CN112063544B - 一种离子液体-复合菌剂体系 - Google Patents

一种离子液体-复合菌剂体系 Download PDF

Info

Publication number
CN112063544B
CN112063544B CN202010771093.3A CN202010771093A CN112063544B CN 112063544 B CN112063544 B CN 112063544B CN 202010771093 A CN202010771093 A CN 202010771093A CN 112063544 B CN112063544 B CN 112063544B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ionic liquid
microbial inoculum
enzymolysis
methylimidazole
aqueous solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010771093.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112063544A (zh
Inventor
路强强
陈智坤
赵叶子
孙晓宇
邢国强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xi'an Botanical Garden Shaanxi Province Shaanxi Institute Of Botany
Original Assignee
Xi'an Botanical Garden Shaanxi Province Shaanxi Institute Of Botany
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xi'an Botanical Garden Shaanxi Province Shaanxi Institute Of Botany filed Critical Xi'an Botanical Garden Shaanxi Province Shaanxi Institute Of Botany
Priority to CN202010771093.3A priority Critical patent/CN112063544B/zh
Publication of CN112063544A publication Critical patent/CN112063544A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112063544B publication Critical patent/CN112063544B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
    • B09B—DISPOSAL OF SOLID WASTE NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • B09B3/00—Destroying solid waste or transforming solid waste into something useful or harmless
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/54—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D233/56—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, attached to ring carbon atoms
    • C07D233/58—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, attached to ring carbon atoms with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms, attached to ring nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种离子液体‑复合菌剂体系，包括离子液体和复合菌剂，所述离子液体和复合菌剂形成用于酶解木质纤维素的耦合体系；离子液体含有1‑乙基‑3‑甲基咪唑氯化铁盐；复合菌剂包括潮湿纤维单胞菌、白色链霉菌、热带假丝酵母和白腐菌的发酵液。酶解试验中，酶解液的最高纤维素酶活力为185.1U·mL‑1、园林生物质的降解失重率达52.6％，比单纯的复合菌剂提高分别59.0％和66.5％，酶解剩余物的木质素含量则减少了35.2％。酶解应用中，园林生物质的酶解周期为18‑26天、高温期持续12‑21天，最高温达62‑72℃，最终降解失重率为47.2‑54.2％，木质素含量下降至8.5‑10.6％。本发明的制备工艺简便、酶解效率显著，可满足集约化、资源化处置利用农林生物质的社会需求和绿色循环的发展理念。

