CN102533717B

CN102533717B - 一种β-葡萄糖苷酶的固定化及其协同纤维素酶水解秸秆纤维素的方法

Info

Publication number: CN102533717B
Application number: CN 201210052838
Authority: CN
Inventors: 郑璞; 王杰; 卢婵; 杨绪娥
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2012-03-02
Filing date: 2012-03-02
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2032-03-02
Also published as: CN102533717A

Abstract

一种β-葡萄糖苷酶的固定化及其协同纤维素酶水解秸秆纤维素的方法，属生物催化技术领域。本发明方法包括：（1）将壳聚糖溶解在丙酸溶液中形成透明均一的胶体，再与Fe₃O₄颗粒混合搅拌，滴入NaOH溶液，得到磁性微球。将磁性微球于戊二醛溶液中交联得到固定化载体。（2）将固定化载体加入到β-葡萄糖苷酶液中进行吸附得到磁性固定化酶。用磁性固定化酶水解纤维二糖底物测其酶活性。（3）将此磁性固定化酶协同纤维素酶降解玉米秸秆。用该方法制得的固定化酶形状均一，比表面积大，机械强度高，酶活高，易回收。并能够协同纤维素酶水解秸秆纤维素，提高水解糖的得率，重复使用稳定性好，可降低酶法水解秸秆纤维素的成本。

Description

一种β-葡萄糖苷酶的固定化及其协同纤维素酶水解秸秆纤维素的方法

技术领域

本发明一种β-葡萄糖苷酶的固定化及其协同纤维素酶水解秸秆纤维素的方法，具体涉及一种磁性固定化β-葡萄糖苷酶的制备方法，以及该固定化酶在秸秆纤维素水解中的应用，属于生物催化技术领域。

背景技术

β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21）又称纤维二糖酶，是一种能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键的水解酶。它能够作用于纤维二糖或纤维寡糖，使其水解为葡萄糖分子，也是纤维素酶的成分之一，可以协同纤维素酶提高木质纤维素水解的速度和程度。在纤维素降解、食品风味的改善等领域具有广泛的应用。一般认为纤维素类物质经酶促作用生成葡萄糖至少需要三种酶：内切葡聚糖酶，外切纤维二糖水解酶和纤维二糖酶（β-葡萄糖苷酶）。内切葡聚糖酶和外切纤维二糖酶把纤维素降解成纤维二糖，它再被纤维二糖酶分解成葡萄糖，纤维素酶的重要作用是通过这三种酶协同进行，最后将纤维素转化为葡萄糖，因此在这个过程中纤维二糖酶起到关键作用。而在多数的纤维素酶组成中纤维二糖酶组分较少，活力低，影响二糖类物质分解，成为纤维素酶整个水解的瓶颈。纤维素是葡萄糖以1,4-糖苷键结合的聚合物，为植物细胞壁的构成成分，占植物干重的1/2到1/3。全球一年间由光合作用生产的的纤维素达1000亿吨，是最丰富的可再生资源。将植物纤维应用于发酵食品工业原料，具有缓减资源短缺的优势，将对人类是一个重大贡献。因此，开发优化纤维素水解的方法具有良好的应用价值。

由于多数商品纤维素酶液中，β-葡萄糖苷酶活力低，在纤维素酶中额外添加适量的β-葡萄糖苷酶，可以一定程度上提高秸秆纤维素的酶解率。但商品β-葡萄糖苷酶价格昂贵，通过固定化酶能实现其回收利用，因此降低酶的使用成本。虽然国内外对固定化β-葡萄糖苷酶研究较多，如采用海藻酸钠通过吸附法固定β-葡萄糖苷酶（催化学报，2008，29(10):1021-2026）；采用ACA微胶囊固定β-葡萄糖苷酶（现代化工，2009，29(10):51-54）。但是这些固定化酶是应用在均相体系的反应中。纤维素酶水解秸杆的产物除了水解得到的糖类外，还有其它固体残渣，这给固定化酶的回收造成困难。虽然中国专利CN101270352A公布了一种用磁性纳米颗粒固定β-葡萄糖苷酶的方法，该法制备纳米固定化酶过程较复杂，酶活回收率不高，且无在秸杆纤维素非均相反应体系中的应用报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种β-葡萄糖苷酶的固定化及其协同纤维素酶水解秸秆纤维素的方法，本发明针对纤维素酶水解秸杆反应体系，通过制备磁性固定化酶，实现β-葡萄糖苷酶的反复利用。

