CN102517277A

CN102517277A - 载体表面相转化法成膜固定化酶技术

Info

Publication number: CN102517277A
Application number: CN2012100078948A
Authority: CN
Inventors: 周小凡; 郭青; 马金霞; 吴伟兵
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2012-01-12
Filing date: 2012-01-12
Publication date: 2012-06-27

Abstract

本发明涉及一种酶固定化的方法。该方法以多孔性材料为载体，让酶留着在多孔载体上，再以水不溶成膜材料溶液包裹多孔性载体，待成膜材料通过相转化后，在多孔性载体表面形成薄膜而将酶固定化的方法。

Description

载体表面相转化法成膜固定化酶技术

一、技术领域

本发明属于酶固定化技术领域，涉及一种制备固定化酶的工艺方法。

二、背景技术

固定化酶技术是20世纪60年代发展起来的一项生物工程技术，是使生物酶得到广泛而有效利用的重要手段。酶的固定化“Immobilization of Enzymes”是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，进行其特有的催化反应，并可回收及重复利用的技术。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处，呈现储存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等优点。固定化酶的研究不仅在化学生物学、生物工程医学及生命科学等领域异常活跃，而且因为具有节省能源与资源、减少污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。

传统化固定化酶方法主要有以下几种：(1)吸附法。即利用形成离子键、物理吸附等方法，将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式。该方法虽易于操作，但吸附力弱，已固定的酶极易脱落。(2)共价结合法。先借助于一些方法在载体上引进一活泼基团，然后，此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应，形成共价键的方法。该方法固定的酶稳定性较好，但在酶与活泼基团反应时易引起(3)包埋法。主要分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法。凝胶包埋法是将酶或酶菌体包埋在凝胶内部的微孔中，而微胶囊包埋法是将酶包埋在高分子半透膜中。(4)交联法。利用双功能或多功能交联试剂，在酶分子和交联试剂之间形成共价键，采用不同的交联条件和在交联体系中添加不同的材料，可以产生物理性质各异的固定化酶。交联法一般作为其它固定化方法的辅助手段。

载体表面向转化法成膜固定化酶技术是以多孔性材料为载体，让酶留着在多孔载体上，再以水不溶成膜材料溶液包裹多孔性载体，待成膜材料通过相转化后，在多孔性载体表面形成薄膜而将酶固定化的方法。与传统的固定化酶方式相比，该方法大大缩短了固定化过程所需时间、成本低，使用水不溶成膜材料作为成膜剂后，可防止固定化酶使用时发生水溶现象，减少酶在使用过程中的流失，增加固定化酶重复使用的次数。