Description

一种离子液体-复合菌剂体系
技术领域
本发明属于园林生物质资源化利用技术领域，涉及木质纤维素的酶解应用，具体涉及一种了用于高效酶解园林生物质的离子液体-复合菌剂体系及其制备方法。
背景技术
园林生物质是园艺维护及农林作业所产生的林草修剪物、枯枝落叶、农业秸秆等，其主要成分包括可降解的纤维素、木质素、半纤维素和淀粉等，也包含一些植物营养元素，是参与生态系统物质循环的重要有机资源。木质纤维素是植物组织结构的主要成分，是由葡萄糖聚合物、聚木糖、聚葡萄甘露糖以及苯丙烷类多酚物等以共价键(如氢键、酯键、醚)和非共价键聚合而成的大分子交联体，且在自然条件下不溶于水和各类有机溶剂。木质纤维素不溶于水和各类有机溶剂的理化性质，是其难以快速降解与再利用的直接原因。
生物酶解是促进木质纤维素水解转化为可利用小分子物质的重要途径。为实现园林生物质的高效利用，适当预处理可降低木质纤维素组分内或组分间的分子聚合力，起到减少纤维素结晶度、提高木质纤维素比表面积、释放酶解位点、加快裂解等作用。传统预处理方法，比如化学酸碱消融、物理机械破碎等，常常伴有废气、废水、扬尘和噪音产生。开发或选择环境友好型木质纤维素预处理方式，并与生物酶解耦合是实现园林生物质快速降解、高效利用的关键所在。
离子液体是一种新型绿色溶剂，在室温条件为熔融态的盐，具有强极性、难挥发、易合成、可溶解等优点。离子液体可实现木质纤维素的溶解与再生利用，主要是通过熔融共混模式形成分子内氢键、降低纤维素结晶度，具有促木质纤维素解聚、提高酶解转化率的作用。目前，对木质纤维素溶解效果较好的阳离子主要有咪唑、嘧啶和三乙基季铵等，阴离子主要包括卤素、有机酸、无机酸及其盐、酯等。咪唑型离子液体具热稳定性好、溶解工艺简单、合成成本低廉、预处理应用广泛等优点。现有研究发现，农林秸秆经1-乙基-3-甲基咪唑乙酸盐([Emim]Ac)处理后，木质素含量和纤维素结晶度均发生明显下降，单糖含量得到显著提升；并且，[Emim]Ac可多次重复利用。
纤维素酶是实现木质纤维素水解转化最为重要的工业化生物酶，该酶属于O-糖苷类氧化复合酶，主要包括葡聚糖内切酶(Endoglucanase,EG)、外切酶(Cellobiohydrolase,CBH)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,β-G)。纤维素酶也是诱导木质素降解酶系产生的核心酶，并协同水解碳水化合物分子内或与非碳水化合物分子间的糖苷键，起到解聚木质纤维素的作用。自然条件下，纤维素酶是腐生在富含腐殖质土壤或有机质中的微生物代谢表达的产物。产纤维素酶的微生物主要包括粘菌属(Cytophaga sp.)和杆菌属(Cellulomonassp.)细菌、链霉菌属(Streptomyces sp.)和诺卡氏菌属(Ncardiac sp.)放线菌以及具有显著利用率和渗透力的真菌，如曲霉属(Aspergillus sp.)、青霉属(Penicillium sp.)和木霉属(Trichoderma sp.)。其中，黄孢原毛平革菌，即白腐菌(Phanerochaetcchrysosporium)被认为是产纤维素酶剂量最大、酶活力最高和水解纤维素能力最强的模式菌。
目前，关于离子液体协同生物酶水解木质纤维素的应用研究，多以高纯离子液体和商品生物酶为应用制剂，以碱化预处理的农林秸秆浆液或高纯纤维素为降解底物，比如CN102533907A、CN105177083A、CN106086109A、CN106423241A、CN109517862A、CN109608657A等。这些专利公开的木质纤维素降解方法，存在酶解反应条件苛刻、离子液体回收困难、应用成本过高等弊端。
发明内容
随着城市绿化水平的不断提高和农村秸秆还田、柴改电等措施的实施，园林生物质资源大幅产生和剩余。为实现园林生物质资源的循环再利用，解决传统方法或途径处置园林生物质资源带来的环境污染与低效利用等技术瓶颈，本着绿色可行、操作简便、酶解持久及产业化应用的原则，本发明提供一种离子液体-复合菌剂体系，探索其在园林生物质资源的酶解应用。
本发明所述的离子液体-复合菌剂体系，包括离子液体和复合微生物菌剂，所述离子液体和复合微生物菌剂形成耦合体系，可高效酶解园林生物质木质纤维素。通过本发明的降解研究获知，该体系具有降解条件温和、酶活力持久、成本低廉、离子液体可降解等优点；尤其值得称道的是，本发明所述离子液体-复合菌剂体系，从根本上解决了传统方法或途径处置园林生物质资源带来的环境污染问题，为实现生态系统有机物质的循环再利用提供了高效途径。
具体地，本发明所述的离子液体-复合菌剂体系，包括离子液体和复合菌剂，所述离子液体和复合菌剂形成用于酶解木质纤维素的耦合体系。
所述离子液体含有1-乙基-3-甲基咪唑氯化铁盐。
所述复合菌剂包括潮湿纤维单胞菌(Cellulomonas uda)、白色链霉菌(Streptomyces albus)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)和白腐菌(Phanerochaetcchrysosporium)的发酵液。
