CN101470052B - 集蛋白质收集和酶解于一体的样品预处理装置及其制备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种样品预处理装置，来提高蛋白质分析速度，即集蛋白质收集和酶解于一体的样品预处理装置及其制备，包括一带有上盖的离心管，其特征在于：离心管的上盖中部开设有一个孔，在离心管的内壁上贴敷有环状的中空多孔刚性整体基质层，基质层材料的表面通过修饰基质的活性基团固定有酶。该装置具有样品处理量大、蛋白质酶解速度快、制作方法简单、成本低等优点，可用作蛋白质样品收集后的快速酶解。在高通量蛋白质研究方面具有很好的实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种样品预处理装置，来提高蛋白质分析速度，即集蛋白质收集和酶解于一体的样品预处理装置及其制备。本发明通过在离心管内合成固定化酶的整体材料，实现蛋白质收集同时的快速酶解。同时，该装置还可以作为样品瓶，用于贮存酶解产物。
背景技术
在复杂蛋白质样品的分析过程中，通常包含蛋白质混合物预分级、馏分收集、自由溶液酶解、肽段分离和蛋白质鉴定等步骤。其中馏分收集和酶解均属于样品预处理过程。然而，自由溶液酶解具有许多缺点，如酶解时间长(需要十几个小时)、蛋白酶不能被重复利用、且易自降解等缺陷。近年来，为了克服上述缺点，人们在自由溶液酶解的基础上发展了几种蛋白质快速酶解的方法。其中微波辅助酶解(Lo CY等，Journal of proteomeresearch，2007，6，887-893，Kweon等，Anal Chem，2006，78，1743-1749)和表面活性剂辅助酶解(Mariah C.Ruth等，Journal of proteome research，2006，5，709-719)可将酶解时间缩短至几小时。然而，这两种技术仍然不能够满足高通量蛋白质分离分析的要求。近期人们将蛋白酶固载在基质上，制得固定化酶反应器，进一步缩短了蛋白质的酶解时间。目前常用的固定化酶反应器均以色谱柱的形式存在。蛋白质直接进样到酶柱上进行快速酶解，并通过与之相连的色谱柱进行肽段分离和蛋白质的质谱鉴定(Jicheng Duan等，Journal of chromatography A，2006，1106，165-174.)。然而这种方法只适于简单样品的分析。对于更复杂的样品，必须对蛋白预分离后再进行酶解、肽段分离和蛋白质鉴定。在此过程中，以酶柱形式进行酶解受到诸多因素的制约。(1)蛋白质酶解条件通常比较苛刻，难以与蛋白质分离的最佳条件兼容，特别是流量难以匹配；(2)酶柱在处理一定量样品后活性会下降，而且难以再生；(3)目前的酶柱反应器只适合于处理微升或纳升级样品。
要想提高蛋白质分离鉴定的通量，必须发展具有样品处理量大、蛋白质酶解速度快、制作方法简单、成本低等优点的蛋白质酶解反应器。此外，为节省操作步骤，最好能将蛋白质的收集和酶解同时进行。
发明内容
本发明的目的在于提供一种集蛋白质收集和酶解于一体的样品预处理装置及其制备，通过在离心管内合成固定化酶的整体材料，实现蛋白质收集同时的快速酶解。同时，该装置还可以作为样品瓶，用于贮存酶解产物。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种集蛋白质收集和酶解于一体的样品预处理装置，包括一带有上盖 的离心管，离心管的上盖中部开设有一个孔，在离心管的内壁上贴敷有环状的中空多孔刚性整体基质层，基质层材料的表面通过修饰基质的活性基团固定有酶。
所述环状的基质层厚度常为为0.5-1mm；
所述预处理装置的制备方法为：通过原位光引发聚合的方式，在离心管内形成中空多孔刚性整体基质；再通过修饰基质的活性基团将酶固定在材料表面，实现蛋白质的收集和快速酶解(可同时用于蛋白质的收集和快速酶解)；具体为：
1)先在离心管盖上打一孔，然后按比例将的单体、交联剂和致孔剂的混合溶液加入离心管中，超声混均；混合溶液中单体的质量含量为10％-40％、交联剂10％-40％、致孔剂(二元高级醇)50％；加入光引发剂后，将一截面与上盖上的孔相当的柱体插入混合溶液中，柱体上端处于混合溶液上表面上方，密封离心管后，通过紫外光照射引发反应5-15min；
2)反应结束后取出柱体，即可获得一种带有活性基团的中空多孔的刚性整体材料；
3)通过进一步修饰材料的活性基团，将酶固定在整体材料表面，制备集蛋白质收集和快速酶解于一体的样品预处理装置。
采用酶液浸泡整体材料的方式将酶固定于材料表面，所述酶为蛋白酶(如Trypsin，Endoproteinase Glu C)，酶液浓度为1-10mg/mL；所述单体为甲基丙烯酸缩水甘油酯和/或丙烯酰琥珀酰亚胺；交联剂为乙叉二甲基丙烯酸酯和/或N，N-甲叉双丙烯酰胺；致孔剂为环己醇和十二醇的混合液，其中环己醇占致孔剂总质量的20％-95％，十二醇占致孔剂总质量的5％-80％；光引发剂为α-二甲氧基-α-苯基苯乙酮DMPA或2，2`-偶氮双(2-甲基丙腈)AIBN，其用量为单体质量的0.5-1.5％；紫外光波长为200-400nm；所述进一步修饰的过程为加入质量浓度为5-15％修饰试剂浸泡整体材料，室温反应6-12h，采用的修饰材料为戊二醛。
