CN105771311B - 一种采用动态轴向压缩柱纯化混合提取物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种采用动态轴向压缩柱纯化混合提取物的方法，包括如下步骤：(A)将混合提取物稀释、注入平衡后的动态轴向压缩柱分离纯化，混合提取物的上样浓度控制在0.5‑8g/ml之间；(B)输送流动相进行洗脱，洗脱流速控制在0.5‑3.2L/min，收集含有目标产物的洗脱液，检测其纯度，即可。本发明实施例的采用动态轴向压缩柱纯化混合提取物的方法提高了生产效率，方法简单易操作，产品质量也更加容易控制，分离得到的产品纯度均达到96％以上，收率也能控制在90％以上。
Description
技术领域
本发明涉及生物科技技术及混合提取物分离纯化提取领域，具体而言，涉及一种采用轴向压缩柱纯化混合提取物的方法。
背景技术
维生素E、白藜芦醇等物质是属于一类具有重要的生理活性物质，具有抗癌、抗氧化、预防流产、抗突变等多重功效，广泛应用于食品、医药、保健品、化妆品和食品添加剂等领域，因此针对这类物质的开发和研究具有重要的经济效益和社会效益。
这类物质广泛存在于种子植物中，因此为了便于后续应用，提取和分离纯化属于该领域中重要研究的方向，尤其是分离纯化直接决定着最后该提取物质的应用价值，如果产品的得率和纯度不高会导致该提取物的生物活性偏低，降低了该物质的市场竞争价值。
现有技术中，针对该类生物活性物质的主要提取方法有有机溶剂提取法与水提法，水提法本身需要大量水，蒸发需要大量能量，且提取物中杂质多，因此不适于大规模生产，有机溶剂提取法得率低、能耗高、工序多、生产周期长、毒性大、易霉变，无法适应现在中药现代化的要求。比如CN1478776A公开了一种利用溶剂萃取提纯天然维生素E的方法，分离效率低，操作流程冗长，生产效率也低，难以实现工业化生产。CN1314353A和CN125395A均公开了一种采用超临界CO2提取和浓缩天然VE，得到的产品VE含量较低为40-70％，纯度本身比较低且对设备要求高，总收率低，操作过程控制难度大，生产效率也较低。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用动态轴向压缩柱纯化混合提取物的方法，该纯化分离方法对设备性能要求比较低，生产周期显著缩短，提高了生产效率，方法简单易操作，产品质量也更加容易控制，分离得到的产品纯度均达到96％以上，收率也能控制在90％以上，是个值得广泛推荐的纯化分离方法，为后续实施提供了可参考的工艺路线。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明实施例提供了一种采用动态轴向压缩柱纯化混合提取物的方法，包括如下步骤：
(A)将混合提取物稀释、注入平衡后的动态轴向压缩柱分离纯化，混合提取物的上样浓度控制在0.5-8g/ml之间；
(B)输送流动相进行洗脱，洗脱流速控制在0.5-3.2L/min，收集含有目标产物的洗脱液，检测其纯度，即可。
现有技术中，针对生物活性物质的提取方法主要有有机溶剂提取法与水提法这两种，但是两种方法本身都存在着诸多缺陷，水提法本身需要大量水，蒸发需要大量能量，且提取物中杂质多，因此不适于大规模生产，有机溶剂提取法得率低、能耗高、工序多、生产周期长、毒性大、易霉变，无法适应现在中药现代化的要求。本发明为了解决上述问题，提供了一种采用动态轴向压缩柱纯化混合提取物的方法，这种纯化混合提取物的方法操作简便，生产周期短、分离效果好、产品得率高、成本低、工艺稳定、易于放大生产，可以实现从实验室到工业化白藜芦醇、维生素E的高效分离提取。
本发明的操作步骤(A)中，首先需要将混合提取物进行稀释，以提取纯的维生素E为例，将含有维生素E的粗品首先进行稀释，当然这种维生素E粗品事先已经经过前面的提取分离步骤，只是需要最后一步的纯化分离即可直接形成产品进行销售，而这最关键的纯化分离步骤就是本发明的整个纯化混合提取物的操作过程，也是本发明要加以保护的重点，其中稀释最好采用弱极性溶剂的流动相，优选流动相包括正己烷、己烷、庚烷、乙酸乙酯、异丙醇、甲醇以及石油醚中的其中一种或多种的混合。这样采用流动相直接对样品进行稀释溶解，更有利于后续上柱纯化操作时目标产物的提炼纯化。