经前期园林生物质溶解率和木质纤维素再生率试验筛选，1-乙基-3-甲基咪唑氯化铁盐([Emim]FeCl4)适于与所述复合菌剂配伍，利于促进高效酶解园林生物质木质纤维素。本发明所述离子液体经有机合成制备，具体地，本发明给出一种[Emim]FeCl4的优选合成方法：N-甲基咪唑和氯乙烷于70℃反应24h，经除杂干燥得中间体；所得中间体和三氯化铁于25±5℃反应2-5h；所述N-甲基咪唑、氯乙烷的摩尔质量比为1:1.1；所述中间体、三氯化铁的摩尔质量比为1:1。
优选的，本发明给出[Emim]FeCl4合成方法的具体实施过程：以摩尔质量比1:1.1将N-甲基咪唑与氯乙烷加入三口烧瓶中，70℃油浴磁力搅拌24h得粘稠粗产物，乙酸乙酯洗涤反应物，减压蒸馏除杂，50℃真空干燥即得类白色中间体[Emim]Cl；并以摩尔质量比1:1将[Emim]Cl与三氯化铁(FeCl3)进行室温(25±5℃)置换反应2-5h，即得浅绿色终产物[Emim]FeCl4，产率和纯度达92％以上。
本发明所述的离子液体-复合菌剂体系，其以一定质量浓度(分数)的离子液体和一定体积的复合菌剂混拌均匀制得，并置5-20℃阴暗处保藏待用。作为所述复合菌剂的优选，所述复合菌剂的制备：潮湿纤维单胞菌(Cellulomonas uda)、白色链霉菌(Streptomyces albus)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)和白腐菌(Phanerochaetcchrysosporium)经最适培养发酵、等体积混匀，并以0.15％的体积分数添加质量浓度为60g/L的鼠李糖脂水溶液。经测定，所述复合菌剂各纤维素酶活力EG、CBH和β-G分别为36.2、42.8和32.6U·mL-1。
作为所述离子液体-复合菌剂体系的优选，所述离子液体选用质量分数为60-90％的1-乙基-3-甲基咪唑氯化铁盐水溶液；在所述离子液体-复合菌剂体系中，所述1-乙基-3-甲基咪唑氯化铁盐水溶液与潮湿纤维单胞菌、白色链霉菌、热带假丝酵母、白腐菌混合发酵液的体积相同。进一步优选地，1-乙基-3-甲基咪唑氯化铁盐水溶液的质量份数为75％。
另外，本发明还提供了所述离子液体-复合菌剂体系的制备方法，其包括：
1-乙基-3-甲基咪唑氯化铁盐离子液体的合成，并配制成水溶液；
潮湿纤维单胞菌、白色链霉菌、热带假丝酵母、白腐菌的发酵液混合，向混合发酵液中添加鼠李糖脂水溶液，形成复合菌剂；
1-乙基-3-甲基咪唑氯化铁盐水溶液和复合菌剂混合均匀，即得所述离子液体-复合菌剂体系。
作为所述离子液体-复合菌剂体系的制备方法的优选，所述1-乙基-3-甲基咪唑氯化铁盐的合成方法为：N-甲基咪唑和氯乙烷于70℃反应24h，经除杂干燥得中间体；所得中间体和三氯化铁于25±5℃反应2-5h；
所述N-甲基咪唑、氯乙烷的摩尔质量比为1:1.1；
所述中间体、三氯化铁的摩尔质量比为1:1。
作为所述离子液体-复合菌剂体系的制备方法的优选，所述1-乙基-3-甲基咪唑氯化铁盐水溶液的质量份数为60-90％；所述鼠李糖脂水溶液的质量浓度为60g/L，以体积分数计，鼠李糖脂水溶液的添加量为所述混合发酵液的0.15％；所述1-乙基-3-甲基咪唑氯化铁盐水溶液和复合菌剂等体积混合。
再者，本发明还提供了所述离子液体-复合菌剂体系在促木质纤维素酶解方面的应用。
关于所述离子液体-复合菌剂体系在促木质纤维素酶解的效果评价，具体地：以体积/质量比1:10添加离子液体-复合菌剂体系混悬液于粉碎过50目筛的园林生物质中，并以质量/体积比1:1.2添加柠檬酸-磷酸氢二钾缓冲液于酶解体系中，在50℃、120r·min-1条件下连续降解15天。每3天取样待测，以园林生物质降解失重率、纤维素酶活力和木质素含量作为考察指标，评估离子液体-复合菌剂体系促木质纤维素的酶解效果。经分析，所述离子液体-复合菌剂体系促木质纤维素的酶解试验效果为，园林生物质的降解失重率在酶解末期达到52.6％、总纤维素酶活力最高值为185.1U·mL-1，比单纯添加复合菌剂分别提高了66.5％和59％；木质素含量在酶解末期降至11.4％，比单纯添加复合菌剂减少了38.3％。
关于所述离子液体-复合菌剂体系在促木质纤维素酶解的应用，包括所述离子液体水溶液对木质纤维素的溶解和复合菌剂对木质纤维素的水解过程。作为所述应用的进一步优选，具体地：以体积/质量比1:10添加离子液体-复合菌剂体系混悬液于粉碎过50目筛的园林生物质中，以尿素水溶液调节园林生物质的碳氮比(C/N)为25:1、含水率为60±5％，置室温通风处进行酶解发酵，利用WatchDog1000系列生态因子记录仪实时监测堆体温度和含水率，每48h翻堆取样一次，补水保持60±5％的含水率。通过考察园林生物质降解失重率和木质素含量，评估离子液体-复合菌剂体系促木质纤维素的酶解应用。经试验获知，园林生物质的酶解周期为21-30天、高温期(≥50℃)维持12-21天，最高温达62.1-72.4℃，最终降解失重率达47.2-54.2％，木质素含量下降至8.5-10.6％。
与现有技术相比，本发明所述离子液体-复合菌剂体系的有益效果或优点主要体现在以下方面。