本发明的技术方案：

本发明提供了一种β-葡萄糖苷酶的固定化及其协同纤维素酶水解秸秆纤维素的方法。包括：

（1）用壳聚糖、丙酸、PEG400和Fe₃O₄颗粒制备磁性壳聚糖微球，并用戊二醛活化，得到固定化载体；

（2）β-葡萄糖苷酶吸附于磁性壳聚糖微球固定化载体上，得磁性固定化β-葡萄糖苷酶；

（3）磁性固定化β-葡萄糖苷酶协同纤维素酶水解秸秆纤维素。

该方法制得的磁性固定化β-葡萄糖苷酶在温度、pH及使用次数上面表现出良好的稳定性。将此固定化酶应用于水解秸秆，表现出一定的促进作用。

以下是本发明方法的详细描述：

固定化载体的制备：

在45~60 mL去离子水体系中，壳聚糖质量为0.5~1.0 g，丙酸质量分数为1.5%~2.5%，PEG400为40~60 μL，Fe₃O₄颗粒质量为0.5~1.0 g，将上述组份搅拌均匀，形成透明均一的胶体后，除去气泡，滴入50-300 mL 2 M的NaOH溶液中，静置8~12 h，得到壳聚糖磁性微球，过滤后1g壳聚糖磁性微球用20mL 1.5%~3.0%的戊二醛溶液在25℃处理2~4 h，过滤后得到固定化载体；

磁性壳聚糖微球固定化载体吸附β-葡萄糖苷酶：

将0.5~0.8 g固定化载体加入到8~12 mL、pH4.5~5.0的β-葡萄糖苷酶溶液中，酶活为0.6-10 CBIU/mL，于150~200 r/min、20~25℃下震荡5~15 h，得到磁性固定化β-葡萄糖苷酶。

磁性固定化β-葡萄糖苷酶协同纤维素酶水解秸秆纤维素：

以用常规的碱预处理的玉米秸秆纤维素为底物，用pH4.5~5.0的柠檬酸缓冲液配成50~100 g/L玉米秸杆纤维素的浆液，加入固定化β-葡萄糖苷酶和纤维素酶，固定化β-葡萄糖苷酶用量为80~150 g/L浆液（湿重），纤维素酶的用量为10~30 FPIU/g秸秆，在40~65 ℃下水解10~48 h。

固定化β-葡萄糖苷酶的保存：

将0.2~0.5 g固定化β-葡萄糖苷酶加入到0.05 N、pH4.0~7.0的柠檬酸缓冲液中保存。

磁性固定化β-葡萄糖苷酶酶活测定：

将固定化酶0.1 g加入2 mL的纤维二糖底物在50℃下恒温反应30 min，再于100℃水浴灭活10 min，用生物传感仪测定葡萄糖含量。酶活单位CBIU/g。其中一个纤维二糖酶活力国际单位 (CBIU) 定义为标准酶促反应条件下（50℃下恒温反应30 min）每分钟生成2.0μmol葡萄糖的酶量。

相关计算公式：

Figure 2012100528386100002DEST_PATH_IMAGE002

本发明的有益效果：固定化操作比较简单，得到磁性固定化β-葡萄糖苷酶产品形状均一，比表面积大，酶活回收率高，使用稳定性良好，易于储存；本发明所得的固定化β-葡萄糖苷酶协同纤维素酶水解秸秆纤维素，提高水解糖得率，并方便回收，重复使用稳定性良好，从而可以降低酶法水解秸秆纤维素的成本。

附图说明

图1给酶量对制备磁性壳聚糖微球固定化酶的影响。

图2 pH对制备磁性壳聚糖微球固定化酶的影响。

图3吸附时间对制备磁性壳聚糖微球固定化酶的影响。

图4 β-葡萄糖苷酶协同纤维素酶水解玉米秸秆。

图5固定化β-葡萄糖苷酶协同纤维素酶水解玉米秸秆的使用稳定性。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不限于本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的授权内容之后，本技术领域人员可以对本发明做各种改动和修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1 给酶量对制备磁性壳聚糖微球固定化酶的影响

取0.5 g壳聚糖溶解在50 mL、2%的丙酸溶液中，加入40 μL PEG400，形成透明均一的液体后，再加入0.5 g Fe₃O₄颗粒，搅拌均匀，除去气泡。然后滴入200 mL 2 M NaOH溶液中静止10 h，形成壳聚糖磁性微球，并用蒸馏水反复洗涤至中性待用。取1 g壳聚糖磁性微球，加入到20 mL、2%戊二醛溶液中于25℃交联2 h，用蒸馏水反复洗涤至中性，得到固定化载体。

