaac aaagcccgaa     1980

aggaagctga gttggctgct gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct     2040

ctaaacgggt cttgaggggt tttttgctga aaggaggaac tatatccgga tctggcgtaa     2100

tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg     2160

ggacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac     2220

cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc     2280

cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt     2340

tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg     2400

gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag     2460

tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt     2520

ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt     2580

taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgct tacaatttag gtggcacttt tcggggaaat     2640

gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg     2700

agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtcatatt     2760

caacgggaaa cgtcttgctc taggccgcga ttaaattcca acatggatgc tgatttatat     2820

gggtataaat gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta tcgattgtat     2880

gggaagcccg atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt tgccaatgat     2940

gttacagatg agatggtcag actaaactgg ctgacggaat ttatgcctct tccgaccatc     3000

aagcatttta tccgtactcc tgatgatgca tggttactca ccactgcgat ccccgggaaa     3060

acagcattcc aggtattaga agaatatcct gattcaggtg aaaatattgt tgatgcgctg     3120

gcagtgttcc tgcgccggtt gcattcgatt cctgtttgta attgtccttt taacagcgat     3180

cgcgtatttc gtctcgctca ggcgcaatca cgaatgaata acggtttggt tgatgcgagt     3240

gattttgatg acgagcgtaa tggctggcct gttgaacaag tctggaaaga aatgcataaa     3300

cttttgccat tctcaccgga ttcagtcgtc actcatggtg atttctcact tgataacctt     3360

atttttgacg aggggaaatt aataggttgt attgatgttg gacgagtcgg aatcgcagac     3420

cgataccagg atcttgccat cctatggaac tgcctcggtg agttttctcc ttcattacag     3480

aaacggcttt ttcaaaaata tggtattgat aatcctgata tgaataaatt gcagtttcat     3540

ttgatgctcg atgagttttt ctaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt     3600

gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc     3660

atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag     3720

atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa     3780

aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg     3840

aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag     3900

ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg     3960

ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga     4020

tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc     4080

ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc     4140

acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga     4200

gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt     4260

cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg     4320

aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac     4380

atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga     4440

gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg     4500

gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc     4560

tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt     4620

tagctcactc attaggcacc ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt     4680

ggaattgtga gcggataaca atttcacaca agaaggagat ata                       4723

Claims (15)

1.一种用于制备固定化酶或固定化细胞的载体，其特征为开孔的多孔有机泡沫材料。

2.根据权利要求1所述的载体，其具有至少为0.2mm/s的水自然湿润速率。

3.根据权利要求2所述的载体，该种载体是选自聚乙烯醇海绵、木浆海绵和三聚氰胺海绵中至少一种海绵。

4.根据权利要求1-3所述的载体，其具有为颗粒状、条带状、片状、柱状或块状的形状。

5.一种用于固定化酶或固定化细胞的制备方法，其特征包括如下步骤：

a)采用开孔的多孔有机泡沫材料作为固定载体；和

b)利用凝絮交联技术将所述酶或细胞固定在所述的载体上。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述载体具有至少为0.2mm/s的水自然湿润速率。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述载体是选自聚乙烯醇海绵、木浆海绵和三聚氰胺海绵中至少一种海绵。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述载体具有为颗粒状、条带状、片状、柱状或块状的形状。

9.权利要求8所述的方法，其中，所述载体为片状载体，该载体可卷绕成为圆柱形的卷轴结构而直接构成反应柱。

10.根据权利要求5所述的方法，其中所述的凝絮交联技术如下完成：用蛋白絮凝剂和多元醛化合物将酶蛋白或细胞交联凝絮沉积于载体的孔壁上。

11.根据权利要求10的方法，其中所述的蛋白絮凝剂为壳聚糖、聚乙烯亚胺(PEI)或羧甲基聚乙烯亚胺。

12.根据权利要求10的方法，其中所述的多元醛化合物为戊二醛。

13.权利要求5所述的方法，其中所述的酶选自葡萄糖异构酶、D-氨基酸氧化酶、戊二酰7-氨基头孢烷酸酰化酶或腺苷蛋氨酸合成酶。

14.权利要求5所述的方法，其中所述的细胞表达至少一种选自葡萄糖异构酶、D-氨基酸氧化酶、戊二酰7-氨基头孢烷酸酰化酶或腺苷蛋氨酸合成酶的酶。

15.权利要求14所述的方法，所述的细胞为大肠杆菌。

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