(1)所述离子液体-复合菌剂体系，包括离子液体和复合菌剂，所述离子液体和复合菌剂形成用于酶解木质纤维素的耦合体系。与已报道的离子液体协同酶制剂实现木质纤维素的酶解技术不同的是，本发明首次将离子液体水溶液与复合微生物菌剂进行有效耦合，利用微生物菌群代谢所产热量实现离子液体水溶液在温和条件下对木质纤维素的溶解、再生，进而促进持久性酶解效率的发挥，既减少离子液体的使用量和生物毒性，也实现了复合菌剂各降解酶的活力持久性与协同性。
(2)本发明合成了一种与所述复合微生物菌剂相配伍的离子液体1-乙基-3-甲基咪唑氯化铁盐，并将其配制成一定浓度的水溶液使用。优选地，离子液体1-乙基-3-甲基咪唑氯化铁盐配制成质量份数为75％的[Emim]FeCl4水溶液，降低了对复合微生物菌的毒性，对应酶活力更强，利于促木质纤维素分子内和分子间氢键的断裂。
(3)酶解反应是一个复杂的非均相反应体系。纤维素酶主要是由葡聚糖内切酶、外切酶和糖苷酶构成的混合酶系，所述离子液体-复合菌剂体系通过协同作用实现纤维素和半纤维素的解聚，而对难降解的木质素则无显著作用。本发明以降解型复合微生物菌剂作为酶解体系组成，各微生物菌种的生物代谢不仅可协同表达纤维素酶，也可产生降解木质素的酶系。复合菌剂的有效活菌数和纤维素酶活力符合《农用微生物菌剂(GB20287-2006)》中有机物料腐熟剂产品粉剂的指标要求，即不低于0.50×108个/mL和30U/mL。纤维素经酶解产生的小分子单糖为微生物代谢提供碳源，从而有利于木质素过氧化物酶和漆酶的产生与表达，并形成持久的复合酶解体系。因此，所述离子液体-复合菌剂体系的酶类型与活力更为全面有效，可高效实现木质纤维素的水解。
(4)离子液体通常都是在高温熔融状态下实现纤维素晶型的转变和和重排，是一个高能耗过程、且存在应用局限性。本发明以较为温和(50℃)的条件实现木质纤维素的溶解再生，该预处理过程不仅可实现离子液体水溶液对木质纤维的部分溶解，也具有促进复合微生物菌剂的酶代谢，有利于维持离子液体-复合菌剂酶解体系的稳定性。因此，在离子液体-复合菌剂酶解木质纤维素的应用中，复合微生物菌剂的发酵散热过程(30-65℃)可完全实现离子液体水溶液对木质纤维素的溶解、再生，从而协同促进酶解应用。
(5)本发明给出了所述离子液体-复合菌剂体系在促木质纤维素酶解的应用。所述木质纤维素为园艺修剪物、枯枝落叶、水草浮萍、农林秸秆、果蔬次品等组分复杂的园林生物质。不同于单纯添加微生物菌剂酶解木质纤维素，本发明有效利用离子液体溶解、再生作用和复合菌剂协同酶解可快速实现园林生物质的高效降解，其中高温降解期(≥50℃)可维持12-21天、最高温达72℃，且降解剩余物中木质素含量下降了55.8-60.9％、有效活菌数不低于0.2×108个/g。
附图说明
图1为不同质量份数离子液体水溶液对园林生物质的溶解与再生结果。
图2为本发明所述离子液体-复合菌剂酶解体系的纤维素酶活力测定结果。
图3为本发明所述离子液体-复合菌剂体系促木质纤维素酶解试验结果。
图4为本发明所述离子液体-复合菌剂体系用于酶解园林生物质的试验一。
图5为本发明所述离子液体-复合菌剂体系用于酶解园林生物质的试验二。
图6为本发明所述离子液体-复合菌剂体系用于酶解园林生物质的试验三。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及有益效果更加清楚，以下结合实施例，对本发明作进一步详细阐述。
实施例1，离子液体[Emim]FeCl4的合成
本实施例给出离子液体1-乙基-3-甲基咪唑氯化铁盐([Emim]FeCl4)的一种优选合成方法。具体地，以N-甲基咪唑与氯乙烷为原料，N-甲基咪唑、氯乙烷的摩尔质量比为1:1.1，将N-甲基咪唑与氯乙烷投入三口烧瓶，70℃油浴磁力搅拌24h，得粘稠粗产物，乙酸乙酯洗涤粗产物，减压蒸馏除杂，50℃真空干燥即得类白色中间体[Emim]Cl；所述中间体[Emim]Cl与三氯化铁(FeCl3)以摩尔质量比1:1，在室温条件下(25±5℃)进行置换反应2-5h，即得浅绿色终产物[Emim]FeCl4。
本实施例提供的[Emim]FeCl4合成方法，离子液体[Emim]FeCl4的有机合成产率达95％以上、纯度为92-98％。下述实施例涉及的园林生物质的溶解(酶解)，均采用本实施例所述方法制备的离子液体[Emim]FeCl4。
实施例2，离子液体-复合菌剂体系的制备
本实施例所述离子液体-复合菌剂体系的制备主要包括离子液体[Emim]FeCl4的合成、微生物菌系的发酵培养、耦合体系的形成。
离子液体[Emim]FeCl4的合成参见实施例1。本领域技术人员应当知晓，高纯度离子液体通常均具有生物毒性，这种生物毒性在一定程度上随阳离子烷基侧链长度的增长呈现毒性增加的趋势。烷基链效应机理解释为：碳链越长则离子液体的亲脂性越强，对生物体细胞膜的吸附聚集力越强，更容易破坏细胞膜、灭活细胞。本实施例优选以离子液体的水溶液作为所述离子液体-复合菌剂体系的组成部分，将[Emim]FeCl4配制成水溶液，阳离子[Emim]+烷基侧链含有2个碳，阴离子为供电能力较强的金属氯化物FeCl4 -。通过园林生物质的溶解与再生试验确定[Emim]FeCl4水溶液的质量分数。在木质纤维素的酶解初期主要以离子液体水溶液形式进行园林生物质的溶解与再生。进一步优选地，离子液体[Emim]FeCl4配制成质量份数为60-90％的水溶液。不同质量份数离子液体水溶液对园林生物质的溶解与再生试验，参见实施例3。