另外，为了预先将混合提取物中的杂质排除，最好在混合提取物稀释之前先依次经过滤膜过滤、超声处理的步骤，滤膜过滤与超声处理基本可以实现将混合提取物中的杂质清除干净。如果一次过滤会导致杂质去除的不彻底不干净，也可以选择反复多次过滤以增强过滤的效果。
对混合提取物进行处理完后，就是对动态轴向压缩柱进行处理，动态轴向压缩柱需要进行平衡以使色谱柱中的色谱填料能够平铺更加均匀，具体动态轴向压缩柱平衡的方法包括：称取一定质量的色谱填料采用流动相匀浆后，注入动态轴向压缩柱，排出溶剂并压实填料，用流动相平衡装填好填料的动态轴向压缩柱，即可。
以上采用流动相平衡的操作即采用流动相反复冲洗流经色谱填料，色谱填料的装填的体积控制在整个动态轴向压缩柱体积的1/2-2/3，这样的高度最适宜后续纯化操作，并且色谱填料在选择上最好选择的是目粒度控制在400-1200目之间的极性硅胶填料，更优选的，色谱填料包括复合硅胶、十八烷基键合硅胶、辛烷基键合硅胶以及氨基键合硅胶中的其中一种。
混合提取物除了可以选择对混合维生素E提取物进行提取外，混合提取物还可以选择混合白藜芦醇提取物，而且针对不同的混合提取物纯化步骤的操作参数各有不同。
在本发明中，上样浓度一般控制在0.5-8g/ml之间，当混合提取物为混合维生素E提取物，上样浓度控制在0.5-8g/ml，当混合提取物为混合白藜芦醇提取物，上样浓度控制在0.8-8g/ml。针对不同的生物活性提取物选择适宜的上样浓度，有利于提高最终产品的纯度，并提高产品的收率。还有，上样的流速最好根据选择的物质的种类不同以选择不同的上样流速，当混合提取物为混合维生素E提取物，上样的流速控制在0.9-3.2L/min，当混合提取物为混合白藜芦醇提取物，上样的流速控制在0.5-3.2L/min，通过整个工艺指标的准确控制，不但提高了产品的指标，还提高了生产效率。
优选地，注入动态轴向压缩柱的样品质量与压缩柱直径的比例控制在(0.5-1.2)g：1cm。控制在这样的样品注入范围内既保证了纯化质量还能使得压缩柱得到充分利用，工作效率最高。
在本发明的步骤(B)中，当混合提取物为混合维生素E提取物，洗脱流速控制在1-3mL/min，当混合提取物为混合白藜芦醇提取物，洗脱流速控制在3-6mL/min。本发明的这种纯化分离方法，最终分离得到的产品纯度均达到96％以上，收率也能能控制在90％以上，而现有技术中普通的化学溶剂法、水提法不但污染大、操作复杂，不易操作而且最终的收率也比较低，纯度基本在50％左右。本发明通过采用动态轴向压缩柱对生物提取物进行分离提取，这种举措属于首次将动态轴向压缩柱应用于生物活性提取物领域，并对纯化分离路线进行了大量的创造性劳动摸索出了一条较优的工艺路线，使得其中各项操作参数比如上样浓度、洗脱流速等参数均控制在最为适宜的参照范围内，为现有技术填补了相关的技术空白，并且显著提高了生物活性提取物的纯度。
本发明的这种纯化混合提取物的方法不止限于天然混合维生素E、混合白藜芦醇，还包括二十八烷醇、青蒿素等多种天然提取物，均可使用此纯化方法。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供了一种采用动态轴向压缩柱纯化混合提取物的方法，实现了从实验阶段到工业化放大，提高了生产效率，方法简单易操作，产品质量也更加容易控制，分离得到的产品纯度均达到96％以上，收率也能控制在90％以上，产品的各项指标均得到明显的提高；
(2)本发明的采用动态轴向压缩柱纯化混合提取物的方法，整个工艺路线所用的化学溶剂较少，而且使用后的化学溶剂可以实现回收再利用，不会对环境与操作人员有任何伤害，降低对环境的氨氮排放等，减少环境污染，对人类以及环境无害，绿色环保；