本发明的有益效果为：
1.通过原位光引发聚合的方式，在离心管内形成中空多孔刚性整体基质。再通过修饰基质的活性基团将酶固定在材料表面，实现蛋白质的收集同时的快速酶解。同时，该装置还可以作为样品瓶，用于贮存酶解产物。
2.利用该装置可以处理不同容量的蛋白样品，能快速得到蛋白的酶解产物，以供蛋白质鉴定。
3.通过改变实心管管径和离心管体积，可制得不同容量的装置。
4.该装置具有样品处理量大、蛋白质酶解速度快、制作方法简单、成本低等优点，可用作蛋白质样品收集后的快速酶解。在高通量蛋白质研究方面具有很好的实用价值。
附图说明
图1为装置的制作示意图，a为实心管，b为离心管，c为反应溶液；
图2为制备的样品预处理装置；
图3为细胞色素c采用该装置酶解10分钟产物的色谱/质谱谱图。
具体实施方式
实施例1
集蛋白质收集和快速酶解于一体的样品预处理装置的制作
1)离心管的制作：在离心管b管盖上凿一个孔，孔径与实心管a的管径相当。
2)基质的制备：以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体，以乙叉二甲基丙烯酸酯为交联剂，制备多孔整体基质。称取甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)0.6g，乙叉二甲基丙烯酸酯(EDMA)0.4g，溶于1g环己醇/十二醇(质量比：50/50)混合溶剂中，超声10min，用铝箔将装有反应溶液的离心管包裹起来。快速称取1mg光引发剂DMPA，震荡30s。如图1所示，取0.8mL反应液c于离心管b中，插入实心管a后，放入紫外交联仪中光聚10min。
3)取出实心管a后，加甲醇于反应装置中浸泡4小时，然后加入29％氨水40℃反应4小时；
4)加入质量浓度5％的戊二醛室温反应2小时，然后加入2mg/mL蛋白酶溶液室温反应过夜。
5)加入25mMNaCNBH3室温反应6小时。
6)制作示意图如图1所示，实物图如图2所示。
实施例2
1)离心管的制作：在离心管b管盖上凿一个孔，孔径与实心管a的管径相当。
2)基质的制备：以甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体，以乙叉二甲基丙烯酸酯为交联剂，制备多孔整体基质。称取甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)0.6g，乙叉二甲基丙烯酸酯(EDMA)0.4g，溶于1g环己醇/十二醇(质量比：50/50)混合溶剂中，超声10min，用铝箔将装有反应溶液的离心管包裹起来。快速称取1mg光引发剂DMPA，震荡30s。如图1所示，取0.8mL反应液c于离心管b中，插入实心管a后，放入紫外交联仪中光聚10min。
3)取出实心管a后，加甲醇于反应装置中浸泡4小时，然后加入29％氨水40℃反应4小时。
4)加入质量浓度5％的戊二醛室温反应2小时，然后加入2mg/mL蛋白酶溶液室温反应过夜。
5)加入25mMNaCNBH3室温反应6小时。
6)将制备的集蛋白质收集和快速酶解为一体的样品预处理装置用于1mg/mL细胞色素C酶解，经37℃10min反应，取出酶解产物，采用μRPLC/MS/MS分析。色谱图如图3所示，经质谱检索，如表1所示，可鉴定出以下七条肽段：KTGQAPGFSYTDANKNK(电荷为+3)TGQAPGFSYTDANKNK(电荷为+2)，KTGQAPGFSYTDANK(电荷为+2)，TGQAPGFSYTDANK(电荷为+2)，MIFAGIKK(电荷为+1)， TGPNLHGLFGR(电荷为+2)KGEREDLIAYLK(电荷为+2)，序列覆盖率为46.15％。
表1
| Sequence | Peptide Mass[M+H+] | Charge | |
| 1 | KTGQAPGFSYTDANKNK | 1827.97 | 3 |
| 2 | TGQAPGFSYTDANKNK | 1699.8033 | 2 |
| 3 | KTGQAPGFSYTDANK | 1585.7002 | 2 |
| 4 | TGQAPGFSYTDANK | 1457.5273 | 2 |
| 5 | MIFAGIKK | 908.1871 | 1 |
| 6 | TGPNLHGLFGR | 1169.3185 | 2 |
| 7 | KGEREDLIAYLK | 1435.651 | 2 |
| Sequence coverage(％) | 46.15 |
[0039] 色素C
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院大连化学物理研究所
<120>集蛋白质收集和酶解于一体的样品预处理装置及其制备
<130>
<160>7