基于本专利申请发明人的前期筛选，优选构建所得降解型复合微生物菌系，即与所述离子液体耦合形成所述离子液体-复合菌剂体系的复合菌剂。具体地，这种复合菌剂包括微生物菌发酵液和鼠李糖脂溶液。所述微生物菌发酵液由潮湿纤维单胞菌(Cellulomonas uda)、白色链霉菌(Streptomyces albus)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)和白腐菌(Phanerochaetc chrysosporium)经培养发酵、按一定比例混匀形成。进一步优选地，所述4种菌株的发酵液以等体积混合
本领域技术人员采用现有技术，可获知潮湿纤维单胞菌(Cellulomonas uda)、白色链霉菌(Streptomyces albus)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)和白腐菌(Phanerochaetc chrysosporium)最佳培养条件，并在最佳培养条件下获得各菌种的发酵液。本实施例所列上述菌种均保藏于陕西省科学院土壤资源与生物技术应用重点实验室，发酵适宜培养温度为30-65℃、最适pH值为6.5-8.0。在最佳培养条件下，所述4种菌株单独发酵至最高有效活菌数(cfu)分别在0.5-1.0×108个/mL以上。向混合发酵液中添加质量浓度为60g/L的鼠李糖脂(纯度为86％)水溶液，以体积分数计，所述鼠李糖脂溶液的添加量为潮湿纤维单胞菌、白色链霉菌、热带假丝酵母和白腐菌混合发酵液总量的0.15％。所述鼠李糖脂是一种生物型阴离子表面活性剂，可有效促离子液体与复合菌剂耦合，从而形成共溶体系。
本实施例所述离子液体-复合菌剂体系，优选为，一定浓度的[Emim]FeCl4水溶液与等体积复合菌剂体系混拌均匀制得，并置5-20℃阴暗处保藏待用。经测定，所述离子液体-复合菌剂体系的基础纤维素酶活力为111.6U·mL-1、最适温度为30-65℃、适宜pH为5.5-8.5。
实施例3，离子液体对园林生物质的溶解与再生试验
本实施例给出不同质量份数离子液体水溶液对园林生物质的溶解与再生试验，试验结果见图1。
本实施例及所涉及的试验所采用的木质纤维素原料为园林生物质，主要由园艺修剪物、枯枝落叶构成，主要结构组成物的含量分别为纤维素39.3％、木质素21.5％、半纤维素17.6％，基本性质为有机质750g·kg-1、全碳436g·kg-1、全氮4.8g·kg-1、碳氮比(C/N)9:1、pH值7.7。
将不同质量份数的[Emim]FeCl4水溶液置于锥形瓶中，取50目过筛园林生物质投加于[Emim]FeCl4水溶液中，园林生物质与[Emim]FeCl4水溶液的质量比设定为1:10，50-70℃磁力搅拌3h，计算[Emim]FeCl4水溶液对园林生物质的溶解率与再生率。从图1可以看出，[Emim]FeCl4水溶液的质量份数设置为60、70、80、90％，对园林生物质的溶解率超过30％，再生率大于60％。基于此，经本专利申请发明人多次试验得出，质量份数为75％的[Emim]FeCl4水溶液，其微生物毒性较低，对应酶活力更强，利于促木质纤维素分子内和分子间氢键的断裂。另外，质量分数为75％的[Emim]FeCl4水溶液在50℃搅拌3h条件下，园林生物质的溶解率最大，为40.8％，对应木质纤维素的再生率达89.7％。因此，本实施例优选质量份数为75％的[Emim]FeCl4水溶液作为所述离子液体-复合菌剂体系的制备组分。
实施例4，离子液体-复合菌剂体系的纤维素酶活力测定和促木质纤维素酶解试验
本实施例给出所述离子液体-复合菌剂体系的纤维素酶活力测定和促木质纤维素酶解试验。所述离子液体-复合菌剂体系促木质纤维素酶解应用，包含离子液体水溶液对木质纤维素的溶解和复合菌剂对木质纤维素的水解两个连续过程。
本实施例及所涉及试验所采用的木质纤维素原料为园林生物质，主要由园艺修剪物、枯枝落叶构成，主要结构组成物的含量分别为纤维素39.3％、木质素21.5％、半纤维素17.6％，基本性质为有机质750g·kg-1、全碳436g·kg-1、全氮4.8g·kg-1、碳氮比(C/N)9:1、pH值7.7。
以体积/质量比1:10添加离子液体-复合菌剂体系混悬液于粉碎后的园林生物质物料中，并以质量/体积比1:(1-1.5)添加适当体积柠檬酸-磷酸氢二钾缓冲液于园林生物质酶解体系中，50℃、120r·min-1连续降解15天。
所述酶活力测定方法为，取适量稀释倍数的酶解液0.5mL，加入1％CMC-Na柠檬酸缓冲液(pH 5.0)1.5mL，于50℃恒温水浴30min，再加入3mLDNS试剂，煮沸5min。利用TECAN
Figure BDA0002616641650000092
200 PRO酶标仪在540nm处测定吸光值并根据葡萄糖标准曲线折算内切酶活力；外切酶和苷酶测定所加入的反应底物为脱脂棉和脱脂滤条各50mg，所用缓冲液为1.5mL的0.05mol·L-1柠檬酸(pH 5.0)，酶促反应时间均为60min，其它测定条件上同。