(3)本发明的制备方法虽然工艺比较简单，但是操作工艺参数需要严格把控，完全替代了传统落后的化学溶剂法以及水提发，不仅前后步骤衔接紧密，而且每个操控参数均是有根据的控制在适宜的范围内，在生物活性物质提取制备领域这种方法尚属首创，值得后续借鉴应用，提供了可参考的操作办法。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
动态轴向压缩柱高效分离提取混合维生素E提取物的方法，包括如下步骤：
1)使用正己烷配制流动相，作为样品洗脱液；
2)将维生素E粗品用正己烷流动相溶解，并用滤膜过滤后超声处理，最后使用流动相稀释至上样浓度0.5-1g/ml之间；
3)称取一定重量的色谱填料，使流动相匀浆；
4)然后将匀浆液倒入动态轴向压缩柱，排出溶剂，压实色谱填料，保证色谱柱有足够的柱效；
5)再使用流动相平衡已经装填好填料的动态轴向压缩柱，准备分离纯化；
6)将样品注入平衡后的动态轴向压缩柱，并启动制备泵输送流动相洗脱，维生素E粗品得到分离纯化；
7)紫外检测器将色谱信号传递到电脑，通过控制及数据采集软件查看维生素E出峰时间，收集；
8)将收集到的混合维生素E浓缩；
9)采用高效液相色谱检测混合维生素E，确定其纯度，经检测后纯度达到96％以上，收率在90％以上。
实施例2
动态轴向压缩柱高效分离提取混合维生素E提取物的方法，包括如下步骤：
1)使用乙酸乙酯配制流动相，作为样品洗脱液；
2)将维生素E粗品用乙酸乙酯流动相溶解，并用滤膜过滤、超声处理后，最后使用流动相稀释至上样浓度0.8-1g/ml之间；
3)称取一定重量的复合硅胶色谱填料，使流动相匀浆；
4)然后将匀浆液倒入动态轴向压缩柱，排出溶剂，压实色谱填料，保证色谱柱有足够的柱效，色谱填料装填的体积控制在整个动态轴向压缩柱体积的1/2-2/3之间；
5)再使用流动相平衡已经装填好填料的动态轴向压缩柱，准备分离纯化；
6)将样品注入平衡后的动态轴向压缩柱，按照每厘米的压缩柱直径注入0.5-0.6g的比例注入样品，并启动制备泵输送流动相洗脱，流动相的洗脱流速控制在0.9-2L/min，维生素E粗品得到分离纯化；
7)紫外检测器将色谱信号传递到电脑，通过控制及数据采集软件查看维生素E出峰时间，收集；
8)将收集到的混合维生素E浓缩；
9)采用高效液相色谱检测混合维生素E，确定其纯度，经检测后纯度达到97％以上，收率在92％以上。
实施例3
动态轴向压缩柱高效分离提取混合维生素E提取物的方法，包括如下步骤：
1)使用异丙醇配制流动相，作为样品洗脱液；
2)将维生素E粗品用异丙醇流动相溶解，最后使用流动相稀释至上样浓度7-8g/ml之间；
3)称取一定重量的目粒度控制在400-1200目之间的极性硅胶填料作为色谱填料，使流动相匀浆；
4)然后将匀浆液倒入动态轴向压缩柱，排出溶剂，压实色谱填料，保证色谱柱有足够的柱效，色谱填料装填的体积控制在整个动态轴向压缩柱体积的1/2-2/3之间；
5)再使用流动相平衡已经装填好填料的动态轴向压缩柱，准备分离纯化；
6)将样品注入平衡后的动态轴向压缩柱，按照每厘米的压缩柱直径注入0.8-1.0g的比例注入样品，并启动制备泵输送流动相洗脱，流动相的洗脱流速控制在2-3.2L/min，维生素E粗品得到分离纯化；
7)紫外检测器将色谱信号传递到电脑，通过控制及数据采集软件查看维生素E出峰时间，收集；
8)将收集到的混合维生素E浓缩；
9)采用高效液相色谱检测混合维生素E，确定其纯度，经检测后纯度达到97％以上，收率在92％以上。
实施例4
动态轴向压缩柱高效分离提取混合白藜芦醇提取物的方法，包括如下步骤：
1)使用乙酸乙酯与正己烷的混合物配制流动相，作为样品洗脱液；
2)将混合白藜芦醇粗品用流动相溶解，并用滤膜过滤、超声处理后，最后使用流动相稀释至上样浓度0.8-1g/ml之间；
3)称取一定重量的复合硅胶色谱填料，使流动相匀浆；
4)然后将匀浆液倒入动态轴向压缩柱，排出溶剂，压实色谱填料，保证色谱柱有足够的柱效，色谱填料装填的体积控制在整个动态轴向压缩柱体积的1/2-2/3之间；
5)再使用流动相平衡已经装填好填料的动态轴向压缩柱，准备分离纯化；
6)将样品注入平衡后的动态轴向压缩柱，按照每厘米的压缩柱直径注入0.5-0.6g的比例注入白藜芦醇样品，并启动制备泵输送流动相洗脱，流动相的洗脱流速控制在0.5-1L/min，白藜芦醇粗品得到分离纯化；