三、发明内容

本发明涉及一种酶固定化的方法，其包括如下步骤：

步骤1：酶用蒸馏水制成1～10mg/ml的酶液，成膜材料用有机溶剂溶解配置成1～35％的溶液；

步骤2：取酶液1ml，与1～300mg多孔性载体混合，搅拌混匀，让多孔载体充分吸收酶液，将多孔载体取出并置于室温25℃干燥；

步骤3：多孔载体干燥后，加入成膜材料溶液0.5～2ml，使多孔载体与成膜材料溶液充分混合，然后在4℃冰箱中干燥；

步骤4：用缓冲液或蒸馏水冲洗干净，直至检测不出蛋白质，即得多孔载体表面成膜的固定化酶。

与现有技术相比，本发明具有诸多优势：

1、本发明采用多孔载体作为载体，提高了固定化酶的比表面积，并且显著地提高了固定化酶的活力。

2、本发明在应用酶学领域中广泛适用，理论上适用于几乎所有类型的酶的固定化。

3、本发明对多孔载体的选用范围较广泛，理论上可选取几乎所有类型的多孔载体，包括无机载体、有机载体和复合载体。

4、本发明对成膜材料的选用范围较广泛，理论上可选取几乎所有类型的成膜材料。

5、本发明使用水不溶成膜材料，可防止固定化酶使用时发生水溶现象。

6、本发明可根据具体工程需要在多孔载体表面使用成膜材料进行多次成膜固定。

7、本发明固定化速度快，制备工艺简单，易操作，成本低，能够实现大量生产。

8、本发明可根据产品不同的需要，选取不同尺寸的载体来制备不同尺寸的产品。

四、具体实施方式

实例一：(1)把葡萄糖氧化酶(GOD)配置成浓度为1mg/mL的酶液，丙烯酸树脂(固含量46％)溶于丙酮，配置成0.5g/ml的溶液；(2)取上述配置好的1mL酶液，在其中加入0.3g空心砖，搅拌均匀，取出空心砖于室温干燥；(3)空心砖工燥后，加入1mL丙烯酸树脂溶液，搅拌使其充分混合，取出空心砖置于4℃的冰箱干燥；(4)用蒸馏水冲洗干净备用。

固定化GOD的性能如下表：

	固定化酶	游离酶
			最适反应温度(℃)	40℃	30℃
最适反应pH	7.0	6.0
			70℃保温100min酶活回收率(％)	30％	5％
重复使用7次酶活回收率(％)	60％	/
			4℃存储30d后酶活回收率(％)	70％	5％

实例二：(1)先将α-淀粉酶在40℃恒温下活化30min并配置成4mg/ml的酶溶液，将乙基纤维素用乙酸乙酯溶解，配置成2％的溶液；(2)将α-淀粉酶溶液1ml与多孔海绵载体4mg混合，反复挤压，让海绵载体充分吸收酶液，完全吸收后将海绵载体挤干，并置于空气中干燥；(3)海绵载体干燥后，加入2ml的乙基纤维素溶液，搅拌以使两者充分混合，然后取出海绵载体置于4℃的冰箱干燥；(4)用蒸馏水冲洗干净备用。

固定化α-淀粉酶的性能如下表：

实例三：(1)中性蛋白酶配置成6mg/ml的酶溶液，聚砜用二甲基乙酰胺溶解，配置成5％的溶液；(2)将中性蛋白酶溶液1ml与陶粒0.1g混合，搅拌混匀，取出陶粒并置于空气中干燥；(3)陶粒干燥后，加入1ml的聚砜溶液，搅拌以使两者充分混合，然后取出陶粒置于4℃的冰箱干燥；(4)重复步骤(3)；(5)用蒸馏水冲洗干净备用。

固定化中性蛋白酶的性能如下表：

实例四：(1)果胶酶配置成8mg/ml的酶溶液，将醋酸纤维素用甲酸甲酯溶解，配置成1％的溶液；(2)取果胶酶溶液1ml与多孔陶瓷0.2g混合，搅拌混匀，取出陶粒并置于空气中干燥；(3)加入2ml醋酸纤维素溶液，搅拌以使两者充分混合，然后取出多孔陶瓷置于4℃的冰箱干燥；(4)重复步骤(3)；(5)用蒸馏水冲洗干净备用。

固定化果胶酶的性能如下表：

Claims

1.一种在多孔载体表面通过成膜材料的相转化成膜制备固定化酶的方法，其特征在于：步骤如下，

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤3可重复操作。

3.根据权利要求1所述的多孔载体，其形状为颗粒状。

4.根据权利要求1所述的多孔载体，选自下组：海绵、陶粒、多孔陶瓷、空心砖

5.根据权利要求1所述的酶，选自下组：α-淀粉酶、中性蛋白酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶。

6.根据权利要求1所述的成膜材料，其特征在于：只溶于有机溶剂，而不溶于水。

7.根据权利要求1所述的成膜材料，选自下组：丙烯酸树脂胶粘剂、聚砜、纤维素衍生物。

8.根据权利要求1所述的有机溶剂，选自下组：氢化烃类、芳香烃类、脂肪烃类、脂环烃类、卤化烃类、萜烯烃、醇类、醛类、胺类、醚类、酯类、酮类、二醇衍生物、杂环化物、含氮化合物、含硫化合物。