Figure BDA0002616641650000091
式中，酶活力单位为U·mL-1；a为葡萄糖标准曲线查得还原糖生成量，μg·mL-1；V为酶解液稀释定容体积，mL；N为参与反应酶液体积(mL)，0.5；T为酶促反应时间(min)，内切酶为30，外切酶和苷酶为60；Mg为葡萄糖分子质量，180。
所述木质素含量测定原理为木质素酚羟基与乙酰溴发生乙酰化溴代反应，其衍生物在280nm处具有特征吸收峰，且吸光值的高低与其含量呈正相关(Hatfield et al.,2005)。具体测定方法为，称取降解剩余物样品5-10mg于25mL具塞玻璃试管中，先后加入5mL体积分数为25％的乙酰溴乙酸溶液和0.2mL 0.7mol·L-1高氯酸溶液，于70℃恒温反应60min，再加入5mL 2mol·L-1氢氧化钠溶液终止反应，并用乙酸定容，酶标仪280nm处测定其吸光值。以乙酸作为空白对照，用碱性木质素标准品做标准工作曲线(线性相关系数R2≥0.995)，折算木质素含量，其含量变化依据公式计算。
Figure BDA0002616641650000101
式中，mi为木质素质量，g；mn为降解剩余物质量，g；i和n为第几天的取样，3,6…12,15。
图2给出了所述离子液体-复合菌剂酶解体系的纤维素酶活力测定结果。经测定，酶解初期，本实施例所述复合菌剂的纤维素酶活力EG、CBH和β-G分别为36.2、42.8和32.6U·mL-1。所述离子液体-复合菌剂酶解体系的总纤维素酶活力最高值为185.1U·mL-1，比单纯添加复合菌剂的酶活力提高了59％。图3给出了所述离子液体-复合菌剂体系促木质纤维素酶解试验结果。从图3可以看出，所述园林生物质的降解失重率在酶解末期达到52.6％，比单纯添加复合菌剂的降解失重率提高了66.5％；所述木质素含量在酶解末期降至11.4％，比单纯添加复合菌剂的木质素含量减少了38.3％。
实施例5，园林生物质酶解试验
本实施例给出所述离子液体-复合菌剂酶解体系的园林生物质酶解试验，其中[Emim]FeCl4水溶液的质量份数为75％。
本实施例及所涉及的试验所采用的木质纤维素原料为园林生物质，主要由园艺修剪物、枯枝落叶构成，主要结构组成物的含量分别为纤维素39.3％、木质素21.5％、半纤维素17.6％，基本性质为有机质750g·kg-1、全碳436g·kg-1、全氮4.8g·kg-1、碳氮比(C/N)9:1、pH值7.7。
园林生物质酶解试验方案为：粉碎园林生物质，过50目筛，向筛分后的园林生物质以体积/质量比1:10添加实施例2所述的离子液体-复合菌剂体系，形成园林生物质酶解体系；向园林生物质酶解体系中以质量/体积比1:1.2添加柠檬酸-磷酸氢二钾缓冲液，50℃、120r·min-1连续降解15天，每3天取2个平行实验组分析其酶解情况，测定指标包括酶解液纤维素酶活力、降解失重率和木质素含量。
试验一
取50目过筛园林生物质5kg置于泡沫保温箱，物料高度不低于25cm，采用尿素水溶液调节物料碳氮比(C/N)至25:1、含水率为60±5％，以体积/质量比1:10添加离子液体-复合菌剂体系混悬液于园林生物质物料中，置室温通风处进行酶解发酵。本试验利用WatchDog1000系列生态因子记录仪实时监测堆体温度和含水率，每48h翻堆并取样一次，补水保持含水率为60±5％。
监测结果如图4所示，第60h时堆体进入高温期(≥50℃)并维持12天，最高温度达62.1℃，第21天时堆体温度降至室温、酶解结束，降解失重率由酶解初期(第2天)的8.6％升至末期的47.2％，木质素含量由20.8％降至10.6％。
试验二
取50目过筛园林生物质100kg置于60×60×90cm挡体中，物料高度不低于50cm，利用尿素水溶液调节物料碳氮比(C/N)至25:1、含水率为60±5％，以体积/质量比1:10添加离子液体-复合菌剂体系混悬液于园林生物质物料中，置室温通风处进行酶解发酵。利用WatchDog1000系列生态因子记录仪实时监测堆体温度和含水率，每48h翻堆并取样一次，补水保持含水率为60±5％。
监测结果如图5所示，第52h时堆体进入高温期(≥50℃)并维持15天，最高温度达68.5℃，第24天时堆体温度降至室温、酶解结束，降解失重率由酶解初期(第2天)的8.8％升至末期的50.5％，木质素含量由20.1％降至8.7％。
试验三
取50目过筛园林生物质600kg置于150×120×120cm挡体中，物料高度不低于100cm，利用尿素水溶液调节物料碳氮比(C/N)至25:1、含水率为60±5％，以体积/质量比1:10添加离子液体-复合菌剂体系混悬液于园林生物质物料中，置室温通风处进行酶解发酵。利用WatchDog1000系列生态因子记录仪实时监测堆体温度和含水率，每48h翻堆并取样一次，补水保持含水率为60±5％。
监测结果如图6所示，第42h时堆体进入高温期(≥50℃)并维持21天，最高温度达72.4℃，第30天时堆体温度降至室温、酶解结束，降解失重率由酶解初期(第2天)的9.4％升至末期的54.2％，木质素含量由20.5％降至8.5％。