7)紫外检测器将色谱信号传递到电脑，通过控制及数据采集软件查看白藜芦醇出峰时间，收集；
8)将收集到的混合白藜芦醇浓缩；
9)采用高效液相色谱检测混合白藜芦醇，确定其纯度，经检测后纯度达到98％以上，收率在90％以上。
实施例5
动态轴向压缩柱高效分离提取混合白藜芦醇提取物的方法，包括如下步骤：
1)使用石油醚配制流动相，作为样品洗脱液；
2)将混合白藜芦醇粗品用石油醚流动相溶解，并用滤膜过滤、超声处理后，最后使用流动相稀释至上样浓度7-8g/ml之间；
3)称取一定重量的十八烷基键合硅胶色谱填料，使流动相匀浆；
4)然后将匀浆液倒入动态轴向压缩柱，排出溶剂，压实色谱填料，保证色谱柱有足够的柱效，色谱填料装填的体积控制在整个动态轴向压缩柱体积的1/2-2/3之间；
5)再使用流动相平衡已经装填好填料的动态轴向压缩柱，准备分离纯化；
6)将样品注入平衡后的动态轴向压缩柱，按照每厘米的压缩柱直径注入0.5-0.6g的比例注入白藜芦醇样品，并启动制备泵输送流动相洗脱，流动相的洗脱流速控制在2-3.2L/min，白藜芦醇粗品得到分离纯化；
7)紫外检测器将色谱信号传递到电脑，通过控制及数据采集软件查看白藜芦醇出峰时间，收集；
8)将收集到的混合白藜芦醇浓缩；
9)采用高效液相色谱检测混合白藜芦醇，确定其纯度，经检测后纯度达到98％以上，收率在93％以上。
比较例1
采用CN1478776A的提取方法对混合维生素E进行纯化分离，最后经过检测纯度为45％，收率在50％。
比较例2
采用CN125395A的提取方法对混合白藜芦醇进行纯化分离，最后经过检测纯度为50％，收率在45％。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
Claims (6)
1.一种采用动态轴向压缩柱纯化混合提取物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（A）将混合提取物稀释、注入平衡后的动态轴向压缩柱分离纯化，混合提取物的上样浓度控制在0.5-8g/ml之间；
（B）输送流动相进行洗脱，洗脱流速控制在0.5-3.2L/min，收集含有目标产物的洗脱液，检测其纯度，即可；
当混合提取物为混合维生素E提取物，上样浓度为8g/ml，当混合提取物为混合白藜芦醇提取物，上样浓度控制在0.8-8g/ml；
当混合提取物为混合维生素E提取物，洗脱流速控制在0.9-3.2L/min，当混合提取物为混合白藜芦醇提取物，洗脱流速控制在0.5-3.2L/min;
所述动态轴向压缩柱平衡的方法包括：称取一定质量的色谱填料采用流动相匀浆后，注入动态轴向压缩柱，排出溶剂并压实填料，用流动相平衡装填好填料的动态轴向压缩柱，即可；
其中，所述色谱填料装填的体积控制在整个动态轴向压缩柱体积的1/2-2/3，注入动态轴向压缩柱的样品质量与压缩柱直径的比例控制在（0.5-1.2）g：1cm。
2.根据权利要求1所述的一种采用动态轴向压缩柱纯化混合提取物的方法，其特征在于，所述步骤（A）中，混合提取物稀释之前先依次经过滤膜过滤、超声处理的步骤。
3.根据权利要求1所述的一种采用动态轴向压缩柱纯化混合提取物的方法，其特征在于，所述步骤（A）中，所述稀释步骤采用弱极性溶剂的流动相。
4.根据权利要求3所述的一种采用动态轴向压缩柱纯化混合提取物的方法，其特征在于，所述步骤（A）中，流动相包括己烷、庚烷、乙酸乙酯、异丙醇、甲醇以及石油醚中的其中一种或多种的混合。
5.根据权利要求1所述的一种采用动态轴向压缩柱纯化混合提取物的方法，其特征在于，所述色谱填料为目粒度控制在400-1200目之间的极性硅胶填料。
6.根据权利要求5所述的一种采用动态轴向压缩柱纯化混合提取物的方法，其特征在于，所述色谱填料包括复合硅胶、十八烷基键合硅胶、辛烷基键合硅胶以及氨基键合硅胶中的其中一种。
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