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>17
<212>PRT
<213>细胞色素C
<220>
<221>SIMILAR
<222>(1)..(17)
<223>
<400>1
Lys Thr Gly Gln Ala Pro Gly Phe Ser Tyr Thr Asp Ala Asn Lys Asn
1 5 10 15
Lys
<210>2
<211>16
<212>PRT
<213>细胞色素C
<220>
<221>SIMILAR
<222>(1)..(16)
<223>
<400>2
色素C
Thr Gly Gln Ala Pro Gly Phe Ser Tyr Thr Asp Ala Asn Lys Asn Lys
1 5 10 15
<210>3
<211>15
<212>PRT
<213>细胞色素C
<220>
<221>SIMILAR
<222>(1)..(15)
<223>
<400>3
Lys Thr Gly Gln Ala Pro Gly Phe Ser Tyr Thr Asp Ala Asn Lys
1 5 10 15
<210>4
<211>14
<212>PRT
<213>细胞色素C
<220>
<221>SIMILAR
<222>(1)..(14)
<223>
<400>4
Thr Gly Gln Ala Pro Gly Phe Ser Tyr Thr Asp Ala Asn Lys
1 5 10
<210>5
<211>8
<212>PRT
<213>细胞色素C
<220>
<221>SIMILAR
<222>(1)..(8)
<223>
色素C
<400>5
Met Ile Phe Ala Gly Ile Lys Lys
1 5
<210>6
<211>11
<212>PRT
<213>细胞色素C
<220>
<221>SIMILAR
<222>(1)..(11)
<223>
<400>6
Thr Gly Pro Asn Leu His Gly Leu Phe Gly Arg
1 5 10
<210>7
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<212>PRT
<213>细胞色素C
<220>
<221>SIMILAR
<222>(1)..(12)
<223>
<400>7
Lys Gly Glu Arg Glu Asp Leu Ile Ala Tyr Leu Lys
1 5 10
Claims (5)
1.一种集蛋白质收集和酶解于一体的样品预处理装置，包括一带有上盖的离心管，其特征在于：离心管的上盖中部开设有一个孔，在离心管的内壁上贴敷有环状的中空多孔刚性有机聚合物整体基质层，基质层材料的表面通过修饰基质的活性基团固定有酶；单体为甲基丙烯酸缩水甘油酯和/或丙烯酰琥珀酰亚胺；交联剂为乙叉二甲基丙烯酸酯和/或N，N-甲叉双丙烯酰胺；致孔剂为环己醇和十二醇的混合液，其中环己醇占致孔剂总质量的20％-95％，十二醇占致孔剂总质量的5％-80％。
2.按照权利要求1所述预处理装置，其特征在于：所述环状的基质层厚度为0.5-1mm。
3.一种权利要求1所述预处理装置的制备方法，其特征在于：通过原位光引发聚合的方式，在离心管内形成中空多孔刚性有机聚合物整体基质；再通过修饰基质的活性基团将酶固定在材料表面，实现蛋白质的收集和快速酶解；
具体为：1)先在离心管盖上打一孔，然后按比例将单体、交联剂和致孔剂的混合溶液加入离心管中，超声混均；混合溶液中单体的质量含量为10％-40％、交联剂10％-40％、致孔剂50％；加入光引发剂后，将一截面与上盖上的孔相当的柱体插入混合溶液中，柱体上端处于混合溶液上表面上方，密封离心管后，通过紫外光照射引发反应5-15min；
2)反应结束后取出柱体，加甲醇于反应装置中浸泡4小时，然后加入29％氨水40℃反应4小时，即可获得一种带有活性基团的中空多孔的刚性整体材料；
3)通过进一步修饰材料的活性基团，将酶固定在整体材料表面，加入25mM NaCNBH3室温反应6小时，制备集蛋白质收集和快速酶解于一体的样品预处理装置；
其中，所述单体为甲基丙烯酸缩水甘油酯和/或丙烯酰琥珀酰亚胺；所述交联剂为乙叉二甲基丙烯酸酯和/或N，N-甲叉双丙烯酰胺；所述致孔剂为环己醇和十二醇的混合液，其中环己醇占致孔剂总质量的20％-95％，十二醇占致孔剂总质量的5％-80％；
所述光引发剂为DMPA或AIBN，其用量为单体质量的0.5-1.5％；紫外光波长为200-400nm。
4.按照权利要求3所述制备方法，其特征在于：采用酶液浸泡整体材料的方式将酶固定于材料表面，所述酶为蛋白酶，酶液浓度为1-10mg/mL。
5.按照权利要求3所述制备方法，其特征在于：所述进一步修饰的过程为加入质量浓度为5-15％修饰试剂浸泡整体材料，室温反应6-12h，采用的修饰试剂为戊二醛。
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