综上，通过本实施例得出，园林生物质的酶解周期为21-30天、高温期(≥50℃)维持12-21天，最高温达62.1-72.4℃，最终降解失重率达47.2-54.2％，木质素含量下降至8.5-10.6％。
上面结合实施例对本发明做了进一步的叙述，但本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。

Claims (5)

1.一种离子液体-复合菌剂体系，其特征在于，包括离子液体、含有鼠李糖脂溶液的复合菌剂，所述离子液体和复合菌剂形成用于酶解木质纤维素的耦合体系；
所述离子液体含有1-乙基-3-甲基咪唑氯化铁盐，所述1-乙基-3-甲基咪唑氯化铁盐水溶液的质量份数为60-90%；
所述复合菌剂包括微生物菌发酵液和鼠李糖脂溶液；所述微生物菌发酵液由潮湿纤维单胞菌（Cellulomonas uda）、白色链霉菌（Streptomyces albus）、热带假丝酵母（Candidatropicalis）和白腐菌（Phanerochaetc chrysosporium）等比例混合；潮湿纤维单胞菌（Cellulomonas uda）、白色链霉菌（Streptomyces albus）、热带假丝酵母（Candidatropicalis）和白腐菌（Phanerochaetc chrysosporium）的发酵液混合，向混合发酵液中添加质量浓度为60 g/L的鼠李糖脂水溶液，以体积分数计，鼠李糖脂水溶液的添加量为所述混合发酵液的0.15 %，形成复合菌剂；
在所述离子液体-复合菌剂体系中，所述1-乙基-3-甲基咪唑氯化铁盐水溶液与复合菌剂发酵液的体积相同。
2.根据权利要求1所述的离子液体-复合菌剂体系，其特征在于，所述1-乙基-3-甲基咪唑氯化铁盐的合成方法为：N-甲基咪唑和氯乙烷于70 ℃反应24 h，经除杂干燥得中间体；所得中间体和三氯化铁于25±5 ℃反应2-5 h；
所述N-甲基咪唑、氯乙烷的摩尔质量比为1:1.1；
所述中间体、三氯化铁的摩尔质量比为1:1。
3.制备权利要求1所述离子液体-复合菌剂体系的方法，其特征在于，包括，
1-乙基-3-甲基咪唑氯化铁盐离子液体的合成，并配制成水溶液，所述1-乙基-3-甲基咪唑氯化铁盐水溶液的质量份数为60-90 %；
潮湿纤维单胞菌、白色链霉菌、热带假丝酵母、白腐菌的发酵液混合，向混合发酵液中添加质量浓度为60 g/L的鼠李糖脂水溶液，以体积分数计，鼠李糖脂水溶液的添加量为所述混合发酵液的0.15 %，形成复合菌剂；
1-乙基-3-甲基咪唑氯化铁盐水溶液和复合菌剂混合均匀，即得所述离子液体-复合菌剂体系，所述1-乙基-3-甲基咪唑氯化铁盐水溶液和复合菌剂等体积混合；
所述1-乙基-3-甲基咪唑氯化铁盐的合成方法为：N-甲基咪唑和氯乙烷于70 ℃反应24h，经除杂干燥得中间体；所得中间体和三氯化铁于25±5 ℃反应2-5 h；
所述N-甲基咪唑、氯乙烷的摩尔质量比为1:1.1；
所述中间体、三氯化铁的摩尔质量比为1:1。
4.权利要求1所述离子液体-复合菌剂体系在促木质纤维素酶解方面的应用。
5.根据权利要求4所述促木质纤维素酶解的应用，包括所述离子液体水溶液对木质纤维素的溶解和复合菌剂对木质纤维素的水解过程。
CN202010771093.3A 2020-08-04 2020-08-04 一种离子液体-复合菌剂体系 Active CN112063544B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010771093.3A CN112063544B (zh) 2020-08-04 2020-08-04 一种离子液体-复合菌剂体系

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010771093.3A CN112063544B (zh) 2020-08-04 2020-08-04 一种离子液体-复合菌剂体系

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112063544A CN112063544A (zh) 2020-12-11
CN112063544B true CN112063544B (zh) 2022-03-25

Family

ID=73657011

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010771093.3A Active CN112063544B (zh) 2020-08-04 2020-08-04 一种离子液体-复合菌剂体系

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112063544B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118127099B (zh) * 2024-05-06 2024-07-19 惠州市绿色能源与新材料研究院 秸秆预处理离子液体及方法、再生秸秆及其制备与酶解液