取5份相同的0.5 g固定化载体，分别加入到6 mL、8 mL、10 mL、12 mL和14 mL的β-葡萄糖苷酶溶液中（pH4.8，酶活为0.93 CBIU/mL），于20℃、200 r/min吸附10 h。测定固定化酶的酶活力，如图1所示，其中最高为6.43 CBIU/mL，酶活回收率74.0 %。

实施例2 pH对制备磁性壳聚糖微球固定化酶的影响

按实施例1的方法制得固定化载体，取5份相同的0.5 g固定化载体，分别加入到10 mL，pH为3.0、4.0、4.8、6.0和7.0的β-葡萄糖苷酶溶液中（酶活为0.93 CBIU/mL），于20℃、200 r/min吸附10 h。测定固定化酶的酶活力，如图2所示，其中最高为6.36 CBIU/mL，酶活回收率74.0 %。

实施例3 吸附时间对制备磁性壳聚糖微球固定化酶的影响

按实施例1的方法制得固定化载体，并取5份相同的0.5 g固定化载体，分别加入到10 mL、pH4.8的β-葡萄糖苷酶溶液中（酶活为0.93 CBIU/mL），于20 ℃、200 r/min分别吸附1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h、10 h和16 h。测定固定化酶的酶活力，如图3所示，其中最高为6.39 CBIU/mL，酶活回收率73.3 %。

实施例4 β-葡萄糖苷酶协同纤维素酶水解玉米秸秆

以用碱法预处理的玉米秸秆纤维素为底物，用pH4.8的柠檬酸缓冲液配成80 g/L玉米秸杆，将按实施例1制得的固定化β-葡萄糖苷酶，以127 g/L的用量（湿重）与25 FPIU/g秸秆纤维素酶（康地恩公司生产，酶活0.993 FPIU/mL）混合加入，在50 ℃下水解32 h，测定酶解率，如图4所示，单用纤维素酶降解玉米秸秆，32 h水解率为63.7%，同时添加固定化β-葡萄糖苷酶，水解率提高到67.63%。

实施例5 固定化β-葡萄糖苷酶协同纤维素酶水解玉米秸秆的使用稳定性

按实施例4的方法，固定化β-葡萄糖苷酶协同纤维素酶水解玉米秸杆32 h后，测定酶解率，回收操作，再重复上述步骤，如图5所示，重复使用8次后酶解率仅降低了1.88%。

Claims

1.一种固定化β-葡萄糖苷酶协同纤维素酶水解秸秆纤维素的方法，其特征在于步骤为：

（1）用壳聚糖、丙酸、PEG400和Fe₃O₄颗粒制备磁性壳聚糖微球，并用戊二醛活化，得到固定化载体：在45~60 mL去离子水体系中，壳聚糖质量为0.5~1.0 g，丙酸质量分数为1.5%~2.5%，PEG400为40~60 μL，Fe₃O₄颗粒质量为0.5~1.0 g，将上述组份搅拌均匀，形成透明均一的胶体后，除去气泡，滴入50-300 mL 2 M的NaOH溶液中，静置8~12 h，得到壳聚糖磁性微球，过滤后1g壳聚糖磁性微球用20 mL 1.5%~3.0%的戊二醛溶液在25℃处理2~4 h，过滤后得到固定化载体；

（2）β-葡萄糖苷酶吸附于磁性壳聚糖微球固定化载体上，得磁性固定化β-葡萄糖苷酶：将0.5~0.8 g固定化载体加入到8~12 mL、pH4.5~5.0的β-葡萄糖苷酶溶液中，酶活为0.6-10 CBIU/mL，于150 r/min、25℃下震荡5~15 h，得到磁性固定化β-葡萄糖苷酶；

（3）磁性固定化β-葡萄糖苷酶协同纤维素酶水解秸秆纤维素：以用碱预处理的玉米秸秆纤维素为底物，用pH4.5~5.0的柠檬酸缓冲液配成50~100 g/L玉米秸杆纤维素的浆液，加入固定化β-葡萄糖苷酶和纤维素酶，固定化β-葡萄糖苷酶用量为80~150 g/L浆液，纤维素酶的用量为10~30 FPIU/g秸秆，在40~65 ℃下水解10~48 h。