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103778983B (zh) * 2012-10-24 2017-05-03 北京大学 一种离子液体直接溶解二氧化铀或乏燃料氧化物的方法
WO2015097685A1 (en) * 2013-12-26 2015-07-02 The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (Aro) (Volcani Center) Lactic acid bacteria genetically modified to express enzymes of the cellulolytic system
CN107641104A (zh) * 2017-11-24 2018-01-30 林州市科能材料科技有限公司 1‑乙基‑3‑甲基咪唑氯盐离子液体的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN112063544A (zh) 2020-12-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kuo et al. Hydrolysis of orange peel with cellulase and pectinase to produce bacterial cellulose using Gluconacetobacter xylinus
Song et al. Production and characterization of cellulases and xylanases of Cellulosimicrobium cellulans grown in pretreated and extracted bagasse and minimal nutrient medium M9
CN102119219A (zh) 木质纤维素材料的降解
CN101974436A (zh) 一种木质纤维素降解菌及其应用
KR101150280B1 (ko) 셀룰라아제를 생산하는 넥트리아 시나바리나 및 이를 이용한 셀룰로오스의 당화방법
CN101717728B (zh) 一株青霉菌及其用于催化水解木质纤维素的用途
CN101693910A (zh) 一种微生物酶法生产纤维低聚糖新工艺
Nutongkaew et al. Bioconversion of oil palm trunk residues hydrolyzed by enzymes from newly isolated fungi and use for ethanol and acetic acid production under two-stage and simultaneous fermentation
CN101603059B (zh) 一种秸秆原料同步糖化发酵生产丁二酸的方法
CN108486017A (zh) 一种园林废弃物降解菌剂
CN101985641A (zh) 一种利用麦秆制备细菌纤维素的方法
CN106047730B (zh) 草酸青霉eu2101及其在制备纤维素酶制剂与降解纤维素中的应用
CN112063544B (zh) 一种离子液体-复合菌剂体系
US10030236B2 (en) Process for the production of an enzymatic cocktail using liquid residues from a process for the biochemical conversion of lignocellulosic materials
CN113151089B (zh) 一种水稻秸秆酵储料、制备方法及其用途
Karpe et al. Comparative degradation of hydrothermal pretreated winery grape wastes by various fungi
CN101705217B (zh) 一种联产木聚糖酶和纤维素酶的方法
CN106434603B (zh) 一种利用亚硫酸铵法制浆废液补料发酵生产纤维素酶的方法
CN108424896B (zh) 一种混菌发酵玉米秸秆糠醛渣生产纤维素酶的方法
CN103045697A (zh) 一种木质纤维素生物质的综合利用方法
Lv et al. Characterization of extracellular and substrate-bound cellulases from a mesophilic sugarcane bagasse-degrading microbial community
CN107488680A (zh) 一种以含碳原料制备生物甲烷气体的方法
CN109797119A (zh) 一种降解秸秆纤维素的复合菌剂
CN102286572A (zh) 一种以秸秆为原料制备可发酵糖液的方法
CN102399766B (zh) 一种用于改善馒头品质的木聚糖酶的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant